facteurs environnementauxspt_poly

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Photos :
UMR B2HM
Science des procédés et de la transformation
Transformer le lait
Facteurs environnementaux abiotiques
et
physiologie microbienne
Murielle Naïtali – 2011 - SPAB
Quels microrganismes transforment le lait ?
Flore acidifiante
•Bactéries lactique
Pseudomonas
L. monocytogenes
Flore
thermorésistante
S. aureus
Flore d’affinage
•Levure, moisissures
Flore coliforme
(désacidifiante, arôme, croute)
•Microcoques, corynébacétries
(croute, arôme)
Flores originelles du lait ou
levains
Salmonella
E. coli
Flores originelles du lait ou
contamination primaire et
secondaire
De quoi ont-ils besoin pour transformer le lait ?
Source de
carbone
Source d’énergie
Reproduction
cellulaire
Source
d’azote
Source de soufre,
de phosphore
Minéraux
Facteurs environnementaux
intrinsèques composition biochimique
pH
Aw
potentiel redox
Facteurs
de croissance
Production de
métabolites
Lactobacillus casei
auxotrophe pour
•Bases puriques et pyrimidiques
•Vitamines B2, B6 et B12
•Acides folique et lipoïque
extrinsèques
température
humidité ambiante
composition en gaz
pression, radiation
Les facteurs environnementaux
Les facteurs environnementaux et la croissance microbienne
Présentation générale
Le pH
Mode d’action
La température
Quelle gamme pour quels microorganismes
L’Aw
Quels aliments sont concernés
L’O2/C02
Et en dehors de la croissance ?
Il n’y a pas de critère absolu !
Les facteurs environnementaux et la croissance
Déterminent l’écologie microbienne des aliments en modulant le développement
Population microbienne
X (g/mL) ou N (UFC/mL)
Vitesse spécifique de croissance
ou taux de croissance
µ (h-1)
Temps de doublement ou de génération
td ou tg (h)
td =ln2/µ
1 - Phase de latence (lag , λ) : X = X0=Cste, µ = 0 Pas de mutiplication, phase d’adaptation, de réparation
Phase de démarrage : µ augmente, X augmente
2 - Phase exponentielle : dX=µ.X.dt, µ=Cste=µmax pour des conditions environnementales données =>
X=X0.exp(µmax.t)
3 -Phase de ralentissement : µ diminue, X augmente (carence nutritionnelle, composés inhibiteurs)
4 - Phase stationnaire : µ = 0, X=Cste=Xmax
5 - Phase de lyse : X diminue
La croissance exponentielle
La croissance exponentielle d'une bactérie peut être définie par deux constantes :
- le temps de génération(tg) ou temps de doublement (td), intervalle de temps entre deux divisions
successives = temps nécessaire au doublement de la population.
Si la concentration initiale est X0 au temps t0=0, par doublement successif, elle devient:
Au temps t1=td après 1 doublement X1 = 2X0
Au temps t2= t1+td=2td, après 2 doublements X2 = 2X1 = 2*2X0 = 22X0
...
Au temps t=ntd, après n doublements, X = 2nX0 soit X = X0*2t/td
On représente la croissance en exponentielle de base e, soit X = X0*eln2*t/td
On définie alors le second paramètre
- le taux de croissance ou vitesse spécifique de croissance (µ) comme la pente de la droite de croissance
en considérant le logarithme népérien de X soit
lnX = lnX0 + µt
ou
La relation entre ces deux paramètres est donc
X = X0eµt
µ= ln2/td
Les facteurs environnementaux et la croissance
Déterminent l’écologie microbienne des aliments en modulant le développement
A optimiser pour
favoriser le développement
inhiber le développement
Durée de la phase stationnaire (lag, λ)
La pente de la phase exponentielle (µ, td ou tg)
Le niveau de la phase stationnaire (Xmax , Nmax)
et sa durée
détruire les microorganismes
Principalement les hautes températures
=> TD 1 conserver le lait
mais aussi
orienter la physiologie microbienne
Les facteurs environnementaux et la croissance
Déterminent l’écologie microbienne des aliments en modulant le développement
A optimiser pour
favoriser le développement
inhiber le développement
Taux de croissance
Valeur
optimale
Valeur
minimale
Valeur
maximale
Valeur d ’un facteur environnemental donné
Les facteurs environnementaux et la croissance
Déterminent l’écologie microbienne des aliments en modulant le développement
A optimiser pour
favoriser le développement
inhiber le développement
Une croissance ralentie entraîne une
population maximale moindre
Lag > lagopt
µmax < µmax-opt
Nmax < Nmax-opt
Utilisation du
substrat
Synthèse de
précurseurs
Synthèse
d’ATP
Synthèse de
biomasse
Energie de
maintenance
Comment agit le pH ?
Mode d’action
pHedu
(pH)pH
1.Complexation des ions métalliques
du milieu extérieur
pH acide
pH basique
pHi
Mg2+
Zn2+, Ca2+, Fe2+
2.Modification de la perméabilité membranaire
pH acide
pH basique
perméases cationiques saturées en H+
perméases anioniques saturées en OH-
3.Modification du métabolisme
Microorganisme
pHe
pHi
td (min)
E. coli
7
5
7,3
6,8
40
140
S. Typhimurium
7
5
7,6
7,0
40
108
Fonctionnement des enzymes = f(pHi)
∆ pHe ∆ pHi mais ∆ pHe ≠ ∆ pHi
pH acide, neutre, légèrement alcalin pHi > pHe
pH très alcalin, pHi < pHe (rare en alimentaire)
Mécanismes d’adaptation au pH
Protection par
- le pouvoir tampon du cytoplasme
- des systèmes de transport des protons
pH acide, neutre, légèrement alcalin pHi > pHe
Force proton motrice
Extrusion de protons
Potentiel électrique ou
potentiel de membrane
pHi
H+
> +pHe
< H
Gradient de pH
Konings et al. 2002
pH et microorganismes
Microorganismes
Levures
Moisissures
Bactéries
Pseudomonas sp.
Staphylococcus sp.
St. pneumoniae
C. diphteriae
M. tuberculosis
Clostridium sp.
Bacillus sp.
L. monocytogenes
E. coli
S. Typhimurium
Bactéries acétiques
Bactéries lactiques
minimal
1,5
1,5
4
5,6
4,2
7
6
5
4,6
5
4,3
4,3
4
2
3,2
pH
optimal
4-6,5
4,5-6,8
6,5-7,5
6,6-7
6,8-7,5
7,8
7,3-7,5
6,8-7,7
6-7,6
6,8-7,5
6,5-7,5
6-8
6,5-7,2
5,4-6,3
5,5-6,5
maximal
9
11
10
8
9,3
8,3
8,3
8,4
9
10
9
9,6
9,2
10,5
adapté de Bourgeois et al. (1996) et Carpenter (1977)
pH, microorganismes et aliments
pH approximatif de quelques produits alimentaires
Produits alimentaires
Glycogène
Acide lactique
+ jus de fruits
pH
Boeuf
5,3-6,2
Porc
5,3-6,4
Poulet
5,8-6,4
Poissons (flétan)
6,5-6,8
Lait frais
6,3-6,5
Beurre
6,1-6,4
Carottes
(Bourgeois et al. 1996)
5,2-6
Pommes de terre
5,4-6,2
Oignons
5,3-5,8
Tomates
4,2-4,9
Pommes
2,9-3,3
Oranges
3,6-4,3
Raisins
Citrons
3,4-4,5
2,2-2,4
Pseudomonas
(protéolytique)
bactéries
Erwinia carotovora
levures
moisissures
pH, microorganismes et aliments
Ecologie microbienne d’un lait stocké à température ambiante
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pH, microorganismes et aliments
Conservation des aliments par abaissement du pH
- Les aliments fermentés
fermentation lactique
=> yaourts, laits fermentés, fromages
Courbe type de
développement (C) et
d’acidification (A) des
bactéries lactiques dans le
lait. Effet sur les germes
pathogènes (GP)
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pH, microorganismes et aliments
Conservation des aliments par abaissement du pH
- Les aliments fermentés
fermentation lactique
=> yaourts, laits fermentés, fromage, saucisson, choucroute
- Les aliments conservés dans du vinaigre ou saumurés
- Les acides organiques faibles
-participent à l'acidification du milieu
acides benzoïque, propionique, sorbique => doses 0,05-0,2%
-ont une toxicité spécifique (empêche l’assimilation des acides gras α-insaturés par les
levures) acides benzoïque, propionique, sorbique => doses 0,05-0,2%
Acide propionique (E280)
(antifongique)
O
Acide sorbique (E200)
(antifongique)
O
OH
OH
Comment agit la température ?
Mode d’action température
1.Etat physique de l'eau (solide, liquide, vapeur)
T
2.Vitesse des réactions enzymatiques (loi du Q10)
3.Plasticité des membranes et du cytoplasme
(modification de la fluidité et de la perméabilité membranaire)
T
4.Dénaturation des macromolécules (protéines, acides nucléiques)
Pas de régulation de la température, mais adaptation aux conséquences
1. Protéines et enzymes
Enzymes thermostables des fosses hydrothermales, « Cold shock proteines »
2. Composition en acides gras des membranes cellulaires
Maintenir le niveau de perméabilité membranaire aux protons et la fluidité membranaire
conséquenc
es
Influence de la
température
température sur les
microorganismes
La plupart
des germes
se multiplient
A nuancer
Leyral et Vierling (2007)
Microbiologie et toxicologie
des aliments. Doin
Arrêt des activités
enzymatiques
Température et microorganismes
Taux de croissance
T optimale
•Courbe dissymétrique
T létale
des formes
végétatives
T minimale
des spores
bactériennes
T maximale
Température
Température et microorganismes
Classification des microorganismes en fonction de
leur températures minimale, optimale et maximale de croissance
Type
Température
minimale
Température
optimale
Température
maximale
µmax
-10
10 - 15
18 - 20
faible
Psychrotrophe
-2 – 2
20 - 30
30 - 40
faible
Mésophile
5 - 10
25 - 40
44 - 48
élevé
15
42 - 46
50
élevé
30 - 40
55 - 60
60 - 70
élevé
Psychrophile
Thermotrophe
Thermophile
Température et microorganismes
Type
Température
minimale
Température
optimale
Température
maximale
µmax
Psychrotrophe
-2 - 2
20 - 30
30 - 40
faible
Produits réfrigérés, développement ou contamination lente (++ semaines)
Beaucoup de moisissures, levures
Gram - : Pseudomonas, Alcaligenes, Erwinia, Flavobacterium
Gram + : Lactobacillus plantarum, certains Leuconostoc
La flore dominante de beaucoup de produit réfrigérés (lait, viande) est Pseudomonas
Peu de pathogènes -> la conservation à des T < 4°C
protège généralement la qualité sanitaire
Pathogènes : Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica
Cas de Clostridium botulinum type E
(Tmin de croissance et toxinogénèse entre 3 et 5 °C)
Température et microorganismes
Type
Température
minimale
Température
optimale
Température
maximale
µmax
5 - 10
25 - 40
44 - 48
élevé
Mésophile
Développement ou contamination rapide (qq h à j)
Quelques moisissures, levures, Gram - : Entérobactéries (Escherichia coli, Salmonella)
Gram + : C. botulinum, C. sporogenes, Bacillus cereus -> Thermorésistants (sporulés)
Certaines bactéries lactiques
Bactéries
Rôle
Utilisation
Lactococcus lactis lactis
acidifiant
lactique, pâte molle, pâte pressée
Lactococcus lactis cremoris
acidifiant
lactique, pâte molle, pâte pressée
Lactococcus lactis diacetylactis
aromatisant
lactique, PM, PP en mélange avec L. lactis lactis/cremoris
Leuconostoc lactis
gazogène
Gouda, pâte persillée
Leuconostoc mesenteroides
gazogène
Gouda, pâte persillée
Lactobacillus acidophilus
acidifiant
parfois pâte pressée, pâte persillée
Température et microorganismes
Type
Température
minimale
Température
optimale
Température
maximale
µmax
Thermotrophe
15
42 - 46
50
élevé
Streptococcus thermophilus + Lactobacillus bulgaricus => yaourt
Streptococcus thermophilus + Lactobacillus helveticus => pâte pressée
Clostridium perfringens
Température, microorganismes et aliments
Conservation du lait à la ferme
Influence de la température
et de l’hygiène
Température, microorganismes et aliments
Réfrigération à la ferme
(2 j, 4°C)
Enrichissement en MS (14-16%)
Destruction de la flore microbienne
Dénaturation des protéines
42-45°C
2-3 h à 42-45°C
4°C, arrêt de la fermentation
24 j à au plus 8°C
Comment agit l’Aw ?
Eau disponible
pHi
Mode d’action aw
- solvant de nutriments
- agent chimique de réactions
Effet de l'aw sur le volume des
cellules de Candida utilis
Aw = P / Po
P pression partielle de vapeur d'eau de la solution
Po pression partielle de l'eau pure à la même T
Nb sans dimension
0 < aw < 1
Régulation de la
pression osmotique
Aw = 1
Aw = 0,92
Comment agit l’Aw ?
La résistance microbienne à une baisse d’aw est due à :
1. la synthèse d’osmo-protecteurs
2. l’incorporation d’osmo-protecteurs
3. De la compatibilité de ces osmo-protecteurs avec le métabolisme
Osmoprotection par la glycine
bétaine chez Lactococcus lactis
Guillot et al (2000) IJFM 55, 47
CMD (
)
CMD + NaCl 0.4 M (2.3%) (
)
CMD + NaCl + bétaine (
)
Aw et microorganismes
Microorganismes « normaux »
Aw
optimale
Taux de croissance
Microorganismes osmotolérants
xérotolérants
halotolérants
Microorganismes osmophiles
xérophiles
halophiles
1
Aw
minimale
0,6
Aw
Aw et microorganismes
Aw limite
Microorganismes concernés
0,95
Bacilles gram - (Pseudomonas, Salmonella), C. botulinum,
spores bactériennes, quelques levures (Hansenula, Pichia)
0,91
La plupart des coques (Stretpococcus, Lactococcus),
Lactobacillus, Listeria monocytogenes,
cellules végétatives des Bacilliaceae (Bacillus),
quelques moisissures
0,87
Levures non osmophiles (Sacchromyces), S. aureus
0,80
Moisissures non xérophiles (Mucor, Rhizopus, Penicillium)
0,75
La plupart des bactéries halophiles
0,65
Moisissures xérophiles (Xeromyces, Eurotium)
0,60
Levures osmophiles (Zygosaccharomyces rouxii, Z. bailii)
Aw, microorganismes et aliments
Aw
0,95-1
Environnement
Bactéries
Mycètes
Lait, Produits périssables
La plupart des bacilles gram -
0,95
Pain, Fromages frais
La plupart des bacilles gram +
0,91
Jambon, Salami
La plupart des coques, Bacillus
0,87
Fromages secs
Staphylococcus
0,80
Confitures
0,75
Lacs salés
Poissons salés
0,70
Céréales, Fruits secs
Aspergillus
0,60
Chocolat
Miel
Lait en poudre
Produits déshydratés
Z. rouxii
Z. Bailii
X. bisporus
< 0,60
Basidiomycète
Penicillium,
Mucor
Penicillium
Halobacterium
Actinospora
Plus de développement microbien
Diminution Aw en fromagerie : Salage (sel, saumurage), pressage, séchage
Aw, microorganismes et aliments
Dénombrement
(log UFC/g)
Influence de l’aw sur la survie
La survie dépend de nombreux
paramètres dont l’aw.
Plus l’aw est basse, plus la survie est
importante.
Stockage (mois)
Survie de Chronobacter sakazakii dans de la
poudre de lait infantile
ayant une aw de 0,27 (
), 0,33 (
), 0,50 (
)
Gurtler and Beuchat (2007) JFP, 70:1579
Réhydratation et à la
contamination croisée
Comment agissent les gaz de l’atmosphère ?
Les espèces réactives de l’oxygène (ROS)
N2 : gaz inerte
O2 : d’indispensable à toxique
CO2 : de neutre à toxique
O2 + eO2-° + 2 H++ eO2 + 2 H+ + 2 eH2O2 + H+ + e-
->
->
->
->
O2-°
2 OH°
H2O2
OH° + H2O
Oxydations des
1. lipides membranaires
2. protéines et acides aminés
(enzymes, liaisons S-S, mobilisation du
fer et action toxique)
3. acides nucléiques
(liaisons anarchiques dans l’ADN)
Comment agissent les gaz de l’atmosphère ?
Les espèces réactives de l’oxygène (ROS)
O2 + eO2-° + 2 H++ eO2 + 2 H+ + 2 eH2O2 + H+ + e-
->
->
->
->
O2-°
2 OH°
H2O2
OH° + H2O
Protection des microorganismes
superoxyde dismutase
2 O2-° + 2 H+
->
H2O2 + O2
H2O2
catalase
->
H2O + 0,5 O2
peroxydase
NADH + H2O2 + H+
->
NAD+ + 2 H2O
Oxygène et microorganismes
( )
( )
( )
Métabolisme respiratoire
Régénération d’une
gélose sans nitrate
(20 min, 100°C)
Fermeture du tube,
incubation puis lecture
des résultats
Aérobies strictes
Moisissures
Pseudomonas
des Bacillus
Anaérobies strictes
Clostridium
Propionibacterium
Aéro-anaérobies
Anaérobies facultatifs
Entérobactéries
Levures
Staphylococcus
Listeria
Anaérobies aérotolérant
Bactéries lactiques
Oxygène et microorganismes
Flore alimentaire et disponibilité en oxygène
- fermenteur : O2 quelques mg/l optimisation de l’aération
- aliments humides et compacts (lait, viande, poisson)
en surface => flore aérobie
en profondeur => flores bactériennes acidifiantes
(bactéries lactiques, entérobactéries)
ou putréfiantes (Clostridium)
- produits végétaux frais et entiers => moisissures, bactéries aérobies
- produits végétaux broyés ou cuits => levures, flores de surissement
- produits pulvérulents => moisissures, bactéries aérobies
CO2 et microorganismes
50% CO2 dans l’atmosphère
pKa = 6,4
CO2 + H2O <->
HCO3-
pKa = 10,3
+ H+ <-> CO32- + 2 H+
CO2 et microorganismes
Tolérance des souches au CO2
Sensibles
Pseudomonas
moisissures
Aérobies strictes
Peu sensibles
levures
Lactobacillus sp.
C. botulinum
C. perfringens
Aéro-anaérobies
Anaérobies strictes
Atmosphère et conservation
• Emballage sous atmosphère modifiée
= Modified Atmosphere Packaging (MAP)
• Emballage sous vide
= Vacuum Packaging (VP)
• Emballage sous atmosphère contrôlée
= Controlled Atmosphere Packaging (CAP)
• Emballage sous atmosphère modifiée en équilibre
= Equilibrium-modified-atmosphere packaging (EMAP)
Et en dehors de la croissance ?
La production de toxine
Température et toxinogénèse
Staphylococcus sp.
Toxinogénèse : 10 - 45 °C
Multiplication : 6 - 46 °C
pH et toxinogénèse
Microorganisme
Gamme de pH de
croissance
Gamme de pH de
production de toxine
S. aureus
C. botulinum
C. perfringens
4-9,8
4,6/5 (minimum)
5,5-9
4,8-9
5 (minimum)
6-8
aw et toxinogénèse
aw minimale pour la
Moisissures
Toxine
Aspergillus flavus
Aflatoxine
Penicillium patulum
Patuline
croissance
production de
toxine
0,78-0,80
0,83
0,81
0,85
Et en dehors de la croissance ?
La résistance à la destruction
Un pH acide (basique) diminue la résistance thermique des formes
végétatives et des spores bactériennes
-> Un produit acide (alcalin) est plus facile à stériliser (à pasteuriser)
qu’un produit à pH neutre
• Une aw basse augmente la résistance thermique
des formes végétatives et des spores bactériennes
-> Un produit sec est plus difficile à stériliser (à
pasteuriser) qu’un produit humide
Et en dehors de la croissance ?
La production de C02
Beaufort 8-12°C
Impact de la
température de la
cave d’affinage
sur l’ouverture des
yeux
Et en dehors de la croissance ?
13-15°C
La productionComté
de toxine
Emmental
cave froide (10-15°C)
puis cave chaude (21-23°C)
Il n’y a pas de critère absolu !
La valeur absolue du paramètre est importante
Mais
Paramètres
influant
l’action du pH
Le type de composé utilisé
La vitesse d’application du paramètre
L’histoire du microorganisme, sa phase de croissance
Le type de produit alimentaire et son conditionnement
Paramètres influant l’action du pH
- se dissocient en fonction du pH et de leur pKa
Pourcentage d'acide non dissocié à différents pH
Acide
Acétique
Benzoïque
Citrique
Lactique
Parabenzoïque
Propionique
Sorbique
(Bourgeois et al. 1996)
Acide non dissocié (%) à pH
pKa
3
4
5
6
7
98.5
93.5
53.0
86.6
99.9
98.5
97.4
84.5
59.3
18.9
39.2
99.9
87.6
82.0
34.9
12.8
0.41
6.1
99.9
41.7
30.0
5.1
1.44
0.006
0.64
99.7
6.67
4.1
0.54
0.14
0.001
0.06
96.7
0.71
0.48
4,76
4,20
3,14/5,95/6,39
3,86
4,87
4,75
•Pénètrent sous forme non dissociée, se dissocient (pHi>pHe) et font chuter le pH
intracellulaire
•Plus le pKa est élevé, plus l’acide est efficace
Paramètres influant l’action du pH
Influence de la structure du milieu sur l’effet du pH
The effect of initial pH on
the
growth
rate
of
L. monocytogenes Scott A
at 10°C in broth (●) and in
gel cassettes (○).
The effect of an initial pH of 5
on the viable population of
L. monocytogenes Scott A in gel
cassettes (○) and broth (●) at
10°C.
Meldrum et al. (2003) Food microbiol 20:97
Importance du produit alimentaire dans sa globalité
Temps de doublement de Listeria en fonction
du produit laitier
T (°C)
Temps de doublement (h)
Poudre de
lait écrémé
4
10
Lait
écrémé
30
11
7
Lait semi
écrémé
30
Référence
Lait
entier
27
5
Donelly, 1986
Bajar, 1997
Conclusion
Les facteurs environnementaux :
ccl
Influent sur différents aspects de la physiologie microbienne
Sont interdépendants et dépendant de l’aliment en question
Prévoir le développement microbien => Microbiologie prévisionnelle
COMBASE
PMP
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