CONTRÔLE DE L`ACTIVITÉ ENZYMATIQUE IN

Contrôle de l'activité métabolique (2TSbc )
CONTRÔLE DE L'ACTIVITÉ ENZYMATIQUE IN-VIVO;
notions de régulations métaboliques
La régulation d'une activité enzymatique peut s'expliquer par des phénomènes liés aux
lois de la chimie ( loi d'action de masse, déplacement d'équilibre, compétitions d'enzyme au
niveau d'un substrat commun) mais ces régulations n'ont pas alors une grande souplesse
d'adaptation et ne permettent pas d'expliquer certains phénomènes comme:
- Toutes les enzymes ne fonctionnent pas en même temps dans une cellule
- Les réactions enzymatiques sont réglées en fonctions des besoins de la cellule
Ainsi, on peut déterminer cinq types de régulations enzymatiques qui permettent de
comprendre la plupart des phénomènes biologiques liés aux enzymes.
Régulation
Régulation par
due à la modification covalente
de la structure
cinétique
enzymatique
michaélienne
*Activation
permanente d'un
précurseur inactif par
l'activité Ez hydrolyse
augmente si (ex:
la [S] ...
*Modifications
covalentes réversibles
Régulation
allostérique
(modifications non
covalentes)
Cas de certaines
enzymes
dites
allostériques
pour lesquelles il
existe
une
modification non
covalente
réversible
(ex: phosphorylation
et déphosphorylation)
Régulation par
l'existence
d'isoenzymes
Régulation par
modification du
taux de synthèse
d'enzyme
Cas d'enzymes
capables
de
catalyser
une
même réaction
mais
à
des
vitesses
différentes
*Action directe
sur la synthèse
protéique (action
au niveau du
génome
inductionrépréssion)
*Actions
d'hormones
(Stéroïdiennes et
thyroïdiennes)
1- ENZYMES DE RÉGULATION MODULÉES DE FACON COVALENTE,
exemple du mécanisme de phosphorylation / déphosphorylation
Ces modifications covalentes des structures enzymatiques sont catalysées par d'autres
enzymes selon le schéma suivant:
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Rq: Les modifications covalentes concernent non seulement les groupements phosphates mais aussi d'autres
groupements chimiques ( nucléotides (adénylation; uridylation); groupements méthyl; etc...)
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1-1- L'exemple type du mécanisme de phosphorylation/déphosphorylation : la glycogène
phosphorylase:
Cette enzyme est présente dans certains tissus animaux (muscle, foie) et catalyse
l'hydrolyse d'un polyoside de réserve: le glycogène pour former le glucose 1 phosphate qui
pourra être utilisé par la cellule en entrant dans les réactions de la glycolyse.
La glycogène phosphorylase existe sous deux formes:
- phosphorylase a (active)
- phosphorylase b (inactive)
La phosphorylase a est un oligomère constitué par deux sous unités dimériques et chaque
sous-unité est phosphorylée. On peut enlever les groupements phosphates par hydrolyse, cette
réaction est catalysée par une enzyme: la phosphorylase phosphatase et permet donc de former
la phosphorylase b.
La réaction inverse est catalysée par une autre enzyme: la phosphorylase kinase.
Pour résumer les modifications covalentes on peut écrire:
Rq:
l'action de la kinase est stimulée par deux hormones hyperglycémiantes: l'adrénaline et le
glucagon
l'action de la phosphorylase est stimulée par une hormone hypoglycémiante: ....
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La propriété essentielle de ce type d'enzyme est de pouvoir amplifier un signal
chimique.
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1-2-L'amplification du signal de phosphorylation/déphosphorylation:
Toutes les enzymes peuvent apporter une amplification, c'est à dire une molécule
d'enzyme peut catalyser la formation de milliers de molécules de produit à partir d'un substrat
donné.
Dans le cas de ces enzymes de régulation l'amplification est d'autant plus importante que des
phénomènes hormonaux entrent en jeu.
La fixation d'une hormone (Adrénaline, glucagon) sur son récepteur membranaire, (respectivement
muscle et foie), déclenche une cascade d'évènements qui permettent d'amplifier le phénomène
pour aboutir à l'activation massive de glycogène phosphorylase, ce qui entraîne donc la
formation de glucose 1 phosphate en grande quantité.
Ces phénomènes font intervenir un 2ème messager: l'AMP cyclique (voir document et voir cours de
biologie cellulaire )
HORMONE 10-10 M
Adénylate cyclase
AMPc 10-6 M
Kinase
enzyme active
Produit
(ex: Glucose 1 P)
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Rq: l'association kinase/phosphatase est une association très étroite !
article Biofutur juillet/août 1998
2- REGULATION PAR TRANSITION
ENZYMES ALLOSTERIQUES;
ALLOSTERIQUES:
LES
2.1- Notion de rétro-inhibition:
La rétro inhibition feedback négatif ou inhibition par le produit final) a été mis en évidence dans
de nombreux systèmes poly enzymatiques où le produit final de la réaction peut inhiber
spécifiquement une enzyme se trouvant au début de la séquence réactionnelle.
ex: dans les séquences réactionnelles de synthèse d'un aminoacide , l'isoleucine à partir
de la thréonine.
La première étape de la séquence réactionnelle est appelée étape déclenchante car une
fois qu'elle a lieu toutes les autres se réalisent.
Ce mécanisme permet d'assurer une économie en métabolites (si [P] , la vitesse diminue)
La rétroinhibition est donc un phénomène d'inhibition spécifique d'une enzyme placée en début de
séquence métabolique, par le produit final de séquence réactionnelle.
Ce type d'enzyme inhibé par le produit final de la réaction est appelé :....
Caractéristiques d'une enzyme allostérique:
- est inhibée uniquement par le produit final de la réaction
- le produit final n'agit pas comme un inhibiteur compétitif (structure du produit final très
différente de celle du substrat habituel de l'enzyme allostérique) il y a alors un effet allostérique
( terme proposé par Monod, Jacob, Changeux).
Cela signifie que l'action de l'inhibiteur sur une telle enzyme agit en dehors du site catalytique
- la cinétique enzymatique n'est pas de type cinétique Michaélienne
Définitions possibles d'une enzyme allostérique:
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2.2- Caractéristiques structurales et fonctionnelles des enzymes allostériques
Les enzymes allostériques ont en général un poids moléculaire plus élevé et sont plus
complexes et plus difficiles à purifier que les autres enzymes (allostérie= autre structure)
• les enzymes allostériques sont des ....
• les enzymes allostériques existent sous deux états conformationnel:
• il existe sur chaque protomère des sites de fixation pour les effecteurs (sites
allostériques).
Si l'effecteur déplace l'équilibre en faveur de la conformation qui a la plus grande affinité pour le
substrat on parle d'activateur allostérique ( coopérativité positive )
Dans le cas inverse on parle d'inhibiteur allostérique ( coopérativité .....
)
L'effecteur allostérique se fixe de manière:


La fixation au site allostérique entraîne une légère modification de structure, c'est la transition
allostérique
2.3- La cinétique des enzymes allostériques: une cinétique non michaelienne
* Étude d'une enzyme allostérique: l'isocitrate déshydrogénase:
Réaction:
• Étude la courbe vi = f([S]) (courbe A)
vi
[S]
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Conclusion:
• Étude la courbe de Lineweaver-Burk
1/vi
1/[S]
• Étude de la courbe vi = f([S]) en présence d'ADP à concentration élevée (courbe B)
*Cas général : coopérativité et modulation par les effecteurs allostériques
1- Coopérativité ou modulation par le substrat:
- Coopérativité positive: cinétique non michaélienne, courbe sigmoïde. La
fixation de la 1°molécule de S facilite la fixation des autres. Une légère augmentation de [S]
peut augmenter très rapidement la vitesse.
On considère dans ce cas que le substrat joue le rôle à la fois de substrat et d'effecteur
allostérique positif
- Coopérativité négative: on obtient une courbe plutôt aplatie
2- Modulation par les effecteurs allostériques:
La cinétique allostérique ne définit pas les termes Vm et Km comme en cinétique
michaélienne. Les termes Vm et Km en cinétique allostérique doivent êtres envisagés avec
prudence, ce sont en fait des constantes apparentes qui permettent de répartir les enzymes en
divers groupes:
- Enzymes du système V ( l'effecteur ne modifie que Vm)
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- Enzymes du système K ( l'effecteur ne modifie que l'affinité apparente de l'enzyme pour
le substrat, soit Km)
- Enzymes du système mixte (l'effecteur modifie le deux paramètre)
2-1- Action d'effecteurs négatifs les inhibiteurs allostériques sont les .....
d'une enzyme allostérique impliquée dans une séquence réactionnelle.
L'inhibiteur se fixe sur une enzyme allostérique
il s'ensuit une transition allostérique modifiant la
conformation du site actif.
ENZYMES DU SYSTÈME K
vi
vi
ENZYMES DU SYSTÈME V
[S]
[S]
2-2- Action d'effecteurs positifs: l'enzyme allostérique qui régule une séquence métabolique est
fréquemment activée par le produit final d'une autre séquence indépendante et parallèle.
Lorsque l'activateur allostérique se fixe sur le site allostérique, il s'ensuit un changement de
conformation permettant une liaison facilitée du substrat sur son site enzymatique.
Schéma:
ENZYMES DU SYSTÈME K
ENZYMES DU SYSTÈME V
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vi
vi
[S]
[S]
La transition allostérique provoque une modification du L'activateur induit une augmentation de Vm sans
site actif qui devient plus propice à la fixation de S, on modifier le Km
a donc une augmentation de l'affinité de E pour S
(baisse de Km sans modification de Vm)
La plupart des enzymes allostériques sont susceptibles d'être régulés par plusieurs effecteurs. La régulation
la plus souvent rencontrée comprend à la fois
- l'activation par le substrat (phénomène de .....
- l'inhibition par le ....
- l'activation en parallèle
RQ:
lorsque l'effecteur d'une enzyme allostérique est également son substrat, on parle d'effecteur homotrope .
On parle d'enzyme allostérique homotrope quand elles sont régulés par le substrat.
Si l'effecteur n'est pas le substrat, il s'agit d'effecteur hétérotrope. L'enzyme hétérotope est modulé par un
effecteur autre que le substrat qui agit donc sur un site différent.
3- LES ISOENZYMES : plusieurs protéines aux activités enzymatiques
identiques
Un autre mécanisme de régulation de l'activité métabolique fait intervenir les
isoenzymes.
Définition: Les isoenzymes sont des formes moléculaires multiples existant chez une espèce donnée ou
même dans une cellule donnée. Ces formes différentes d'une même enzyme se distinguent par la composition
en acides aminés et donc par leur pHi .
L'exemple historique encore d'actualité: la lactate déshydrogénase
La découverte des isoenzymes s'est faite après une électrophorèse de la LDH de lapin:
Conclusion:
pôle 5 bandes
M4
M3H
M2H2
MH3
H4
pôle +
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Répartition organique de la LDH:
coeur
rein
hématies
cerveau
leucocytes
muscle
foie
M4
+
+
+
+
+
+++++
++++
M3H
+
++
+
+
++
+++
+++
M2H2
++
+++
+
++++
+++
+
+
MH3
+++
++++
+++
++++
+
+
+
H4
++++++
+++
++
++
+
+
+
Les isoenzymes de la LDH possèdent comme propriétés:
- même masse molaire (134000)
- 4 chaînes polypeptidiques (enzyme ...
- constituent 5 combinaisons différentes
- individuellement les chaînes M et H n'ont aucune activité ....
( Ces chaînes sont codées par deux gènes différents)
- catalysent la ...
réaction mais diffèrent par leur
cinétiques.
constantes
Réaction catalysée:
• L'isoenzyme H4 (=LDH1) possède par rapport à M4 (=LDH5):
- un Km plus élevé pour le pyruvate et un Vm plus faible pour la réduction de ce dernier
cela signifie que: ....
Quel est l'intérêt de ces formes isoenzymatiques ?
Il faut raisonner à l'échelle de l'organisme; sachant que le pyruvate est une molécule du
métabolisme qui peut avoir plusieurs destinées:
- soit il est dégradé en aérobie et entre alors dans le cycle du Citrate (= cycle de Krebs)
- soit il est utilisé en absence d'oxygène et entre dans la voie fermentative (fermentation
lactique)
• Au niveau du muscle: il utilise le glucose en anaérobiose, il décompose donc le
pyruvate en lactate grâce à la LDH
L'AFFINITÉ de l'enzyme (LDH 5 =
) pour le pyruvate doit être .....
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• Au niveau du coeur: le coeur est un muscle particulièrement bien oxygéné, il est moins
intéressé par la fermentation lactique que les autres muscles.
Ceci explique la faible affinité de la LDH1 pour le pyruvate à ce niveau.
Rq: - il existe de nombreuses isoenzymes, on peut citer la Créatine phosphokinase (CPK),
l'amylase (pancréas et salive),les transaminases , etc..
- les isoenzymes ont un grand intérêt clinique, exemple de la LDH dans le diagnostic
médical.
Le taux de LDH sérique est normalement faible mais au cours de certaines maladies (au niveau
du foie ou du coeur) les tissus lésés libèrent entre autre cette enzyme dans le sang où la
concentration va augmenter.
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Document: à propos de la cinétique des enzymes allostériques !
La cinétique des enzymes allostériques ne répond pas au modèle michaélien,en effet
vi
cinétique michaélienne
cinétique allostérique
[S]
;
La courbe allostérique indique le phénomène de coopérativité positive ( liaison du substrat
à plusieurs sites : la liaison d'un substrat à un site affecte la liaison aux autres sites )
Rq: Cette allure de courbe et ce mécanisme sont retrouvés lors de la fixation de l'oxygène sur
une protéine fonctionnelle : l'hémoglobine.
Pour mesurer la cinétique de substrats sigmoïdes, on ne peut plus utiliser l'équation de
Michaélis-Menten, aussi on utilise la formule empirique que Hills a déterminée lors des études
sur l'hémoglobine. Cette équation permet de déterminer le type de coopérativité au niveau de la
liaison E-S en donnant une représentation graphique pseudo-linéaire.
Equation de Hills:
sites liés / sites totaux = [ES]/[Et] = [S]n / (K + [S]n)
où n et K sont des constantes.
pour faire une analogie avec l'équation de Michaélis-Menten, on utilise le fait que
vi =kcat [ES] , on peut alors écrire:
Représentation graphique:
vi=
k[Et].[S]n
=
K + [S]n
V. [S]n
K + [S]n

viK + vi [S]n = V [S]n


/K
viK = [S]n (V-vi)
viK/ [S]n = V - vi
log
vi
n > 1 (coopérativité pos itive)
V -vi
vi / V-vi = [S]n
log vi /V-vi = n log [S] - log K
n = 1 (enz. michaélienne)
n < 1 (coopérativité
négative)
log [S]
ATTENTION !: la constante "n" n'a rien à voir avec le nombre de sites !!
l'intérêt de ce graphique est de permettre de déterminer le type de coopération GRÀCE À LA PENTE n
- si n = 1
ENZYME MICHAELIENNE
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- si n < 1
- si n > 1
COOPÉRATIVITÉ NÉGATIVE
COOPÉRATIVITÉ POSITIVE
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