LV1 Module-Molécules de la vie 2008-2009 Travaux Dirigés n°4 Peptides Par commodité, les valeurs de pKa des différentes fonctions ionisables sont les suivantes pour l'ensemble des exercices: COOH : 2,3 NH3+ : 8,9 Phénol : 10,0 COOH : 3,9 NH3+ : 10,5 Imidazole : 6,5 COOH 4,2 Thiol 8,0 Guanidinium : 12 : : Rappel : La dégradation d’Edman coupe le 1er résidu en N-Ter, le bromure de Cyanogène en C-ter de la méthionine, La Chymotrypsine en C-ter de Phe, Tyr et Trp, la Trypsine en C-ter de Lys et Arg et la Thermolysine en N-ter de Leu, Val et Iso. EXERCICE 1 L’angiotensine II est une hormone peptidique impliquée dans la régulation de la pression artérielle. Sa séquence est la suivante. Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe 1) 2) 3) 4) Faites ressortir toutes les fonctions ionisables de ce peptide. Ecrire tous ses états d’ionisation. Déterminer le point isoélectrique de ce peptide. Calculer le pourcentage des formes présentes à plus de 1% (pH ± 2) à pH 9. EXERCICE 2 Un peptide P isolé à partir de cerveau de bœuf a été hydrolysé pendant 48h en milieu HCL 6N et sa composition en acide aminé a été déterminée : 2Asp, 2 Arg, Gly, Ile, 2 Tyr. P traité par la méthode d’Edman conduit au dérivé phénylthiohydantoïnique (PTH) de Asp. P traité par la trypsine donne 2 fragments T1 et T2 dont le poids moléculaire est semblable et environ égal à 500. La réaction d’Edman sur T2 conduit au dérivé phénylthiohydantoïnique (PTH) de Ile. P traité par la chymotrypsine donne trois fragments C1, C2, C3 qui sont passés au travers d’une colonne équilibrée à pH 7. La résine échangeuse d’anions utilisée comporte des billes de polystyrène contenant des groupements ammonium (NH3+) covalement liés aux noyaux phényls. C1 sort en premier. Son poids moléculaire est de 245 et le traitement d’Edman conduit au dérivé phénylthiohydantoïnique (PTH) de Gly. C2 sort un peu plus tard. Son poids moléculaire est de 382 et le traitement d’Edman conduit au dérivé phénylthiohydantoïnique (PTH) de Arg. C3 est retenu par la colonne. 1) Reconstituer le peptide P. 2) Quels sont les différents états d’ionisation pour les peptides T1, T2 et donner les pIs de ces 2 peptides. 3) Quelle colonne utiliseriez-vous pour séparer T1 et T2 à PH 6 ? 4) Calculer les différentes formes (en %) de T1 à pH 4,5 (intervalle 2 de pH). Le PM moyen pour un aa est de 125. EXERCICE 3 Déduisez la séquence en acide aminé d’un polypeptide à l’aide des informations suivantes. 1) 2) 3) 4) 5) Hydrolyse acide : Ala, Val ,Arg, Lys x2, Met, Leu, Ser x2 Carboxypeptidase A : Ala Trypsine : a) Val,Arg b) Lys, Leu, Ser c) Lys d) Ala, Met, Ser Bromure de Cyanogene : a) Val, Arg, Lys x2, Met, Leu, Ser b) Ala, Ser Thermolysine : a) Val, Met, Ala, Ser, Arg b) Lys, Leu c) Ser, Lys EXERCICE 4 Une protéine peut être réduite pour donner 2 peptides. Chaîne 1 : Ala-Cys-Val-Pro-Lys-Arg-Leu-Cys-Arg-Arg-Leu-Cys Chaîne 2 : Cys-Iso-Cys-Val-Cys La protéine native (ponts disulfures intacts) est digérée avec la Thermolysine et les peptides suivant sont obtenus. a) Ala, Cys x2, Leu b) Arg,Lys,Val,Pro c) Arg x2,Cys x2,Leu, Iso d) Cys x2, Val Indiquer la position des ponts disulfure dans la protéine native. EXERCICE 5 Au cours de la maladie dite du « trou de mémoire » deux hormones ont été isolées chez des patients alors qu’une seule été isolée chez le sujet sain. En fait, le patient infecté possède à la fois la protéine saine et une autre protéine mutante. Protéine normale Arg-Met-Gly-Trp-Tyr-Asp-His-Lys Protéine mutée : Arg-Met-Gly-MET-PHE-Asp-His-Lys 1/ Faire un tableau de l’évolution des charges en fonction du pH pour et et donner les pI des deux peptides en indiquant la formule utilisée. 2/ Écrire complètement la forme la plus protonnée de . 3/ Comment feriez-vous pour séparer ces deux peptides (colonne, pH, type d’élution) ? 4/ Calculer en % les différentes fractions de et à pH7 (intervalle 2 de pH).