La découverte de la sérotonine
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Invalidation du gène Tph1 chez la souris Rôle de la sérotonine circulante et implication de la sérotonine maternelle dans la fonction cardiaque. Cécile FLIGNY – 14 JUIN 2007 La découverte de la sérotonine Erspamer & Vialli, 1937 Rapport et coll., 1948 Une substance présente dans le sang provoque la contraction des vaisseaux: elle est appelée sérotonine. Erspamer & Asero, 1952 Une substance isolée de la muqueuse gastrique provoque des contractions des muscles lisses: elle est nommée entéramine. Entéramine et sérotonine sont une seule et même substance. Twarog & Page, 1954 La sérotonine est un neurotransmetteur dans le cerveau des mollusques et est présente dans le cerveau des mammifères. La sérotonine: fonctions biologiques Système nerveux central thermorégulation nociception mémoire et apprentissage cycle veille/sommeil comportement sexuel/maternel prise alimentaire humeur Système cardiovasculaire Système sanguin contractilité cardiaque tonus vasculaire fonction des lymphocytes hémostase Développement embryonnaire différenciation neuronale synaptogenèse division cellulaire morphogène développement cardiaque Système gastro-intestinal péristaltisme La sérotonine: pathologies associées Système nerveux central schizophrénie douleur anxiété dépression comportements suicidaires agressivité migraine alcoolisme Système cardiovasculaire hypertension artérielle systémique et pulmonaire cardiopathie hypertrophique cardiopathie dilatée asthme thrombose Développement embryonnaire retard de croissance Système sanguin Système gastro-intestinal tumeurs carcinoïdes syndrome du colon irritable Les acteurs du système 5-HT 1/ des récepteurs spécifiques 15 récepteurs 5-HT différents, répartis en 7 classes. Récepteurs à 7 domaines transmembranaires couplés aux protéines G, à l’exception du récepteur 5-HT3. Expression dépendante de l’organe et de l’espèce considérés. 5-HT Na+ R.à 7 domaines transmembranaires Na+ R. canaux (5-HT3) Signalisation intracellulaire Les récepteurs de la classe 2 sont spécialement impliqués dans la régulation des fonctions cardiaques chez la souris. Les acteurs du système 5-HT 2/ des mécanismes d’inactivation Recapture 5-HT R. 5-HT Int. Ext. SERT 5-HT 5-HT Na+ R. à 7 domaines transmembranaires Na+ R. canaux (5-HT3) Signalisation intracellulaire Un mécanisme de recapture: Le transporteur de haute affinité SERT Les acteurs du système 5-HT 2/ des mécanismes d’inactivation 5-HT 5-HIAA Recapture 5-HT R. SERT 5HT 5-HT 5-HT Na+ R. à 7 domaines transmembranaires Na+ R. canaux (5-HT3) Signalisation intracellulaire Un mécanisme de dégradation: La monoamine oxydase MAO Les acteurs du système 5-HT 3/ une enzyme de synthèse limitante: la TPH Enzyme limitante de la voie de biosynthèse de la 5-HT tryptophane noyaux du raphé Tryptophane hydroxylase 5-hydroxytryptophane 5-HTP neurones myentériques cellules entérochromaffines Décarboxylase des aa aromatiques 5-hydroxytryptamine SÉROTONINE Mélatonine glande pinéale Inactivation du gène Tph chez la souris Stratégie de « knock-in » locus Tph endogène Vecteur de ciblage locus Tph muté Les souris Tph-/-(+/-) sont viables 60 ♂ Tph1+/- x ♀ Tph1+/- % de chaque génotype 49 50 40 30 24 27 20 10 0 Tph1+/+ Tph1+/- Tph1-/- Deux gènes Tph… 200 5-HT (pg/µg prot.) glande pinéale *** 114 180 160 140 120 100 80 60 40 6 20 0 Tph1+/+ 5-HT (ng/g tissu) 3000 neurones myentériques cellules entérochromaffines Tph1-/- *** 2277 2500 2000 1500 1000 500 78 0 Tph1+/+ 5-HT (ng/g tissu) 900 noyaux du raphé Effondrement du taux de 5-HT. Tph1-/- 2 gènes Tph 724 800 594 700 600 Taux de 5-HT normal. 500 400 300 200 Tph2 100 0 Tph1+/+ Tph1-/- Lieux d’expression des gènes Tph 65% d’identité TPH1 TPH2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Domaine de régulation et d’interaction Domaine catalytique 83% d’identité Région 3’ non traduite Glande pinéale TPH1 non neuronale 90% Cellules entérochromaffines Biosynthèse de 5-HT TPH2 neuronale Neurones 5-HT du raphé 5% Neurones myentériques 5% Souris invalidées pour le gène Tph1 Temps d’expression des gènes Tph 0.5 2.5 4.5 6.5 8.5 glande pinéale Tph1 SNC Tph2 Tph2 10.5 12.5 16.5 14.5 18.5 E14.5 E10.5 E12.5 NM intestins CE Tph1 E15.5 Sérotonine de l’embryon Naissance En résumé … parents 50% Tph1+/Souris viables 100% de survie adultes 3-15% *** *** Tph1-/-(+/-) *** 15% 3% 3-15% Tph1-/-(+/-) Conséquences du faible taux de 5-HT circulante? Faible taux de 5-HT circulante Problèmes cardiaques dysfonctionnement? La cathéterisation de conductance Courbe de fonction ventriculaire gauche = contractilité Pression Pression Insuffisance cardiaque éjection contraction relaxation remplissage Volume Volume 3-15% Tph1-/-(+/-) Le phénotype cardiaque est hétérogène Tph1+/+ Tph1-/Souris 273 Phase de compensation Tph1-/Souris 296 Phase de décompensation 3-15% Tph1-/-(+/-) n=7 Le phénotype cardiaque est hétérogène n=30 n=7 n=30 Conclusion (1) parents 50% Tph1+/Souris viables 100% de survie adultes 3-15% Tph1-/-(+/-) Diminution contractilité cardiaque Insuffisance cardiaque Hétérogénéité importante 3-15% Tph1-/-(+/-) Le stress, un facteur aggravant de la cardiopathie? Origine de l’hétérogénéité du phénotype cardiaque? exacerbation du phénotype cardiaque en période de stress Le taux individuel de 5-HT, prédicateur de la sévérité du phénotype cardiaque? 3-15% Tph1-/-(+/-) Le stress, facteur aggravant de la cardiopathie? Protocoles envisageables: Exercice physique (marche forcée, nage). Une stimulation adrénergique. Protocole expérimental choisi: Test pharmacologique d’effort avec la dobutamine. dobutamine Catécholamine de synthèse Agoniste 1-adrénergique Inotrope + ( force de contraction) Bathmotrope + ( conduction) Chronotrope + ( fréquence) 3-15% Tph1-/-(+/-) Aucune réserve contractile cardiaque… Souris Tph1-/Non sensibles Survie (min) Souris Tph1-/sensibles Survie moyenne des souris Tph1-/(+/-) après dobutamine: 11.4 ± 2.8 min. non sensibles sensibles Souris Tph1-/-(+/-) Souris contrôles 3-15% Tph1-/-(+/-) Modification de la signalisation 5-HT cardiaque Étude de liaison des récepteurs -adrénergiques cardiaques Kd (nmol/l) Bmax (fmol/mg prot.) β1/β 2 (%) Tph1+/+ Tph1-/- 0.03 ± 0.00 0.045 ± 0.02 39.66 ± 2.24 42.42 ± 3.08 51 ± 49 52 ± 48 Ø modification de la signalisation -AR. Étude de liaison des récepteurs 5-HT cardiaques Tph1+/+ Tph1-/- 5-HT2A (fmol/mg prot.) 67 51 5-HT2B (fmol/mg prot.) 107 211 13 57 SERT (fmol/mg prot.) x2 néoexpression Conclusion (2) parents 50% Tph1+/Souris viables 100% de survie adultes 3-15% 5-HT2B Tph1-/-(+/-) Absence de réserve contractile cardiaque stress, facteur aggravant de la cardiopathie SERT Hétérogénéité importante Diminution contractilité cardiaque Insuffisance cardiaque 3-15% Tph1-/-(+/-) Taux individuel de 5-HT, prédicateur de la cardiopathie? Protocole expérimental: Mesure des paramètres cardiaques de chaque animal par échocardiographie. Détermination des taux individuels de sérotonine circulante. Contrainte: Analyser un nombre important d’animaux . Analyse des souris Tph1-/- issues de mères Tph1-/-. Générer un nombre important d’animaux mutés dans une même portée Diminuer l’hétérogénéité entre les individus d’une même portée. Seuls 20% des souris Tph1-/-(-/-) survivent ! Tph1-/-(-/-) parents 50% 3-15% Tph1-/-(+/-) Tph1+/Souris viables 100% de survie adultes Très peu de naissance 3-15% 5-HT2B Tph1-/-(+/-) SERT Tph1-/-(-/-) 20% de survie Diminution contractilité cardiaque Insuffisance Stress cardiaque aggrave la cardiopathie Tph1-/-(-/-) Génotype maternel +/+ +/- -/- Tph1+/+(+/+) Conséquences du faible taux de 5-HT maternelle? Génotype des embryons +/+ +/- -/- % d’embryons petits / malformés 3 28 - - 3.6 +/- 1 4 6 - 0 -/- 2 - 27 - 3.7 +/+ 1 6 4 - 0 +/- 4 11 24 10 6.7 -/- 2 - 4 3 0 +/+ 3 - 10 +/- 2 - 9 9 88.9 -/- 2 - - 15 86.7 Génotype paternel Nombre de croisements +/+ Tph1-/-(-/-) Tph1+/+(+/-) 80 Embryons normaux malformations létales à ~E12 Tph1+/-(-/-) La 5-HT maternelle est indispensable pour le développement embryonnaire normal. Seuls 20% des souris Tph1-/-(-/-) survivent ! ?? Tph1-/-(-/-) parents 50% 3-15% Tph1-/-(+/-) Tph1+/Souris viables 100% de survie adultes Très peu de naissance ?? 3-15% 5-HT2B Tph1-/-(+/-) SERT Tph1-/-(-/-) 20% de survie Diminution contractilité cardiaque Insuffisance Stress cardiaque aggrave la cardiopathie ?? Tph1-/-(-/-) Quel phénotype cardiaque? Echocardiographie sur des souris âgées de 2 à 5 mois: données anatomiques. Tph1+/+ Tph1-/-(+/-) Tph1-/-(-/-) 2 mois 5 mois 5 mois 2 mois PPVGd (cm) 0.07 ± 0.01 0.07 ± 0.01 0.08 ± 0.01 0.07 ± 0.01 0.06 ± 0.01 Ұ PPVGs (cm) 0.10 ± 0.01 0.10 ± 0.01 0.11 ± 0.01 0.10 ± 0.02 0.07 ± 0.01 *** Ұ Ұ Ұ Sd (cm) 0.08 ± 0.01 0.08 ± 0.01 0.08 ± 0.01 0.08 ± 0.01 0.07 ± 0.01 Ss (cm) 0.10 ± 0.01 0.10 ± 0.01 0.11 ± 0.01 0.11 ± 0.01 0.08 ± 0.01 * Ұ Ұ DIVGd (cm) 0.41 ± 0.01 0.42 ± 0.01 0.41 ± 0.04 0.43 ± 0.05 0.48 ± 0.05 ** Ұ DIVGs (cm) 0.25 ± 0.01 0.25 ± 0.03 0.25 ± 0.05 0.29 ± 0.04 0.35 ± 0.05 ** Ұ Longueur VG (cm) 0.82 ± 0.03 0.80 ± 0.06 0.77 ± 0.07 0.86 ± 0.07 0.84 ± 0.05 Ø signe anatomique de cardiopathie à 2 mois. 5 mois Signes anatomiques de cardiopathie dilatée (CMD). Se développe entre 2 et 5 mois. ?? Tph1-/-(-/-) Echocardiographie sur des souris âgées de 2 à 5 mois: données fonctionnelles. 2 mois FC (bpm) 5 mois FS (%) Quel phénotype cardiaque? Signes fonctionnels de CMD: • FS (index de contractilité) ?? Tph1-/-(-/-) Mesure des marqueurs plasmatiques précoces d’insuffisance cardiaque. CK-MB (µg/l) Augmentation des marqueurs précoces d’IC chez les Tph1-/-(+/-) Troponine Ic (ng/ml) 5 mois BNP (pg/ml) Quel phénotype cardiaque? Augmentation plus importante chez les Tph1-/-(-/-). Les souris Tph1-/-(+/-) développent une cardiopathie à un âge plus avancé Influence du génotype maternel Conclusion (3) parents 50% 3-15% Tph1-/-(+/-) Tph1+/Souris viables 100% de survie adultes Très peu de naissance 20% de survie ?? 3-15% 5-HT2B Tph1-/-(+/-) Diminution contractilité cardiaque Insuffisance Stress SERT cardiaque aggrave la cardiopathie Augmentation ± des marqueurs d’IC Tph1-/-(-/-) Cardiopathie dilatée Augmentation +++ des marqueurs d’IC La sérotonine circulante 90% de la sérotonine circulante entérochromaffines par la TPH1. est synthétisée dans les cellules Neurones myentériques (TPH2) 99% plaquettes sanguines Cellules entérochromaffines (TPH1) 5-HT 1% plasma ?? Tph1-/-(-/-) > 99% de la sérotonine circulante stockée dans les plaquettes sanguines. 5 mois 5-HT sang total (µM) Taux de sérotonine plaquettaire? Même taux de 5-HT entre les souris Tph1-/-(+/-) et Tph1-/-(-/-). Pas de corrélation entre la sévérité de la cardiopathie et le taux de 5-HT plaquettaire. ?? Tph1-/-(-/-) < 1% de la sérotonine localisée dans le plasma sanguin. 5 mois 5-HT plasma (nM) Taux de sérotonine plasmatique? Taux de 5-HT plasmatiques significativement diminués entre les Tph1-/-(+/-) et -/-(-/-). ?? Corrélation 5-HT / cardiopathie? BNP Tph1-/-(-/-) corrélation inverse entre la sévérité de la cardiopathie et le taux de 5-HT plasmatique. 5-HT plasma La sérotonine active pour la régulation de la fonction cardiaque est localisée dans le compartiment plasmatique sanguin. Conclusion (4) 50% parents 3-15% Tph1-/-(+/-) Tph1+/Souris viables 100% de survie 3-15% 20% 3-15% 41% adultes Très peu de naissance 20% de survie 5-HT2B Tph1-/-(+/-) Diminution contractilité cardiaque Insuffisance Stress SERT cardiaque aggrave la cardiopathie Tph1-/-(-/-) Cardiopathie dilatée Augmentation d’IC corrélation inverse entre la sévérité de la cardiopathie et le taux de 5-HT plasmatique. +++ des marqueurs Augmentation ± des marqueurs d’IC Le génotype maternel influence le taux de 5-HT plasmatique Le génotype maternel régule le taux de 5-HT plasmatique? E14.5 E10.5 Tph1 Tph2 E12.5 Tph2 E15.5 Tph1 5-HT2B SERT 0.5 2.5 4.5 6.5 8.5 10.5 12.5 14.5 16.5 Sérotonine maternelle Sérotonine de l’embryon 18.5 Naissance Tph1-/-(-/-) La 5-HT maternelle régule le taux de 5-HT plasmatique? diminution de la production de 5-HT dans les intestins des souris Tph1-/-(-/-)? augmentation du catabolisme de la 5-HT? Peu probable car la concentration plaquettaire de 5-HT est la même entre les groupes de souris Tph1-/-. modification du nombre, de la fonction (capture de 5-HT, capacité de dégranulation) et/ou de la structure (capacité de stockage de la 5-HT) des plaquettes? 20% Les plaquettes sanguines Tph1-/-(-/-) Nombre de plaquettes sanguines. 5 mois Plaquettes (103/µl) •Diminution du nombre de plaquettes en fonction du génotype maternel . La sérotonine maternelle régule le nombre de plaquettes sanguines … une première piste? Plaquettes sanguines Sérotonine 5-HT2B 5-HT2A? SERT 5-HT2B? 5-HT2A SERT SERT 5-HT mégacaryocytes Réarrangement Réarrangement du cytosquelette du cytosquelette proplaquettes plaquettes L’implication des petites protéines G? cardiomyocytes adultes Maintien du phénotype 5-HT foetal SERT x 5 5-HT2B x 2 contractilité 5-HT cardiomyocytes Formation anormale du cytosquelette activation petites protéines G (RhoA?) Réarrangement anormal du cytosquelette maturation Mégacaryocytes / proplaquettes 5-HT 5-HT2B mégacaryocytes SERT sérotonine maternelle Autisme Maladies psychiatriques Diabète Obésite… Études épidémiologiques Environnement maternel
