Manipulation sans contact
publicité
Manipulation sans contact Jacques Derouard Université Grenoble I Laboratoire de Spectrométrie Physique « Manipulation sans contact » • De quoi? • Pourquoi et pourquoi faire? • Avec quoi? • Comment? « Manipulation sans contact » • De quoi? – Objets « d’intérêt biologique »: • Cellules biologiques • virus, bactéries • macromolécules biologiques (protéines, ADN) « Manipulation sans contact » • Pourquoi – Evite contamination et/ou dommages – Adapté à traitement parallèle de nombreux objets • pourquoi faire? – – – – Transport Immobilisation Observation, caractérisation Tri « Manipulation sans contact » • Avec quoi? – Forces « agissant à distance » • • • • Electriques Magnétiques Optique Acoustiques • Comment? « Manipulation sans contact » • Avec quoi? – Forces « agissant à distance » • • • • Electriques: Magnétiques: Optique: Acoustiques • Comment? Electrodes Aimants Faisceaux lumineux Ondes sonores « Manipulation sans contact » • Avec quoi? – Forces « agissant à distance » • • • • Electriques: Magnétiques: Optique: Acoustiques Electrodes Aimants Faisceaux lumineux Ondes sonores • NB1: Parfois plusieurs modalités combinées • NB2: Domaine du « Micro-monde » et ses lois d’échelle • NB3: Milieu liquide et microfluidique Forces électriques Forces électriques • Objet chargé soumis à champ électrique – en milieu « libre »: cf « FACS » – en milieu liquide: « électrophorèse » • Objet dielectrique dans champ non uniforme: – « dielectrophorèse » FACS: Fluorescence Activated Cell Sorting Electrophorèse r r • Force F = qE • Force de frottement en milieu liquide (Stokes) r r FV = 6πRµV Rayon particule (sphérique) Viscosité fluide • Mouvement à vitesse constante r r qE V= 6πRµ Permet séparer particules en fonction de leur charge, taille (forme) Electrophorèse • Mouvement à vitesse constante r r qE V= 6πRµ • Application numérique – – – – Eau µ=0,001 SI q=1 électron R=1 nm E=10000 V/m V=85µm/s Nécessité d’appliquer de fortes tensions Diélectrophorèse • Force s’exerçant sur objet non nécessairement électriquement chargé plongé dans un champ électrique non uniforme • cf attraction de bouts de papier par objet électrisé Diélectrophorèse • Sous l’effet du champ la particule se polarise (déplacement de charges à l’intérieur de la particule) • La particule est attirée (dans ce cas) vers les régions où l’intensité du champ est la plus grande NB: « Magnétophorèse » • Aimant produit un champ magnétique non uniforme, plus intense tout près de l’aimant • Objet en fer « s’aimante » en présence de ce champ • L ’objet est attiré vers l’aimant où le champ est plus intense • En présence d’un champ uniforme (cf champ magnétique terrestre) objet aimanté peut s’orienter, mais ne se déplace pas Diélectrophorèse: exemple de système Zone E plus faible Zones E intense Pt SiO2 AC AC L. Yang et al, 2008 Diélectrophorèse: exemple de système Electrode Gap V=3 Volt pic à pic 50kHz L. Yang et al, 2008 Bactéries 25µm Diélectrophorèse Expression mathématique de la force (particules sphériques): r r 3 2 Fdep = 2πR ε m K∇E Gradient de (l’intensité)2 du champ électrique = Variation de E2 par unité de longueur Diélectrophorèse • Force ne change pas de signe si E change de signe Marche en AC (élimine effets parasites électrophorèse, électrolyse) • Gradient ∇E 2 = (tension appliquée)2 / (distance)3 – Distance ~25µm, petite, donc ∇E 2 grand Marche avec tensions faibles Diélectrophorèse Expression mathématique de la force: r r 3 2 Fdep = 2πR ε m K∇E Rayon particule εr Permittivité diélectrique du fluide ε 0ε r = 9 36π .10 = avec ε ~80 pour H 0 r 2 Diélectrophorèse Expression mathématique de la force: r r 3 2 Fdep = 2πR ε m K∇E « Facteur de Clausius-Mossotti » (de l’ordre de l’unité, mais signe varie suivant le couple particulefluide et la fréquence de la tension, cf ci-après) Diélectrophorèse • Si K>0 particules attirées par zones E fort (« pDEP ») • Si K<0 particules repoussées vers zone E faible (« nDEP »): lévitation de particules dans « piège diélectrophorétique » (équilibre entre force DEP et poids) Diélectrophorèse Variation de K avec fréquence pour différents type de cellules K>0: pDEP K<0: nDEP Y. Huang et al, 2001 Diélectrophorèse: variation du signe de la force diélectrophorétique Electrode Gap Bactéries 25µm 3Volt, 50kHz: pDEP L. Yang et al, 2008 Dielectrophorèse: variation du signe de la force dielectrophorétique Electrode Gap Bactéries 25µm 3Volt, 1kHz: nDEP L. Yang et al, 2008 3Volt, 10kHz 3Volt, 50kHz: pDEP Application de nDEP à transport de cellules sur microsystème http://www-dsv.cea.fr/var/plain/storage/original/media/File/biopuces_film_02.avi Fuchs, Manaresi et al , 2006 Application de nDEP à transport de cellules sur microsystème http://www-dsv.cea.fr/var/plain/storage/original/media/File/biopuces_film_02.avi Fuchs, Manaresi et al , 2006 Application de nDEP à transport de cellules sur microsystème Projection optique d’un motif sur substrat photoconducteur: « électrodes virtuelles » reconfigurables Chiou, Ohta et Wu , 2005 Application de nDEP à transport de cellules sur microsystème Chiou, Ohta et Wu , 2005 Forces magnétiques Magnétophorèse Expression mathématique de la force: r r 1 3 2 Fmgp = 2πR X∇ B µm Rayon particule Gradient intensité Perméabilité magnétique champ magnétique du fluide Facteur Clausius-Mossotti magnétique (Dia)Magnétophorèse Expression mathématique de la force: r r 1 3 2 Fmgp = 2πR X∇ B µm Pour la plupart des matériaux biologiques X<0: particules expulsées des zones où B est intense (Dia)Magnétophorèse Force diamagnétique r B = 16T A. Geim, 1997 Grenouille lévitant dans une bobine magnétique verticale Poids (Dia)magnétophorèse Version micro Chetouani, Haguet, Reyne et al, 2007 (Dia)Magnétophorèse Pour la plupart des matériaux biologiques X<0: particules expulsées des zones où B est intense Exceptions: -globules rouges avec hémoglobine déoxygénée -cellules marquées avec particules ferromagnétiques Dans ce dernier cas forces relativement énormes! Magnétophorèse Exemple de microsystème: Pamme et Wilhelm, 2006 Forces optiques Forces optiques « Pression de radiation » du rayonnement solaire pousse la queue des comètes Comète Hale-Bopp (1997) Conséquence de la quantité de mouvement du photon p=hν/c Forces optiques: Pression de radiation • Absorption, réflexion ou réfraction d’un faisceau lumineux uniforme par une particule r F Absorption des photons pousse la particule r F Déviation des photons répartis symétriquement par rapport au centre de la particule conduit à force résultante dirigée suivant direction de la lumière Forces optiques: « Force de gradient » • Réflexion ou réfraction d’un faisceau lumineux d’intensité non uniforme par une particule r F Déviation des photons répartis non uniformément: force résultante oblique pousse particule vers zone la plus éclairée Forces optiques: « Force de gradient » • Réflexion ou réfraction d’un faisceau lumineux d’intensité non uniforme par une particule r r 3 2 Fgrad = 2πR ε mopt K opt ∇E Même effet que force de diélectrophorèse Sauf que ε et K n’ont pas du tout les mêmes valeurs Forces optiques: « Force de gradient » • Réflexion ou réfraction d’un faisceau lumineux d’intensité non uniforme: exemple où K<0 Bulle dans un liquide: Signe de K: cf signe de nm-nparticule r F Indices de réfraction En résumé, deux types de forces exercées par la lumière: • Pression de radiation: flux de lumière pousse les particules éclairées • Force de gradient: attire (en général) les particules vers les régions de fort éclairement Mise en évidence en 1970 par Ashkin sur des microparticules avec faisceau laser focalisé Exemple: guidage et propulsion de particules par la lumière confinée dans un guide optique Caméra CCD Objectif de microscope Guide d’onde Micro-particules en suspension dans l’eau Substrat Silicium Gaugiran et al 2005 Guidage et propulsion de particules par la lumière confinée dans un guide d’onde optique FGRAD Profil intensité lumineuse F GRAD FPrad FGRAD laser FPrad FGRAD Particule Lumière diffusée Gaugiran et al 2005 F Guidage microparticules de verre (diamètre 1µm) (Gaugiran et coll., 2005) Guidage cellules biologiques (levures et bactéries) (Gaugiran, Colas et coll., 2005) Tri cellules biologiques (cellules «Jurkat» et bactéries) (Colas, Gaugiran et coll., 2005) Utilisation des forces radiatives pour immobiliser des particules • Il faut Fgradient > F pression radiation • Deux possibilités – Annuler Fpression si 2 faisceaux sens opposés – Gradient très fort: Faisceau très focalisé (« pince optique », Ashkin 1986)) Piégeage par un seul faisceau focalisé: pince optique Modulateur spatial de lumière (« SLM »): hologramme digital par réflexion La lame de cristal liquide se comporte comme une lame biréfringente de déphasage ajustable par le V appliqué Permet de « sculpter » le front d’onde: multiples points focaux, dans différents plans, de différentes formes Application à la manipulations de plusieurs particules simultanément Chapin et al 2006 Exemple: FACS microfluidique avec force optique Perroud et al 2008 Ordres de grandeur Particule « biologique » de diamètre 1µm dans eau • Poids • Poids-Archimède • Force de frottement visqueux • « Forces sans contact » Ordres de grandeur Particule « biologique » de diamètre 1µm dans eau 0,5.10-14 N • Poids • Poids-Archimède 0,5.10-16 à 0,5.10-15 N • Force de frottement visqueux • « Forces sans contact » Ordres de grandeur Particule « biologique » de diamètre 1µm dans eau • Poids-Archimède 0,5.10-16 à 0,5.10-15 N r r • Force de frottement visqueux FV = 6πRµV V=10µm/s • « Forces sans contact » FV = 2,4.10-14 N Ordres de grandeur Particule « biologique » de diamètre 1µm dans eau • Poids-Archimède 0,5.10-16 à 0,5.10-15 N r r • Force de frottement visqueux FV = 6πRµV V=10µm/s FV = 2,4.10-14 N Force de gravité faible en pratique • « Forces sans contact » Ordres de grandeur Particule « biologique » de diamètre 1µm dans eau r r • Force de frottement visqueux FV = 6πRµV V=10µm/s • « Forces sans contact » – Diélectrophorèse – Magnétophorèse – Forces optiques FV = 2,4.10-14 N Ordres de grandeur Particule « biologique » de diamètre 1µm dans eau • Force de frottement visqueux V=10µm/s FV = 2,4.10-14 N r r 3 2 • Force diélectrophorèse: Fdep = 2πR ε m K∇E – Tension de 2V sur électrodes espacées de 20µm (E = 105V/m et gradient( E2 ) = 5.1014 V2/m3) – Facteur Clausius Mossotti K~1 Fdep = 2,8.10-13 N Ordres de grandeur Particule « biologique » de diamètre 1µm dans eau • Force de frottement visqueux V=10µm/s FV = 2,4.10-14 N r r 2 3 1 X∇B • Force magnétophorèse: Fmgp = 2πR µm – 1Tesla /10µm – Facteur Clausius Mossotti magnétique X~10-5 Fmgp = 1,6.10-13 N Ordres de grandeur Particule « biologique » de diamètre 1µm dans eau • Force de frottement visqueux V=10µm/s FV = 2,4.10-14 N • Force magnétophorèse: – NB Avec cellules marquées par des billes magnétiques, facile d ’avoir des forces 100 ou 1000 fois plus grandes Ordres de grandeur Particule « biologique » de diamètre 1µm dans eau • Force de gradient optique: cf diélectrophorèse r r 2 3 Fgrad = 2πR ε mopt K opt ∇E sauf que champ électrique oscille à fréquence optique: – εmopt = n2ε0 = (1,33)²ε0 (au lieu de 80ε0 en diélectrophorèse) – et K opt = 2 n 2p − nmopt n + 2n 2 p 2 mopt ≈ 0,03 Ordres de grandeur Particule « biologique » de diamètre 1µm dans eau • Force de gradient optique: cf diélectrophorèse r r 2 3 Fgrad = 2πR ε mopt K opt ∇E • On joue sur l’intensité de E: 1mW focalisé sur 1µm E~6,9.105V/m, gradient E2=4,8.1017 V2/m3 donne -13 Fmgp = 1,8.10 N • NB s’extrapole mal si R augmente Retour sur diélectrophorèse Facteur de Clausius-Mossotti Variation de K avec type de cellule et fréquence d’oscillation de E Retour sur diélectrophorèse • -0,5 < K < 1 • K dépend de la fréquence • Cellules biologiques vivantes – K<0 à basse fréquence et à haute fréquence (repoussées par E) – K>0 à Moyenne fréquence (attirées par E) Retour sur diélectrophorèse ε p −εm K= ε p + 2ε m Facteur de Clausius-Mossotti εp permittivité diélectrique de la particule εm permittivité diélectrique du milieu fluide (eau+) Retour sur diélectrophorèse ε p −εm K= ε p + 2ε m Facteur de Clausius-Mossotti Si εp >> εm K = 1 Si εp << εm K = -0,5 Mais pourquoi dépend de ω ? Retour sur diélectrophorèse Tenir compte de la conductivité de la matière! ε −ε K = ℜe ε + 2ε * p * p ε = ε rpε 0 − * p iσ p ω iσ m * ε m = ε rmε 0 − ω * m * m Conductivités de la particule et du milieu fluide Retour sur diélectrophorèse Tenir compte de la conductivité de la matière! ε −ε K = ℜe ε + 2ε * p * p ε = ε rpε 0 − * p iσ p ω iσ m * ε m = ε rmε 0 − ω * m * m A basse fréquence σ p −σ m K= σ p + 2σ m Retour sur diélectrophorèse A basse fréquence σ p −σ m K= σ p + 2σ m Facteur de Clausius-Mossotti Si σp >> σm K = 1 Si σp << σm K = -0,5 Retour sur diélectrophorèse A basse fréquence σ p −σ m K= σ p + 2σ m Facteur de Clausius-Mossotti En pratique σp >> σm (cytoplasme milieu salin, tampon non ionique) mais K <0 …? Retour sur diélectrophorèse Tenir compte aussi de la structure de la particule Intérieur conducteur ε = ε rpε 0 − * p Milieu extérieur ε = ε rmε 0 − * m R iσ m ω iσ p ω δ Membrane isolante εmem Retour sur diélectrophorèse Tenir compte aussi de la structure de la particule (membrane isolante épaisseur δ +intérieur conducteur) ε −ε K = ℜe ε + 2ε * eff * eff * m * m Cf Y. Huang, 1992 * ε eff R + δ 2 ε *p − ε mem = ε mem +2 * ε p + 2ε mem R ε = ε rmε 0 − * m iσ m ω R + δ 3 ε *p − ε mem − * R ε p + 2ε mem ε = ε rpε 0 − * p iσ p ω Retour sur diélectrophorèse Tenir compte aussi de la structure de la particule (membrane isolante épaisseur δ +intérieur conducteur) -A très haute fréquence régime purement diélectrique, effets de conductivité négligeable ε p −εm K= ε p + 2ε m Retour sur diélectrophorèse Tenir compte aussi de la structure de la particule (membrane isolante épaisseur δ +intérieur conducteur) -A moyenne fréquence impédance de la membrane négligeable, effets de conductivité importants, σ p −σ m K= σ p + 2σ m Retour sur diélectrophorèse Tenir compte aussi de la structure de la particule (membrane isolante épaisseur δ +intérieur conducteur) -A basse fréquence impédance de la membrane fondamentale K ≈ −0,5 Transition entre basse et moyenne fréquence pour 1 1 1 ν≈ ⋅ ≈ 2 1 2σ p R 4πR ε0εmem / δ rC Retour sur diélectrophorèse • K dépend de ω • K dépend des propriétés diélectriques du milieu et de la particule • K dépend des conductivités du milieu et de la particule • K est fortement modifié par la présence d’une membrane isolante autour de la particule Cf Y. Huang et al Phys. Med. Biol. 37 1499 (1992) Retour sur diélectrophorèse • K dépend de ω • K dépend des propriétés diélectriques du milieu et de la particule • K dépend des conductivités du milieu et de la particule • K est fortement modifié par la présence d’une membrane isolante autour de la particule Cf Y. Huang et al Phys. Med. Biol. 37 1499 (1992) Applications possibles au diagnostic et au tri... Influence de la taille des particules • Forces de gradient proportionnelles à R3 • Poids proportionnel à R3 – Rapport indépendant de R – Mais si R grand il faut relâcher le gradient: – d’où en pratique une limite maximum à la taille R des particules manipulables Influence de la taille des particules • Forces de gradient proportionnelles à R3 • Force de viscosité proportionnel à R – Difficile de bouger particule R petit, et donc limite inférieure à la taille des particules manipulables Influence de la taille des particules • Forces de gradient proportionnelles à R3 • Energie d’agitation thermique 3/2kT indépendante de R – Impose une limite inférieure à la taille des particules immobilisables (augmenter le gradient…) Conclusion Comparaison des différentes méthodes • Diélectrophorèse • Magnétophorèse • Optique Conclusion Comparaison des différentes méthodes • Diélectrophorèse – – – – Forces intenses Permet différenciation de particules Compatible avec microsystèmes, pilotage temps réel Nécessite implantation électrodes • Magnétophorèse • Optique Conclusion Comparaison des différentes méthodes • Diélectrophorèse • Magnétophorèse – Ne nécessite pas de source d’énergie – Non spécifique sauf si marquage par particules magnétiques fonctionnalisées – Force pas facilement modifiable en temps réel • Optique Conclusion Comparaison des différentes méthodes • Diélectrophorèse • Magnétophorèse • Optique – Souplesse de l’adressage par faisceau optique – Peu spécifique – Extrapolation peu favorable aux grosses particules (mais possibilité de jouer sur Plaser)
