mémoire du diplôme d`études spécialisées de biologie médicale

UNIVERSITE DE NANTES
FACULTE DE MEDECINE
Année 2012 N° 132
MÉMOIRE
DU DIPLÔME D’ÉTUDES SPÉCIALISÉES DE BIOLOGIE
MÉDICALE
(Spécialité Immunologie)
Conformément aux dispositions du décret 2003-76
du 23 Janvier 2003, tient lieu de
THÈSE
POUR LE
DIPLÔME D’ÉTAT DE DOCTEUR EN MÉDECINE
par
POLI Caroline
né(e) le 20/11/1984
Présentée et soutenue publiquement le 18 Septembre 2012
Président : Monsieur le Professeur Régis JOSIEN
Directeur de thèse : Madame le Professeur Danila VALMORI et Madame le Docteur Maha
AYYOUB
Génération de lignées lymphocytaires T CD4
+
spécifiques de l’antigène
tumoral NY-ESO-1 à partir du sang périphérique de donneurs sains par
priming in vitro et utilisation de tétramères CMHII/peptide

2
SOMMAIRE
TABLE DES FIGURES ............................................................................................ 4
LISTE DES ABBREVIATIONS ................................................................................. 5
1 INTRODUCTION ............................................................................................... 8
1.1 LE TRANSFERT ADOPTIF CELLULAIRE : UNE IMMUNOTHERAPIE CIBLEE DEBUTANT IL
Y A 30 ANS .............................................................................................................................. 9
1.1.1 L’IMMUNITE ANTI-TUMORALE ................................................................................ 9
1.1.2. LE MICROENVIRONNEMENT TUMORAL ................................................................ 15
1.1.3. LE DEVELOPPEMENT DU TRANSFERT ADOPTIF CELLULAIRE DANS LE CADRE DU
MELANOME ET DES TUMEURS VIRO-INDUITES ............................................................... 18
1.1.4. LES LIMITES DU TRANSFERT ADOPTIF CELLULAIRE DE TIL ..................................... 22
1.2. PLUS RECEMMENT, LE TRANSFERT ADOPTIF CELLULAIRE DE LT CD4
+
..................... 23
1.2.1. ROLE DES LT CD4
+
DANS L’IMMUNITE ANTI-TUMORALE ....................................... 23
1.2.2. TETRAMERE CMHII ................................................................................................. 27
2 OBJECTIF ....................................................................................................... 33
3 MATERIEL ET METHODES .............................................................................. 34
3.1. ISOLEMENT DES LT CD4
+
DE DONNEURS SAINS ........................................................ 35
3.2. SELECTION DES PATIENTS DR52b+ ............................................................................ 36
3.3. MARQUAGE TETRAMERE EX VIVO ............................................................................. 36
3.4. STIMULATION IN VITRO DES SOUS-POPULATIONS LT CD4
+
TRIEES EN PRESENCE DU
PEPTIDE IMMUNODOMINANT ESO119-143 ........................................................................ 36
3.5. DETECTION DES CELLULES SPECIFIQUES DE NY-ESO-1 DANS LES CULTURES DE LT
CD4
+
PAR MARQUAGE AVEC LES TETRAMERES ................................................................... 37
3.6. GENERATION DE LIGNEES LT SPECIFIQUES DU PEPTIDE ESO119-143 ...................... 37

3
3.7.
TEST DE RECONNAISSANCE ANTIGENIQUE : TITRATION ........................................... 37
3.8. PROFIL CYTOKINIQUE DES LIGNEES LT CD4
+
SPECIFIQUES DE DR52b/ESO119-143 . 38
3.9. ALLOREACTIVITE DES LIGNEES LT CD4
+
SPECIFIQUES DE DR52b/ESO119-143 ......... 38
3.10. ANALYSES STASTISTIQUES ..................................................................................... 38
4 RESULTATS .................................................................................................... 39
4.1 PRIMING IN VITRO DE LT CD4
+
SPECIFIQUES D’ESO119-143 A PARTIR DE CELLULES
NAIVES CONVENTIONNELLES DE DONNEURS SAINS ET DETECTION PAR LES TETRAMERES
DR52b/ESO119-143 .............................................................................................................. 40
4.2 ESTIMATION DE LA FREQUENCE DES PRECURSEURS SPECIFIQUES D’ESO119-143
RESTREINTS PAR DR52b PARMI LES LT CD4
+
NAIFS DES DONNEURS SAINS DR52b+ .......... 41
4.3 GENERATION IN VITRO DE LT CD4
+
ESO/TETRAMERE+ A PARTIR DE LT CD4
+
MEMOIRES CONVENTIONNELS CENTRAUX, MAIS PAS A PARTIR DE LT EFFECTEURS
MEMOIRES, NI DE LT CD4
+
REGULATEURS ........................................................................... 43
4.4 EVALUATION FONCTIONNELLE DES LIGNEES LT CD4
+
ESO/TETRAMERE
+
GENEREES
PAR PRIMING IN VITRO ........................................................................................................ 45
4.4.1 AVIDITE FONCTIONNELLE : TEST DE TITRATION .................................................... 45
4.4.2 UTILISATION FREQUENTE DU Vβ2 PAR LES LT CD4
+
ESO/TETRAMERE+ OBTENUS
PAR PRIMING IN VITRO .................................................................................................... 47
4.4.3 SECRETION D’Il-2 ET DE CYTOKINES ASSOCIEES AU PROFIL FONCTIONNEL TH1 .. 48
4.4.4 LES LIGNEES T CD4
+
ESO/TETRAMERE+ NE RECONNAISSENT PAS DE CELLULES
DENDRITIQUES ALLOGENIQUES ....................................................................................... 50
5 DISCUSSION ................................................................................................... 51
CONCLUSION .................................................................................................... 63
BIBLIOGRAPHIE ................................................................................................ 64

4
TABLE DES FIGURES
Figure 1. "L'immunoediting” (ou revision immunologique) tumoral ...................................... 10
Figure 2. Etapes clefs des mécanismes tolérogènes tumoraux lors d’une réaction immunitaire
effectrice anti-tumorale. .......................................................................................................... 15
Figure 3. Développement du transfert adoptif cellulaire chez l’animal .................................. 18
Figure 4. Développement du transfert adoptif cellulaire chez l’humain ................................. 19
Figure 5. Méthode des « leucines zipper ». ............................................................................. 29
Figure 6. Méthode de sélection des molécules CMHII chargées en peptide grâce à la
détection du groupement histidine. ........................................................................................ 30
Figure 7. Organisation de la région HLA de classe II. ............................................................... 32
Figure 8. Plan de séparation des différentes sous-populations de LT CD4
+
par tri en
cytométrie en flux. ................................................................................................................... 35
Figure 9. Détection de LT CD4
+
spécifiques d’ESO119-143 chez les donneurs sains. .............. 41
Figure 10. Quantification en ex vivo des L T CD4
+
ESO/tétramère
+
. ........................................ 42
Figure 11. Présence de précurseurs spécifiques de DR52b/ESO119-143, parmi les LT CD4
+
mémoires conventionnels et centraux mémoires, mais absents au sein des populations
effectrices conventionnelles et régulatrices (naïves et mémoires) ......................................... 44
Figure 12. Obtention de lignées de LT CD4
+
spécifiques de l’épitope DR52b/ESO119-143 et
caractérisation de leur avidité fonctionnelle. .......................................................................... 46
Figure 13. Analyse de la fréquence des LT CD4
+
Vβ2+ parmi les cellules ESO/tétramère
+
. .... 47
Figure 14. Profil cytokinique des lignées spécifiques d’ESO générées à partir de LT CD4
+
conventionnels naïfs après priming in vitro. ............................................................................ 49
Figure 15. Evaluation de l’alloréactivité des lignées spécifiques d’ESO générées à partir de LT
CD4
+
conventionnels naïfs après priming in vitro. ................................................................... 50

5
LISTE DES ABBREVIATIONS
ADNc : Acide désoxyribonucléique complémentaire
Ac : anticorps
AIRE : autoimmune regulator
CD : cellules dendritiques
CDR : Complementarity Determining Region (région déterminant la complémentarité)
CM : centrale mémoire
CMH : Complexe Majeur d’Histocompatibilité
CPA : Cellule Présentatrice d’Antigène
CTA : Cancer Testis Antigen (antigène tumoral testiculaire)
CTL : lymphocyte T CD8
+
cytotoxique
CMH : Complexe Majeur d’Histocompatibilité
CMNS : Cellules Mononucléées du Sang Périphérique
DR52b/NY-ESO-1119-143 His-tag-PE : DR52b/ESO119-143
DS : Deviation Standard
EBV : Epstein Barr Virus
ELISA : Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (méthode immuno-enzymatique)
EM : effecteur mémoire
ESO : NY-ESO-1
ESO/tétramère
+
: cellule tétramère DR52b/NY-ESO-1119-143 His-tag-PE
+
FOXP3 : forkhead box P3
GvH : Greffon contre Hôte
GvL : Greffon versus Leucémie
HD : Healthy Donor (donneur sain)