Condition nécéssaire à la régulation de FOXO3 par SIRT1

Analyse d'article
Stress-Dependent Regulation of FOXO Transcription
Factors by the SIRT1 Deacetylase
I. Introduction - Problématique
Quelques paramètres pouvant faire varier la
longévité d'un organisme
Le même type de courbe est obtenu pour
l'effet d'un stress sur la longévité
Effet de la restriction calorique sur la
longévité d'une population de rats
Sir2, régulateur central de la longévité chez la levure
- Délétion de Sir2 => Suppression de la réponse à la RC et au stress chez la
levure
- Permet de limiter la formation des ADNr circulaires en contrôlant la
recombinaison
- Mode d'action: désacétyle les résidus lysines acétylés:
Cible-Lys-acétyl
NAD
Sir2
Cible-Lys
Nicotinamide
+ O-acétyl ADP
ribose
- Les cibles de Sir2 peuvent être des histones (régulation épigénétique), mais
aussi d'autres protéines
Sir2 et le contrôle de la longévité chez les mammifères?
- Il existe 7 homologues de Sir2 chez les mammifères. Le plus proche: SIRT1
- Chez Caenorhabditis elegans: les protéines de la famille Sir2 interagissent avec Daf-16.
Daf-16 = facteur de transcription de la famille FOXO
- Chez les mammifères: il existe 4 protéines de la famille FOXO (1, 3, 4, et 6)
Première question posée:
Chez les mammifères, existe-t-il une interaction directe entre SIRT1 et une
protéine FOXO?
- Chez les mammifères, les protéines FOXO contrôlent des évènements liés à la longévité
(réparation de l'ADN, détoxification des ROS, arrêt du cycle cellulaire, apoptose)
D'où la deuxième question posée:
Dans le cas où il existe une interaction directe entre SIRT1 et une protéine
FOXO, quelles sont les effets sur la régulation des évènements moléculaires
liés à la longévité?
II. Techniques utilisées
je verrai à la fin si je fais cette partie ou pas
III. Résultats et interprétations
Première question posée:
Chez les mammifères, existe-t-il une interaction directe entre
SIRT1 et une protéine FOXO?
-> Condition nécessaire à sa régulation par SIRT1
FOXO est-il acétylé dans les cellules de mammifères?
Anticorps anti-
Anticorps anti-
Expériences de Western Blot
Cellules de la lignée 293T exprimant la
forme “flag-tagged” de FOXO3
- La protéine FOXO3 est acétylée dans la cellule
- Le degré d'acétylation est fortement augmenté en présence d'un stress oxydant
(H2O2)
- Expérience supplémentaire: Les acétylases p300/PCAF interagissent avec les
protéines FOXO en présence de stress
-Remarque: qu'en est-il de FOXO1, 4, et 6 ?
-> Condition nécéssaire à la régulation de FOXO3 par SIRT1:
Y a-t-il colocalisation de FOXO3 et SIRT1 dans la cellule?
Culture de fibroblastes Ccl39
transfectés par la forme “HAtagged” de FOXO3
Immunofluorescence avec Ac antiHA
-> étude de la localisation de
FOXO3
En condition de stress oxydatif, FOXO3 et SIRT1 sont tous les 2
présents dans le noyau.
SIRT1 et FOXO3 peuvent-ils interagir?
Cellules 293T co-transfectées avec
“Flag-tagged” SIRT1 et “HAtagged” FOXO3
Immunoprécipitation de SIRT1
suivie d'un Western Blot de FOXO3 > Détection du complexe
SIRT1/FOXO3
SIRT1 et FOXO3 interagissent, et l'interaction est stimulée par certains
stress (oxydatif, heat shock, menadione)
L'interaction SIRT1/FOXO3 est-elle détectable lorsque les 2 protéines sont
exprimées à leur niveau endogène dans la cellule?
cellules 293T
neurones granuleux du cervelet
L'interaction entre les deux protéines est détectables losque elles sont
exprimées à leur niveau endogène, et est stimulée par un stress oxydatif
La co-localisation de SIRT1 et FOXO3 est-elle suffisante à leur interaction?
TM = forme mutée de FOXO3 où les sites de
phosphorylation ont été supprimés
En l'absence de stress, la simple co-localisation des deux protéines ne semble
pas suffisante pour leur interaction
Expérience supplémentaire (spectroscopie de masse): Le stress induit la
phosphorylation de FOXO3
=> Des acétylations et phosphorylation de FOXO3 pouvant être induites
par des conditions de stress semblent nécessaires à leur interaction
FOXO3 est-il le substrat direct de SIRT1?
-> Expériences in vitro
PCAF et p300 = acétylases
FOXO3 acétylé in vitro par PCAF ou p300 est le substrat direct de
SIRT1 en présence de NAD
Que se passe-t-il in vitro lorsque l'acétylation de FOXO3 est
causée par des conditions de stress in vivo?
BML-210: inhibiteur de SIRT1
TSA: inhibiteur des HDACs de classe I et II
In vitro, SIRT1 désacétyle FOXO3 préalablement acétylé par
des conditions de stress in vivo
FOXO3 est-il le substrat de SIRT1 in vivo?
Inhibiteur HDACs
Inhibiteur HDACs
(FOXO3 endogène)
Dans la cellule, FOXO3 est désacétylé par SIRT1 mais aussi par les
HDACs de classe I et II