P. EHSANI1, A. MEUNIER2, F. NATO2, I. OLD2, A. JAFARI1, S. DARTEVELLE2, J.-C. MAZIE2, G. DUCREUX3, P. LAFAYE2, A. NATO3 EXPRESSION DE FRAGMENTS SCFV ANTI-CYTOKINE PAR DES VITROPLANTS DE NICOTIANA TABACUM CV XANTHI 1 Molecular Biology Unit, Institut Pasteur, Avenue Pasteur, 13164 Téhéran (Iran) 2 Laboratoire Ingénierie des Anticorps, Institut Pasteur, 25-28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15 (France) 3 Laboratoire Morphogenèse Végétale Expérimentale, Bât. 360, Université Paris XI, 91405 Orsay Cedex (France) Le groupe de travail Objectif du projet Produire des fragments d’anticorps de type scFv anticytokine humaine (IL-4 ou IL-6) chez Nicotiana tabacum cv Xanthi Elaborer un test ELISA permettant de déterminer la concentration en cytokines des fluides corporels pour le diagnostic de nombreuses pathologies humaines (réaction inflammatoire, allergies…). Structure générale d’une immunoglobuline CDR VH Fv CH1 Fab VL S-S S-S CL CH2 Fc CH3 Structure des fragments d’anticorps Papaïne Pepsine Génie génétique Pourquoi un végétal comme bioréacteur ? Les plantes transgéniques constituent un système alternatif à la production de protéines eucaryotes et notamment d’anticorps grâce : au faible coût de production de la biomasse végétale, à l’absence de risque de contamination par des pathogènes humains, à une plus grande conformité de la protéine recombinée avec la protéine naturelle, à l ’existence d’infrastructures de récolte, de stockage et d’extraction. Quelle construction génétique a été réalisée ? LB R P scFv C-myc tag T RB RB : Extrémité droite droite ; VL ; RB : Extrémité VH LB : Extrémité gauche RB : Extrémité droite R : Gène sélectif de résistance (nptII) P : Promoteur (CaMV 35S) scFv : Fragment variable simple chaîne c-myc-tag : peptide tag T : Terminateur (3 ’ocs) La transformation végétale Régénération d’une plantule entière Plantule Début d’organogenèse de tabac transformée sur des disques partirend’un foliaires disque defoliaire, tabac, 48 Disques foliaires de àtabac pré-culture semaines semaines après après la la transformation transformation par par Agrobacterium Agrobacterium Résultats (1) Plantule non transformée Plantes IL-4 (5 clones) Plantes IL-6 (5 clones) µg de protéines solubles totales/g de Matière Fraîche Pourcentage de protéines solubles totales par comparaison avec la plantule non transformée 3800 100% 2080 55% Dégradation des protéines et accélération de la sénescence 1970 52% foliaire. Quantification des protéines solubles totales de vitroplants de Nicotiana tabacum âgésphysiologiques de 45 jours. des vitroplants Caractéristiques Tabac Expression sur les Vitroplantd’un processus de floraison hâtive transgénique vitroplants 3 de tabacet plantes acclimatées en serres (En aprèsserres, 3 semaines au lieu de 8, pour la plante non transformée). transformé semaines en serres IL-6 Témoin IL-4 Résultats (2) Fragments scFv anti-cytokine Nombre de disques foliaires de Nombre de plantules de Nombre de plantules de tabac transformés par tabac transformées tabac produisant le fragment Agrobacterium tumefaciens régénérées scFv anti-cytokine 129 68 8% 122 131 76% Faible proportion de plantules produisant le scFv anti-IL-4 en comparaison des anti-IL-6. Anti-IL-4 Anti-IL-6 Présence d’une double bande aux environs de 30 kDa, taille Tableau récapitulatif des résultats obtenus pour l’expression correspondant à celle attendue du scFv anti-cytokine. des fragments scFv anti-cytokine chez Nicotiana tabacum. kDa PMPM 1 T 2 F3 kDa R4 F5 6R 7F 8 R T 50 47,5 Caractéristiques biochimiques des vitroplants 35 Accumulation beaucoup plus importante des fragments 32,529 d’anticorps de type scFv anti IL-6 dans les racines que dans 25 les feuilles. 21 16,5 6,5 Immuno-transfert d’extraits protéiques foliaires (F) et Immuno-transfert protéiques(3declones tabacsanti transformés racinaires (R) de d’extraits tabacs transformés IL-6) et (IL-6 : 1, 2, 3 ,4 ; IL-4 : 5, 6, 7, 8) et(T). non transformés (T). non transformés Discussion et perspectives (1) 10 fois moins de plantules IL-4 que d’IL-6 avec des différences morphologiques importantes (fragilité, jaunissement des feuilles...). Hypothèse : les scFv interfèrent sur le métabolisme général de la plante. Tests ELISA : Conformation correcte des scFv anti IL-4 et anti IL-6. Estimation quantitative, par Western Blot : Les scFv représentent environ 1% des Protéines Solubles Totales ce qui correspond aux résultats (entre 1 à 2% des PST) obtenus par de nombreuses équipes (Conrad et Fiedler, 1998 ; Ma et al., 1995...). Discussion et perspectives (2) Immuno-transferts : L’accumulation au niveau des racines laisse présager un pourcentage d ’expression supérieur à ceux déjà observés. Travaux en cours : purification par chromatographie d’affinité des scFv anti-cytokine, présents dans les extraits végétaux, réalisation d’une nouvelle construction génétique avec la séquence KDEL (Conrad et Fiedler, 1998), transformation d’autres espèces végétales : la pomme de terre, Solanum tuberosum et l ’aubergine, Solanum melongena.