1. cytométrie en flux
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Hôpital L’Archet - Nice - La cytométrie en flux en immunologie par Frédéric Larbret Introduction à la cytométrie en flux Origine de la cytométrie en flux : 1934: applicable aux cellules hématopoïétiques(comptage) 1941: développement des techniques d’anticorps couplés 1960: développement des premiers cytomètres Définition : La cytométrie en flux permet l’étude précise de cellules isolées entraînées dans un flux liquide. Les cellules, alignées les unes derrière les autres, sont analysées une par une en défilant à grande vitesse (plus de 30Km/h) devant une source lumineuse (un laser). Intérêt : C’est une technique rapide qui permet une caractérisation : - individuelle de chaque cellule - quantitative (intérêt statistique) - qualitative et multiparamétriques (morphologie de la cellule et phénotypage) Principe Propulsion des cellules une à une à grande vitesse dans un flux hydrodynamique Passage devant une source lumineuse (Laser) Récupération de la fluorescence issu d’un immunomarquage le plus souvent Adaptée aux cellules en suspensions et donc à L’analyse de liquides biologiques : - Sang - Lavage broncho-alvéolaire - ascite ou épanchement pleural - Liquide céphalorachidien - aspiration médullaire Possibilité tout de même d’analyser des cellules tissulaires après dissociation Intérêt Monitoring de l’état immunitaire des patients dans différentes maladies: - déficits immunitaires - infections graves - maladies inflammatoires chroniques - auto-immunité - au décours de traitement (immunostimulants, immunosupresseurs, vaccinations…) Evaluation du pourcentage des différents types cellulaires que compte le système immunitaire La différenciation lymphoïde et myéloïde CD3+ CD3+/CD4+ CD56+ CD3+/CD8+ CD19+ CD14+ les immunomarquages Immunomarquage direct Ac-FLUO1 Immunomarquage indirect Ac-secondaire fluorescent Ac-primaire Non fluorescent + les fluorochromes Présentation des données La cytométrie polychromatique 2 Populations 1 Colour 4 2 Colour 2 1 3 Colours 12 2 1 4 Colours 5 Colours 6 Colours 3 3 1 2 24 40 60 La cytométrie polychromatique Fluorochromes et compensations Importance dans le choix des combinaisons de fluorochromes AVANT APRES FL2 - %FL1 Composition d’un cytomètre Composition d’un cytomètre Un cytomètre est une combinaison de 3 différents systèmes : 1 1) Système fluidique : Flux laminaire qui permet aux cellules en suspension de passer une à une devant le laser 2) Système optique : Rayon laser et différents filtres qui permettent de sélectionner les longueurs d’ondes appropriées 3) Système électronique : - PMT qui capte la lumière émise, - Digitaliseur qui la transforme en signal électrique puis en signal numérique, - Ordinateur qui gère et entrepose les données 2 3 La fluidique Système basé sur le principe de Focalisation hydrodynamique Le tri cellulaire Le tri cellulaire Clonage cellulaire L’optique séparation des excitations Le trajet optique Les filtres Les paramètres FSC/SSC Mesures de phénomènes de diffusion lumineuse : - Forward Scatter (FSC) : la lumière diffractée est collectée sous un petit angle (1 à 10°). Le signal est relatif à la taille de la cellule. ( = Taille de la cellule) - Side Scatter (SSC) : la lumière est collectée à 90° de l’axe du laser. Le signal est relatif à la granularité de la cellule. ( = granulométrie de la cellule) L’électronique PMT (Photomultiplicateur) Principe de fonctionnement d'un convertisseur Mesure de la frequence de distribution des cellules Les applications Application la plus courante : Le comptage de lymphocytes T pour le suivi des infections HIV ou de greffes. Principe - 50 à 100uL de sang - Ajout des Ac couplés - Possibilité d’ajouter : CD16 (neutrophile ) CD14 ou CD15 (monocytes) Avantages - Intérêt statistique - rapide (3min d’analyse) - multiparamétrique donc précise (cas des monocytes CD4+ mais CD3-) Les applications Résultats attendus d’un sujet sein (sur sang périphérique) : LyT CD3+/CD4+ = 66% LyT CD3+/CD8+ = 33% Rapport CD4/CD8 doit être 2/3 à 1/3 Les applications Observations de sous-types rares et encore très méconnus : LyT CD8+/CD56+ (très cytotoxiques ??) LyT CD4+/CD8 dim <2% LyT CD8+/CD4dim <3% Recherche Intérêt du trieur de cellules Les applications Utilisation d’ac spécifiques des chaines αβ ou γδ Domaine d’intérêt - LTγδ impliqués dans des pathologies des muqueuses: - LTαβ majoritaire +90% des LT dans le sang - LTγδ minoritaire 2 à 10% les LT dans le sang - reconnaissent des peptides - sont CD4-/CD8+-/CD56+- reconnaissent des glycolipides bactériens, fongiques ou tumoraux • Asthme • Maladies inflammatoires de l’intestin • activité de protection contre le cancer • infections à CMV (LT γδ++ pdt plusieurs années) • cicatrisation Les applications Analyse par CMF de la diversité des clones lymphocytaires par analyse des clonotypes V des chaînes du TCR: - Actuellement 20 à 30 Ac disponibles pour l’identification de la partie variable de la chaine β Permet d’identifier d’éventuelles proliférations monoclonales avec un phénotype particulier • Cas des LT CD4 dans la maladie de Sézary Les applications Diagnostiques et pronostiques des hémopathies malignes : - La leucémie lymphoïde chronique (LLC) est l’hémopathie maligne la plus fréquente du sujet âgé. - Diagnostic par hémogramme et phénotypage - Orientation des décisions thérapeutiques en fonction des marqueurs prédictifs de l’évolution de la maladie Les applications Les tests fonctionnels • Test d’activation in vitro : - CD25 ou CD69 + Stimulants Cytométrie en flux - Antigènes infectieux - Antigènes vaccinaux - type de population répondant CD4 + souvent - Types Lt (naïfs, effecteurs, mémoires) Lt CD3+ ! • Les Lt circulants n’expriment majoritairement pas de marqueurs d’activation Excepté 2% des CD4+ : les T régulateurs (CD4+/CD25+/CD127-/FoxP3 +) Rôle important dans la production de cytokines immunosupressives (IL10 et TGFβ) et donc dans la tolérance immunitaire (grossesse, tumeur et greffes) Rô Les applications Les applications Tests de prolifération : test au CFSE 0 division 1ere division 2ieme division 3ième division * Un lymphocyte T se divise 6 à 8 fois en moins de 10 jours Utilisé dans les tests de transformation lymphoblastiques Les applications Normal Aneuploïdie (tumeur) Sert pour le suivi des patients atteints de cancer du sein * Outil de diagnostique et de pronostique Les applications Les applications Analyse de la mort cellulaire Nombreuses techniques qui correspondent chacune à différentes étapes de la mort cellulaire Dioc6 Fas/ Fas L Activation des récepteurs Cytochromes C / APAF-1 Réduction du potentiel mitochondrial Annexine V /7AAD Activation des caspases Exposition de la phosphatidyl-sérine Pic Sub-G1 Changements morphologiques Fragmentation de l’ADN t Les protéines fluorescentes Les protéines fluorescentes
