Isolement et identification de microorganismes indigènes de

Isolement et identification de microorganismes indigènes de cacaoyères
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Sciences & Nature Vol.6 N°1: 71 - 82 (2009)
Article original
Isolement et identification de microorganismes indigènes de cacaoyères
en Côte d’Ivoire et mise en évidence de leurs effets antagonistes vis-àvis de Phytophthora palmivora, agent de la pourriture brune des
cabosses.
Ismaël B. KEBE1*, Joseph MPIKA1, Kouamé F. N’GUESSAN1, Prakash K. HEBBAR2, Gary S. SAMUELS2 & Severin AKE3
2
1
CNRA, BP 808 Divo, Côte d’Ivoire.
USDA-ARS, Beltsville, MD 20705, USA.
3
Université de Cocody, UFR Biosciences, Côte d’Ivoire
*Auteur pour les correspondances (Email : [email protected])
Reçu le 07-02-2008, accepté le 21-04-2009.
Résumé
En Côte d’Ivoire, avec des pertes de production qui avoisinent 60 % dans certaines régions, la lutte contre la pourriture
brune des cabosses du cacaoyer est devenue une priorité. La stratégie préconisée par la recherche est le
développement d’une méthode de lutte intégrée, peu onéreuse et compatible avec les préoccupations
environnementales. L’une des approches privilégiées de cette stratégie est l’utilisation des antagonistes naturels
de Phytophthora sp. Dans cette optique, la biodiversité a été explorée dans l’écosystème de la cacaoyère. Des
champignons et des bactéries ont été isolés à partir des sols sous cacaoyères et des cabosses. L’action antagoniste
des champignons sur P. palmivora a été évaluée in vitro ainsi que la sensibilité foliaire à P. palmivora sur des disques
de feuilles de cacaoyers en présence des bactéries. Les résultats montrent qu’en culture mixte avec P. palmivora,
des isolats de Trichoderma sp ont montré un effet fongistatique et fongicide. Une réduction significative des notes
de sensibilité selon l’échelle de Blaha a été obtenue avec deux bactéries, appartenant au genre Bacillus. L’étude
se poursuit avec l’évaluation de l’efficacité des antagonistes naturels de Phytophthora sp en milieu réel sur le
cacaoyer.
Mots clés : Cacaoyer ; pourriture brune ; Phytophthora ; Trichoderma ; antagonistes
Abstract
Isolation and identification of indigenous micro-organisms of cocoa farms in Côte d’Ivoire and
assessment of their antagonistic effects on Phytophthora sp, the causal agent of black pod disease.
In Côte d’Ivoire, yield losses due to Phytophthora sp. reach of about 60% in some cocoa growing areas; therefore,
the control of cocoa black pod disease has become a priority. The management strategy is based on the
development of an integrated control method which is cost effective and environmentally sound. The emphasis has
been put on the use of natural antagonists of Phytophthora sp. Thus, the microbial biodiversity in the cocoa
ecosystem has been explored. Fungi and bacteria have been isolated from pods and soil in cocoa farms. The
antagonistic effects of these micro-organisms on Phytophthora sp. have been assessed in vitro. In addition, the
leaf susceptibility to P. palmivora was assessed on cocoa leaf disks in the presence of the bacteria. The results
showed that in a mix culture with P. palmivora, some isolates of Trichoderma sp. showed fungicidal effects. Two
bacteria belonging to the genus Bacillus significantly reduced cocoa leaf susceptibility to P. palmivora. The study
will continue to assess the efficacy of the potentially effective micro-organisms in the field for the control of the
black pod disease.
Key words: Cocoa tree, Black pod disease, Phytophthora, Trichoderma, antagonists.
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KEBE I. Boubacar et al.
1. Introduction
La pourriture brune des cabosses due à
Phytophthora spp est une maladie très
préjudiciable du cacaoyer. Au niveau mondial, elle
engendre des pertes de production de l’ordre de
30 % (Lass, 1985). La Côte d’Ivoire, premier
producteur mondial de cacao, avec plus de 44 %
de l’offre (ICCO, 2000), n’échappe pas à cette
affection. Plusieurs espèces de Phytophthora
peuvent être à l’origine de la maladie. Deux
espèces, P. palmivora et P. megakarya, sont les
plus importantes en Afrique. La première, la plus
cosmopolite, sévit dans tous les pays producteurs
de cacao, causant des pertes de l’ordre de 20 à 30
% ; la deuxième, endémique en Afrique centrale et
de l’Ouest, est la plus agressive. Ce pathogène
peut engendrer dans certains pays, la perte de la
totalité de la production de cacao (Flood 2006). En
Côte d’Ivoire, depuis l’apparition de P. megakarya
dans le secteur Est du verger, vers la fin des années
1990, la pourriture brune des cabosses prend de
plus en plus d’ampleur (Koné, 1999 ; Kouamé,
2006). Les pertes de production sont passées
d’une moyenne de 10 % à 30-45 % (Kébé et al.,
1996). Ainsi, la lutte contre la pourriture brune des
cabosses en Côte d’Ivoire devient une priorité.
Bien que la lutte chimique soit mise au point par la
recherche, la vulgarisation de cette méthode a
connu peu de succès en milieu paysan. Le faible
niveau d’adoption de cette technologie par les
producteurs s’explique aussi bien par le coût élevé
des fongicides, que par la pénibilité du travail due
à la collecte de l’eau des traitements et l’application
des produits. Par ailleurs, les exigences du marché
international en termes de qualité du cacao
marchand, les préoccupations environnementales, la santé des consommateurs, les
différents moratoires en la matière de la part des
partenaires commerciaux (Anonyme 2006), sont
autant d’éléments qui ne favorisent pas le
développement de la lutte chimique. La stratégie
adoptée est le développement d’une méthode de
lutte intégrée, peu onéreuse et compatible avec
les préoccupations environnementales. Cette
approche s’articule autour de trois axes : la lutte
agronomique, la résistance variétale et la lutte
biologique. Le programme de recherche en lutte
biologique contre les maladies à Phytophthora sp,
a démarré en 2000.
Au cours de la présente étude, la biodiversité a
été explorée dans des écosystèmes de
cacaoculture. Des champignons et des
bactéries ont été collectés à partir des sols sous
cacaoyères et des cabosses et une collection
de microorganismes a été constituée. L’action
antagoniste des champignons sur P. palmivora
a été évaluée in vitro ainsi que la sensibilité
foliaire à P. palmivora sur des disques de feuilles
de cacaoyers en présence des bactéries.
2. Matériel et méthodes
2.1. Echantillons et milieux de culture
Les microorganismes utilisés au cours de cette
étude ont été isolés des écosystèmes de
cacaoculture, notamment à partir des sols sous
cacaoyers et des cabosses. Les échantillons de
sol ont été collectés dans des cacaoyères
localisées dans la région d’Abengourou, dans l’Est
de la Côte d’Ivoire, et dans la région de Divo dans
le Centre - Ouest de la Côte d’Ivoire. Dans chacune
des deux localités, les échantillons de sol ont été
prélevés dans 8 cacaoyères réparties en deux
catégories de parcelles selon l’âge. La première
catégorie est constituée de 4 parcelles jeunes (3
à 5 ans), en phase d’installation dont la canopée
est encore ouverte avec une litière peu abondante
au sol. La seconde catégorie est constituée de 4
parcelles adultes (25 à 30 ans) en pleine
production avec une canopée bien fermée et une
litière abondante au sol. Dans chaque parcelle,
un échantillon composite de 800 g de sol a été
constitué à partir de 4 prélèvements effectués au
pied de 4 cacaoyers chargés de cabosses saines,
choisis de manière aléatoire dans les parties
homogènes de la parcelle. Avant chaque
prélèvement, la surface du sol a été d’abord
débarrassée des feuilles mortes et des débris
végétaux. Les prises d’échantillons de sol ont été
ensuite effectuées dans les couches superficielles
qui du fait du travail du sol et de la fertilisation est
colonisée par le chevelu racinaire des cacaoyers.
C’est donc dans cet horizon de 30 à 40 cm
d’épaisseur que les échantillons sont prélevés
(Davet et Rouxel, 1997). Chaque échantillon
composite est soigneusement mélangé et divisé
en deux parties égales qui sont recueillies dans
des boîtes en plastique. Dans l’une des deux
boîtes, des pièges constitués de fragments de
cortex de cabosses infectées par Phytophthora
palmivora, ont été enfouis dans l’échantillon de
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sol pour servir d’appâts aux antagonistes (Tim et
al., 2003). L’autre boîte ne contient pas de piège.
Afin d’obtenir une bonne colonisation des pièges,
les échantillons sont conservés au laboratoire à
la température de 26 °C pendant 30 jours.
Les cabosses ayant servi à l’isolement des
microorganismes ont été collectées dans les
principales zones de production cacaoyère de
Côte d’Ivoire. Ainsi 390 cabosses saines ont été
prélevées dans les 13 régions productrices de
cacao. Dans chaque région, la collecte a été
effectuée dans 10 plantations. 3 cabosses ont
été prélevées par parcelle. Les cabosses
prélevées sont conservées dans des sachets
plastiques renfermant des étiquettes portant les
coordonnées des prélèvements et ramenées au
laboratoire pour l’isolement des endophytes.
De nombreux champignons et bactéries isolés
du sol ou des cabosses ont été désignés par
plusieurs auteurs comme potentiels agents de
lutte contre les maladies des plantes (Evans et
al., 2003 ; Krauss and Soberanis, 2001 ; Shari,
2000). Ainsi, pour évaluer la diversité des deux
groupes cibles dans les sols sous cacaoyers et
dans les cabosses, quatre milieux de culture
sélectifs ont été éprouvés. Pour l’isolement des
bactéries, le milieu PCAT « P. cepacia Azelaic
acid tryptamine», spécifique des Pseudomonas
et des Burkhoderia (Burbage, 1982), et le milieu
NYD «nutrient yeast dextrose» (Guizzardi et
Pratella, 1996), adapté à un spectre plus large
de bactéries ont été utilisés. Pour l’isolement
des champignons, le milieu TME «Trichoderma
medium», spécifique des champignons
appartenant aux genres Trichoderma. et
Gliocladium (Papavizas et Lumsden, 1982) a été
éprouvé. Le milieu PDA «potato dextrose agar»,
adapté à un spectre plus large de champignons,
a été utilisé pour l’isolement des autres
champignons.
2.2. Isolement des microorganismes
2.2.1. Endophytes des cabosses
La surface des cabosses est préalablement
lavée à l’eau du robinet, puis a subi une série
de désinfection à l’éthanol à 95 %, pendant 30
secondes, dans l’hypochlorite de sodium à 10
%, pendant 2 minutes puis dans l’éthanol à 75
% pendant 2 minutes, de manière à éliminer
73
les microorganismes présents sur le cortex. Les
cabosses sont ensuite rincées trois fois à l’eau
distillée stérile pour éliminer les traces de
désinfectant (Arnold, 1999 ; Evans, et al., 2003 ;
Rubini et al ., 2005). La zone de prélèvement est
choisie et les tissus superficiels sont décapés
à l’aide d’un scalpel stérile. Dix morceaux de
forme cubique de 5 à 7 mm de côté ont été
prélevés par cabosse dans les tissus sous
corticaux. Les fragments prélevés sont mis en
culture sur les milieux sélectifs contenus dans
des boites de Pétri. L’incubation est faite à
l’obscurité dans une étuve, à 26 °C pendant 2
jours pour les bactéries et 7 jours pour les
champignons.
2.2.2. Microorganismes du sol.
Les microorganismes ont été obtenus, par
isolement direct, à partir du sol selon la méthode
décrite par Davet & Rouxel (1997) et à partir des
fragments pièges de cortex de cabosses
enfouis dans les échantillons de sol. Les
échantillons de sol ont été préalablement
séchés, broyés et calibrés par tamisage. Les
fragments pièges du fait de la consistance
gélatineuse du cortex des cabosses en
décomposition, sont broyés dans un mortier en
porcelaine émaillée pour individualiser chaque
propagule vivante. Dans les deux cas, 10 g du
broyat sont transférés dans 90 ml d’eau distillée
stérile contenue dans un Erlenmeyer. Le
mélange est ensuite mis en agitation pendant
30 minutes pour obtenir une bonne dilacération
des particules. Pour obtenir une concentration
variable de propagules et
faciliter le
dénombrement des colonies une série de
dilution est réalisée à partir de la solution mère
dont la concentration est de 10-1 (Rapilly, 1968).
Pour obtenir une solution à 10 -2, 1 ml de la
solution mère est transféré dans 9 ml d’eau
distillée stérile. Ainsi, une série de dilution allant
de 10 -2 à 10 -9 est réalisée dans des tubes
d’hémolyse. 100 de chaque dilution est étalée
sur les milieux de culture contenus dans des
boîtes de Pétri. Pour chaque dilution et pour
chaque milieu de culture 4 boîtes de pétri sont
ensemencées.
L’incubation est faite à l’obscurité dans une étuve,
à 26 °C pendant 2 jours pour les bactéries et 7
jours pour les champignons.
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2.3. Conservation des microorganismes
Les microorganismes isolés sont d’abord purifiés
par deux ou trois repiquages successifs
monospore ou mono-colonie sur des milieux de
culture spécifiques. Une fois purifié, chaque isolat
est désigné par un numéro de code. Pour les
souches bactériennes, le numéro de code est
précédé par la lettre B, suivi d’un numéro d’ordre.
La nomenclature des isolats de champignon
commence par la ou les premières lettres du nom
du genre, suivi d’un numéro d’ordre. La
conservation des microorganismes ainsi
désignés se fait au congélateur à une température
de – 80°C pour les bactéries, et à – 10°C pour les
champignons. Dans les deux cas, des disques de
gélose prélevés sur le pourtour de la culture purifiée,
sont transférés dans des microtubes d’Eppendorf
stériles de 1,5 ml, contenant du glycérol à 50 %.
2.4. Evaluation de l’action antagoniste des
microorganismes.
L’action antagoniste des microorganismes isolés
contre P. palmivora a été évaluée par deux tests.
Le premier test réalisé in vitro, est un test de
confrontation directe entre P palmivora et le
microorganisme en culture mixte. Le second test
est réalisé in vivo sur des disques de feuilles de
cacaoyer. Le test consiste à mesurer la sensibilité
foliaire à P. palmivora selon une échelle qui varie
de 0 à 5 (Nyasse et al., 1995)., en présence du
microorganisme.
Le test de confrontation Trichoderma-P. palmivora
à été réalisé dans des boîtes de pétri contenant
un milieu de culture gélosé à base de bouillon de
pomme de terre (milieu PDA). Un fragment
mycélien de 6 mm de diamètre est prélevé sur le
pourtour des cultures de chacun des deux
champignons. Ces fragments sont repiqués face
à face dans la même boîte de pétri, à 2 centimètres
du centre de la boîte (Benhanou et Chet, 1996).
Les témoins sont des monocultures de chacun
des 2 champignons éprouvés. Dans ce cas,
l’explant est déposé au centre de la boîte de pétri. Six
répétitions sont ainsi réalisées pour objet. L’incubation
est réalisée à l’obscurité dans une étuve
cryptogamique. 24 heures après la mise en culture,
la croissance mycélienne de chaque explant est
mesurée quotidiennement jusqu’au plein de la boîte.
Sept jours après la rencontre des filaments
mycéliens des deux champignons, la survie des
propagules de P. palmivora a été évaluée par le
prélèvement d’explants dans la boîte de culture
mixte selon un axe qui passe par le centre de la
boîte et les explants d’ensemencement des deux
champignons. Deux prélèvements consécutifs
sont espacés de 0,5 cm. Neuf explants sont ainsi
prélevés dans chaque boîte de culture mixte. Les
fragments mycéliens ainsi prélevés, sont placés
dans des ouvertures réalisées sur le cortex de
cabosses saines de cacaoyers prélevées sur un
même clone, indemnes d’attaques de
Phytophthora sp. Les cabosses ainsi inoculées
sont placées dans des cristallisoirs dans laquelle
l’humidité est entretenue par un tampon de coton
hydrophile stérile imbibé d’eau distillée stérile.
L’incubation est réalisée à la température
ambiante du laboratoire. La survie de Phytophthora
est évaluée par le dénombrement des taches de
pourriture brune initiées à la surface des cabosses
inoculées après 15 jours d’observation
quotidienne. La présence de Phytophthora dans
les taches de pourriture est ensuite confirmée par
des observations réalisées au microscope optique.
L’évaluation de l’action des bactéries sur P.
palmivora été réalisée par le test feuille. Ce test
est effectué sur des disques de feuilles de
cacaoyer de 15 mm de diamètre. Les disques de
feuille sont préalablement trempés dans la
suspension bactérienne pendant une minute puis
disposés dans des bacs sur une plaque de
mousse imbibée d’eau. Chaque disque reçoit
alors 10 μl d’une suspension calibrée à 3.105
zoospores/ml. Les témoins ne subissent pas le
trempage dans la suspension bactérienne. Ils ne
reçoivent que la suspension de zoospores. Les
disques de feuilles ont été prélevés sur 3 clones
de cacaoyer dont la réaction à Phytophthora sp est
connue (Tahi et al., 2000). Ainsi, le clone sensible
(IFC5), le clone moyennement résistant (P7), et le
clone résistant (SCA6) ont été éprouvés. Pour
chaque clone, 40 disques de feuille ont été inoculés
et repartis dans 4 bacs constituant chacun une
répétition. L’incubation a été réalisée à l’obscurité à
26°C pendant 7 jours. Les résultats ont été notés
selon l’échelle de Blaha (Nyassé et al., 1995).
2.5. Analyses des données
Le logiciel SAS (Statistical Analysis System, SAS
Institute, Cary, NC) a été utilisé pour toutes les
analyses statistiques. Pour les isolements des
microorganismes et le test sur disques de feuille,
les analyses de variance (ANOVA) ont porté sur le
nombre moyen des colonies de microorganismes
dénombrées sur milieu de culture et la note
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moyenne de sensibilité foliaire à Phytophthora en
présence des bactéries. La normalité des
résiduels et l’homogénéité des variances ont été
vérifiées. Les comparaisons entre les moyennes
ont été faites selon le test de Student Newman et
Keuls au seuil de 5 %.
3. Résultats
3.1. Microorganismes isolés
Pourcentage
L’exploration de la biodiversité au sein des
microorganismes issus des sols sous
cacaoyers et des endophytes des cabosses, a
75
mis en évidence deux catégories de
microorganismes : les champignons et les
bactéries. Au niveau des cabosses, les
champignons représentent 66,31 % des
isolements positifs, contre 33,04 % pour les
bactéries. Ces deux types de microorganismes
se retrouvent en proportions inversées au niveau
du sol : 55, 8 % pour les bactéries et 29,8 %
pour les champignons. Dans le groupe des
champignons, les levures qui représentent 11,6
% de la population au niveau des cabosses ne
représentent plus que 3,7 % au niveau du sol.
Parmi les bactéries isolées, les actinomycètes
qui ne représentent que 0,64 % au niveau des
cabosses, passent à 10,5 % au niveau du sol.
80
Endophytes des cabosses
70
Sol sous cacaoyers
60
50
40
30
20
10
0
Champignons Bactéries
divers
diverses
Levures
Actimycétes
Microorganismes
Figure 1: Groupes de microorganismes et leur importance relative dans le sol sous cacaoyers et dans le cortex
des cabosses
Les résultats des analyses statistiques
montrent que le nombre moyen de colonies de
microorganismes dénombrées par gramme de
sol varie de manière significative (au seuil de
5%), en fonction de la technique d’isolement,
avec ou sans pièges. Ce résultat révèle que
l’utilisation de fragments de cabosses infectées
par Phytophthora comme piège, améliore
significativement le rendement des isolements
sur les milieux PDA, TME et PCAT (Tableau 1).
L’analyse des échantillons prélevés dans la
région de Divo et d’Abengourou n’a révélé, au
plan statistique, aucune différence significative
(au seuil de 5%) du nombre moyen de colonies
en fonction de la localité pour les différents milieux
de culture éprouvés sauf pour le NYD. Aucune
relation directe n’est établie entre la densité des
microorganismes isolés et l’âge des cacaoyères
sauf pour les bactéries sur le milieu de culture
NYD à Abengourou (Tableau 2).
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Tableau 1 : Nombre moyen de colonies dénombrées par gramme de sol en fonction de la technique d’isolement et
du milieu de culture.
Milieux de culture
Techniques
NYD
PDA
TME
Isolement direct
3,27.1011 a± 2,14.1011
4,72.106 a± 1,42.106
4,64.105 a±1,6.105
5,1.105 a± 2,5.105
PCAT
Isolement par piégeage
3,80.1011 a± 2,35.1011
2,43.109 b±1,41.109
6,1.106b±1,6.106
7,64.107 b ± 3,67.107
Les moyennes de la même colonne suivies de la même lettre ne sont pas significativement différentes au seuil de 5 % selon le test
de Student Newman & Keuls
Tableau 2 : Nombre moyen de colonies dénombrées par gramme de sol en fonction des localités et de l’âge des
cacaoyères.
Localités
Abengourou
Divo
Type cacaoyère
Jeune
Adulte
Jeune
Adulte
NYD
1,9.107a ±1,42.107
1,38.1012b±4,31.1010
5,81.107a ±4,78.107
3,2.1010a ±2,15.1010
Milieux de culture
PDA
TME
1,75.106a±0
4,67.106a±2,2.106
1,15.107b±1,11.106
5,97.106a±3,22106
2,05.108a±1,42.108
1,42.106a±7,96.105
9
9
3,45.10 a±1,99.10
1.106a ±5,76.105
PCAT
1,2.108 a±6,96.1
2,77.107a±1,52.
5,75.106 a±4.106
5,78.104a±3,77.
Les moyennes de la même colonne affectées de la même lettre pour chaque localité ne sont pas significativement différentes au seuil
de 5 % selon le test de Student Newman & Keuls.
3.2. Identification des organismes isolés
Au niveau des cabosses, 313 isolats de
champignons ont été purifiés. Parmi les isolats
purifiés, cinquante huit (58) isolats appartenant à
9 genres ont été identifiés. Il s’agit de Trichoderma
sp (7), Penicillium sp (6), Fusarium sp (7), Botrytis
sp. (2), Pestalotia sp. (24). Le reste des isolats
identifiés appartiennent aux genres Nigrospora (2),
Physoderma (1), Polynema (1), et Botryodiplodia
(8). Les autres isolats (255) appartiennent à des
espèces ou genres divers dont l’appartenance n’a
pu être encore identifiée.
Cent deux (102) colonies bactériennes endophytes
des cabosses ont été isolées. Ces bactéries
appartiennent à deux groupes selon les réponses
aux réactions chimiques colorées : 56 bactéries
Gram positif (45 bacilles et 11 coques) et 46
bactéries gram négatif (9 bacilles et 37 coques).
Les colonies bactériennes B105 et B116 ont été
identifiées comme appartenant au genre Bacillus.
Enfin, 55 souches levuriformes et 2 isolats
d’actinomycètes ont été identifiés.
Au niveau du sol, sur 450 isolats collectés et
purifiés, 254 bactéries, 136 champignons, 48
actinomycètes et 17 levures ont été identifiés. Dans
le groupe des champignons, 15 isolats appartiennent au genre Trichoderma. Quatre espèces
ont été identifiées. Il s’agit de T. virens (6 isolats),
T. harzianum (6 isolats), T. hamatum (2) et T.
spirale (1 isolats). Trois isolats appartenant au
genre Clonostachys ont également été identifiés
3.3. Action des organismes sur Phytophthora
palmivora
3.3.1. Action de Trichoderma sur la croissance
mycélienne de P. palmivora
Les tests de confrontation directe réalisés in
vitro, entre les isolats de Trichoderma sp, et de
Phytophthora palmivora mettent en évidence une
action inhibitrice de Trichoderma sur P.
palmivora en culture mixte.
Après trois jours de confrontation, l’inhibition de
la vitesse devient très forte et la croissance de
P. palmivora devient pratiquement nulle (Fig. 3).
La capacité de Trichoderma à bloquer la
croissance mycélienne de P. palmivora révèle
un effet fongistatique avéré. A partir du quatrième
jour, on note une disparition progressive du
mycélium de P. palmivora. Cette dégradation du
mycélium de P. palmivora qui est plus marquée
au cinquième jour, avec tous les isolats, révèle
une action mycoparasitique de Trichoderma.
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Après 7 jours de confrontation, en culture
mixte, la survie des propagules de P.
palmivora a été évaluée. L’influence de
Trichoderma sp. a varié selon les isolats. Le
pourcentage de survie de Phytophthora varie
respectivement de 90 à 50 % avec les isolats
Culture pure
Phytophthora
palmivora
77
Trichoderma 3 et Trichoderma 6. Ce taux
passe de 30 à 10 % avec Trichoderma 2 et 4.
Enfin, la présence de Trichoderma 1 et 5 en
culture mixte, a un effet fongicide très net qui a
été observé avec un pourcentage de survie de
P. palmivora égal à 0.
Culture Mixe
P. palmivora / Trichoderma sp.
Culture pure
Trichoderma sp
Trichoderma 1
peu compétitif
Trichoderma 2
très compétitif
Phytophthora palmivora
partiellement envahi
Par Trichoderma 1
Phytophthora palmivora
entièrement envahi avec
destruction du mycélium
Par Trichoderma 2
Diamètre de croissance mycélienne (mm)
Figure 2 : Boîtes de Pétri montrant des cultures pures et des cultures mixtes de P. palmivora et Trichoderma sp. in vitro.
100
90
PP
80
Tricho
70
P/Tricho1
60
P/Tricho 2
50
P/Tricho 3
40
P/Tricho 4
30
P/Tricho 5
20
P/Tricho 6
10
0
1
2
3
4
5
Temps (jours)
Figure 3 : Influence des isolats de Trichoderma sp. sur la croissance mycélienne de P. palmivora
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3.3.2. Influence des bactéries sur la sensibilité
foliaire à P. palmivora
clone résistant (SCA 6), les notes de sensibilité
foliaire varient de 2,75 à 0,37 avec respectivement les souches bactériennes B104 et B105
(Fig. 4). Avec le clone moyennement résistant
(P7), la note de sensibilité varie dans les
mêmes proportions (Fig. 5).
L’action de 37 souches bactériennes sur P.
palmivora a été évaluée par le test sur des disques
de feuilles. Les résultats montrent que, pour le
3,5
a
3
ab
ab
ab ab
Notes de sensibilité
2,5
ab ab ab ab ab
ab
2
ab ab ab ab
ab ab
ab ab ab
ab
ab b
1,5
b b b b b b
bc bc bc bc
bc bc bc bc
1
c
c
0,5
temoin
B104
B132
B108
B84
B127
B4
B122
B132
B85
B92
B103
B130
B54
B14
B108
B4
B141
B13
B121
B135
B106
B99
B140
B86
B124
B113
B110
B88
B129
B20
BB10
B69
B10
B114
B102
B123
B116
B105
0
Souches de bactéries
Figure 4 : Effet des souches bactériennes sur la sensibilité foliaire à Phytophthora palmivora d’un clone de cacaoyer
résistant (SCA6).
Les barres surmontées de la même lettre ne sont pas significativement différentes au seuil de 5 % selon le test de Student Newman & Keuls.
3,5
3
Notes de sensibilité
2,5
2
1,5
a
ab
ab
ab ab
ab ab ab ab ab
ab
ab ab ab ab
ab
ab
ab ab ab
ab
b b
b b
b b b b
b
b b b
bc bc bc bc
c
1
c
0,5
temoin
B104
B132
B84
B108
B85
B22
B120
B122
B127
B92
B103
B130
B54
B14
B108
B4
B121
B141
B13
B135
B106
B99
B140
B86
B142
B113
B110
B88
B69
BB10
B20
B129
B10
B102
B123
B114
B116
B105
0
Souches de bactéries
Figure 5 : Effet des souches bactériennes sur la sensibilité foliaire à Phytophthora palmivora d’un clone de cacaoyer
moyennement résistant (P7).
Les barres surmontées de la même lettre ne sont pas significativement différentes au seuil de 5 % selon le test de Student Newman & Keuls.
Sci. Nat. Vol. 6 N°1 : 71 - 82 (2009)
Isolement et identification de microorganismes indigènes de cacaoyères
Dans les deux cas, les analyses de variance
révèlent un effet bactérie significatif au seuil de
5% selon le test de Student Newman & Keuls et
mettent en évidence l’existence de 5 groupes
homogènes de bactéries (a, ab, b, bc, et c). L’effet
le plus marqué a été obtenu avec les bactéries
BI05 et B116 (groupe c). Avec le clone sensible
79
IFC 5, on note que la réduction des notes de
sensibilité foliaire est nettement plus faible. Les
notes de sensibilité varient de 3,6 à 2,5. Les
analyses statistiques ne révèlent aucune
différence significative au seuil de 5% entre les
objets traités avec les suspensions
bactériennes et le témoin non traité (Fig. 6).
4,5
4
a
Notes de sensibilité
3,5
a a
a a a a
a a a a a aa a a a a a aa
a a a a aa
3
2,5
a a a a a a
aa a a
a a
a
2
1,5
1
0,5
B92
temoin
B124
B113
B88
B129
B54
B140
B86
B84
B20
B122
B103
B99
B141
B4
B120
B108
B18
B124
B104
B10
B227
B22
B132
B106
B85
B69
B14
B116
B118
B135
B123
B114
B105
BB10
B102
B129
B113
B88
0
Souches bactériennes
Figure 6 : Effet des souches bactériennes sur la sensibilité foliaire à Phytophthora palmivora d’un clone de cacaoyer
sensible (IFC5).
Les barres surmontées de la même lettre ne sont pas significativement différentes au seuil de 5 % selon le test de Student Newman & Keuls.
4. Discussion
Cette étude a permis de mettre en évidence
l’existence d’une forte biodiversité au sein de la
population de microorganismes dans l’écosystème de la cacaoyère. Au niveau des deux
composantes explorées, le sol et les endophytes
des cabosses, la biodiversité s’avère variée aux
plans qualitatif et quantitatif.
Les endophytes sont des microorganismes qui
colonisent les tissus des plantes hôtes sans
provoquer de symptômes visibles en condition
normale (Carroll, 1998). Depuis le début des
années 2000, ces organismes sont couramment
étudiés dans les plantes tropicales pour leur
utilisation en lutte biologique ou pour la production
de substances ayant des propriétés pharmacologiques (Azevedo, 2002 ; Peixoto-Neto, 2002).
Les isolements réalisés sur les cabosses du
cacaoyer ont montré une prédominance des
champignons (66,31 %), contre 33,04 % de
bactéries. Des résultats similaires ont été obtenus
par Evans et al. (2003) et Rubini et al. (2005). Au
niveau du sol, les résultats de l’étude ont
également montré une forte prolifération des deux
catégories de microorganisme avec une plus forte
proportion de bactéries. Les sols sous cacaoyers
et les cabosses constituent donc des sites de
prédilection de microorganismes indigènes,
antagonistes potentiels de P palmivora, occupant
la même niche écologique.
Les résultats montrent que l’utilisation de pièges
à microorganismes, constitués de fragments de
cabosses de cacaoyers, infectés par P.
palmivora, améliore de manière significative le
rendement des isolements de micro-
Sci. Nat. Vol. 6 N°1 : 71 - 82 (2009)
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KEBE I. Boubacar et al.
organismes au niveau du sol. Cette amélioration
pourrait s’expliquer par une affinité entre P.
palmivora et les microorganismes collectés.
L’examen de la liste des microorganismes isolés
révèle l’existence de champignons et de bactéries
identifiés par de nombreux auteurs comme ayant
un effet antagoniste avéré contre des agents
pathogènes responsables de maladies des
plantes. C’est le cas des genres Trichoderma et
Clonostachys, dont plusieurs espèces sont
éprouvées dans la lutte contre les maladies du
cacaoyer (Sanogo et al., 2002 ; Krauss et
Soberanis, 2001 ; Tondje et al., 2007 ; Samuels,
1996). Dans le groupe des bactéries, l’effet
antagoniste du genre Bacillus a été mis en
évidence par Shari Fuddin, 2000.
Les tests de confrontations directes réalisés in
vitro entre P. palmivora et les isolats Trichoderma
ont mis en évidence un effet allant de l’inhibition
de la croissance mycélienne (effet fongistatique),
à la dégradation puis la disparition du mycélium
de P. palmivora (mycoparasitisme et effet
fongicide). Des résultats similaires ont été obtenus
avec Trichoderma harzianum sur Fusarium
oxysporum (Hibar et al., 2005). En Amérique
centrale, des résultats analogues ont été
également obtenus avec Trichoderma
stromaticum dans la lutte contre la maladie des
balais de sorcière du cacaoyer et avec Trichoderma
virens contre la pourriture brune des cabosses
(Krauss & Soberanis, 2002). Cette étude a donc
permis d’isoler et purifier plusieurs antagonistes
potentiels de Phytophthora sp, susceptibles d’être
utilisés dans la lutte contre la pourriture brune
des cabosses du cacaoyer.
L’étude de l’action des souches bactériennes sur
P. palmivora par le test sur disques de feuilles, a
mis en évidence une réduction de la sensibilité
foliaire à P. palmivora des clones de cacaoyers
résistants (SCA6) ou moyennement résistants
(P7). Par contre, cet effet est moins perceptible
avec le clone sensible (IFC5). Des résultats
analogues ont été obtenus par Maurhofer et al.
(1994) sur le tabac, Duijff et al., 1997) sur la tomate
et Chen et al (1998) sur le concombre. Ces
résultats pourraient révéler un renforcement de la
résistance intrinsèque du matériel végétal par les
souches bactériennes. Les effets les plus forts
ont été enregistrés avec les souches bactériennes
B 105 et B 116, ce qui fait de ces deux souches
bactériennes des candidats potentiels à la lutte
biologique contre P. palmivora. Ces deux bactéries
appartiennent au genre Bacillus doté d’une
aptitude à sporuler, ce qui pourrait présager une
bonne aptitude à la dissémination dans le cadre
d’un programme de lutte biologique.
5. Conclusion
Les résultats montrent qu’il est possible
d’identifier des antagonistes naturels à
Phytophthora sp issus de la microflore indigène
des cacaoyères. Ainsi, plusieurs isolats de
Trichoderma et des souches bactériennes ont
révélé un effet antagoniste avéré contre P
palmivora en laboratoire. Cette efficacité laisse
entrevoir la possibilité d’utiliser ces microorganismes dans la lutte contre les maladies à
Phytophthora sp du cacaoyer. Toutefois, cette
éventualité ne pourra être envisagée que si
l’efficacité observée in vitro, se confirme en
milieu réel sur le cacaoyer. La mise en œuvre
de cette seconde phase de l’étude nécessite la
maîtrise de la technique de production massive
de la biomasse des microorganismes éprouvés
pour la réalisation des essais.
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