Comment intégrer l`analyse de PDL1 en pratique
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Comment intégrer l’analyse de PDL1 en pratique Les étapes clés Besançon 3 février 2017 Dr Laurent ARNOULD Département de Biologie et de Pathologie des Tumeurs CGFL - DIJON Diagnostic Histologique (avant-hier) Carcinomes non à petites cellules Épidermoïdes (plusieurs sous type) Adénocarcinomes (nombreux sous type avec liaison avec résultat de la biologie moléculaire et indication pronostique) Autres rares Carcinomes avec différenciation neuro-endocrine Petites cellules Autres Les métastases Pronostic et traitements différents Outils nécessaires au Diagnostic histologique Morphologie Prélèvements représentatifs Prélèvements non altérés (nécrose, écrasement,…) Bonne fixation Coupe de qualité Immunohistochimie (P63 ou P40 et TTF1 : +/- CK7 et CK20 +/- neuro-endocrines) Coloration des mucines si ADK (bleu alcian +/- PAS) Fixation Coupe Contrôles de qualité Hier on ajoutait la biologie moléculaire Diagnostic moléculaire (recommandations Inca) Gènes analysés : EGFR Kras Braf PI3K* HER2 réarangement ALK réarangement de ROS1 Pronostic et traitements différents (thérapie ciblées) Evolution des connaissances : Vers une classification moléculaire des CBNPC Pao et Nicolas Girard (Lancet Oncol 2011;12 : 175-80) En pratique hier au CGFL Juste après les coupes pour diagnostic Dernière lame quantification (%) ALK IHC ROS1 IHC 4 lames blanches pour éventuelle FISH (congélation / enrobage dans de la paraffine) ou essai clinique 6 rouleaux 7 micron (+/- microdissection) pour PCR 1HES sandwich (%) si IHC + ou contexte clinique ou histo OK , FISH : ALK / ROS pour éventuel Tki Aujourd’hui et demain • Etudes cliniques positives pour immunothérapie • Seconde ligne • Bientôt première ligne Rôle de PD-L1 dans les cancers • PD-1 est exprimé à la surface des lymphocytes T activés reconnaissant les néoantigènes tumoraux • L interaction avec PD-L1, exprimé par les cellules présentant ces néoantigènes, entraîne l inactivation des lymphocytes T – La voie PD-1/PD-L1 est un point de contrôle (checkpoint) inhibiteur du système immunitaire • L expression de PD-L1 constitue un mécanisme d échappement majeur des cancers à la réponse immunitaire adaptative anti-tumorale APC -­‐ T-­‐cell interac4on Tumor Microenvironment Checkpoints immunitaires : modula4on de la réponse adapta4ve Wolchock, 2013 Expression de PD-L1 Expression induite Expression cons4tu4ve Amplifica4on gène PD-­‐L1 Voies oncogéniques Infec4on virale Traitements ciblant PD-1 et PD-L1 Immune ckeckpoints blockers Soria et al., Clin Cancer Res 2015 Traitement Compagnie Cible Essais cliniques de phase II/III Nivolumab BMS PD-­‐1 Checkmate 017, Checkmate 057 Checkmate 026* Pembrolizumab MSD PD-­‐1 KEYNOTE001, KEYNOTE010 KEYNOTE024* Atezolizumab Roche PD-­‐L1 POPLAR, BIRCH, OAK Durvalumab AstraZeneca PD-­‐L1 Avelumab Pfizer / Merck KGaA PD-­‐L1 Traitements en monothérapie dans les carcinomes pulmonaires non à petites cellules En vert : études positives, en rouge : étude négative * Etudes en première ligne Tests IHC PD-L1 utilisés dans les essais cliniques Traitement Clone Epitope Détec4on Seuils étudiés Statut FDA (USA) Nivolumab (BMS) 28-­‐8 Dako Extracellulaire EnVision FLEX CT : ≥1%, ≥5%, ≥10% Complementary diagnos`c (lung, melanoma) Pembrolizumab (MSD) 22C3 Dako Extracellulaire EnVision FLEX CT : ≥1%, ≥50% Companion diagnos`c (lung) Atezolizumab (Roche) SP142 Intracellulaire Ventana Op`View + amplifica`on CT : ≥1%, ≥5%, ≥50% CI : ≥1%, ≥5%, ≥10% Complementary diagnos`c (bladder) Durvalumab (AstraZeneca) SP263 Intracellulaire Ventana Op`View CT : ≥25% -­‐ Représentativité des prélèvements • La réponse immunitaire est hétérogène dans l espace – La taille du prélèvement peut être corrélée avec le taux de positivité – Tumeur primitive versus métastase(s) : peu de données • Elle peut être modulée par différents traitements – L impact sur la valeur prédictive de l expression PD-L1 n est pas connu Ilie et al. Ann Oncol 2015 Interprétation du marquage et «scoring » l l l l Marquage positif = membranaire, complet ou incomplet, quelque soit l'intensité Évaluation du % de cellules tumorales positives et du % de cellules immunitaires positives selon le test PD-L1 Appréciation à faible grandissement de l'homogénéité du marquage Détection à fort grandissement des différentes intensités de marquage Préparation des lames pour la technique IHC PD-L1 1 LNC pour l'AC PD-L1 l 1 LNC pour le contrôle négatif : IgG monoclonale de lapin l 1 à 3 LNC pour les Témoins externes: l - - - Lignées témoins externes positifs et négatifs (fournis ds certains Kits) Tissu témoin externe positif amygdale : expression marquée de épithélium des cryptes, et faible à modérée es cellules immunitaires dont macrophages des centres germinatifs Tumeurs témoins externes positif et négatif Si la distribution du marquage est focale : 10% de la tumeur comportant 50% de CT marquées = 5% de CT positives au total Si la distribution du marquage est hétérogène, identification à faible grandissement de zones présentant des % de cellules positives différents : 80% 10% 50% 25% (80+10+25+10 ) : 4= 40% Concordance inter-observateurs • Principales problématiques liées à l évaluation du marquage : – Identification des cellules PD-L1+ : cellules tumorales et immunitaires – Cellules tumorales : marquage membranaire vs. cytoplasmique – Faibles intensités de marquage – Marquage de la nécrose – Nombre de cellules tumorales (100) – Pourcentages proches du seuil de positivité – Echantillons de cytologie : tests non validés Study Tumor cells Immune cells Scheel, Mod Pathol 2016 (9 pathologists) Cologne (6-­‐categories) score: κ =0.47-­‐0.50 Dichotomous cut-­‐offs: κ =0.6-­‐0.8 Cologne (6-­‐categories) score: κ <0.2 Dichotomous cut-­‐offs: κ =0.12-­‐0.25 Rimm et al. (IASLC sept. 2016) (13 pathologists) Kappa=0.832 to 0.882 depending on the assay Kappa=0.172 to 0.229 depending on the assay Préparation des lames pour la technique IHC PD-L1 1 LB pour l'AC PD-L1 1 LB pour le contrôle négatif : IgG monoclonale de lapin 1 témoins externe (amygdale) sur chaque lame ? pour chaque run ? Au moins 100 cellules tumorales CQ externe (UKNequas ? AFAQAP ?) Problème en pathologie pulmonaire Beaucoup de tests à effectuer sur un matériel de très petite taille Le diagnostic pathologique nécessite souvent de l’histochimie et de l’immunohistochimie. Puis il faut encore du tissu pour l’extraction d’ADN Puis encore du tissu pour l’IHC +/- FISH prédictives Les biopsies ne contiennent souvent pas beaucoup de cellules tumorales (macro-dissection) Information des pneumologues ++++ (plus de biopsies et plus grosses) Procédures de prise en charge des prélèvements systématiques Circuit Préleveur (pneumologues, radiologues, chirurgiens) Identifieur (diagnostic IHC prédictive et FISH) (pathologistes) Qualité Délais Moléculeur (biologistes moléculaires) Thérapeute (pneumologues, oncologues) Prélèvements biopsiques (80%) Quantité du matériel Beaucoup d analyses « plus y en a, mieux c est » Qualité du prélèvement Éviter zones de nécrose, ne pas écraser Maitrise de la fixation Fixateur adéquat (formol 4% tamponné) en quantité suffisante (10X) immersion immédiate, Renseigner l heure du prélèvement pour calcul du temps de fixation Idem pour la cytologie (aspiration, liquide d épenchement, …) Quantité de matériel tissulaire Quantité et qualité de fixateur Traçabilité de la date et de l’heure du prélèvement Gestion des prélèvements de petites tailles (cytobloc ou biopsie) Toujours penser au départ au prédictif en plus du diagnostic procédure d’inclusion spécifique (séparation des biopsies, inclusion dans le même plan) lames blanches ou rubans pour IHC, rouleaux pour biomol Macrodissection Après la fixation , la deshydratation Automate : Programme validé pour la taille des prélèvements Attention à la sur fixation dans l’automate Lors de l’inclusion mettre les prélèvements dans le même plan Ne pas trop user Ne pas faire ce que l’on nous a appris ! Avoir une gestion rationalisée des IHC initiales MORPHOLOGIE Neuroendocrine 20% Squamoïde P40 +++ et TTF1- Epidermoïde 30% TTF1+ : papillaires et lépidiques TTF1- BA + : mucineux Glandulaire P40 - Adenocarcinome 50% Solides , cribriforme, en bague à chaton.. Exemple d’immunohistochimie pour TTF1 Inclusion dans le même plan 1er HES pas trop usé 1ere lames IHC anticipées Prélèvements chirurgicaux Beaucoup d analyses Matériel tumoral toujours suffisant Qualité du prélèvement Adresser le prélèvement à l état frais le plus rapidement possible (idéal 1h). Système sous vide et réfrigéré Fixation immédiate sous optimal sauf petite résection Maitrise de la fixation Fixateur adéquat (formol 4% tamponné) en quantité suffisante (10X) Injection de fixateur dans l arbre bronchique Renseigner l heure de la fixation pour calcul du temps de fixation Technique de fixation : injection de fixateur dans l’arbre bronchique puis immersion Recoupe après 24 h Formol tamponné : bonne pénétration mais fixation lente En pratique, aujourd’hui, au CGFL Juste après les coupes pour diagnostic Dernière lame (quantification) 1 ALK en IHC 1 ROS1 en IHC PDL1 CD8 4 lames blanches pour FISH 6 rouleaux 7 micron (+/- microdissection) pour PCR 1HES sandwich (quantification) Circuit Préleveur (quantité, qualité, info sur l heure de prélèvement) Identifieur (procédures techniques+++, économe, reproductif sur l analyse des Biomarqueurs et sur l analyse du % de cellules) Qualité Délais Moléculeur (techniques éprouvées, témoins, contrôles de qualités) Thérapeute (réactif (événements rares),critique, conscient) Je vous remercie de votre attention.
