Dégradation du complexe Cdk2/cycline A par le protéasome et

Matthieu STIERLE
Dégradation du complexe
Cdk 2/cycline A par le protéasome
et implication dans le cancer
Master EGPR 2004-2005
SOMMAIRE
RÉSUMÉ
1
INTRODUCTION
1
LE PROTÉASOME
LE COMPLEXE CDK2/CYCLINE A ET LE CYCLE CELLULAIRE
1
2
LES RÉGULATIONS EXERCÉES PAR LE COMPLEXE CDK2/CYCLINE A
4
LA RÉGULATION VIA LA PHOSPHORYLATION DES FACTEURS DE TRANSCRIPTION E2F
LA RÉGULATION VIA LA PHOSPHORYLATION DE LA PROTÉINE RB
4
4
LA DÉGRADATION DU COMPLEXE CDK2/CYCLINE A DANS LES CELLULES
CANCÉREUSES
5
INHIBITION DU COMPLEXE CDK2/CYCLINE A DANS LES CELLULES CANCÉREUSES
LA DÉGRADATION DU COMPLEXE CDK2/CYCLINE A DANS LES CELLULES CANCÉREUSES
5
6
CONCLUSIONS
8
RÉFÉRENCES
10
FIGURES
11
Résumé
Les stratégies modernes pour le traitement du cancer tendent à cibler
spécifiquement les cellules tumorales en essayant de minimiser les effets
secondaires sur les cellules saines. Une des stratégies récemment développées
consiste à cibler le complexe Cdk2/cycline A pour l’inhiber ou le dégrader. Cette
stratégie a montré que l’inhibition du complexe Cdk2/cycline A à l’aide d’un peptide
compétiteur (peptide RLX : domaine de liaison de la cycline A présent sur les
facteurs de transcription E2F) induit une inhibition spécifique de la croissance
tumorale. D’autres expériences qui visent à détruire le complexe Cdk2/cycline A par
la voie ubiquitine/protéasome ont donné des résultats encore plus prometteurs : in
vitro, on observe un phénomène d’apoptose spécifique des cellules tumorales et in
vivo, il y a une inhibition spécifique de la croissance tumorale sans qu’il y ait des
effets secondaires notables pour les cellules saines.
Mots-clés : Cdk2/cycline A ; protéasome ; cancer ; E2F ; pRb
Introduction
Le protéasome
Les protéines qui assurent l’essentiel des fonctions cellulaires, sont
synthétisées en permanence pour renouveler le stock de molécules actives.
Cependant, le processus inverse, la dégradation protéique, est tout autant une
nécessité pour la cellule : d’une part, pour que les nouvelles protéines s’ajoutent au
stock existant sans modifier l’équilibre cellulaire ; d’autre part pour éliminer les
protéines mal repliées par suite de mutations génétiques ou de stress thermiques ou
oxydatifs. La dégradation détermine ainsi la durée de vie et la concentration de
nombreuses enzymes et protéines régulatrices (cyclines, kinases impliquées dans le
cycle cellulaire, facteurs de transcription,…). De même, le fonctionnement du
système immunitaire repose en partie sur la reconnaissance de peptides
immunocompétents, les antigènes, issus de la dégradation de protéines d’origine
1
endogène ou exogène et présentés aux lymphocytes T via le complexe majeur
d’histocompatibité de classe I ou II.
La majorité de ces activités est assurée chez les eucaryotes par le système
ubiquitine/protéasome 26S [1•] (figure 1), qui utilise l’ubiquitine pour marquer les
protéines à dégrader et le protéasome en tant qu’enzyme protéolytique
reconnaissant les substrats poly-ubiquitinés. L’ubiquitination des protéines à
dégrader est assurée par trois types d’enzymes : E1, E2 et E3. E1 (ubiquitine
transactivase) active l’ubiquitine en formant avec elle un thiol-ester, et la transmet à
E2 (ubiquitine conjugase), qui également fixe l’ubiquitine par un thiol-ester. E2
ensuite, soit par l’intermédiaire de E3 (ubiquitine ligase), soit avec E3, transfère
l’ubiquitine sur le substrat. Le protéasome, complexe multicatalytique de forme
cylindrique, est présent dans le noyau et le cytoplasme de toutes les cellules
eucaryotes [2]. L’activité protéolytique est portée par le complexe protéique appelé
protéasome 20S et est régulée par deux particules régulatrices appelés complexes
19S. L’association d’un protéasome 20S avec deux complexes multimériques 19S
est nommée protéasome 26S.
Ces dernières années, l’étude du protéasome 26S est devenue un domaine
de recherche particulièrement actif. Des études ont montré que le protéasome 26S
est impliqué dans la régulation de processus cellulaires importants via la dégradation
de protéines intracellulaires impliquées dans la division cellulaire (topoisomérases I
et II), la progression dans le cycle cellulaire (cyclines, inhibiteurs de Cdk), la
régulation de la transcription (Fos/Jun), l’apoptose (Bcl-2)…[3].
Le complexe Cdk2/cycline A et le cycle cellulaire
La division cellulaire est à la base du développement et de la maintenance
d’un organisme vivant. Pour qu’une cellule en engendre deux, elle doit accomplir un
parcours complexe, composé de plusieurs phases caractérisées par des événements
cellulaires distincts : les phases G1, S, G2 et M (figure 2) qui constituent le cycle
cellulaire.
Nous allons ici nous intéresser plus particulièrement à la phase S du cycle
cellulaire qui est caractérisée principalement par la réplication semi-conservatrice de
l’ADN. Cette phase fait suite à la phase G1. La transition de la phase G1 à la phase S
est principalement contrôlée par le complexe Cdk2/cycline E : l’expression de la
2
cycline E est périodique et maximale lors de la transition de la phase G1 à S. Elle
peut alors former un complexe actif avec son partenaire Cdk2 pour exercer son
activité régulatrice positive qui va favoriser la transition G1/S. En fin de phase G1, la
synthèse de la cycline A débute, elle peut alors à son tour former un complexe avec
Cdk2. Le complexe Cdk2/cycline A va réguler la progression de la cellule dans la
phase S (figure 2) via la phosphorylation de la protéine Rb (régulation positive) ou
des facteurs de transcription de la famille E2F qui sous leur forme non phosphorylée
vont pouvoir se lier à l’ADN pour induire la transcription des gènes nécessaires à la
progression dans la phase S (régulation négative) [4•].
La protéine Rb (protéine supresseur de tumeur) forme naturellement un
complexe avec les facteurs de transcription de la famille E2F [5•]. Sa
phosphorylation durant la phase S par le complexe Cdk2/cycline A va induire un
changement conformationnel du complexe pRb-E2F entraînant sa dissociation. Les
facteurs de transcription E2F alors libre peuvent se lier à l’ADN pour induire la
transcription des gènes de la phase S. L’expression des gènes de la phase S
dépend donc du complexe Cdk2/cycline A qui suivant son substrat de
phosphorylation va induire ou non la progression de la cellule dans la phase S.
Dans la plupart des cellules cancéreuses, la protéine Rb est non fonctionnelle
ce qui entraîne une concentration anormalement élevée de E2F libre dans la cellule
menant finalement à un développement tumoral.
Des études récentes [6••] ont montré que l’inhibition du complexe
Cdk2/cycline A par complexation avec un peptide RLX (motif de liaison de la cycline
A aux facteurs de transcription E2F) dans des cellules cancéreuses (pRb non
fonctionnelle) conduit à une concentration intracellulaire de E2F libre et non
phosphorylé encore plus importante. De plus, les facteurs de transcription E2F
exercent un rétrocontrôle positif sur l’expression de leur propre gènes, ce qui mènent
finalement à une inhibition de la croissance des cellules cancéreuses en raison d’une
concentration de E2F libre et non phosphorylé trop importante et donc toxique.
Cependant, cette stratégie nécessite une concentration intracellulaire
importante et continue du peptide RLX en raison d’une compétition avec les sites de
liaison naturels de Cdk2. C’est pourquoi, nous choisissons de développer une
stratégie antitumorale qui vise à détruire le complexe cdk2/cycline A en utilisant la
voie ubiquitine/protéasome et non pas à l’inhiber par complexation avec un peptide.
3
Les régulations exercées par le complexe
Cdk2/cycline A
Le complexe Cdk2/cycline A est impliqué dans la régulation de la progression
de la cellule dans le cycle cellulaire et plus spécialement dans la régulation de la
progression de la phase S en permettant ou non aux facteurs de transcription de la
famille E2F de se lier à l’ADN pour induire la transcription des gènes de la phase S.
Le complexe Cdk2/cycline A régule la progression de la phase S via la
phosphorylation de la protéine Rb et des facteurs de transcription de la famille E2F.
Ces deux voies de régulation sont en équilibre dans la cellule, ce qui permet une
régulation fine de la phase S.
La régulation via la phosphorylation des facteurs de transcription
E2F
Le complexe Cdk2/cycline A peut exercer un premier niveau de régulation
pour la progression de la cellule dans la phase S du cycle cellulaire, via la
phosphorylation des facteurs de transcription de la famille E2F.
Si le complexe Cdk2/cycline A phosphoryle les facteurs de transcription
de la famille E2F, ces derniers ne pourront plus se lier à l’ADN pour induire la
transcription des gènes nécessaires à la progression de la cellule dans la phase S et
ils ne pourront plus exercer un rétrocontrôle positif sur l’expression de leur propre
gène.
Au contraire, si le complexe Cdk2/cycline A ne phosphoryle pas les facteurs
de transcription de la famille E2F, ces derniers vont pouvoir aller induire la
transcription des gènes de la phase S et l’expression de leur propre gène en se liant
à l’ADN (figure 3) [4•].
La régulation via la phosphorylation de la protéine Rb
4
Le complexe Cdk2/cycline A peut également exercer un autre niveau de
régulation via la phosphorylation de la protéine Rb pour la progression de la cellule
dans la phase S.
La protéine Rb forme naturellement un complexe avec les facteurs de
transcription de la famille E2F. Lorsque la protéine Rb n’est pas phosphorylée par le
complexe Cdk2/cycline A, le complexe pRb-E2F est stable et les facteurs de
transcription de la famille E2F ne peuvent se lier à l’ADN pour induire la transcription
des gènes de la phase S. Si le complexe Cdk2/cycline A phosphoryle la protéine Rb,
cette dernière subit un changement conformationnel et le complexe pRb-E2F devient
instable, ce qui conduit finalement à sa dissociation. Les facteurs E2F libre peuvent
alors aller induire la transcription des gènes de la phase S par liaison à l’ADN (figure
4) [5•].
Les deux voies de régulation établissent dans la cellule un équilibre qui
permet ou non à la cellule de progresser dans la phase S.
Dans les cellules cancéreuses, la protéine Rb est souvent non fonctionnelle
conduisant à une dérégulation de l’équilibre établit par les deux voies de régulation,
cela se traduit dans la cellule par une concentration anormalement élevée en
facteurs de transcription E2F aboutissant finalement à un développement tumoral.
La dégradation du complexe Cdk2/cycline A
dans les cellules cancéreuses
Inhibition du complexe Cdk2/cycline A dans les cellules
cancéreuses
Des études préliminaires [6••] ont montré que l’inhibition du complexe
Cdk2/cycline A dans les cellules cancéreuses entraînait une inhibition de la
croissance tumorale. Le principe de l’inhibition mise en œuvre repose sur la liaison
d’un peptide (peptide RLX) qui va se lier spécifiquement au complexe Cdk2/cycline A
empêchant ainsi ce dernier de phosphoryler les facteurs de transcription E2F.
L’expérience réalisée a consisté à inoculer à quatre lots de souris nudes des
cellules de la lignée SVT2. Lorsque les tumeurs ont atteint un volume de 100 mm3,
5
les souris sont traitées avec des injections intra et peritumorale de PEN-RLX. Le
domaine PEN du peptide PEN-RLX permet l’entrée dans la cellule (peptide
perméant) du peptide d’intérêt (RLX). Le motif RLX du peptide PEN-RLX est un
domaine de liaison de la cycline A présent sur les facteurs de transcription de la
famille E2F. Ainsi, le peptide PEN-RLX va se lier au complexe Cdk2/cycline A
empêchant ainsi ce dernier de phosphoryler les facteurs de transcription E2F. Trois
lots de souris sont traitées en parallèle avec trois doses différentes de peptide PENRLX, le quatrième lot est traité avec la dose maximale de peptide PEN non fusionné
au peptide RLX (contrôle). Les résultats sont présentés sur la figure 5 et ils montrent
une réponse dose dépendante à la quantité de peptide PEN-RLX injectée.
Cependant, cette stratégie présente une limitation : elle nécessite une concentration
intracellulaire importante et continue de peptide PEN-RLX car ce peptide entre en
compétition dans la cellule avec les substrats naturels de Cdk2/cycline A.
C’est pourquoi, il est préférable d’envisager une stratégie qui vise à dégrader
le complexe Cdk2/cycline A plutôt qu’à l’inhiber par liaison avec un compétiteur. Des
études publiées durant le mois de juin 2004 et visant à détruire le complexe
Cdk2/cycline A via la voie ubiquitine/protéasome dans les cellules cancéreuses ont
apporté des résultats prometteurs. Nous présentons cette stratégie dans le
paragraphe suivant.
La dégradation du complexe Cdk2/cycline A dans les cellules
cancéreuses
La stratégie utilisée [7••] pour dégrader le complexe Cdk2/cycline A repose
sur l’utilisation d’une protéine chimère (TrCP-LFG). Le domaine TrCP constitue une
sous-unité d’une ubiquitine ligase (E3) : la SCF (Skp1-Cul1-F-box protein) [8•] qui va
ubiquitiner spécifiquement le complexe Cdk2/cycline A. Le domaine LFG constitue,
quant à lui, un domaine de reconnaissance de Cdk2 présent sur certains inhibiteurs
comme p21. Lorsque la protéine de fusion TrCP-LFG est présente dans la cellule, le
domaine LFG va se lier au complexe Cdk2/cycline A tandis que le domaine TrCP
fusionné au domaine LFG va ubiquitiner le complexe Cdk2/cycline A qui sera ensuite
reconnu par les sous-unités régulatrices du protéasome 26S et internalisé pour être
dégradé par le core protéolytique du protéasome 26S (figure 6). La protéine de
fusion TrCP-LFG permet donc un rapprochement spatial dans la cellule du complexe
6
Cdk2/cycline A et de l’ubiquitine ligase qui lui est spécifique et qui va, en partenariat
avec E1 et E2 présentes dans la cellule ubiquitiner le complexe Cdk2/cycline A.
Une première série d’expériences a consisté à transfecter, in vitro, des cellules
HeLa grâce à des adénovirus recombinants qui vont permettre l’expression dans les
cellules transfectées soit de la protéine chimère TrCP-LFG, soit de la protéine TrCP
seule, soit de la protéine TrCP-LFG tronquée. Quarante heures après avoir
transfecté les cellules, ces dernières sont lysées et les lysats cellulaires obtenus sont
analysés par western-blot en utilisant des anticorps spécifiques. Les résultats sont
montrés sur la figure 7B. Les résultats montrent bien que dans les cellules HeLa
traitées avec un adénovirus permettant l’expression de la protéine de fusion TrCPLFG, le complexe Cdk2/cycline A est présent en quantité beaucoup moins importante
que dans les cellules traitées avec des adénovirus permettant l’expression de la
protéine TrCP-LFG tronquée ou la protéine TrCP seule.
Une deuxième série d’expériences a eu pour but de vérifier que la diminution
de présence du complexe Cdk2/cycline A observée dans la première série
d’expériences dans les cellules HeLa traitées avec les adénovirus permettant
l’expression de la protéine chimère TrCP-LFG était bien du à sa dégradation par la
voie ubiquitine/protéasome. Pour cela, quatre lots de cellules HeLa sont traités en
parallèle avec des adénovirus recombinants permettant l’expression de la protéine
chimère TrCP-LFG. Trois de ces lots sont traités aussi en même temps avec des
concentrations différentes d’ALLN (N-acetyl-L-leucinyl-L-leucinyl-L-norleucinal), un
inhibiteur du protéasome. Le quatrième lot ne subit pas de traitement avec l’ALLN
(contrôle). Quarante heures après avoir traité les cellules, ces dernières sont lysées
et les lysats cellulaires obtenus sont analysés par western-blot avec des anticorps
spécifiques. Les résultats sont montrés sur la figure 7C. Les résultats mettent bien en
évidence que plus la concentration d’ALLN est importante, plus le complexe
Cdk2/cycline A est présent. Ces résultats prouvent donc bien que le protéasome est
donc à l’origine de la dégradation du complexe Cdk2/cycline A dans les cellules
traitées avec des adénovirus permettant l’expression de la protéine de fusion TrCPLFG.
Une troisième série d’expérience a eu pour but de comparer le taux de survie
de cellules cancéreuses et non cancéreuses lorsqu’elles sont traitées avec des
adénovirus permettant l’expression de la protéine chimère TrCP-LFG. Pour cela, trois
lignées de cellules cancéreuses (U2OS, U87 et SAOS), et deux lignées de cellules
7
non cancéreuses (Hs27 et NHA) sont traitées en parallèle avec des adénovirus
permettant l’expression de la protéine chimère TrCP-LFG et le taux de survie des
cellules est évalué pendant 96 heures après l’infection par les adénovirus. Les
résultats sont montrés sur la figure 8. Ces résultats montrent que le traitement induit
l’apoptose spécifique dans les cellules cancéreuses en raison d’une trop grande
concentration intracellulaire de facteurs de transcription E2F libres due à la protéine
Rb non fonctionnelle et la destruction du complexe Cdk2/cycline A par le traitement
(figure 8A). En ce qui concerne les cellules non cancéreuses (pRb fonctionnelle,
figure 8B), on peut observer que le taux de survie n’est pratiquement pas affecté par
le traitement en raison d’une concentration intracellulaire de E2F libre plus
importante que la normale mais pas assez pour induire l’apoptose.
Enfin, une dernière série d’expérience a été réalisée, in vivo, pour valider les
résultats observés in vitro. Pour cela, deux lots de souris nudes porteuses d’une
tumeur U87 ont été traités en parallèle avec des adénovirus permettant l’expression
soit de la protéine chimère TrCP-LFG, soit la protéine GFP. Six injections
intratumorales des adénovirus sont réalisées à différents temps (voir figure 9). Un
troisième lot de souris identiques aux deux précédents est traité avec du tampon
salin PBS ( 6 injections intratumorales de 100 µL à différents temps (voir figure 9).
Les instants d’injections intratumorales sont les mêmes pour les trois lots de souris
traitées. Les volumes des tumeurs sont mesurées au cours du temps. Les résultats
sont présentés sur la figure 9. Ces résultats montrent que dans les cellules traitées
avec les adénovirus permettant l’expression de la protéine chimère TrCP-LFG, le
volume de la tumeur n’a pratiquement pas augmenté contrairement aux contrôles
(Ad/GFP et PBS : voir figure 9).
L’ensemble de ces expériences montrent donc que la dégradation du
complexe Cdk2/cycline A par le protéasome induit, in vitro l’apoptose des cellules
cancéreuses spécifiquement et in vivo, l’inhibition de la croissance des cellules
cancéreuses spécifiquement.
Conclusions
Les stratégies thérapeutiques antitumorales ciblant le complexe Cdk2/cycline
A offrent de réels espoirs pour le traitement du cancer. En effet, il a été montré dans
8
des expériences préliminaires que l’inhibition du complexe Cdk2/cycline A dans des
cellules cancéreuses par un peptide qui se lie au complexe Cdk2/cycline A entraîne
une inhibition de la croissance tumorale. Cependant, cette stratégie visant à inhiber
le complexe Cdk2/cycline A par un peptide compétiteur a aussi présenté une limite :
l’inhibition par compétition nécessite une concentration intracellulaire de peptide
compétiteur importante et continue en raison de la compétition avec les substrats
naturels du complexe Cdk2/cycline A. C’est pourquoi une nouvelle stratégie a été
mise en œuvre : cette stratégie vise à dégrader spécifiquement le complexe
Cdk2/cycline A par la voie ubiquitine/protéasome. Cette stratégie utilisant une
protéine chimère TrCP-LFG a donné des résultats prometteurs. In vitro, il a été
montré que la dégradation du complexe Cdk2/cycline A induit spécifiquement
l’apoptose des cellules cancéreuses sans avoir un réel effet néfaste sur les cellules
saines. In vivo, la dégradation du complexe Cdk2/cycline A inhibe la croissance
tumorale.
9
Références
[1•] Hershko A, Ciechanover A : The ubiquitin system. Annu Rev Biochem 1998,
67 : 425-479
[2] Bochtler M, Ditzel M et al : The proteasome. Annu Rev Biophys Biomol Struct
1999, 28 : 295-317
[3] Adams J : Potential for proteasome inhibition in the treatment of cancer.
Drug Discov Today 2003, 8(7) : 307-315
[4•] Xu M, Sheppard KA et al : Cyclin A/Cdk2 binds directly to E2F-1 and inhibits
the DNA-binding activity of E2F/DP-1 by phosphorylation. Mol Cell Bio 1994,
14(12) : 8420-8431
[5•] Liu H, Dibling B et al : New roles for the RB tumor suppressor protein. Curr
Opin Genet Dev 2004, 14 : 55-64
[6••] Mendoza N, Fong S et al : Selective Cyclin-dependent Kinase 2/cyclin A
Antagonists that Differ from ATP Site Inhibitors Block Tumor Growth. Cancer
Res 2003, 63 : 1020-1024
[7••] Chen W, Lee J et al : Proteasome-Mediated Destruction of the Cyclin
A/Cyclin-Dependent Kinase 2 Complex Suppresses Tumor Cell Growth in vitro
and in vivo. Cancer Res 2004, 64 : 3949-3957
[8•] Cardozo T, Pagano M : The SCF ubiquitin ligase : insigths into a molecular
machine. Mol Cell Bio, 5 : 739-751
10
Figures
11
Figure 1 : schéma simplifié de la voie ubiquitine/protéasome 26S
de dégradation des protéines
Figure 2 : Le cycle cellulaire et les principaux complexes
Cdk/cycline intervenant dans sa régulation
Le complexe Cdk2/cycline A intervient dans la
régulation de la progression de la phase S
12
E2F
cdk2/cycline A
E2F P
E2F
Transcription des gènes de la
phase S et des gènes E2F
Figure 3 : mécanisme de régulation de la progression de la phase S
via la phosphorylation des facteurs de transcription E2F
13
Cdk2/cycline A
Transcription des gènes
de la phase S et des gènes
E2F
Figure 4 : mécanisme de régulation de la progression de la phase S
via la phosphorylation de la protéine Rb par le complexe Cdk2/cycline A
14
Figure 5 : Inhibition de la croissance tumorale par le peptide PEN-PVKRRLDL
Les souris nudes sont porteuses d’une tumeur SVT2, elles subissent des
injections intra et peritumorale de peptide PEN-PVKRRLDL à différentes
doses et la taille de la tumeur est mesurée au cours du temps après injection
Figure 6 : Principe de dégradation du complexe Cdk2/cycline A par la
voie ubiquitine/protéasome en utilisant la protéine chimère TrCP-LFG
15
Figure 7 : dégradation du complexe Cdk2/cycline A par le protéasome
en B : dégradation de Cdk2/cycline A induite par TrCP-LFG
SDS-PAGE avec des anticorps spécifiques
β-actin : contrôle positif
cycline E : normalisation
en C : dégradation de Cdk2/cycline A dépendante du protéasome
SDS-PAGE avec anticorps spécifiques
β-actin : contrôle positif
Cdk4 : normalisation
16
A
B
Figure 8 : Effets de la dégradation du complexe Cdk2/cycline A sur le taux de
survie cellulaire
U2OS, U87, SAOS : lignées de cellules cancéreuses
Hs27, NHA : lignée de cellules non cancéreuses
Les cellules sont infectés par un adénovirus permettant l’expression
de la TrCP-LFG et on mesure le taux de survie cellulaire au cours du
temps après l’infection.
Figure 9 : in vivo, effet de la dégradation de Cdk2/cycline A sur la croissance tumorale
PBS : injection de tampon salin PBS
Ad/GFP : injection d’adénovirus recombinant permettant l’expression de la GFP
dans les cellules (contrôle)
Ad/TrCP-LFG : injection d’adénovirus recombinant permettant l’expression de la
TrCP-LFG dans les cellules
17