Photos : UMR B2HM Science des procédés et de la transformation Transformer le lait Facteurs environnementaux abiotiques et physiologie microbienne Murielle Naïtali – 2011 - SPAB Quels microrganismes transforment le lait ? Flore acidifiante •Bactéries lactique Pseudomonas L. monocytogenes Flore thermorésistante S. aureus Flore d’affinage •Levure, moisissures Flore coliforme (désacidifiante, arôme, croute) •Microcoques, corynébacétries (croute, arôme) Flores originelles du lait ou levains Salmonella E. coli Flores originelles du lait ou contamination primaire et secondaire De quoi ont-ils besoin pour transformer le lait ? Source de carbone Source d’énergie Reproduction cellulaire Source d’azote Source de soufre, de phosphore Minéraux Facteurs environnementaux intrinsèques composition biochimique pH Aw potentiel redox Facteurs de croissance Production de métabolites Lactobacillus casei auxotrophe pour •Bases puriques et pyrimidiques •Vitamines B2, B6 et B12 •Acides folique et lipoïque extrinsèques température humidité ambiante composition en gaz pression, radiation Les facteurs environnementaux Les facteurs environnementaux et la croissance microbienne Présentation générale Le pH Mode d’action La température Quelle gamme pour quels microorganismes L’Aw Quels aliments sont concernés L’O2/C02 Et en dehors de la croissance ? Il n’y a pas de critère absolu ! Les facteurs environnementaux et la croissance Déterminent l’écologie microbienne des aliments en modulant le développement Population microbienne X (g/mL) ou N (UFC/mL) Vitesse spécifique de croissance ou taux de croissance µ (h-1) Temps de doublement ou de génération td ou tg (h) td =ln2/µ 1 - Phase de latence (lag , λ) : X = X0=Cste, µ = 0 Pas de mutiplication, phase d’adaptation, de réparation Phase de démarrage : µ augmente, X augmente 2 - Phase exponentielle : dX=µ.X.dt, µ=Cste=µmax pour des conditions environnementales données => X=X0.exp(µmax.t) 3 -Phase de ralentissement : µ diminue, X augmente (carence nutritionnelle, composés inhibiteurs) 4 - Phase stationnaire : µ = 0, X=Cste=Xmax 5 - Phase de lyse : X diminue La croissance exponentielle La croissance exponentielle d'une bactérie peut être définie par deux constantes : - le temps de génération(tg) ou temps de doublement (td), intervalle de temps entre deux divisions successives = temps nécessaire au doublement de la population. Si la concentration initiale est X0 au temps t0=0, par doublement successif, elle devient: Au temps t1=td après 1 doublement X1 = 2X0 Au temps t2= t1+td=2td, après 2 doublements X2 = 2X1 = 2*2X0 = 22X0 ... Au temps t=ntd, après n doublements, X = 2nX0 soit X = X0*2t/td On représente la croissance en exponentielle de base e, soit X = X0*eln2*t/td On définie alors le second paramètre - le taux de croissance ou vitesse spécifique de croissance (µ) comme la pente de la droite de croissance en considérant le logarithme népérien de X soit lnX = lnX0 + µt ou La relation entre ces deux paramètres est donc X = X0eµt µ= ln2/td Les facteurs environnementaux et la croissance Déterminent l’écologie microbienne des aliments en modulant le développement A optimiser pour favoriser le développement inhiber le développement Durée de la phase stationnaire (lag, λ) La pente de la phase exponentielle (µ, td ou tg) Le niveau de la phase stationnaire (Xmax , Nmax) et sa durée détruire les microorganismes Principalement les hautes températures => TD 1 conserver le lait mais aussi orienter la physiologie microbienne Les facteurs environnementaux et la croissance Déterminent l’écologie microbienne des aliments en modulant le développement A optimiser pour favoriser le développement inhiber le développement Taux de croissance Valeur optimale Valeur minimale Valeur maximale Valeur d ’un facteur environnemental donné Les facteurs environnementaux et la croissance Déterminent l’écologie microbienne des aliments en modulant le développement A optimiser pour favoriser le développement inhiber le développement Une croissance ralentie entraîne une population maximale moindre Lag > lagopt µmax < µmax-opt Nmax < Nmax-opt Utilisation du substrat Synthèse de précurseurs Synthèse d’ATP Synthèse de biomasse Energie de maintenance Comment agit le pH ? Mode d’action pHedu (pH)pH 1.Complexation des ions métalliques du milieu extérieur pH acide pH basique pHi Mg2+ Zn2+, Ca2+, Fe2+ 2.Modification de la perméabilité membranaire pH acide pH basique perméases cationiques saturées en H+ perméases anioniques saturées en OH- 3.Modification du métabolisme Microorganisme pHe pHi td (min) E. coli 7 5 7,3 6,8 40 140 S. Typhimurium 7 5 7,6 7,0 40 108 Fonctionnement des enzymes = f(pHi) ∆ pHe ∆ pHi mais ∆ pHe ≠ ∆ pHi pH acide, neutre, légèrement alcalin pHi > pHe pH très alcalin, pHi < pHe (rare en alimentaire) Mécanismes d’adaptation au pH Protection par - le pouvoir tampon du cytoplasme - des systèmes de transport des protons pH acide, neutre, légèrement alcalin pHi > pHe Force proton motrice Extrusion de protons Potentiel électrique ou potentiel de membrane pHi H+ > +pHe < H Gradient de pH Konings et al. 2002 pH et microorganismes Microorganismes Levures Moisissures Bactéries Pseudomonas sp. Staphylococcus sp. St. pneumoniae C. diphteriae M. tuberculosis Clostridium sp. Bacillus sp. L. monocytogenes E. coli S. Typhimurium Bactéries acétiques Bactéries lactiques minimal 1,5 1,5 4 5,6 4,2 7 6 5 4,6 5 4,3 4,3 4 2 3,2 pH optimal 4-6,5 4,5-6,8 6,5-7,5 6,6-7 6,8-7,5 7,8 7,3-7,5 6,8-7,7 6-7,6 6,8-7,5 6,5-7,5 6-8 6,5-7,2 5,4-6,3 5,5-6,5 maximal 9 11 10 8 9,3 8,3 8,3 8,4 9 10 9 9,6 9,2 10,5 adapté de Bourgeois et al. (1996) et Carpenter (1977) pH, microorganismes et aliments pH approximatif de quelques produits alimentaires Produits alimentaires Glycogène Acide lactique + jus de fruits pH Boeuf 5,3-6,2 Porc 5,3-6,4 Poulet 5,8-6,4 Poissons (flétan) 6,5-6,8 Lait frais 6,3-6,5 Beurre 6,1-6,4 Carottes (Bourgeois et al. 1996) 5,2-6 Pommes de terre 5,4-6,2 Oignons 5,3-5,8 Tomates 4,2-4,9 Pommes 2,9-3,3 Oranges 3,6-4,3 Raisins Citrons 3,4-4,5 2,2-2,4 Pseudomonas (protéolytique) bactéries Erwinia carotovora levures moisissures pH, microorganismes et aliments Ecologie microbienne d’un lait stocké à température ambiante A fin de v ous aider à protéger v otre confidentialité, PowerPoint a empêché le téléchargement automatique de cette image externe. Pour la télécharger et l'afficher, cliquez sur Options dans la barre de message, puis cliquez sur A utoriser le contenu externe. pH, microorganismes et aliments Conservation des aliments par abaissement du pH - Les aliments fermentés fermentation lactique => yaourts, laits fermentés, fromages Courbe type de développement (C) et d’acidification (A) des bactéries lactiques dans le lait. Effet sur les germes pathogènes (GP) A fin de v ous aider à protéger v otre confidentialité, PowerPoint a empêché le téléchargement automatique de cette image externe. Pour la télécharger et l'afficher, cliquez sur Options dans la barre de message, puis cliquez sur A utoriser le contenu externe. pH, microorganismes et aliments Conservation des aliments par abaissement du pH - Les aliments fermentés fermentation lactique => yaourts, laits fermentés, fromage, saucisson, choucroute - Les aliments conservés dans du vinaigre ou saumurés - Les acides organiques faibles -participent à l'acidification du milieu acides benzoïque, propionique, sorbique => doses 0,05-0,2% -ont une toxicité spécifique (empêche l’assimilation des acides gras α-insaturés par les levures) acides benzoïque, propionique, sorbique => doses 0,05-0,2% Acide propionique (E280) (antifongique) O Acide sorbique (E200) (antifongique) O OH OH Comment agit la température ? Mode d’action température 1.Etat physique de l'eau (solide, liquide, vapeur) T 2.Vitesse des réactions enzymatiques (loi du Q10) 3.Plasticité des membranes et du cytoplasme (modification de la fluidité et de la perméabilité membranaire) T 4.Dénaturation des macromolécules (protéines, acides nucléiques) Pas de régulation de la température, mais adaptation aux conséquences 1. Protéines et enzymes Enzymes thermostables des fosses hydrothermales, « Cold shock proteines » 2. Composition en acides gras des membranes cellulaires Maintenir le niveau de perméabilité membranaire aux protons et la fluidité membranaire conséquenc es Influence de la température température sur les microorganismes La plupart des germes se multiplient A nuancer Leyral et Vierling (2007) Microbiologie et toxicologie des aliments. Doin Arrêt des activités enzymatiques Température et microorganismes Taux de croissance T optimale •Courbe dissymétrique T létale des formes végétatives T minimale des spores bactériennes T maximale Température Température et microorganismes Classification des microorganismes en fonction de leur températures minimale, optimale et maximale de croissance Type Température minimale Température optimale Température maximale µmax -10 10 - 15 18 - 20 faible Psychrotrophe -2 – 2 20 - 30 30 - 40 faible Mésophile 5 - 10 25 - 40 44 - 48 élevé 15 42 - 46 50 élevé 30 - 40 55 - 60 60 - 70 élevé Psychrophile Thermotrophe Thermophile Température et microorganismes Type Température minimale Température optimale Température maximale µmax Psychrotrophe -2 - 2 20 - 30 30 - 40 faible Produits réfrigérés, développement ou contamination lente (++ semaines) Beaucoup de moisissures, levures Gram - : Pseudomonas, Alcaligenes, Erwinia, Flavobacterium Gram + : Lactobacillus plantarum, certains Leuconostoc La flore dominante de beaucoup de produit réfrigérés (lait, viande) est Pseudomonas Peu de pathogènes -> la conservation à des T < 4°C protège généralement la qualité sanitaire Pathogènes : Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica Cas de Clostridium botulinum type E (Tmin de croissance et toxinogénèse entre 3 et 5 °C) Température et microorganismes Type Température minimale Température optimale Température maximale µmax 5 - 10 25 - 40 44 - 48 élevé Mésophile Développement ou contamination rapide (qq h à j) Quelques moisissures, levures, Gram - : Entérobactéries (Escherichia coli, Salmonella) Gram + : C. botulinum, C. sporogenes, Bacillus cereus -> Thermorésistants (sporulés) Certaines bactéries lactiques Bactéries Rôle Utilisation Lactococcus lactis lactis acidifiant lactique, pâte molle, pâte pressée Lactococcus lactis cremoris acidifiant lactique, pâte molle, pâte pressée Lactococcus lactis diacetylactis aromatisant lactique, PM, PP en mélange avec L. lactis lactis/cremoris Leuconostoc lactis gazogène Gouda, pâte persillée Leuconostoc mesenteroides gazogène Gouda, pâte persillée Lactobacillus acidophilus acidifiant parfois pâte pressée, pâte persillée Température et microorganismes Type Température minimale Température optimale Température maximale µmax Thermotrophe 15 42 - 46 50 élevé Streptococcus thermophilus + Lactobacillus bulgaricus => yaourt Streptococcus thermophilus + Lactobacillus helveticus => pâte pressée Clostridium perfringens Température, microorganismes et aliments Conservation du lait à la ferme Influence de la température et de l’hygiène Température, microorganismes et aliments Réfrigération à la ferme (2 j, 4°C) Enrichissement en MS (14-16%) Destruction de la flore microbienne Dénaturation des protéines 42-45°C 2-3 h à 42-45°C 4°C, arrêt de la fermentation 24 j à au plus 8°C Comment agit l’Aw ? Eau disponible pHi Mode d’action aw - solvant de nutriments - agent chimique de réactions Effet de l'aw sur le volume des cellules de Candida utilis Aw = P / Po P pression partielle de vapeur d'eau de la solution Po pression partielle de l'eau pure à la même T Nb sans dimension 0 < aw < 1 Régulation de la pression osmotique Aw = 1 Aw = 0,92 Comment agit l’Aw ? La résistance microbienne à une baisse d’aw est due à : 1. la synthèse d’osmo-protecteurs 2. l’incorporation d’osmo-protecteurs 3. De la compatibilité de ces osmo-protecteurs avec le métabolisme Osmoprotection par la glycine bétaine chez Lactococcus lactis Guillot et al (2000) IJFM 55, 47 CMD ( ) CMD + NaCl 0.4 M (2.3%) ( ) CMD + NaCl + bétaine ( ) Aw et microorganismes Microorganismes « normaux » Aw optimale Taux de croissance Microorganismes osmotolérants xérotolérants halotolérants Microorganismes osmophiles xérophiles halophiles 1 Aw minimale 0,6 Aw Aw et microorganismes Aw limite Microorganismes concernés 0,95 Bacilles gram - (Pseudomonas, Salmonella), C. botulinum, spores bactériennes, quelques levures (Hansenula, Pichia) 0,91 La plupart des coques (Stretpococcus, Lactococcus), Lactobacillus, Listeria monocytogenes, cellules végétatives des Bacilliaceae (Bacillus), quelques moisissures 0,87 Levures non osmophiles (Sacchromyces), S. aureus 0,80 Moisissures non xérophiles (Mucor, Rhizopus, Penicillium) 0,75 La plupart des bactéries halophiles 0,65 Moisissures xérophiles (Xeromyces, Eurotium) 0,60 Levures osmophiles (Zygosaccharomyces rouxii, Z. bailii) Aw, microorganismes et aliments Aw 0,95-1 Environnement Bactéries Mycètes Lait, Produits périssables La plupart des bacilles gram - 0,95 Pain, Fromages frais La plupart des bacilles gram + 0,91 Jambon, Salami La plupart des coques, Bacillus 0,87 Fromages secs Staphylococcus 0,80 Confitures 0,75 Lacs salés Poissons salés 0,70 Céréales, Fruits secs Aspergillus 0,60 Chocolat Miel Lait en poudre Produits déshydratés Z. rouxii Z. Bailii X. bisporus < 0,60 Basidiomycète Penicillium, Mucor Penicillium Halobacterium Actinospora Plus de développement microbien Diminution Aw en fromagerie : Salage (sel, saumurage), pressage, séchage Aw, microorganismes et aliments Dénombrement (log UFC/g) Influence de l’aw sur la survie La survie dépend de nombreux paramètres dont l’aw. Plus l’aw est basse, plus la survie est importante. Stockage (mois) Survie de Chronobacter sakazakii dans de la poudre de lait infantile ayant une aw de 0,27 ( ), 0,33 ( ), 0,50 ( ) Gurtler and Beuchat (2007) JFP, 70:1579 Réhydratation et à la contamination croisée Comment agissent les gaz de l’atmosphère ? Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) N2 : gaz inerte O2 : d’indispensable à toxique CO2 : de neutre à toxique O2 + eO2-° + 2 H++ eO2 + 2 H+ + 2 eH2O2 + H+ + e- -> -> -> -> O2-° 2 OH° H2O2 OH° + H2O Oxydations des 1. lipides membranaires 2. protéines et acides aminés (enzymes, liaisons S-S, mobilisation du fer et action toxique) 3. acides nucléiques (liaisons anarchiques dans l’ADN) Comment agissent les gaz de l’atmosphère ? Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) O2 + eO2-° + 2 H++ eO2 + 2 H+ + 2 eH2O2 + H+ + e- -> -> -> -> O2-° 2 OH° H2O2 OH° + H2O Protection des microorganismes superoxyde dismutase 2 O2-° + 2 H+ -> H2O2 + O2 H2O2 catalase -> H2O + 0,5 O2 peroxydase NADH + H2O2 + H+ -> NAD+ + 2 H2O Oxygène et microorganismes ( ) ( ) ( ) Métabolisme respiratoire Régénération d’une gélose sans nitrate (20 min, 100°C) Fermeture du tube, incubation puis lecture des résultats Aérobies strictes Moisissures Pseudomonas des Bacillus Anaérobies strictes Clostridium Propionibacterium Aéro-anaérobies Anaérobies facultatifs Entérobactéries Levures Staphylococcus Listeria Anaérobies aérotolérant Bactéries lactiques Oxygène et microorganismes Flore alimentaire et disponibilité en oxygène - fermenteur : O2 quelques mg/l optimisation de l’aération - aliments humides et compacts (lait, viande, poisson) en surface => flore aérobie en profondeur => flores bactériennes acidifiantes (bactéries lactiques, entérobactéries) ou putréfiantes (Clostridium) - produits végétaux frais et entiers => moisissures, bactéries aérobies - produits végétaux broyés ou cuits => levures, flores de surissement - produits pulvérulents => moisissures, bactéries aérobies CO2 et microorganismes 50% CO2 dans l’atmosphère pKa = 6,4 CO2 + H2O <-> HCO3- pKa = 10,3 + H+ <-> CO32- + 2 H+ CO2 et microorganismes Tolérance des souches au CO2 Sensibles Pseudomonas moisissures Aérobies strictes Peu sensibles levures Lactobacillus sp. C. botulinum C. perfringens Aéro-anaérobies Anaérobies strictes Atmosphère et conservation • Emballage sous atmosphère modifiée = Modified Atmosphere Packaging (MAP) • Emballage sous vide = Vacuum Packaging (VP) • Emballage sous atmosphère contrôlée = Controlled Atmosphere Packaging (CAP) • Emballage sous atmosphère modifiée en équilibre = Equilibrium-modified-atmosphere packaging (EMAP) Et en dehors de la croissance ? La production de toxine Température et toxinogénèse Staphylococcus sp. Toxinogénèse : 10 - 45 °C Multiplication : 6 - 46 °C pH et toxinogénèse Microorganisme Gamme de pH de croissance Gamme de pH de production de toxine S. aureus C. botulinum C. perfringens 4-9,8 4,6/5 (minimum) 5,5-9 4,8-9 5 (minimum) 6-8 aw et toxinogénèse aw minimale pour la Moisissures Toxine Aspergillus flavus Aflatoxine Penicillium patulum Patuline croissance production de toxine 0,78-0,80 0,83 0,81 0,85 Et en dehors de la croissance ? La résistance à la destruction Un pH acide (basique) diminue la résistance thermique des formes végétatives et des spores bactériennes -> Un produit acide (alcalin) est plus facile à stériliser (à pasteuriser) qu’un produit à pH neutre • Une aw basse augmente la résistance thermique des formes végétatives et des spores bactériennes -> Un produit sec est plus difficile à stériliser (à pasteuriser) qu’un produit humide Et en dehors de la croissance ? La production de C02 Beaufort 8-12°C Impact de la température de la cave d’affinage sur l’ouverture des yeux Et en dehors de la croissance ? 13-15°C La productionComté de toxine Emmental cave froide (10-15°C) puis cave chaude (21-23°C) Il n’y a pas de critère absolu ! La valeur absolue du paramètre est importante Mais Paramètres influant l’action du pH Le type de composé utilisé La vitesse d’application du paramètre L’histoire du microorganisme, sa phase de croissance Le type de produit alimentaire et son conditionnement Paramètres influant l’action du pH - se dissocient en fonction du pH et de leur pKa Pourcentage d'acide non dissocié à différents pH Acide Acétique Benzoïque Citrique Lactique Parabenzoïque Propionique Sorbique (Bourgeois et al. 1996) Acide non dissocié (%) à pH pKa 3 4 5 6 7 98.5 93.5 53.0 86.6 99.9 98.5 97.4 84.5 59.3 18.9 39.2 99.9 87.6 82.0 34.9 12.8 0.41 6.1 99.9 41.7 30.0 5.1 1.44 0.006 0.64 99.7 6.67 4.1 0.54 0.14 0.001 0.06 96.7 0.71 0.48 4,76 4,20 3,14/5,95/6,39 3,86 4,87 4,75 •Pénètrent sous forme non dissociée, se dissocient (pHi>pHe) et font chuter le pH intracellulaire •Plus le pKa est élevé, plus l’acide est efficace Paramètres influant l’action du pH Influence de la structure du milieu sur l’effet du pH The effect of initial pH on the growth rate of L. monocytogenes Scott A at 10°C in broth (●) and in gel cassettes (○). The effect of an initial pH of 5 on the viable population of L. monocytogenes Scott A in gel cassettes (○) and broth (●) at 10°C. Meldrum et al. (2003) Food microbiol 20:97 Importance du produit alimentaire dans sa globalité Temps de doublement de Listeria en fonction du produit laitier T (°C) Temps de doublement (h) Poudre de lait écrémé 4 10 Lait écrémé 30 11 7 Lait semi écrémé 30 Référence Lait entier 27 5 Donelly, 1986 Bajar, 1997 Conclusion Les facteurs environnementaux : ccl Influent sur différents aspects de la physiologie microbienne Sont interdépendants et dépendant de l’aliment en question Prévoir le développement microbien => Microbiologie prévisionnelle COMBASE PMP