Session1 - Club Exocytose

Session 1 - Club ExoEndo 2004
Distribution Subcellulaire des Récepteurs du Glutamate de type Kaïnate
Jaskolski.F, Coussen.F, Normand.E, Mulle.C, UMR 5091.
Physiologie Cellulaire de la Synapse, CNRS, UMR 5091.
La répartition cellulaire des récepteurs du glutamate conditionne leur rôle physiologique
comme médiateur ou régulateur de la transmission synaptique. Il existe trois familles de
récepteurs ionotropiques du glutamate, les récepteurs AMPA, NMDA et Kaïnate (KARs). Les
KARs sont des hétérotétramères composés d'une combinaison des sous-unités GluR5, GluR6,
GluR7, KA1 et KA2. Ces sous-unités sont des protéines transmembranaires pour lesquelles il
existe différents variants d'épissage. Nous avons étudié la distribution subcellulaire des
variants d'épissage C-terminaux des sous-unités GluR5 et GluR6 (GluR5a, GluR5b, GluR5c,
GluR6a, GluR6b). Le domaine C-terminal des sous-unités des KARs est intracellulaire et
constitue potentiellement un site de régulation pour le trafic cellulaire de ces protéines.
L’utilisation de sous-unités recombinantes étiquetées en N-terminal et transfectées dans des
neurones d’hippocampe de souris en culture (de génotype sauvage ou déficientes GluR5-/xGluR6-/-) nous a permis d’étudier l’adressage membranaire des KARs. Les différents
variants d’épissage des sous-unités GluR5 et GluR6 ne sont pas exprimés dans les mêmes
proportions à la surface des cellules. Les sous-unités GluR5a, GluR5b, GluR5c et GluR6b
sont faiblement détectées à la surface des cellules et sont retenues dans le réticulum
endoplasmique (RE). La sous-unités GluR5c porte un site de rétention dans le RE de type
RXR. Par contre, GluR6a possède un site d’export du RE dans son domaine C-terminal que
nous avons identifié 871-CQRRLKHKP-879. Enfin, l’hétéromérisation de GluR6a avec une
sous-unité retenue dans le RE favorise la sortie de l’hétéromère du RE vers la membrane
plasmique. Ainsi, l’épissage alternatif et la composition en sous-unité sont des facteurs
déterminants pour la distribution subcellulaire des KARs.
Session 1 - Club ExoEndo 2004
Deux mécanismes indépendants sont impliqués dans la compartimentation
de protéines au segment initial de l’axone
Anissa MOUSSIF, Marie-Pierre FACHE, Fanny FERNANDES, Pierre GIRAUD, Juan José
GARRIDO# et Bénédicte DARGENT.
Inserm U641, Institut Jean Roche, Université De la Méditerranée, Faculté de Médecine Secteur Nord,
Boulevard Pierre Dramard, 13916 Marseille cedex 20, France.
# Centro de Biologica Molecular « Severo Ochoa », Universidad Autonoma de Madrid, 28049
Cantoblanco, Spain.
A la jonction entre le domaine somato-dendritique et le domaine axonal, le segment initial de
l’axone (SIA) joue un rôle déterminant dans la physiologie du neurone. Son organisation
moléculaire en fait le site privilégié de génération du potentiel d’action mais aussi une
barrière de diffusion, support de la polarité neuronale. Ce sous-domaine axonal se caractérise
par la présence du complexe protéique ankyrine G/βIV spectrine associé au cytosquelette et
par l’accumulation de glycoprotéines membranaires telles que les protéines d’adhérence de la
famille L1 et les canaux sodium voltage-dépendants.
Pour identifier les déterminants d’adressage et d’organisation des canaux sodium au
SIA, nous avons développé une approche basée sur l’analyse de l’expression de chimères
transfectées dans des neurones d’hippocampe. Les différentes régions cytoplasmiques de la
sous-unité Nav1.2 formant le pore du canal, ont été fusionnées au récepteur CD4 délété de sa
région intracellulaire. Nous avons montré qu’un motif de 27 acides aminés (acides aminés
1102-1128, motif AIS) localisé dans la région cytoplasmique liant les domaines II et III du
canal (CD4-Nav1.2-II-III) détermine sa compartimentation au SIA (1). Neuf de ces acides
aminés dont un résidu glutamate (E1111), composent le motif consensus d’interaction de la
sous-unité Nav1 des canaux sodiques avec l’ankyrine G (2). Nous montrons dans cette étude
que l’accumulation et l’ancrage de CD4-Nav1.2-II-III dans le SIA repose sur ce résidu.
Pour analyser les voies du trafic intracellulaire de CD4-Nav1.2-II-III conduisant à son
enrichissement et à sa rétention dans la membrane du SIA nous avons étudié sa cinétique
d’insertion. Les résultats obtenus montrent que la protéine nouvellement synthétisée est
préférentiellement incorporée dans le domaine somato-dendritique et dans le segment initial
de l’axone. Son apparition dans la région plus distale de l’axone a lieu ultérieurement.
L’application d’un test d’immunoendocytose a montré que la protéine est ensuite éliminée par
endocytose de la membrane plasmique à l’exclusion du SIA. L’internalisation de CD4Nav1.2-II-III est gouvernée par un second motif de 19 acides aminés (acides aminés 10101030) distinct et indépendant du motif AIS.
Ces observations nous conduisent à proposer le modèle suivant (3). Après une
insertion préférentielle dans la membrane du domaine somato-dendritique, CD4-Nav1.2-II-III
diffuserait par la suite vers le compartiment axonal. La protéine serait alors piégée et ancrée
au SIA via une interaction avec l’ankyrine G. Pour finir, son endocytose permettrait son
élimination de la membrane des autres compartiments du neurone. Nous n’excluons pas pour
autant d’autres voies possibles de trafic comme un acheminement direct des protéines au
segment initial de l’axone.
1-Garrido, J.J., Giraud, P., Carlier, E., Fernandes, F., Moussif, A., Fache, MP., Debanne, D.and Dargent, B.
Identification of a targeting motif involved in sodium channel clustering at the axonal initial segment Science
2003; 30, 2091-2094.
2-Lemaillet, G., Walker, B. And Lambert S. Identification of a conserved ankyrin binding motif in the family of
sodium channel
3-.Moussif, A. and Fache, MP., Fernandes, F., Giraud, P., Garrido, J.J.and Dargent, B.Endocytotic elimination
and domain –selective tethering confer protein segregation at the axonal initial segment, (article soumis)
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IMPLICATION DE LA NEUROTRANSMISSION EXCITATRICE DANS LA
DYNAMIQUE MEMBRANAIRE DU RECEPTEUR DE LA GLYCINE
Sabine Lévi.
Ecole normale Supérieure, 46 rue d’Ulm, 75005 Paris.
Les récepteurs aux neurotransmetteurs sont enrichis dans la membrane postsynaptique, face
aux terminaisons contenant le neurotransmetteur correspondant. Tel est le cas du récepteur
inhibiteur de la glycine (RGly) qui prédomine dans la moelle épinière et le tronc cérébral. Les
récepteurs sont ancrés au cytosquelette sous-synaptique par l’intermédiaire d’un échafaudage
moléculaire. Des modifications structurales de l’élément postsynaptique sont impliquées dans
les processus de plasticité développementale et d’apprentissage.
La dynamique de diffusion latérale des récepteurs permet de rendre compte de l’organisation
de la membrane postsynaptique. Nous avons utilisé des sondes fluorescentes inorganiques
nanomètriques, les quantums dots semiconducteurs, pour suivre la diffusion membranaire du
RGly en molécule unique sur des neurones spinaux vivants (Science 302, 2003, pg 442-445).
Plusieurs domaines membranaires de diffusion ont été caractérisés en relation avec la
localisation synaptique, périsynaptique ou extrasynaptique des récepteurs. L’entrée de
récepteurs dans la fente synaptique par diffusion a été observée et confirmée en microscopie
électronique. Lors d’échanges synaptiques, le RGly alternait rapidement entre des états de
diffusion libre et confinée démontrant l’importance du mécanisme de diffusion-capture dans
l’accumulation postsynaptique des récepteurs. Le rôle du cytosquelette et de l’activité dans la
mobilité du RGly a été analysée. Nous avons observé que la dynamique membranaire du
RGly est accélérée à la suite d’une dépolymérisation des microtubules et de l’actine par le
nocodazole et la latrunculine, respectivement. Le cytosquelette limite donc les déplacements
du récepteur. Le blocage de la libération évoquée en neurotransmetteur par la tétrodotoxine
augmente la diffusion du RGly. La transmission inhibitrice glycinergique n’est pas impliquée
dans cette diffusion. En revanche, la diffusion du RGly est augmentée à la suite d’un blocage
de la transmission excitatrice glutamatergique. Nous avons montré que cet effet est médié par
une élévation de la concentration en calcium intracellulaire. En effet, une élévation transitoire
du calcium intracellulaire à la suite de l’activation du RNMDA déclenche une cascade
signalétique qui induit des réarrangements du cytoquelette (ref dans Nature Rev.
Neuroscience 5, 2004, pg 45-54). Nos résultats indiquent que la neurotransmission excitatrice
controle la dynamique du RGly via la polymérisation du cytosquelette sous-membranaire.
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MODULATION PAR DES FACTEURS NEUROTROPHIQUES D’UN TRAFIC
MEMBRANAIRE PRE-SYNAPTIQUE VISUALISÉ IN VIVO À LA JONCTION
NEUROMUSCULAIRE PAR L’UTILISATION DE TRACEURS DÉRIVÉS DE LA
NEUROTOXINE TÉTANIQUE.
Sylvie ROUX(1,2) ; Cécile SAINT CLOMENT(1) ; Emmanuelle GIRARD(2) ; Thomas
CURIE(1) ; Julien BARBIER(2) ; Cesare COLOSSANTE(3) ; Francisco-Javier MIANAMENA(4) ; Jordi MOLGO(2) & Philippe BRULET(1).
(1) Unité d’Embryologie Moléculaire, URA CNRS 2578 Institut Pasteur Paris, France
(2) Laboratoire de Neurobiologie Cellulaire et Moléculaire UPR CNRS 9040 Gif-sur-Yvette,
France.
(3) Facultad de Medicina, Universidad de Los Andes, Merida, Venezuela
(4) Laboratorio de Genetica Bioquimica y Grupos Sanguineos, Facultad de Veterinaria
Zaragoza, Spain.
Pour comprendre et analyser l’organisation synaptique et le fonctionnement de réseaux
neuronaux, nous avons utilisé des traceurs dérivés de la neurotoxine tétanique. Par injection
intramusculaire d’une protéine de fusion entre le fragment C-terminal atoxique de la toxine
tétanique ou fragment TTC et un gène rapporteur comme la Green Fluorescent Protein (GFPTTC) ou lacZ (ßGal-TTC), on visualise in vivo un trafic membranaire spécifique à la jonction
neuromusculaire. Après l’injection, la protéine de fusion se concentre rapidement au niveau
de la jonction neuromusculaire active. Elle est internalisée au niveau neuronal puis acheminée
par transport rétrograde jusqu’aux dendrites puis à un neurone en connexion. L’activité
nerveuse pré-synaptique agit sur ce trafic probablement via l’intermédiaire de la sécrétion
et/ou l’action de différentes molécules. Nous avons donc étudié l’influence de différents
facteurs neurotrophiques et en particulier des neurotrophines. Ainsi, l’injection de BDNF,
mais également de NT-4 et de GDNF, augmente la concentration du traceur à la jonction
neuromusculaire ainsi que son internalisation neuronale, probablement par des
microdomaines lipidiques. Par comparaison avec les marquages obtenus par injection du
fragment B de la toxine du choléra, un marqueur spécifique des radeaux lipidiques, on a pu
mettre en évidence une dynamique différente de concentration entre ces deux traceurs.
Comme le marqueur GFP-TTC utilise pour son internalisation et son trafic des mécanismes
cellulaires constitutifs, on visualise donc avec ce traceur un trafic membranaire physiologique
probablement impliqué dans le fonctionnement synaptique.
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La mémoire cellulaire neuronale, pré- ou post-synaptique ?
Humeau Yann.
Centre de Neurochimie, 5 rue Blaise Pascal, 67084 Strasbourg.
La plasticité des connexions synaptiques au sein du système nerveux central est à l’origine
des phénomènes d’apprentissage et de mémorisation. La traduction moderne du principe
énoncé par Hebb dans les années 50 est synaptique : l’activité simultanée des éléments pré- et
post-synaptiques entraîne des modifications de la physiologie synaptique avec comme
conséquences un changement i) de la force synaptique a ce niveau et ii) des propriétés
d’intégration du neurone post-synaptique. Les données historiques obtenues dans l’aire CA1
de l’hippocampe ont mené à une vision purement post-synaptique de la plasticité à long terme
avec un rôle central des récepteurs glutamatergiques (AMPA et NMDA). Cependant, des
études récentes menées dans diverses structures cérébrales soulignent également la plasticité
de la libération de neurotransmetteurs par l’élément présynaptique. Je décrirais ici les études
que nous menons sur les neurones de projection de l’amygdale latérale (LA) qui intègrent des
inputs excitateurs thalamiques et corticaux, porteurs d’informations sensorielles essentielles à
la fonction du noyau amygdalien. Nous avons pu mettre en évidence l’existence d’une forme
de plasticité à long terme associative résultant de l’activité conjointe des inputs excitateurs
sans intervention des neurones post-synaptiques ou d’autres acteurs cellulaires locaux. Cette
forme de LTP (Long Term Potentiation) associative et hétérosynaptique ajoute un niveau de
complexité supplémentaire au principe de Hebb, et d’une façon plus générale, ces formes de
plasticité présynaptiques (liées à des changements de la probabilité de libération) posent une
question de biologie cellulaire plus générale : Quels sont les mécanismes cellulaires
permettant de moduler sur le long terme l’activité exocytotique des terminaisons
synaptiques ?
Humeau Y, Shaban H, Bissiere S, Lüthi A.(2003) Presynaptic induction of heterosynaptic
associative plasticity in the mammalian brain. Nature. 426:841-5.