Isolement et identification de microorganismes indigènes de

Sci. Nat. Vol. 6 N°1 : 71 - 82 (2009)
Isolement et identification de microorganismes indigènes de cacaoyères 71
Sciences & Nature Vol.6 N°1: 71 - 82 (2009)
Isolement et identification de microorganismes indigènes de cacaoyères
en Côte d’Ivoire et mise en évidence de leurs effets antagonistes vis-à-
vis de Phytophthora palmivora, agent de la pourriture brune des
cabosses.
Ismaël B. KEBE1*, Joseph MPIKA1, Kouamé F. N’GUESSAN1, Prakash K. HEBBAR2, Gary S. SAMUELS2 & Severin AKE3
1CNRA, BP 808 Divo, Côte d’Ivoire.
2USDA-ARS, Beltsville, MD 20705, USA.
3Université de Cocody, UFR Biosciences, Côte d’Ivoire
*Auteur pour les correspondances (Email : [email protected])
Reçu le 07-02-2008, accepté le 21-04-2009.
Résumé
En Côte d’Ivoire, avec des pertes de production qui avoisinent 60 % dans certaines régions, la lutte contre la pourriture
brune des cabosses du cacaoyer est devenue une priorité. La stratégie préconisée par la recherche est le
développement d’une méthode de lutte intégrée, peu onéreuse et compatible avec les préoccupations
environnementales. L’une des approches privilégiées de cette stratégie est l’utilisation des antagonistes naturels
de Phytophthora sp. Dans cette optique, la biodiversité a été explorée dans l’écosystème de la cacaoyère. Des
champignons et des bactéries ont été isolés à partir des sols sous cacaoyères et des cabosses. L’action antagoniste
des champignons sur P. palmivora a été évaluée in vitro ainsi que la sensibilité foliaire à P. palmivora sur des disques
de feuilles de cacaoyers en présence des bactéries. Les résultats montrent qu’en culture mixte avec P. palmivora,
des isolats de Trichoderma sp ont montré un effet fongistatique et fongicide. Une réduction significative des notes
de sensibilité selon l’échelle de Blaha a été obtenue avec deux bactéries, appartenant au genre Bacillus. L’étude
se poursuit avec l’évaluation de l’efficacité des antagonistes naturels de Phytophthora sp en milieu réel sur le
cacaoyer.
Mots clés : Cacaoyer ; pourriture brune ; Phytophthora ; Trichoderma ; antagonistes
Abstract
Isolation and identification of indigenous micro-organisms of cocoa farms in Côte d’Ivoire and
assessment of their antagonistic effects on Phytophthora sp, the causal agent of black pod disease.
In Côte d’Ivoire, yield losses due to Phytophthora sp. reach of about 60% in some cocoa growing areas; therefore,
the control of cocoa black pod disease has become a priority. The management strategy is based on the
development of an integrated control method which is cost effective and environmentally sound. The emphasis has
been put on the use of natural antagonists of Phytophthora sp. Thus, the microbial biodiversity in the cocoa
ecosystem has been explored. Fungi and bacteria have been isolated from pods and soil in cocoa farms. The
antagonistic effects of these micro-organisms on Phytophthora sp. have been assessed in vitro. In addition, the
leaf susceptibility to P. palmivora was assessed on cocoa leaf disks in the presence of the bacteria. The results
showed that in a mix culture with P. palmivora, some isolates of Trichoderma sp. showed fungicidal effects. Two
bacteria belonging to the genus Bacillus significantly reduced cocoa leaf susceptibility to P. palmivora. The study
will continue to assess the efficacy of the potentially effective micro-organisms in the field for the control of the
black pod disease.
Key words: Cocoa tree, Black pod disease, Phytophthora, Trichoderma, antagonists.
Article original

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1. Introduction
La pourriture brune des cabosses due à
Phytophthora spp est une maladie très
préjudiciable du cacaoyer. Au niveau mondial, elle
engendre des pertes de production de l’ordre de
30 % (Lass, 1985). La Côte d’Ivoire, premier
producteur mondial de cacao, avec plus de 44 %
de l’offre (ICCO, 2000), n’échappe pas à cette
affection. Plusieurs espèces de Phytophthora
peuvent être à l’origine de la maladie. Deux
espèces, P. palmivora et P. megakarya, sont les
plus importantes en Afrique. La première, la plus
cosmopolite, sévit dans tous les pays producteurs
de cacao, causant des pertes de l’ordre de 20 à 30
% ; la deuxième, endémique en Afrique centrale et
de l’Ouest, est la plus agressive. Ce pathogène
peut engendrer dans certains pays, la perte de la
totalité de la production de cacao (Flood 2006). En
Côte d’Ivoire, depuis l’apparition de P. megakarya
dans le secteur Est du verger, vers la fin des années
1990, la pourriture brune des cabosses prend de
plus en plus d’ampleur (Koné, 1999 ; Kouamé,
2006). Les pertes de production sont passées
d’une moyenne de 10 % à 30-45 % (Kébé et al.,
1996). Ainsi, la lutte contre la pourriture brune des
cabosses en Côte d’Ivoire devient une priorité.
Bien que la lutte chimique soit mise au point par la
recherche, la vulgarisation de cette méthode a
connu peu de succès en milieu paysan. Le faible
niveau d’adoption de cette technologie par les
producteurs s’explique aussi bien par le coût élevé
des fongicides, que par la pénibilité du travail due
à la collecte de l’eau des traitements et l’application
des produits. Par ailleurs, les exigences du marché
international en termes de qualité du cacao
marchand, les préoccupations environ-
nementales, la santé des consommateurs, les
différents moratoires en la matière de la part des
partenaires commerciaux (Anonyme 2006), sont
autant d’éléments qui ne favorisent pas le
développement de la lutte chimique. La stratégie
adoptée est le développement d’une méthode de
lutte intégrée, peu onéreuse et compatible avec
les préoccupations environnementales. Cette
approche s’articule autour de trois axes : la lutte
agronomique, la résistance variétale et la lutte
biologique. Le programme de recherche en lutte
biologique contre les maladies à Phytophthora sp,
a démarré en 2000.
Au cours de la présente étude, la biodiversité a
été explorée dans des écosystèmes de
cacaoculture. Des champignons et des
bactéries ont été collectés à partir des sols sous
cacaoyères et des cabosses et une collection
de microorganismes a été constituée. L’action
antagoniste des champignons sur P. palmivora
a été évaluée in vitro ainsi que la sensibilité
foliaire à P. palmivora sur des disques de feuilles
de cacaoyers en présence des bactéries.
2. Matériel et méthodes
2.1. Echantillons et milieux de culture
Les microorganismes utilisés au cours de cette
étude ont été isolés des écosystèmes de
cacaoculture, notamment à partir des sols sous
cacaoyers et des cabosses. Les échantillons de
sol ont été collectés dans des cacaoyères
localisées dans la région d’Abengourou, dans l’Est
de la Côte d’Ivoire, et dans la région de Divo dans
le Centre - Ouest de la Côte d’Ivoire. Dans chacune
des deux localités, les échantillons de sol ont été
prélevés dans 8 cacaoyères réparties en deux
catégories de parcelles selon l’âge. La première
catégorie est constituée de 4 parcelles jeunes (3
à 5 ans), en phase d’installation dont la canopée
est encore ouverte avec une litière peu abondante
au sol. La seconde catégorie est constituée de 4
parcelles adultes (25 à 30 ans) en pleine
production avec une canopée bien fermée et une
litière abondante au sol. Dans chaque parcelle,
un échantillon composite de 800 g de sol a été
constitué à partir de 4 prélèvements effectués au
pied de 4 cacaoyers chargés de cabosses saines,
choisis de manière aléatoire dans les parties
homogènes de la parcelle. Avant chaque
prélèvement, la surface du sol a été d’abord
débarrassée des feuilles mortes et des débris
végétaux. Les prises d’échantillons de sol ont été
ensuite effectuées dans les couches superficielles
qui du fait du travail du sol et de la fertilisation est
colonisée par le chevelu racinaire des cacaoyers.
C’est donc dans cet horizon de 30 à 40 cm
d’épaisseur que les échantillons sont prélevés
(Davet et Rouxel, 1997). Chaque échantillon
composite est soigneusement mélangé et divisé
en deux parties égales qui sont recueillies dans
des boîtes en plastique. Dans l’une des deux
boîtes, des pièges constitués de fragments de
cortex de cabosses infectées par Phytophthora
palmivora, ont été enfouis dans l’échantillon de

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sol pour servir d’appâts aux antagonistes (Tim et
al., 2003). L’autre boîte ne contient pas de piège.
Afin d’obtenir une bonne colonisation des pièges,
les échantillons sont conservés au laboratoire à
la température de 26 °C pendant 30 jours.
Les cabosses ayant servi à l’isolement des
microorganismes ont été collectées dans les
principales zones de production cacaoyère de
Côte d’Ivoire. Ainsi 390 cabosses saines ont été
prélevées dans les 13 régions productrices de
cacao. Dans chaque région, la collecte a été
effectuée dans 10 plantations. 3 cabosses ont
été prélevées par parcelle. Les cabosses
prélevées sont conservées dans des sachets
plastiques renfermant des étiquettes portant les
coordonnées des prélèvements et ramenées au
laboratoire pour l’isolement des endophytes.
De nombreux champignons et bactéries isolés
du sol ou des cabosses ont été désignés par
plusieurs auteurs comme potentiels agents de
lutte contre les maladies des plantes (Evans et
al., 2003 ; Krauss and Soberanis, 2001 ; Shari,
2000). Ainsi, pour évaluer la diversité des deux
groupes cibles dans les sols sous cacaoyers et
dans les cabosses, quatre milieux de culture
sélectifs ont été éprouvés. Pour l’isolement des
bactéries, le milieu PCAT « P. cepacia Azelaic
acid tryptamine», spécifique des Pseudomonas
et des Burkhoderia (Burbage, 1982), et le milieu
NYD «nutrient yeast dextrose» (Guizzardi et
Pratella, 1996), adapté à un spectre plus large
de bactéries ont été utilisés. Pour l’isolement
des champignons, le milieu TME «Trichoderma
medium», spécifique des champignons
appartenant aux genres Trichoderma. et
Gliocladium (Papavizas et Lumsden, 1982) a été
éprouvé. Le milieu PDA «potato dextrose agar»,
adapté à un spectre plus large de champignons,
a été utilisé pour l’isolement des autres
champignons.
2.2. Isolement des microorganismes
2.2.1. Endophytes des cabosses
La surface des cabosses est préalablement
lavée à l’eau du robinet, puis a subi une série
de désinfection à l’éthanol à 95 %, pendant 30
secondes, dans l’hypochlorite de sodium à 10
%, pendant 2 minutes puis dans l’éthanol à 75
% pendant 2 minutes, de manière à éliminer
les microorganismes présents sur le cortex. Les
cabosses sont ensuite rincées trois fois à l’eau
distillée stérile pour éliminer les traces de
désinfectant (Arnold, 1999 ; Evans, et al., 2003 ;
Rubini et al ., 2005). La zone de prélèvement est
choisie et les tissus superficiels sont décapés
à l’aide d’un scalpel stérile. Dix morceaux de
forme cubique de 5 à 7 mm de côté ont été
prélevés par cabosse dans les tissus sous
corticaux. Les fragments prélevés sont mis en
culture sur les milieux sélectifs contenus dans
des boites de Pétri. L’incubation est faite à
l’obscurité dans une étuve, à 26 °C pendant 2
jours pour les bactéries et 7 jours pour les
champignons.
2.2.2. Microorganismes du sol.
Les microorganismes ont été obtenus, par
isolement direct, à partir du sol selon la méthode
décrite par Davet & Rouxel (1997) et à partir des
fragments pièges de cortex de cabosses
enfouis dans les échantillons de sol. Les
échantillons de sol ont été préalablement
séchés, broyés et calibrés par tamisage. Les
fragments pièges du fait de la consistance
gélatineuse du cortex des cabosses en
décomposition, sont broyés dans un mortier en
porcelaine émaillée pour individualiser chaque
propagule vivante. Dans les deux cas, 10 g du
broyat sont transférés dans 90 ml d’eau distillée
stérile contenue dans un Erlenmeyer. Le
mélange est ensuite mis en agitation pendant
30 minutes pour obtenir une bonne dilacération
des particules. Pour obtenir une concentration
variable de propagules et faciliter le
dénombrement des colonies une série de
dilution est réalisée à partir de la solution mère
dont la concentration est de 10-1 (Rapilly, 1968).
Pour obtenir une solution à 10-2, 1 ml de la
solution mère est transféré dans 9 ml d’eau
distillée stérile. Ainsi, une série de dilution allant
de 10-2 à 10-9 est réalisée dans des tubes
d’hémolyse. 100 de chaque dilution est étalée
sur les milieux de culture contenus dans des
boîtes de Pétri. Pour chaque dilution et pour
chaque milieu de culture 4 boîtes de pétri sont
ensemencées.
L’incubation est faite à l’obscurité dans une étuve,
à 26 °C pendant 2 jours pour les bactéries et 7
jours pour les champignons.

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2.3. Conservation des microorganismes
Les microorganismes isolés sont d’abord purifiés
par deux ou trois repiquages successifs
monospore ou mono-colonie sur des milieux de
culture spécifiques. Une fois purifié, chaque isolat
est désigné par un numéro de code. Pour les
souches bactériennes, le numéro de code est
précédé par la lettre B, suivi d’un numéro d’ordre.
La nomenclature des isolats de champignon
commence par la ou les premières lettres du nom
du genre, suivi d’un numéro d’ordre. La
conservation des microorganismes ainsi
désignés se fait au congélateur à une température
de – 80°C pour les bactéries, et à – 10°C pour les
champignons. Dans les deux cas, des disques de
gélose prélevés sur le pourtour de la culture purifiée,
sont transférés dans des microtubes d’Eppendorf
stériles de 1,5 ml, contenant du glycérol à 50 %.
2.4. Evaluation de l’action antagoniste des
microorganismes.
L’action antagoniste des microorganismes isolés
contre P. palmivora a été évaluée par deux tests.
Le premier test réalisé in vitro, est un test de
confrontation directe entre P palmivora et le
microorganisme en culture mixte. Le second test
est réalisé in vivo sur des disques de feuilles de
cacaoyer. Le test consiste à mesurer la sensibilité
foliaire à P. palmivora selon une échelle qui varie
de 0 à 5 (Nyasse et al., 1995)., en présence du
microorganisme.
Le test de confrontation Trichoderma-P. palmivora
à été réalisé dans des boîtes de pétri contenant
un milieu de culture gélosé à base de bouillon de
pomme de terre (milieu PDA). Un fragment
mycélien de 6 mm de diamètre est prélevé sur le
pourtour des cultures de chacun des deux
champignons. Ces fragments sont repiqués face
à face dans la même boîte de pétri, à 2 centimètres
du centre de la boîte (Benhanou et Chet, 1996).
Les témoins sont des monocultures de chacun
des 2 champignons éprouvés. Dans ce cas,
l’explant est déposé au centre de la boîte de pétri. Six
répétitions sont ainsi réalisées pour objet. L’incubation
est réalisée à l’obscurité dans une étuve
cryptogamique. 24 heures après la mise en culture,
la croissance mycélienne de chaque explant est
mesurée quotidiennement jusqu’au plein de la boîte.
Sept jours après la rencontre des filaments
mycéliens des deux champignons, la survie des
propagules de P. palmivora a été évaluée par le
prélèvement d’explants dans la boîte de culture
mixte selon un axe qui passe par le centre de la
boîte et les explants d’ensemencement des deux
champignons. Deux prélèvements consécutifs
sont espacés de 0,5 cm. Neuf explants sont ainsi
prélevés dans chaque boîte de culture mixte. Les
fragments mycéliens ainsi prélevés, sont placés
dans des ouvertures réalisées sur le cortex de
cabosses saines de cacaoyers prélevées sur un
même clone, indemnes d’attaques de
Phytophthora sp. Les cabosses ainsi inoculées
sont placées dans des cristallisoirs dans laquelle
l’humidité est entretenue par un tampon de coton
hydrophile stérile imbibé d’eau distillée stérile.
L’incubation est réalisée à la température
ambiante du laboratoire. La survie de Phytophthora
est évaluée par le dénombrement des taches de
pourriture brune initiées à la surface des cabosses
inoculées après 15 jours d’observation
quotidienne. La présence de Phytophthora dans
les taches de pourriture est ensuite confirmée par
des observations réalisées au microscope optique.
L’évaluation de l’action des bactéries sur P.
palmivora été réalisée par le test feuille. Ce test
est effectué sur des disques de feuilles de
cacaoyer de 15 mm de diamètre. Les disques de
feuille sont préalablement trempés dans la
suspension bactérienne pendant une minute puis
disposés dans des bacs sur une plaque de
mousse imbibée d’eau. Chaque disque reçoit
alors 10 μl d’une suspension calibrée à 3.105
zoospores/ml. Les témoins ne subissent pas le
trempage dans la suspension bactérienne. Ils ne
reçoivent que la suspension de zoospores. Les
disques de feuilles ont été prélevés sur 3 clones
de cacaoyer dont la réaction à Phytophthora sp est
connue (Tahi et al., 2000). Ainsi, le clone sensible
(IFC5), le clone moyennement résistant (P7), et le
clone résistant (SCA6) ont été éprouvés. Pour
chaque clone, 40 disques de feuille ont été inoculés
et repartis dans 4 bacs constituant chacun une
répétition. L’incubation a été réalisée à l’obscurité à
26°C pendant 7 jours. Les résultats ont été notés
selon l’échelle de Blaha (Nyassé et al., 1995).
2.5. Analyses des données
Le logiciel SAS (Statistical Analysis System, SAS
Institute, Cary, NC) a été utilisé pour toutes les
analyses statistiques. Pour les isolements des
microorganismes et le test sur disques de feuille,
les analyses de variance (ANOVA) ont porté sur le
nombre moyen des colonies de microorganismes
dénombrées sur milieu de culture et la note

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moyenne de sensibilité foliaire à Phytophthora en
présence des bactéries. La normalité des
résiduels et l’homogénéité des variances ont été
vérifiées. Les comparaisons entre les moyennes
ont été faites selon le test de Student Newman et
Keuls au seuil de 5 %.
3. Résultats
3.1. Microorganismes isolés
L’exploration de la biodiversité au sein des
microorganismes issus des sols sous
cacaoyers et des endophytes des cabosses, a
mis en évidence deux catégories de
microorganismes : les champignons et les
bactéries. Au niveau des cabosses, les
champignons représentent 66,31 % des
isolements positifs, contre 33,04 % pour les
bactéries. Ces deux types de microorganismes
se retrouvent en proportions inversées au niveau
du sol : 55, 8 % pour les bactéries et 29,8 %
pour les champignons. Dans le groupe des
champignons, les levures qui représentent 11,6
% de la population au niveau des cabosses ne
représentent plus que 3,7 % au niveau du sol.
Parmi les bactéries isolées, les actinomycètes
qui ne représentent que 0,64 % au niveau des
cabosses, passent à 10,5 % au niveau du sol.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Champignons
divers
Bactéries
diverses
Levures Actimycétes
Microorganismes
Pourcentage
Endophytes des cabosses
Sol sous cacaoyers
Figure 1: Groupes de microorganismes et leur importance relative dans le sol sous cacaoyers et dans le cortex
des cabosses
Les résultats des analyses statistiques
montrent que le nombre moyen de colonies de
microorganismes dénombrées par gramme de
sol varie de manière significative (au seuil de
5%), en fonction de la technique d’isolement,
avec ou sans pièges. Ce résultat révèle que
l’utilisation de fragments de cabosses infectées
par Phytophthora comme piège, améliore
significativement le rendement des isolements
sur les milieux PDA, TME et PCAT (Tableau 1).
L’analyse des échantillons prélevés dans la
région de Divo et d’Abengourou n’a révélé, au
plan statistique, aucune différence significative
(au seuil de 5%) du nombre moyen de colonies
en fonction de la localité pour les différents milieux
de culture éprouvés sauf pour le NYD. Aucune
relation directe n’est établie entre la densité des
microorganismes isolés et l’âge des cacaoyères
sauf pour les bactéries sur le milieu de culture
NYD à Abengourou (Tableau 2).