Université Joseph Fourier GRENOBLE I
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Université Joseph Fourier GRENOBLE I TRAVAUX DIRIGES BIO 121 Première année de LICENCE –Année 2008-2009 2 Sommaire et Progression en TD Ce polycopié de TD comprend un nombre important d’exercices qui ne pourront peut-être pas être tous traités en séance. Certains seront faits en priorité, vous pourrez faire les autres chez vous et les faire vérifier par l’enseignant. Thème 1 : Concentrations-Dosages (en 2 séances) p3 Concentration : à faire en priorité : exo n° 1,2,3,4. Spectrophotométrie : à faire en priorité : exo n° 1 ,3 et 4 (bien le détailler) Thème 2 : Glucides (en 2 séances maxi) p9 à faire en priorité : exo n° 2, 3 (à faire chez vous, correction des structures posant problèmes), 4, 5 et 6. Thème 3 : Acides Nucléiques (en 1,5 séance) à faire en priorité : exo n° 1,3,4. p15 Thème 4 : Proteines (en 5 séances maxi) p20 Propriétés ioniques des acides aminés et des peptides : 1 séance à faire en priorité : exo n° 1 faire exemple de l’acide aspartique, 2, 3. Séquençage des protéines: 1 séance à faire en priorité : exo n° 1,2. Conformation des protéines: à faire en priorité : exo n° 3,4. 1 séance manipulations sur ordinateur : 1 séance en salle informatique, se reporter au tableau d'affichage pour les lieux et dâtes Méthodes de séparation des protéines : 2 séances à faire en priorité: exo n° 1,2,3,4. Thème 5 : Lipides (en 1,5 séances) à faire en priorité : exo n° 1,2,4,5. p48 3 Thème n°1 CONCENTRATIONS - DOSAGES ---------------------CONCENTRATION SPECTROPHOTOMÉTRIE 4 CONCENTRATION Notions à acquérir : - concentration en masse - concentration en molarité - concentration en % p/v ou en % v/v - effectuer une solution exacte en concentration à partir d'une substance solide (soluté) - dilution en cascade - produit anhydre, produit hydraté - pureté en % I - COMPLEMENTS THEORIQUES 1 - Une solution est obtenue en dissolvant un corps solide, liquide ou gazeux dans un liquide. Le corps dissous est le soluté, le liquide qui dissout le solvant. Ne pas confondre dissolution d'un corps solide dans un solvant liquide et dilution d'une solution liquide dans un solvant liquide. 2 - La concentration des solutés s'exprime le plus souvent : 2-1 en molarité C'est le nombre de moles de soluté dissoutes dans 1 litre de solution finale. ex. 1 solution d'urée 6 M est une solution d'urée à 6 mol.L-1. 2-2 en poids par volume p/v Les unités utilisées sont en général g.L-1, mg.mL-1, µg.µL-1 ex. la concentration du glucose dans le sang est de 0,9 g.L-1. 2-3 en pourcentage 2-3-1 pourcentage poids/volume (p/v) C'est le nombre d'unités de poids de soluté contenu dans 100 unités de volume de solution. ex. 7 % p/v signifie 7 g de soluté dans 100 mL de solution finale c'est-à-dire 7 g soluté + solvant q.s.p. 100 mL (q.s.p. signifie quantité suffisante pour). ex. 9o/oo p/v signifie 9 g de soluté dans 1000 mL de solution finale c'est-à-dire 9 g soluté + solvant q.s.p. 1 L. 2-3-2 pourcentage poids/poids (p/p) ex. 7 % p/p signifie 7 g de soluté dans 100 g de solution finale (7 g soluté + solvant q.s.p 100 g) 2-3-3 pourcentage volume/volume (v/v) ex. 7 % v/v signifie 7 mL de soluté dans 100 mL de solution finale (7 mL soluté + solvant q.s.p 100 mL) 5 II - EXERCICES Exercice 1 : Préparer 100 mL d'une solution de glucose à 10,8 g.L-1 dans NaCl 1 % p/v. - à partir de glucose cristallisé C6H12O6 - à partir de glucose monohydraté cristallisé C6H12O6, H2O - à partir d'une solution de glucose 150 mM. Comment doit-on procéder ? Exprimer la concentration de la solution obtenue en mg.mL-1 et en molarité. Exercice 2 : Calculer la molarité de la lessive de soude (solution concentrée de soude) à partir des données suivantes : PM = 40, d = 1,3, pureté 30 % minimum. Préparer 1 litre de lessive de soude à partir de pastilles de soude. Exercice 3 : Calculer la molarité d'une solution diluée d'acide sulfurique (H2SO4) réalisée dans les conditions suivantes : 14,1 mL d'une solution commerciale d'acide sulfurique sont ajoutés à environ 400 mL d'eau distillée (dans un bécher). Après refroidissement, la solution est transvasée dans une fiole jaugée de 500 mL et le volume est complété à 500 mL par de l'eau distillée. La mise en œuvre expérimentale vous paraît-elle adaptée ? Les indications fournies sur la bouteille d'acide sont : d = 1,83 ; pureté = 95 % ; H2SO4 : M = 98 g.mol-1. Exercice 4 : Préparer 60 mL d’agarose 1 % p/v dans du tampon de migration. Pour cela, vous disposez d’agarose en poudre et de tampon de migration concentré 10 fois. Comment allez-vous procéder ? Exercice 5 : Exprimer en molarité les concentrations des solutions suivantes : 1) Glucose (M =180 g.mol-1) à 18% (p/v) 2) NaCl (M = 58,5 g.mol-1) à 9o/oo (p/v) 3) Protéine A (M = 60 000 g.mol-1) à 12 µg.mL-1 Exercice 6 : Vous recevez une bouteille d’acide chlorhydrique sur laquelle vous avez les indications suivantes : 37% (v/v), M = 36,46 g.mol-1 et d = 1.18. Calculer sa molarité. 6 SPECTROPHOTOMETRIE Notions à acquérir : - absorbance d'une substance colorée (spectre dans le visible) ou incolore (spectre U.V.) - loi de Lambert-Beer - limites de la loi de Lambert-Beer - loi d'additivité - gamme étalon I - COMPLEMENTS THEORIQUES Quand une radiation monochromatique de longueur d'onde λ traverse une cuve à faces parallèles contenant un milieu homogène, on note une atténuation plus ou moins importante de l'intensité du faisceau ; par contre, la longueur d'onde ne varie pas entre l'entrée et la sortie de la cuve. Il y a eu absorption d'une partie de la lumière. On définit l'absorbance A (ou densité optique DO) d'une solution : Io A λ = log I I0 I A est donc un nombre toujours positif ou nul ( Io ≥ I ), sans dimension, sans unité. Pour une solution totalement transparente, Io = I donc A = 0. Pour une solution totalement opaque, I = 0 donc le faisceau est totalement absorbé. La relation entre I et Io dépend de la longueur du trajet optique, c'est-à-dire de la largeur de la cuve, et de la concentration c de la solution absorbante. La loi de Lambert-Beer met en équation cette relation : Aλ = ε λ c avec λ la largeur de la cuve exprimée en cm ; en général λ = 1 cm, c la concentration de la substance en solution exprimée en mol.L-1, et ε le coefficient d'extinction molaire de la substance à λ, exprimé en mol-1.L.cm-1. Cette loi est vérifiée à condition d'avoir : - une lumière monochromatique, (en général, on se place à la longueur d'onde correspondant au maximum d'absorption de la substance à doser), - des solutions à doser très diluées (c < 10 -2 mol.L-1). En pratique, on mesure l'absorbance d'une solution à l'aide d'un spectrophotomètre et de cuves plastiques (λ du visible) ou en quartz ou plastique spécial (λ U.V.). 7 On peut ainsi doser des substances en solution qui absorbent dans les U.V. (elles sont donc incolores), comme les protéines à λ = 280 nm, les acides nucléiques à λ = 260 nm ou le coenzyme NADH à λ = 340 nm, ou qui absorbent dans le visible (elles sont colorées) notamment lorsque l'on dose une substance par formation d'un complexe coloré entre la substance à doser et un réactif approprié (voir TP). Spectre d'absorption Le coefficient d'extinction molaire "ε" caractéristique de la substance dissoute, change avec la longueur d'onde incidente. La courbe ε = f (λ) , ou A = f (λ) , est le spectre d'absorption. Loi de l'additivité des absorptions dans les mélanges Pour des substances en mélange n'interagissant pas les unes sur les autres, l'absorption pour le mélange est égale à la somme des absorptions des constituants: Amélange = A1 + A2 + A3 + ... II - EXERCICES Exercice 1 : Le nicotinamide adénine dinucléotide réduit (NADH), sous forme disodique (M = 709 g.mol ), est le coenzyme de nombreuses enzymes déshydrogénases. Calculer l'absorbance à 340 nm et à 260 nm d'une solution de NADH à 0,05 g.L-1, placée dans une cuve dont le trajet optique est 1 cm. -1 εNADH (à 340 nm) = 6,3 . 103 M-1. cm-1 εNADH (à 260 nm) = 15 400 M-1cm-1 Exercice 2 : loi d'additivité des absorbances Au cours d'une manipulation, l'expérimentateur réalise 5 mL d'un mélange NADH / NAD+ mais oublie de noter les concentrations respectives en NADH et NAD+ sur le flacon. Pour retrouver ces valeurs, il effectue des mesures au spectrophotomètre avec une cuve de largeur 1 cm. 1. Dans un premier temps, il enregistre un spectre d'absorption de la solution et obtient deux pics d'absorption maximum à 260 et 340 nm. Tracer et interpréter l'allure du spectre obtenu sachant que seule la forme réduite NADH possède un pic d'absorption spécifique à 340 nm. 2. L'expérimentateur effectue alors deux mesures d'absorbance à longueur d'onde fixe et trouve les valeurs suivantes : à 340 nm, A340nm = 0,44 et à 260 nm, A260nm = 1,3. L'expérimentateur peut alors connaître les concentrations respectives en NADH et NAD+ dans son mélange. Quelles sont-elles ? ε340 nm (NAD+) = 0 ε260nm(NADH)= 15000 M-1.cm-1 ε260nm(NAD+) = 15000 M-1.cm-1 ε340 nm (NADH)= 6220 M-1.cm-1 8 Exercice 3 : La tyrosine est un des 20 acides aminés standard. Sa masse molaire est de 181 g.mol -1. A 20°C, la solubilité de la tyrosine dans l’eau est de 0,0362 % p/v. Une dilution au 1/5 d’une partie aliquote de la solution précédente, placée dans une cuve de spectrophotomètre de 1 cm de trajet optique, présente une absorbance de 0,60 à 275 nm. 1. Calculer le coefficient d’extinction molaire de la tyrosine. 250 mL d’une solution de 1mM de tyrosine tamponnée à pH = 7, sont oubliés par négligence à température ambiante. La solution est contaminée par des microorganismes de l’air qui utilisent l’acide aminé comme source de carbone et d’énergie. La présence d’un nombre croissant de microorganismes se traduit par le trouble de la solution, limpide au moment de sa préparation. Après élimination des bactéries par centrifugation, l’absorbance à 275 nm de la solution est de 0,30. 2. En déduire la quantité de tyrosine utilisée par les microorganismes pour assurer leur croissance. Exercice 4 : Vous voulez doser les protéines d’un extrait biologique (EB). La méthode utilisée est celle de Bradford, basée sur les propriétés d’adsorption d’un colorant hydrophobe (bleu de Coomassie) sur les protéines. Le protocole consiste à ajouter 1 mL de réactif à 100 µL d’échantillon contenant entre 1 et 10 µg de protéines. L’absorbance est lue après 20 min à 595 nm, dans une cuve de 1 cm de trajet optique. Le dosage nécessite l’élaboration d’une gamme étalon réalisée à l’aide de sérumalbumine bovine (SAB), la protéine de référence utilisée pour le dosage des protéines. Pour cela, 4 solutions de SAB de concentrations différentes sont préparées. Comme vous n’avez aucune idée de l’ordre de grandeur de la concentration à trouver, vous effectuez une gamme de dilutions en cascades de l'extrait biologique: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32. Le test colorimétrique est donc appliqué aux 4 solutions de SAB ainsi qu’aux différentes dilutions de l’EB. Les absorbances lues au spectrophotomètre sont les suivantes : Echantillons SAB SAB 25 µg.mL-1 SAB 50 µg.mL-1 SAB 75 µg.mL-1 SAB 100 µg.mL-1 A595 nm 0,15 0,30 0,44 0,56 Echantillons EB EB sans dilution EB dilution 1/2 EB dilution 1/4 EB dilution 1/8 EB dilution 1/16 EB dilution 1/32 A595 nm 1,5 1,0 0,8 0,47 0,24 0,11 Comment effectuez-vous les dilutions en cascade de l’extrait biologique et avec quel volume minimum de EB pour des raisons d'économie ? (vous en avez 1 mL au total). 2- Pour les lectures d’absorbance, comment effectuez-vous le zéro au spectrophotomètre ? 3- Tracez la courbe étalon et calculez la pente de la droite obtenue, que vous exprimerez en mL.µg-1. Quel est l’intérêt d’un tel calcul ? 4- Repérez les valeurs d’absorbance proportionnelles aux dilutions utilisées puis calculez avec l’ensemble de celles-ci la concentration moyenne en protéines de l’extrait biologique. Malgré le fait qu’une seule mesure par dilution ait été effectuée, cvelle-ci estelle fiable ? 1- 9 Thème n°2 GLUCIDES ------------------- 10 11 Notions à acquérir : oses simples : - fonctions alcool primaire et secondaire, aldéhyde et cétone (1ère S) - représentation selon Fisher, série D / série L, épimères, énantiomères - passage de la forme linéaire à la forme cyclique, anomères α et β , représentations de Tollens et de Haworth - oses à connaître : glucose, galactose, mannose, ribose, fructose osides : - formation de la liaison osidique, caractère réducteur - nomenclature II - EXERCICES Exercice 1 : Ecrire les formules selon Fisher - des hexoses épimères en 2 et en 4 du D-glucose. - des hexoses énantiomères des hexoses obtenus précédemment. Exercice 2 : Le glucose en solution existe sous 5 formes différentes en équilibre entre elles. Quelles sont ces 5 formes ? Par quel mécanisme coexistent-elles en équilibre en solution ? Exercice 3 : 1. Ecrire les formules cycliques selon Tollens puis selon Haworth des oses et osides naturels suivants. α D glucopyranose β D glucofuranose β D fructofuranose α D fructopyranose β D galactofuranose β D mannopyranose β D ribofuranose D-glucosamine 2. Ecrire les formules chimiques selon Haworth des osides naturels suivants : saccharose, maltose, lactose. 3. Préciser lesquels sont réducteurs ou non réducteurs et entourer la fonction réductrice. 12 Exercice 4 : 1. Soit un monosaccharide A de formule Cn(H2O)n représenté en projection de Fischer : CHO CH2OH 1.1. Définir la fonction portée : - par le C1 - par le C6 - par les carbones C2 à C5. 1.2. Quelle fonction permet de définir l'isomérie D/L ? 2. L'isomérisation de A en cétohexose correspondant est catalysée par une hexose isomérase. Représenter le cétohexose (monosaccharide B) en projection de Fischer. 3. Chez les végétaux, les deux monosaccharides A et B sont associés pour former un diholoside dont le nom systématique est β-D-fructofuranosyl (2→1)-α-D-glucopyranoside. 3.1. Ecrire, en représentation de Haworth, la réaction de synthèse du diholoside. Donner son nom d'usage. 3.2. Pour chaque réactant (réactif ou produit), entourer, si elle existe, la fonction hémiacétal libre. Exercice 5 : Les glycoprotéines (GP) sont des hétérosides formés d’un motif glucidique fixé de façon covalente à une chaîne polypeptidique. On distingue les N-GP et les O-GP selon la nature de la liaison reliant la partie glucidique à la protéine, respectivement une liaison N-osidique ou une liaison O-osidique. 1. Quels sont les acides aminés impliqués dans la fixation des parties glucidiques d’une N-GP, d’une O–GP ? Dans le cas des N-GP, le résidu glucidique impliqué dans la liaison N-osidique est presque toujours le dérivé N-acétylé du glucose. 2. Ecrire la formule chimique du dérivé N-acétylé du glucose (NAG) selon la représentation de Haworth. 3. Etablir la liaison N-osidique entre le carbone anomérique β de cet ose NAG et l’acide aminé trouvé en question 1. 4. Les motifs glucidiques des N-GP possèdent une séquence commune en oses. Sur cette séquence commune appelée « noyau (core) », viennent se greffer d’autres oses, selon le motif glucidique adopté par la N-GP. Cette séquence noyau est la suivante : αMan (1→6) αMan (1→3) βMan(1→4) βNAG(1→4) NAG Etablir la formule selon Haworth de la séquence noyau. 13 Les oses galactose et acide sialique sont greffés sur le noyau des Immunoglobulines G humaines selon le schéma suivant : Sia Gal NAG Man Sia Gal NAG Man Man NAG NAG 5. Où trouve-t-on les Ig G solubles dans notre organisme ? Quel est leur rôle physiologique ? 6. Sachant que les motifs glucidiques sont très hydrophiles, quelle propriété confèrent les parties glucidiques aux Ig G permettant à ces molécules d’assurer leur fonction dans de bonnes conditions ? 7. Dans les parois des vaisseaux sanguins, une enzyme, une sialidase, catalyse l’hydrolyse progressive des acides sialiques présents aux extrémités des motifs glucidiques des Ig G. Quelle sera la structure des motifs glucidiques d’une « vieille » Ig G ayant circulé longtemps dans nos vaisseaux ? 8. Les capillaires du foie sont eux tapissés par une protéine faisant partie de la famille des lectines. Les lectines sont des protéines capables de fixer de façon spécifique un type de résidu glucidique plutôt qu’un autre. La lectine du foie fixe, quant à elle, de façon spécifique les résidus galactose. A partir de ces données, expliquer comment s’effectue le renouvellement des protéines plasmatiques à l’exemple des Ig G, sachant que les protéines fixées au niveau du foie sont ensuite éliminées. Exercice 6 La spécificité des groupes sanguins ABO est portée par l'extrémité de chaînes glucidiques déployées comme des antennes à la surface des cellules. Sur les globules O, on trouve un antigène O dont la structure vous est donnée ci-dessous. Les antigènes A et B possèdent la même molécule de base légèrement modifiée par l’addition d’un ose supplémentaire qui est soit de la N-acétyl-D-galactosamine dans le cas de l’antigène A, soit du galactose pour l’antigène B. Fuc α -1,2 Fuc Gal α -1,2 β -1,3 GlcNac Gal β -1,3 Antigène O GalNac α 1, ? Gal β -1,3 GlcNac Gal β -1,3 Antigène A Fuc α -1,2 Gal Gal α 1, ? β -1,3 GlcNac Gal β -1,3 Antigène B Afin de connaître le branchement respectif de la N-acétyl-D-galactosamine sur l’antigène A et du galactose sur l’antigène B, les deux oligoholosides sont soumis à un 14 traitement de perméthylation (transformation des -OH en -OCH3) suivi d’une hydrolyse acide (hydrolyse des liaisons osidiques). La composition en oses méthylés du mélange obtenu après traitement est la même pour les deux groupes à l’exception de la 1,4,6 trimethyl N-acétyl-D-galactosamine pour le groupe A et du 1,2,4,6 tetramethyl galactose pour le groupe B. Avec la représentation semi-développée de Haworth (pour chaque structure demandée) : 1- Donner la formule du α-D galactopyranose et numéroter ses carbones. 2 - Sachant que la N-acétyl-D-galactosamine comporte un groupement –NH-CO-CH3 substitué au OH en C2 du galactose, représenter la molécule sous forme pyranose. 3 – D’après les résultats de perméthylation, représenter les deux oses méthylés . 4– Ecrire la formule semi-developpée de l’association du galactose avec soit la N-acétyl-Dgalactosamine, soit le galactose terminal des deux antigènes A et B, (cf partie entourée en pointillés). 5 – Sachant que chaque individu peut être de groupe sanguin, A,B,O ou AB (c'est-à-dire avoir à la fois un antigène A et un antigène B), en observant la structure des 3 antigènes ABO, quel est le groupe sanguin du receveur universel et celui du donneur universel ? Justifier votre réponse. 15 Thème n°3 ACIDES NUCLEIQUES ---------------------- 16 Notions à acquérir : - bases azotées (à connaître par cœur) - ribose / désoxyribose (à connaître par cœur) - nucléoside (liaison N osidique entre la base azotée et le sucre) - nucléotide (liaison ester entre le sucre et le groupement phosphate) - nucléoside triphosphate (liaison anhydride acide entre 2 groupements phosphate) - structures I, II, III des acides nucléiques - modèle en double hélice de l'ADN et chromatine - hybridation EXERCICES 1. Liaison phosphodiester 1.1. Donner la définition d'un nucléoside, d'un nucléotide et d'un acide nucléique. 1.2. Dessiner la désoxyriboadénosine 5' triphosphate en formule semi-développée, en numérotant les atomes du sucre et de la base, ainsi que les phosphates. Vous prendrez soin de mentionner le nom du sucre et de la base. 1.3. Entourer et nommer la liaison entre la base et le sucre. Entourer et nommer la liaison entre le sucre et le phosphate. Entourer et nommer une liaison entre deux phosphates. 1.4. Que signifie dNTP et NTP ? Détailler leur structure et leur composition. Dans quelles molécules d'acides nucléiques les trouve-t-on ? 1.5. Dessiner le didésoxynucléotide pppdAdC, en ajoutant à la désoxyriboadénosine 5-'triphosphate, la désoxycytidine. Comment nomme-t-on la liaison entre deux désoxyribonucléotides ? Expliquer cette dénomination. Orienter les brins. Dans quelles autres molécules d'intérêt biologique trouve-t-on des liaisons similaires ? 17 2. Liaison hydrogène 2.1. Loi de complémentarité des bases ADN / ADN : 2.1.1. Etablir les liaisons hydrogènes entre les bases des deux dinucléotides ci-dessous. Orienter les brins. 2.1.2. Quelles sont les caractéristiques d'une liaison hydrogène ? 2.1.3. Quelles seront les conséquences d'une augmentation suivie d'une baisse de température sur la structure d'un ADN double brin ? Quels mécanismes cellulaires mettent en jeu ces processus de dénaturation / renaturation de l'ADN ? 2.1.4. Sur la figure de la page suivante, orienter les brins. Quel est le brin matrice ? Quel est le brin en cours d'élongation ? 2.1.5. En respectant la loi de complémentarité des bases, ajouter le bon nucléotide au brin en cours d'élongation. 18 2.2. Loi de complémentarité des bases ARN / ARN : 2.2.1. Soit la séquence primaire suivante : AUCCUCCCUUUGCAAGGGAGAGG Pourquoi s'agit-il d'une molécule d'ARN ? Ecrire cette séquence en utilisant la convention d'écriture utilisée en question 1.5. 2.2.2. Pourquoi cette molécule peut-elle adopter une structure secondaire ? La nommer et la représenter. Au sein quelle molécule, ces structures secondaires sont-elles abondamment retrouvées ? 2.2.3. Dans quel cas l'hybridation ARN / ARN est-elle trouvée entre deux molécules d'ARN différentes ? Est-ce une hybridation durable ? Justifier. 2.3. Loi de complémentarité des bases ADN / ARN : La séquence d'ADN simple brin suivante correspond au brin codant d'une molécule d'ADN : TGGATGGGCGATGGCTTCTTGTTGTGAGGCGGG 2.3.1. Dessiner la molécule d'ADN cellulaire en orientant les brins. Nommer chaque brin. 19 2.3.2. Ecrire le produit de transcription correspondant et le nommer. Orienter la molécule obtenue. 3. Plasmides, enzymes et cartes de restriction. 3.1.1. Donner la définition d'un plasmide. Quelles sont ses caractéristiques ? Pourquoi sont-il si utilisés par les chercheurs en biologique moléculaire ? 3.1.2. A quelle longueur d'onde mesure-t-on l'absorbance d'une solution d'acide nucléique ? 3.1.3. Quatre microlitres de la solution d'ADN plasmidique P, que vous venez de préparer, sont dilués avec 796 microlitres d'eau. L’absorbance est de 0,1. Calculer la concentration de la solution initiale P et la quantité d'ADN total sachant qu’une unité d’absorbance correspond à 50 µg.mL -1 d'ADN double brin, pour un trajet optique de 1 cm. 3.1.4. Comment vérifieriez-vous la qualité de votre ADN plasmique natif ? Expliquer la technique expérimentale employée et son principe. Faire un schéma représentatif du résultat attendu, correctement annoté. 3.2. Donner la définition d'une enzyme de restriction. Les deux enzymes de restriction EcoRI et SmaI coupent l'ADN au niveau de leur site de restriction respectif, dont la séquence est donnée ci-dessous : EcoRI GAATTC SmaI CCCGGG CTTAAG. CCCGGG Orienter ces séquences. Placer les liaisons phosphodiester et les liaisons hydrogènes. Ecrire les séquences d'ADN ci-dessus après digestion enzymatique, en orientant les brins d'ADN. 3.3.1. En quoi consiste l'établissement d'une carte de restriction ? 3.3.2. Afin d'établir la carte de restriction de votre plasmide P, vous procédez à une série de digestions enzymatiques. Dans un premier temps, vous digérez l'ADN plasmidique P avec l’enzyme de restriction SmaI. Vous obtenez un fragment de 3000 paires de bases (pb) et un fragment de 1000 pb. Quelles conclusions pouvez-vous tirez de cette première expérience ? 3.3.3. Vous digérez ensuite votre ADN avec l’enzyme EcoRI. Vous obtenez un fragment de 4000 pb. Quelles sont vos conclusions ? 3.3.4. Après double digestion par EcoRI et SmaI, vous obtenez un fragment de 300 pb, un fragment de 700 pb et un fragment de 3000 pb. A l'aide des informations que vous possedez, dessiner la carte de restriction de P. 20 Thème n°4 PROTEINES ------------------- PROPRIÉTÉS IONIQUES DES ACIDES AMINES ET DES PEPTIDES SÉQUENCAGE DES PROTÉINES CONFORMATION Manipulation de structures sur ordinateur METHODES DE SEPARATION 21 PROPRIÉTÉS IONIQUES DES ACIDES AMINES ET DES PEPTIDES Notions à acquérir : - formule générale des acides aminés - attribuer à chaque fonction dissociable, le pKa correspondant - écrire les équilibres de dissociation - pH des espèces intermédiaires ( pHi ) - diagramme de prédominance selon le pH - quantification des espèces prédominantes à un pH donné : équation de HendersonHasselbach - prédominance des espèces selon le pH : schéma - titration d'un acide faible par une base forte ; courbe de titration dans le cas d'un polyacide, exemple d'un acide aminé - solutions tampon - cas d'un polypeptide, d'une protéine. I - COMPLEMENTS THEORIQUES Les tableaux suivants vous donnent la structure et le nom des 20 acides aminés les plus courants, ainsi que les valeurs de leur masse molaire (en g.mol-1) et des pKa de leurs groupements ionisables (αCOOH, αNH2 et éventuellement chaîne latérale). Ces tableaux vous indiquent aussi les abréviations et le code lettre utilisé pour chaque acide aminé. Les acides aminés sont présentés selon la polarité de leur chaîne latérale. 22 Structure MM Nom Abrév. Code lettre pka αCOOH pKa αNH2 A - Chaîne latérale non polaire 75 Glycine Gly G 2,4 9,6 89 Alanine Ala A 2,3 9,7 117 Valine Val V 2,4 9,6 131 Leucine Leu L 2,4 9,6 131 Isoleucine Ile I 2,4 9,7 149 Methionine Met M 2,3 9,2 165 Phenylalanine Phe F 1,8 9,1 115 Proline Pro P 2,0 10,6 pKa ch. lat. 23 Structure MM Nom 105 Sérine 119 Thréonine Abré Code pka v. lettre αCOOH pKa αNH2 pKa ch. lat. B - Chaîne latérale polaire Ser S 2,2 9,2 T 2,6 10,4 C 1,7 10,8 N 2,0 8,8 Q 2,2 9,1 Y 2,2 9,1 W 2,4 9,4 Thr Cys 121 Cystéine 8,3 (Sulfhydryle) Asn 132 Asparagine Gln 146 Glutamine Tyr 181 Tyrosine Trp 204 Tryptopha ne 10,1 (hydroxyle phenolique) 24 Structure MM Nom Abré Code pka v. lettre αCOOH pKa αNH2 pKa ch. lat. C - Chaîne latérale chargée 133 Aspartate Asp D 2,1 9,8 3,9 (β-carboxyle) 147 Glutamate Glu E 2,2 9,7 4,3 (γ-carboxyle) 155 Histidine His H 1,8 9,2 6,0 (imidazole) 146 Lysine Lys K 2,2 9,0 10,5 (ε-amino) 174 Arginine Arg R 2,2 9,0 12,5 (guanidino) 25 II - EXERCICES Exercice 1 : 1. Ecrire les équilibres ioniques des acides aminés glycine, tyrosine, acide aspartique, lysine et cystéine aux pH suivants : pH = 1 ; pH = 3 ; pH = 8 ; pH = 10 ; pH = 13. 2. Calculer leur pHi ? 3. Quel est le pH pour lequel 50 % de la fonction ionisable de la chaine latérale de la cystéine sont dissociés ? 4. Combien de moles de OH- faut-il ajouter au milieu pour que deux moles de tyrosine à son pHi soient totalement déprotonnées ? 5. Tracer la courbe de titration d'une mole d'acide aspartique. Qu'est-ce qu'une solution tampon ? A quels pH l'acide aspartique exerce-t-il un effet tampon ? Exercice 2: Quel volume de KOH 0.1 M faut-il ajouter à 50 mL d'une solution du peptide valylméthionyl-histidyl-glutamyl-alanyl-thréonine 0,2 M à son pHi pour que ce composé soit totalement ionisé de telle sorte qu'il migre à l'anode si on en fait l'électrophorèse ? Remarque : le résidu glutamyl correspond à l’acide aminé glutamique, alors que le résidu glutaminyl correspond à à l’acide aminé glutamine. Exercice 3 : On étudie le peptide glycyl-aspartyl-valyl-seryl-lysine : 1. Ecrire la formule développée du peptide à pH = 1. 2. Donner les équilibres de dissociation et calculer le pHi du peptide. 3. Tracer la courbe de titration de 1 mole du peptide par la soude. 4. Dans quelle direction migrera ce peptide sous l'action d'un champ électrique aux pH suivants = 1 - 6,75 -10,5 ? Exercice 4 : Un étudiant travaille sur un dipeptide contenant de la proline et de la phénylalanine mais ignore si la séquence correcte est Phe- Pro ou Pro-Phe. Soumis à une électrophorèse à pH 6,20, le dipeptide ne se déplace ni en direction de l'anode, ni en direction de la cathode. 1. Trouver la séquence correcte de ce peptide. 2. Donner la formule de ce dipeptide à pH 1. 3. Colorier les atomes engagés dans la liaison peptidique. 4. Représenter la structure de la liaison peptidique entre deux carbones α. Quelle est sa caractéristique géométrique ? 26 DETERMINATION DE LA SEQUENCE D'UN PEPTIDE Notions à acquérir : - hydrolyses totales acide et basique sur un peptide - méthodes de détermination de l’acide aminé N-term - méthodes de détermination de l’acide aminé C-term - effet du BrCN - spécificité de clivage des enzymes trypsine, chymotrypsine, clostripaïne I - COMPLEMENTS THEORIQUES Par convention la séquence s'écrit toujours avec la fonction α-amine de l'acide aminé Nterminal placée à gauche. Méthode générale de détection des acides aminés : Lorsque des acides aminés sont chauffés avec un excès de ninhydrine, tous ceux possédant un groupement α-aminé libre fournissent un produit pourpre capable d’absorber la lumière à 570 nm. Ceci constitue donc une méthode précise et simple pour détecter la présence d’acides aminés et mesurer leur concentration. 1. HYDROLYSES TOTALES Hydrolyse acide totale En général par HCl 6N à 110°C pendant 12 à 24H. Elle conduit à la libération de tous les acides aminés constitutifs de la protéine. Une seule exception : le tryptophane est détruit. D’autre part, Asn comme Gln donnent Asp et Glu par hydrolyse acide de la fonction amide. Il devient alors impossible de distinguer les résidus Asp et Glu initiaux de ceux formés à partir de Asn et Gln, de sorte que par convention, ces aa identifiés s’écrivent Asx et Glx. D’autres méthodes permettent de lever l’ambiguïté. Hydrolyse alcaline totale Elle a l'avantage de ne pas détruire le tryptophane mais elle provoque la modification et le remaniement de la structure de certains acides aminés. 27 2. DETERMINATION DE L'ACIDE AMINE (aa) N-TERMINAL 2.1. Méthodes chimiques 2.1.1. Méthode de Sanger Le groupement NH2 de l’acide aminé situé à l’extrémité N-terminale d’une chaîne polypeptidique peut se condenser avec le dinitrofluorobenzène pour obtenir un dinitrophénylpolypeptide. La liaison ainsi formée est plus stable que la liaison peptidique, de sorte qu’après hydrolyse acide, on obtient tous les acides aminés libres et l’acide aminé Nterminal sous forme de dinitrophénylaminoacide facilement identifiable par chromatographie sur papier. 2.1.2. Réaction avec le chlorure de dansyle Cette réaction est intéressante car elle ne nécessite que quelques nanogrammes de peptide, le composé formé étant fluorescent. 28 Après hydrolyse acide totale du peptide, tous les acides aminés sont libérés. Par contre, l’acide aminé N-terminal reste lié au chlorure de dansyle car cette liaison est résistante à l’hydrolyse. Ce dérivé est facilement détectable par chromatographie. 2.1.3. Dégradation d'Edman Le groupement NH2 de l’acide aminé situé à l’extrémité N-terminale d’une chaîne polypeptidique peut se condenser avec le phénylthioisocyanate pour obtenir un phénylthiohydantoïne de l’acide aminé N-terminal. La première liaison peptidique est rendue plus fragile par la substitution, de sorte qu’elle se rompt en libérant la phénylthiohydantoïne de l’acide aminé N-terminal, facilement identifiable par chromatographie. La dégradation d'EDMAN donne la possibilité d'effectuer plusieurs cycles de dégradation successifs. L’acide aminé N°2 se trouve en position N-terminale après le 1er cycle et peut agir à son tour avec le phénylthioisocyanate. Et ainsi de suite… 29 2.2.Méthodes enzymatiques Les aminopeptidases sont des exopeptidases qui hydrolysent la liaison peptidique dans laquelle est engagé l’acide aminé N-terminal. Elle n’agit pas lorsque l’acide aminé N-terminal est la proline. 3. DETERMINATION DE L'ACIDE AMINE (aa) C-TERMINAL 3.1. Méthodes chimiques Hydrazinolyse : action de l'hydrazine 12h à 100°C. Cette réaction chimique conduit à la rupture de toutes les liaisons peptidiques. Tous les résidus sont transformés en hydrazides, sauf l’acide aminé C-terminal que l’on retrouve sous forme libre, facile à isoler et à identifier. 30 3.2.Méthodes enzymatiques Les carboxypeptidases hydrolysent la liaison peptidique dans laquelle est engagé l’acide aminé C-terminal. 3.2.1. Carboxypeptidase A Elle détache les acides aminés C-terminaux acides ou neutres à l’exception de la proline. Si la séquence est -Pro-aaCt, l’acide aminé C-terminal n’est pas libéré, ou alors à une vitesse très lente. 3.2.2. Carboxypeptidase B Elle détache les acides aminés C-terminaux basiques : Arg, Lys. Si la séquence est -Pro-aaCt, l’acide aminé C-terminal n’est pas libéré, ou alors à une vitesse très lente. 4. CLIVAGES INTERNES 4.1. Clivages chimiques Bromure de cyanogène (BrCN) Il permet l’hydrolyse de la liaison peptidique du côté Carboxylique de la méthionine (Met). 31 Hydroxylamine Elle coupe la liaison Asn-Gly. N-Bromosuccinimide Il clive du côté Carboxylique de Tyr, Trp, His ou après un acide aminé contenant S dans sa chaîne latérale. Hydrolyse acide partielle L’hydrolyse acide partielle est réalisée par exemple, pendant 48H à 40°C en utilisant de l’acide formique. Elle génère des coupures au hasard. Cette hydrolyse conduit à des peptides de différentes longueurs en fonction de la sévérité du traitement acide. 4.2. Coupures enzymatiques NB. Les liaisons dans lesquelles intervient la proline ne sont en général pas clivées par les enzymes. Trypsine (très spécifique) La trypsine clive naturellement du côté carboxylique des résidus Arg et Lys, mais également du côté carboxylique de AE-Cys si la chaîne latérale -CH2-SH du résidu Cys a été modifiée en -CH2-S-CH2-CH2-NH3+ par l'éthylène imine. Chymotrypsine Elle clive du côté carboxylique de Tyr, Trp, Phe essentiellement (mais parfois également de Leu, Met, Asn, Glu). Clostripaïne Elle clive du côté carboxylique de Arg. 32 II - EXERCICES Exercice 1 : On dispose d’une solution stock de peptide P dont on peut tirer des fractions aliquotes permettant de traiter le peptide par différents réactifs. 1- Un peptide P est traité par le chlorure de dansyle puis soumis à une hydrolyse acide totale. La chromatographie du mélange obtenu permet de caractériser les composés suivants : DANS-Ser, Tyr, Cys, Lys, Asp, Gly. 2- Le traitement de ce peptide P par la carboxypeptidase A permet d'identifier successivement Gly et Tyr. 3- L'action de la chymotrypsine sur P, suivie de celle du chlorure de dansyle puis d'hydrolyse acide fournit un mélange d'acides aminés dont 3 sont dansylés (Ser, Lys, Gly). 4- Après action de la trypsine sur P, on obtient 2 peptides A et B. - Le peptide A donne 3 acides aminés après l'hydrolyse acide et 4 acides aminés après l'hydrolyse alcaline. Soumis à la dégradation d'Edman, ce peptide A donne successivement les PTH de Ser et Asp. - Le peptide B, après action du chlorure de dansyle, donne DANS-Cys. Quelle est la séquence du peptide ? Exercice 2 On dispose d’une solution stock de peptide P dont on peut tirer des fractions aliquotes permettant de traiter le peptide par différents réactifs. 1- Un peptide P traité par le DNFB puis par hydrolyse acide donne le mélange suivant : DNP-Ala (2), Phe (2), Lys (2), Cys (2), Met. Une hydrolyse alcaline conduit au même rapport. 2- L'action de la trypsine sur le peptide P donne 2 peptides T1 et T2. 3- L'action du chlorure de dansyle donne : - Sur T1 : DANS-Ala - Sur T2 : DANS-Phe + DANS-Ala 4- L’action du 2-mercaptoethanol sur T 2 donne 2 peptides M1 et M2. - Sur M1 : la carboxypeptidase A libère un AA qui absorbe dans l’UV; le chlorure de dansyle donne le DANS-Phe. - Sur M2 : le bromure de cyanogène donne 2 dipeptides, l'un formé d'Ala et Met, l'autre qui donne Cys et Lys lorsqu'il est soumis à l'action de la carboxypeptidase B. Quelle est la séquence du peptide ? 33 Exercice 3 On dispose d’une solution stock de peptide P dont on peut tirer des fractions aliquotes permettant de traiter le peptide par différents réactifs. Ce peptide P soumis à une hydrolyse acide totale donne le mélange suivant : Ser, 2 Asp, 2 Gly, Ile, Phe, Arg, Glu, 2 Leu L’action du DNFB sur P permet d’identifier DNP-Ile. La carboxypeptidase A agissant sur P libère un acide aminé dépourvu de carbone asymétrique. L’hydrolyse enzymatique du peptide P par la chymotrypsine donne un hexapeptide B de pHi voisin de 6,5, et un pentapeptide C de pHi voisin de 3,25. Le mélange B + C est déposé à pH = 1,5 sur une résine échangeuse de cations et élué par un gradient de pH allant de 1,5 à 8. L’hexapeptide B n’est repéré qu’après addition de ninhydrine à une partie aliquote des fractions éluées, après développement d’une coloration violette à 570 nm. 1. Représenter le profil d’élution de la chromatographie en superposant sur le même graphe : A280nm = f(fractions éluées) et A570nm = f(fractions éluées). Trois cycles successifs d’addition de phénylisothiocyanate au peptide B libèrent successivement PTH-Asp, PTH-Leu puis PTH-leu. La protéolyse de B par la trypsine libère un dipeptide comprenant un acide aminé hydroxylé à chaîne courte. La réaction d’Edman sur le peptide C donne successivement PTH-Ile, PTH-Asn puis PTH-Glu 2. Donner la séquence du peptide P. 34 CONFORMATION DES PROTEINES Notions à acquérir : - structure primaire, secondaire, tertiaire et quaternaire - notion de domaine - les différents types d'interactions entre 2 molécules biologiques, notamment protéine / protéine - rôle des agents dénaturants sur la conformation des protéines - rôle des agents réducteurs I - COMPLEMENTS THEORIQUES La séquence en acides aminés reliés entre eux par les liaisons peptidiques, constitue la structure primaire d’une protéine. Certains acides aminés s’organisent localement dans l’espace en structures secondaires dont les plus communes sont les hélices alpha et les feuillets béta. Ces structures secondaires sont établies grâce à des liaisons hydrogènes entre les groupements amides et carboxyl des acides aminés impliqués. En outre, les protéines adoptent une structure tridimensionnelle qui leur est propre. Celle-ci est maintenue par de nombreuses liaisons autres que peptidiques (structures II et III). Qui plus est, une protéine est parfois constituée de plusieurs sous-unités protéiques (structure IV). 1. NATURE DES LIAISONS INTERVENANT DANS LA STRUCTURE SPATIALE DES PROTEINES Pont disulfure Cette liaison covalente ( > 400 KJ.mol-1) se forme par oxydation de deux groupements thiols (-SH). Elle participe surtout à la stabilité à l'intérieur d'une protéine, mais elle peut aussi contribuer à l'élaboration d'une structure quaternaire (association de plusieurs chaînes polypeptidiques). Les liaisons disulfure sont stables mais peuvent être rompues par des agents réducteurs tels que le dithiothréitol et le 2-mercaptoéthanol. La réaction est réversible, à moins de la compléter par une seconde étape d'alkylation (-SH transformé en –SR, ne pouvant plus s’oxyder) à l'aide d'agents spécifiques (acide iodoacétique, iodoacétamide). Liaison ionique Cette liaison faible de nature électrostatique s'établit entre deux groupements de charge opposée. La force des liaisons ioniques dépend fortement de la force ionique du milieu environnant: plus celle-ci augmente, plus les liaisons ioniques seront faibles. Par ailleurs, les variations de pH vont, bien entendu, avoir une incidence sur la nature des charges et donc sur la formation et la stabilité de ces liaisons. Enfin, la constante diélectrique du milieu influe également sur la stabilité de la liaison ionique : celle-ci est affaiblie dans un milieu polaire, renforcée dans un milieu hydrophobe. Ce type de liaison peut s’avérer être forte (80 KJ.mol -1) dans les meilleures conditions, mais elle est souvent atténuée par la forte solvatation des ions. Elle n’est généralement pas indispensable au maintien de la conformation des protéines. 35 Liaison Hydrogène Cette liaison faible électrostatique (12 à 30 KJ.mol-1) peut être établie lorsque des atomes électronégatifs (O, N) partagent un atome d'Hydrogène, lui-même lié à un atome électronégatif. Il s'agit d'une interaction entre deux dipôles électriques, C=O et N-H par exemple, dont les atomes portent des charges électriques partielles. L'interaction est la plus forte lorsque les deux dipôles sont alignés donc lorsque les 4 atomes sont colinéaires. Les liaisons H peuvent être détruites par les agents chaotropiques tels que l'urée ou le chlorure de guanidine. Liaisons de van der Waals Ces liaisons faibles électrostatiques (<10 KJ.mol-1) rassemblent des interactions entre molécules électriquement neutres de types dipôle permanent ou dipôle induit. Par exemple, il s'agit d'interaction entre deux dipôles permanents, C=O, dont les atomes portent des charges électriques partielles ou entre un dipôle permanent C=O et un dipôle induit, CH3, par le voisinage du C=O. Interaction hydrophobe Cette interaction faible résulte de la proximité de groupements hydrophobes (ou apolaires) portés par les chaînes latérales de certains acides aminés (Ala, Val, Leu, Ile, Phe) qui forment des régions hydrophobes. La force de l’interaction est fonction du degré de recouvrement des zones hydrophobes. Ces interactions hydrophobes ont une influence majeure sur l’acquisition et la stabilisation de la conformation native finale des protéines. Ces interactions peuvent être facilement détruites par l'ajout de détergents mais les agents chaotropiques ont aussi un effet sur elles. 2. DENATURATION DES PROTEINES La dénaturation d'une protéine résulte d'une désorganisation de sa conformation tridimensionnelle, par rupture des liaisons faibles essentiellement. Elle se traduit souvent par une perte de solubilité (précipitation). Celle-ci peut être provoquée par différents agents tels que la température, le pH, les détergents, les solvants organiques, l'urée, etc... La dénaturation peut être réversible ou irréversible, selon l'importance de la désorganisation moléculaire et la complexité de la protéine. La dénaturation par la chaleur est généralement irréversible, alors que la dénaturation par des agents plus spécifiques tels que l'urée est parfois réversible. NB: si la dénaturation des protéines provoque souvent leur précipitation, ceci ne veut pas dire que précipitation soit synonyme de dénaturation. - L'exemple le plus classique est l'effet du sulfate d'ammonium à concentration saturante. Celui-ci diminue l'état de solvatation des protéines qui s'associent et précipitent (effet de relargage). Ce phénomène est réversible et les protéines gardent généralement leur intégrité après élimination du sel d'ammonium (effet de salting out). - Un autre exemple est celui de certaines protéines qui précipitent spontanément dans un tampon de pH égal à leur point isoélectrique. 36 Remarque : Dans le cas de molécules protéiques, lorsque l’on parle de masse molaire, on exprime souvent cette masse en Daltons (Da), plutôt qu’en grammes par mole (g.mol-1), même si cette dernière unité est correcte. Le Dalton équivaut au douzième de la masse d’un atome de carbone 12, et exprime la masse d’un atome d’hydrogène. Il est égal à 1,66.10-27 kg. Ainsi, une protéine de masse molaire égale à 75.000 g.mol-1 aura une masse égale à 75.000 Da ou encore 75 kDa. II - EXERCICES Exercice 1 : À partir de l’ossature polypeptidique représentée ci-dessous : Sélectionner un groupement carbonyle (C= O) et attribuer au carbone α portant ce groupement, la chaîne latérale de la phénylalanine en la dessinant. 2. Sélectionner un groupement amine (N- H) et attribuer au carbone α portant ce groupement, la chaîne latérale de la cystéine en la dessinant. 3. Quels sont les atomes de l’ossature polypeptidique concernés par les liaisons hydrogène dans une hélice α ? 1. Exercice 2 : Un polypeptide de synthèse constitué de résidus aspartate adopte une conformation en hélice α au-dessous de pH = 3 et un repliement au hasard à pH = 7. 1. Donner la formule développée de l’aspartate à pH = 7. 2. Expliquer la raison de cette transition conformationnelle dépendante du pH. Donnée : le pKa de la chaîne latérale de l’aspartate est de 3,86. 37 Exercice 3 : On analyse l’hémoglobine humaine par une méthode classique de détermination du résidu N-terminal. Qualitativement, on n’obtient qu’un acide aminé, la valine. Quantitativement, en partant de 0,3 mg de protéine (masse molaire 60 000 g.mol-1), on obtient 20 nanomoles de valine. 1. Donner le nom d’une méthode d’identification du résidu N-terminal. 2. Compléter le tableau ci-dessous. Vrai Faux L’expérience ne permet pas de le déterminer L’hémoglobine est constituée d’une seule chaîne polypeptidique. L’hémoglobine est constituée de plusieurs chaînes polypeptidiques dont les acides aminés N-terminaux sont identiques. L’hémoglobine est constituée de plusieurs chaînes polypeptidiques différentes. L’hémoglobine est constituée de plusieurs chaînes polypeptidiques identiques. L’hémoglobine est constituée de 4 chaînes polypeptidiques. Exercice 4 : L’acide aminé cystéine (R-SH) réagit avec le DTNB (Y-S-S-Y) selon la réaction suivante d’échange thiol / disulfure : R-SH + Y-S-S-Y R-S-S-Y + HS-Y Le produit de la réaction HS-Y s’ionise à pH basique en anion Y-S –, coloré en jaune et présentant une absorption maximale à 412 nm. 1- Dans un premier temps, un test qualitatif au DTNB est effectué sur une protéine P inconnue que l’on cherche à caractériser. tubes protéine P à 1 mg.mL-1 dans tampon pH8 (mL) Urée 8M (mL) SDS 1% (mL) 5 min à100°C Eau distillée (mL) DTNB 100 mM (mL) Résultats : Coloration jaune 1 0,8 2 0,8 3 0,8 4 0,8 non 0,1 0,1 - 0,1 non 0,1 +++ 0,1 non 0,1 +++ oui 0,1 0,1 +++ Quel est le tube témoin ? Cette protéine P contient-elle des cystéines ? Justifier. 5 _ non 0,9 0,1 - 38 Grâce à l’interprétation de ces résultats, que pouvez-vous conclure à propos de la conformation spatiale de cette protéine ? 2- On se propose de déterminer le nombre de groupements thiol de cette protéine P (M = 43 000 g.mol-1 ) purifiée, de concentration 1 mg.mL-1. Le volume total du test est de 1mL (tampon pH 8 + produit à tester + DTNB 10mM) et le trajet optique des cuves utilisées pour les lectures d’absorbance à 412 nm est de 1 cm. 2.1. Une courbe d’étalonnage est réalisée à partir de L-cystéine 0,1 mM. L-cystéine 0,1 mM (mL) 0,1 0,2 0,3 0,5 A à 412 nm 0,135 0,270 0,409 0,681 Tracer la courbe d’étalonnage A412nm = f(nmol de Cys). Quelles informations pouvez-vous obtenir à partir de cette courbe d’étalonnage ? 2.2. La protéine P (1 mg.mL-1) à étudier subit maintenant différents traitements : Un traitement par le DTNB de 600µL de protéine native. A412nm après traitement = 0,009. Une dénaturation par l’urée ou le SDS de 200 µL de protéine puis traitement par le DTNB . A412nm après traitement = 0,064. La protéine est traitée par le 2-mercaptoéthanol en présence de SDS, puis extensivement dialysée de façon à éliminer toute trace de l’agent réducteur. 50 µL de la protéine dialysée après addition de DTNB donne A412nm = 0,078. Commentez les résultats expérimentaux. Que pouvez-vous dire en ce qui concerne le nombre et l’accessibilité des fonctions thiol de cette protéine ? 39 Manipulation de structures sur ordinateur Préambule : Dans le cadre de ce TD d'initiation à la biologie structurale, vous allez naviguer dans un site spécialement conçu à destination des étudiants. Le site utilisé en TD permet de manipuler des structures grâces à la pré-installation d'un plugin gratuit : Chime Quelques commandes pour le maniement des structures avec le logiciel Chime Action MENU Rotate X,Y Translate X,Y Rotate Z Zoom Coupe dans un plan Windows NT Right Left Ctrl-Right# Shift-Right Shift-Left Ctrl-Left De nombreuses options utiles à la manipulation et à la représentation des éléments de structures sont accessibles par les menus visualisables avec le clic droit de la souris. Répondre aux questions à partir de l'observation et de la manipulation des structures du site sur votre poste de travail... Exercice 1 : La liaison peptidique : (dans le menu principal, cliquer sur 1.1.3. exemple puis encore sur le lien liaison peptidique ……) Observation et réprésentation : A partir de la structure 3 D, schématiser la structure chimique présente à l'écran. Identifier le coté Nterm et le coté Cterm Identifier dans votre schéma les chaînes latérales Valine et Asparagine. Mesurer les longeurs des différents types de liaisons C-C ; C=O et C-N Que remarquez vous et comment pouvez vous interpréter vos observations ? Exercice 2 : les structures secondaires 1. L'Hélice α (dans le menu principal, cliquer sur 2.3.1 l'hélice α puis encore sur le lien les hélices α) 40 Par rapport à l'axe de l'hélice, dans quelle direction pointent les chaînes latérales des acides aminés ? En regardant l'hélice par le haut, pouvez-vous faire une observation particulière en ce qui concerne l'hélice présentée ? Faire apparaître les liaisons H qui stabilisent l'hélice. Mesurer la distance entre les atomes donneur et accepteur d'une liaison H et la comparer aux distances entre deux atomes impliqués dans une liaison covalente. Quels sont les types de groupements impliqués dans les liaisons H de cette hélice ? Donner le nom et le numéro des atomes impliqués dans la première liaison H situé du coté Nterminal de l'hélice. Combien y a t il de résidus par tour ? 2. Les feuillets β (Ouvrir une deuxième fenêtre de votre navigateur avec le menu principal du site. Partagez l'écran de manière équivalente avec les deux fenêtres. Fenêtre de gauche :dans le menu principal, cliquer sur 2.3.2 les feuillets β puis encore sur le lien les feuillets β anti-parallèles Fenêtre de droite :dans le menu principal, cliquer sur 2.3.2 les feuillets β puis encore sur le lien les feuillets β parallèles) Comment sont positionnées les chaînes latérales vis à vis du feuillet ? Quelle différences peut-on voir dans le réseau de liaison H entre un feuillet parallèle et un feuillet antiparallèle? Exercice 3 : la structure tertiaire Exemple d'une sous-unité de l'hémoglobine de Caudina arenicola (le concombre de mer). (dans le menu principal, cliquer sur 3.2.1 Repliement majoritaire en hélice α puis encore sur le lien l'hémoglobine de Caudina…….) Trouver une représentation permettant de simplifier l'observation de l'architecture de cette protéine. Où se trouvent majoritairement les résidus hydrophobes dans la structure ? Où se trouvent majoritairement les résidus polaires ? Comment pouvez-vous expliquer cela ? Analyse structurale et fonctionnelle : Il existe un cofacteur dans cette protéine : le localiser et choisir une représentation permettant de le visualiser. Faire un schéma de sa structure. Quel est l'atome central présent dans ce cofacteur qui est crucial pour la fonction de l'hémoglobine ? Dans cette structure, quel est le ligand fixé sur ce cofacteur ? Dans quelle situation physiologique sommes-nous ? 41 METHODES DE SEPARATION Notions à acquérir : - dialyse - précipitation des protéines par les sels ou les solvants organiques - chromatographies d'absorption mono et bidimensionnelles sur différents supports - centrifugation - filtration sur gel - chromatographie par échange d'ions - électrophorèse sur gel natif ou en conditions dénaturantes I - COMPLEMENTS THEORIQUES CHROMATOGRAPHIES Cas des acides aminés, peptides, protéines. La chromatographie est une méthode qui permet d'obtenir des molécules de haute pureté. Le mot chromatographie veut dire en grec "écrire en couleur ". Cette définition s'explique par les manipulations du botaniste Mikhail Tswett (1904) qui inventa le terme : il réalisa la chromatographie d'un extrait éthéré de feuilles vertes renfermant des carotènes, des chlorophylles et des xanthophylles. Tswett monta une colonne de CaCO3 sur laquelle il déposa l'extrait, puis il fit passer sur la colonne un solvant éthéré. Cette élution fit apparaître plusieurs bandes colorées, d'où le terme chromatographie. 1. DEFINITIONS Toute chromatographie repose sur la distribution des composants d'un mélange entre deux phases, avec la particularité que l'une des deux phases est fixée sur un support inerte et prend le nom de phase stationnaire (solide ou liquide fixé). La seconde phase prend le nom de phase mobile (liquide ou gaz), ou éluant, car elle migre sur le support en contact avec la phase stationnaire. 42 A Particule absorbant la phase stationnaire Phase stationnaire A A A : Substance à chromatographier A A A A Phase mobile - élution : opération visant à déplacer une substance retenue par un support quelconque à l'aide d'un solvant. On parle aussi de l'élution de la substance. - éluat : la substance déplacée, " éluée", s'appelle l'éluat. - éluant : le solvant qui sert à éluer s'appelle l'éluant. - effluent : liquide sortant de la colonne. - coefficient de partage κ : définit la distribution entre deux solvants non miscibles. Il s'agit du rapport de la concentration d'une substance dans la phase stationnaire à sa concentration dans la phase mobile (Cs/Cm). 2. DIFFERENTS TYPES DE CHROMATOGRAPHIE Les facteurs qui interviennent dans le partage des molécules à séparer entre les phases fixe et mobile sont : - la solubilité dans un solvant liquide - la taille (la forme) - la polarité - la charge électrique - la présence de groupements d’atomes formant des sites particuliers Les différents types de chromatographie résultent du fait que l’on a privilégié l’effet d’un de ces facteurs, mais l’exclusivité du mécanisme n’est jamais totale au cours d’une séparation chromatographique. Chromatographie de partage : chromatographie liquide-liquide Le principe est simple : deux substances A et B peuvent se dissoudre à des concentrations différentes dans 2 solvants non miscibles. Dans l'un des 2 solvants, il y aura plus de substance A par exemple et dans l'autre, plus de substance B. C'est le début d'une séparation. Chromatographie d'adsorption : chromatographie liquide-solide Un support (solide polaire) adsorbe plus ou moins certains composés, ce qui conduit à une séparation de ceux-ci. Lors de l'élution, les uns sont retardés, d'autres le sont moins et certains ne le sont pas du tout. 43 Chromatographie échangeuse d'ions : La phase stationnaire est un échangeur d’ions qui est constitué par une résine porteuse de groupements ionisés négativement ou positivement, exerçant des interactions de type électrostatique avec les solutés ioniques du milieu. + Phase mobile A A B +++++++++++++++ Phase stationnaire Chromatographie d’exclusion : Elle est encore appelée chromatographie d’exclusion-diffusion, tamisage moléculaire, filtration sur gel. Cette chromatographie est une technique qui permet une séparation simple et rapide des molécules solubles dans l’eau ou certains solvants organiques, en fonction de leur taille, donc de leur masse molaire. La forme de la molécule intervient également, c’est pourquoi on parle de masse molaire apparente. La phase stationnaire est un solide poreux : les grosses particules du mélange sont exclues de la phase fixe, alors que les petites particules diffusent dans les pores du gel. Chromatographie d'affinité La phase stationnaire est un support macromoléculaire chimiquement inerte, sur lequel est greffé un effecteur qui présente une affinité pour un soluté de l’échantillon à analyser (affinité enzyme-substrat, anticorps-antigène, ligand-récepteur…) B A B B Phase mobile X XA X Phase stationnaire Remarque importante : notion de capacité Un système chromatographique donné ne sera efficace que si les quantités de composés à séparer ne dépassent pas un certain seuil, au delà duquel les composés ne seront plus séparés : le système sera dit saturé. Par exemple, dans le cas de la chromatographie échangeuse d'ions, la capacité s'exprime en quantité d'équivalents échangeables par mL (ou par g) d'échangeur. Expérimentalement, il est prudent de s'assurer que la capacité du système chromatographique permette de traiter de 5 à 10 fois plus que le nombre d'équivalents que l'on désire fixer. 44 ELECTROPHORESE L'électrophorèse permet de séparer les protéines selon leur charge et / ou selon leur taille. Le principe consiste à déposer le mélange à fractionner sur un gel (polyacrylamide le plus souvent) équilibré dans un tampon donné, puis de soumettre le système à un champ électrique. On distingue plusieurs sortes d'électrophorèse appliquées aux protéines, les principales étant : - L'électrophorèse en gel de polyacrylamide dans des conditions natives : les protéines sont alors séparées selon leur charge globale au pH considéré et selon leur taille. - L'électrophorèse en gel de polyacrylamide dans des conditions dénaturantes : elle permet de séparer les protéines selon leur taille. L'échantillon est traité par un détergent (le S.D.S. ou sodium dodécyl sulfate) et par un agent réducteur (β-mercaptoéthanol) destiné à rompre les ponts disulfure si nécessaire. - La focalisation isoélectrique (ou isoélectrofocalisation) : le gel de polyacrylamide est imprégné d'ampholines qui sous l'action du champ électrique forment un gradient de pH. Les protéines migrent dans la zone de leur pHi où elles se concentrent. Cette technique permet donc de distinguer les différentes protéines constitutives d'un mélange selon leur pHi. Bien que les différentes techniques d'électrophorèse soient essentiellement appliquées à des fins d'analyse, elles sont parfois utilisées pour la purification de protéines en faible quantité. II - EXERCICES Exercice 1 : On veut séparer l'acide glutamique, la leucine et la lysine par chromatographie sur une résine DOWEX 50x8 (polystyrène sulfoné R-SO3- H+) équilibrée à pH 4. Les points isoelectriques de l'acide glutamique, de la leucine et de la lysine sont respectivement : 3,22 ; 5,98 et 9,74 à 25°C. Ces 3 acides aminés sont dissous dans un tampon de pH 4 et déposés sur la colonne. On fait ensuite passer successivement sur la colonne un tampon de pH 4,0 puis un tampon de pH 7,0. Quels sont les acides aminés élués et dans quel ordre ? Exercice 2 : Récemment, on a mis en évidence une nouvelle protéine enzymatique E dont l'inactivation est la cause d'une maladie héréditaire très rare. Dans le but de lutter contre cette maladie, un scientifique décide de caractériser les formes active (E) et inactive (Ei) de l'enzyme. La masse molaire approximative de E et Ei natives a été estimée à 287 000 g.mol-1 (± 9000). 1- Donner le nom d’une technique pouvant vous apporter ce résultat. Pour affiner ces données, le chercheur dépose ensuite les protéines E et Ei sur un gel de polyacrylamide en présence de SDS et selon le cas, sans (pistes 2 et 3) ou avec (pistes 4 et 5) 2-mercaptoéthanol en excès. Des marqueurs de poids moléculaire sont déposés dans la piste 45 1. Après coloration des protéines au bleu de Coomassie, il obtient le profil d'électrophorèse suivant : Piste 1 Piste 2 : E Piste 3 : Ei Piste 4 : E Piste 5 : Ei dépôts Les marqueurs de poids moléculaire utilisés sont les suivants : myosine 200 000 g.mol-1 ; βgalactosidase 120 000 g.mol-1 ; albumine du sérum de bœuf 70 000 g.mol-1 ; ovalbumine 40 000 g.mol-1 ; trypsine 24 000 g.mol-1 ; myoglobine 16 000 g.mol-1. 2- Rappeler le principe d'une électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS (sodium dodécyl sulfate), en précisant le rôle du SDS. Qu'est-ce que le 2-mercaptoéthanol ? Quel est son rôle ? 3- Tracer le graphe : log Masse molaire = f (distance de migration). 4- Donner la ou les masses molaires des chaînes polypeptidiques des pistes 2, 3, 4 et 5. 5- Que pouvez-vous déduire en termes de structure des pistes 2 et 3 ? 6- Que pouvez-vous déduire en termes de structure des pistes 4 et 5 ? Le chercheur veut isoler les constituants des protéines E et E i pour procéder à une caractérisation enzymatique de l'origine de l'inactivation. Pour cela, il met chaque protéine E et Ei en présence d'urée et de 2-mercaptoéthanol, avant de les déposer à la surface de deux colonnes de gel filtration contenant chacune un gel ayant comme domaine de fractionnement 110 000 - 60 000 g.mol-1. À l’issue de cette chromatographie, le scientifique obtient trois pics d'élution pour chaque colonne. Il récupère un seul pic dans le domaine de fractionnement du gel et le nomme Pic E (et Pic Ei dans le cas de la protéine inactive). 7- Comment interprétez-vous les valeurs du domaine de fractionnement ? 8- Comment désigne-t-on les volumes caractéristiques correspondant à chacun des deux pics qui ne sont pas élués dans le domaine de fractionnement ? Que contiennent-ils ? 9- Dans cet exemple d'utilisation, est-il nécessaire d'étalonner la colonne avec des protéines dont les masses molaires apparentes sont connues ? Justifier votre réponse. 10- Justifier l'existence d'un seul pic d'élution dans le domaine de fractionnement. 46 La caractérisation enzymatique nécessite l’utilisation d’une protéine ayant une configuration native permettant l’activité enzymatique. 11- Justifier l’utilisation d’urée à la place de SDS. 12- Doit-on effectuer une dialyse du pic E (ou Pic Ei ) pour éliminer l’urée et le 2mercaptoéthanol ? La caractérisation enzymatique met en évidence que le pic E est responsable de l’activité enzymatique de l’enzyme et qu’il n’est pas fonctionnel dans le cas de Ei. Pour connaître l'origine de l'inactivation de l'enzyme, le chercheur effectue une hydrolyse spécifique au bromure de cyanogène du pic E obtenu à partir de la protéine normale et obtient alors trois fragments : un long peptide et deux pentapeptides dont le séquençage révèle les structures primaires suivantes. peptide A : glycyl aspartyl glycyl séryl méthionine peptide B : cystéyl glycyl phénylalanyl alanyl lysine. 13- Ecrire à pH 1,2 les formules simplifiées de ces deux peptides en ne faisant apparaître que les fonctions ionisables. 14- Calculer leur pHi respectif. données : pKαCOOH = 2 ; pKαNH2 = 9 ; pKCOOH chaîne latérale = 4 ; pK chaîne latérale Lys = 10; pKSH = 8 15- Proposer une méthode pour récupérer séparément les peptides A et B. 16- L'étude des peptides obtenus dans le cas de la protéine anormale révèle deux peptides Ai et Bi de pHi respectifs 3 et 5. Proposer une explication sur l'origine de l'inactivation de l'enzyme. Exercice 3 : Un extrait enzymatique commercial solide (poudre) contient 1 g de glucose contaminant. L'enzyme présente une masse de 40.000 daltons (Da). On souhaite éliminer le glucose par dialyse (glucose MM = 180 g.mol-1). 1- On dispose de deux types de tubes de dialyse dont les seuils de coupure sont de 10 kDa et 100 kDa. Quel tube va-t-on choisir et pourquoi ? 2- La totalité de l'extrait est dissous dans un volume final de 5 mL d'un tampon, introduit dans le tube de dialyse et mis à dialyser contre 100 mL du même tampon. L'ensemble est mis sous agitation une nuit à 4°C. Combien de glucose aura-t-on éliminé au terme de cette dialyse? 3- L'élimination du glucose aurait-elle été meilleure ou moins bonne si on avait dissous l'extrait protéique dans un volume de tampon de 1 mL ? On considérera que la concentration en protéines est faible et ne participe pas au phénomène d’osmose. De même, on considérera que le volume de solution dans le tube de dialyse reste constant (5 mL). 47 Exercice 4 : 1. Rappeler la structure de la cystéine. 3. Equilibrer la réaction suivante en milieu oxydant en écrivant la formule développée du ou des produits obtenus. cystéines 3. Citer les molécules réductrices que vous connaissez et faire apparaître le groupement chimique caractéristique commun à ces molécules. Un chimiste synthétise un support chromatographique constitué d’un noyau insoluble sur lequel est greffé un bras chimique de type – (CH2)8-SH et vous offre une colonne remplie de ce support. 4. Parmi les 3000 protéines de la bactérie Escherichia coli, quelles sont celles qui sont susceptibles d’être retenues sur ce support chromatographique ? Par quel type de liaison sontelles retenues ? Dès que l’échantillon protéique a pénétré dans la colonne, celle-ci est alimentée en permanence par une solution tamponnée à pH 7,5. Des fractions de 1 mL sont recueillies automatiquement dans des tubes disposés sur un collecteur de fractions. 5. Quel moyen utiliseriez-vous pour repérer les protéines éluées, non retenues par le support ? 6. Quel signal utiliseriez-vous pour arrêter l’élution et passer à l’étape de récupération des protéines liées au support chromatographique ? 7. Comment procèderiez-vous pour éluer ces protéines ? 8. En admettant que les protéines du mélange initial ne présentent aucune interaction avec la structure non spécifique du support chromatographique, combien de fraction(s) vous attendezvous à récupérer ? Quel(s) type(s) de protéine(s) contiendront-elles ? 48 Thème n°5 LIPIDES ------------------- 49 Notions à acquérir : - formule générale d'un acide gras saturé ou insaturé - glycérolipides, sphingolipides, stéroïdes - nature des liaisons mises en jeu - régions hydrophobe et hydrophile - micelles - membranes biologiques EXERCICES Données : acide oléïque : C18:1 (9) ou C18 ∆ 9 acide stéarique : C18:0 acide palmitique : C16:0 acide linoléïque : C18:2 (9,12) ou C18 ∆ 9-12 acide linolénique : C18:3 (9,12,15) acide laurique : C12:0 acide arachidonique : C20:4 (5,8,11,14) Exercice 1 : 1. Donner la formule chimique semi-développée des lipides suivants, à pH physiologique : 2 stéaryl dipalmityl glycerol, 1 linolényl 2 linoléyl 3 lauryl glycérol 1 lauryl 2 palmitoléyl 3 β-D-galactosyl glycérol 1 oléyl 2 linoléyl phosphatidique ; 1 palmityl 2 stéaryl phosphatidyl – sérine ; 1 arachidonyl 2 stéaryl phosphatidyl – éthanolamine ; 2. Classer ces lipides. 3. Quelle est leur fonction ? 4. Où les trouve-t-on particulièrement représentés ? 5. Entourer les régions hydrophobes et hydrophiles au sein de chacun de ces lipides. 6. A partir des lipides constituant les membranes biologiques, schématiser une bicouche phospholipidique en les plaçant convenablement les uns par rapport aux autres et en précisant la nature des interactions qui les relient. Exercice 2 : Un individu mange une raclette au lait cru (45% de matières grasses/ extrait sec). 1. Citer les lipides majoritairement représentés dans le lait. 2. Quel est l’autre constituant majeur de l’extrait sec du lait ? 50 La digestion s’effectue en plusieurs étapes le long du tube digestif, de la bouche à l’anus. Le bol alimentaire subit des actions mécaniques (broyage, malaxage) et des actions chimiques accélérées par différentes enzymes. Ainsi les macromolécules ingérées sont transformées en nutriments qui peuvent alors être absorbés par la paroi intestinale de l’intestin grêle. 3. Où se passe la majeure partie de la digestion des lipides ? Le malaxage effectué en amont a permis de fractionner la phase hydrophobe contenant les lipides, sous forme de gouttelettes de 1 à 2 µm de diamètre en suspension dans la phase hydrophile contenant les protéines : on parle d’émulsification. Les enzymes lipolytiques sont des molécules hydrosolubles qui fonctionnent à la surface de la phase hydrophobe. La lipase pancréatique catalyse l’hydrolyse de la première et la troisième liaison ester des triglycérides. 4. Ecrire les réactions d’hydrolyse catalysées par la lipase pancréatique sur le triglycéride suivant : le di-palmityl 3 oléyl glycérol. 5. Entourer les régions polaires et apolaires de chacun des produits obtenus. D’autres types de lipides sont présents dans le lait comme les phospholipides et les vitamines A et D. La phospholipase A2 pancréatique catalyse l'hydrolyse d'esters d'alcools secondaires des phospholipides comme la phosphatidylcholine. O O H 3C ( C H 2 )7 C H C H (C H 2 )7 C H 2C O O C H C H ( C H 2 )1 6 C H 3 C H O O 2 C P o O H ( C H 2 )2 + 3 N C H C H 3 3 6. Entourer et nommer chaque constituant de la molécule ci-dessus. 7. Ecrire de façon schématique l’équation, équilibrée à pH=7, de la réaction catalysée par la phospholipase A2 sur la phosphatidylcholine. Les produits libérés par ces enzymes ne sont pas assez polaires pour être absorbés directement et les gouttelettes de 1µm de diamètre sont trop grosses pour permettre l’absorption des lipides. La formation de micelles de très petite taille (20 à 50 nm) est requise pour permettre un contact étroit entre les lipides à absorber et la paroi intestinale. Pour cela les régions polaires des molécules participant à la formation des micelles sont tournées vers le milieu aqueux, tandis que les régions apolaires le sont vers l’intérieur de la micelle. 8. Quelles sont les molécules sécrétées par la vésicule biliaire, indispensables à la formation et à la stabilisation de ces micelles ? 9. Quel est le pré requis structural indispensable à ces molécules pour exercer leur fonction ? 10. Faire le schéma d’une micelle contenant les molécules trouvées à la question 8 et les produits de dégradation enzymatique obtenus aux questions 4 et 6. 51 Exercice 3 : la bicouche lipidique des membranes biologiques La membrane plasmique des cellules de Schwann, forme la gaine de myéline autour des axones de certains neurones. Cette membrane plasmique est particulièrement riche en un type de lipides appartenant à la catégorie des sphingolipides. L’objectif de ce problème est de trouver la structure d’un sphingolipide pour le placer correctement au sein d’une membrane biologique représentant la base de la gaine de myéline. Le constituant de base des sphingolipides est la sphingosine. CH3 (CH2)12 CH = CH CH(OH) CH CH2OH NH2 La sphigosine est amidifiée (formation d'une liaison amide) par un acide gras pour former une céramide. 1. Écrire la formule semi développée en numérotant les carbones de l'acide gras suivant : Acide oléique : C18:1 ∆ 9 cis 2. Qu'est-ce qu'une liaison amide ? 3. Effectuer la formation de cette liaison amide entre la sphingosine et l'acide gras précédent pour former la céramide correspondante. Un des sphingolipides le plus abondant dans la myéline est un sphingoglycolipide, le céramide lactoside. 4. Écrire les formules selon Haworth, en numérotant les carbones, des oses suivants : β-D-glucopyranosyl et β-D-galactopyranosyl. 5. Effectuer la liaison glycosidique pour obtenir le diholoside suivant : β-D-galactopyranosyl (1 → 4) β-D-glucopyranose Les sphingoglycolipides sont des dérivés glycosylés de la céramide. La céramide s’associe à des sucres grâce à l’établissement d'une liaison glycosidique. 6. Entourer en rouge la liaison alcool primaire de la céramide obtenue précédemment. 7. Pour établir la formule semi développée du céramide lactoside, effectuer la liaison glycosidique entre la fonction alcool primaire de la céramide et la fonction OH libre portée par le carbone 1 du glucose au sein du diholoside. Les sphingoglycolipides possèdent une partie polaire, hydrophile et une partie apolaire, hydrophobe. Ces deux parties sont spatialement distinctes et permettent aux glycosphingolipides d'adopter une organisation en bicouche lipidique. 8. Quelles sont les propriétés d'une molécule (ou partie de molécule) polaire ? 9. Réécrire la formule du céramide lactoside obtenu en ordonnant la molécule de façon à mettre d'un côté, la partie apolaire et de l'autre, la partie polaire. Entourer la partie polaire en bleu. 10. Qu'est-ce qu'une liaison hydrogène ? 11. Écrire, à partir de la formule demandée dans la question 7, des exemples de liaison hydrogène s'établissant entre le céramide lactoside et deux molécules d'eau. 52 12. Légender le modèle de bicouche lipidique ci-dessous, en situant les zones polaires et apolaires, les compartiments cytoplasmique et extracellulaire dans le cas étudié de membrane plasmique. 13. Insérer la formule du céramide lactoside obtenu dans le modèle de bicouche lipidique cidessus.
