ENZYTEC fluid D-Glucose / D-Fructose Ref. n°: 5160
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ENZYTECTM fluid D-Glucose / D-Fructose Ref. n°: 5160 Coffret pour 4 x 10 déterminations (pour usage in vitro uniquement) page 1 / 2 Réactif pour la mesure du D-Glucose par photométrie en UV, dans des échantillons alimentaires. Méthode Test enzymatique en UV utilisant l’Hexokinase (HK) et la Phosphoglucoseisomérase (PGI). Blanc échantillon (BE, facultatif) 100 µl - 100 µl Eau distillée 100 µl - - Glucose-6-phosphate + ADP Réactif 1 2000 µl 2000 µl 2000 µl Échantillon/ standard D-Fructose + ATP D-Glucose + ATP HK > HK > Fructose-6-phosphate < PGI > Glucose-6-Phosphate Glucose-6-phosphate + NAD+ G6P-DH > Gluconate-6-P + NADH + H+ Mélanger, incuber pendant 1 min. à 37 °C ou 3 min. à 20 – 25 °C, lire l’absorbance A1, et rajouter : Réactif 2 Stockage et stabilité des réactifs Les réactifs sont stables jusqu’à la fin du mois de la date de péremption indiquée, à condition de les stocker entre 2 et 8 °C, et en évitant toute contamination. Ne pas congeler les réactifs! Avertissements et précautions 2. Échantillon Fructose-6-phosphate + ADP Principe 1. Blanc réactif (BR) Eau distillée 500 µl - - - 500 µl Mélanger, attendre la fin de la réaction (incubation d’environ 10 min. à 37°C ou 15 min. à 20 - 25°C), lire l’absorbance A2 et ajouter : Réactif 3 Les réactifs contiennent de l’azide de sodium (0,95 g/l) comme conservateur. Ne pas avaler! Éviter tout contact avec la peau et les membranes muqueuses. Prendre les précautions nécessaires à l'utilisation de réactifs de laboratoire. 500 µl Eau distillée 500 µl 500 µl - - - 500 µl Mélanger, attendre la fin de la réaction (incubation d’environ 10 min. à 37°C ou 15 min. à 20 - 25°C), lire l’absorbance A3. Des fiches techniques pour automates de chimie sont disponibles sur demande. Préparation des réactifs Les réactifs ainsi que les standards sont prêts à l’emploi. Calcul des résultats Matériel requis mais non fourni Eau distillée (aseptique et sans métaux lourds) et équipement de laboratoire. Glucose Contenu du coffret et concentration des réactifs Mesure avec blanc réactif (BR): ∆A = (A2 – fd x A1)échantillon – (A2 – fd x A1)BR R1 4 x 20,8 ml R2 4 x 5,5 ml R3 4 x 5,0 ml Tampon ATP NAD Tampon Hexokinase (HK) Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6P-DH) Tampon Phoshoglucose Isomerase (PGI) pH 7,8 1,7 mmol/l 1,7 mmol/l pH 7,0 ≥ 1,5 kU/l ≥ 1,5 kU/l pH 7,8 ≥ 20 KU/l Préparation des échantillons (le cas échéant) Si les échantillons présentent l’une ou l’autre des caractéristiques détaillées ci-dessous, lesquelles perturbent le test, suivre les instructions correspondantes. • Utiliser des échantillons liquides clairs, transparents et pratiquement neutres. Si nécessaire diluer l’échantillon pour obtenir une concentration en D-Glucose et D-Fructose comprise entre 90 et 1000 mg/l. • Filtrer ou centrifuger les solutions troubles. • Eliminer le gaz carbonique contenu dans les échantillons. • Ecraser ou homogénéiser les échantillons solides et semi-solides. Peser une quantité suffisante d’échantillon (en fonction de la concentration) dans une flasque volumétrique, extraire avec de l’eau. Filtrer, centrifuger ou utiliser une clarification Carrez si nécessaire. • Pour les échantillons contenant des matières grasses, peser une quantité suffisante d’échantillon (en fonction de la concentration) dans une flasque volumétrique, extraire avec de l’eau chaude. Refroidir pour permettre la séparation des graisses, en plaçant la flasque dans un bac de glace pendant 15 minutes et filtrer. On peut aussi clarifier avec les réactifs de Carrez après l’extraction. • Ajuster les échantillons acides en ajoutant du NaOH (ou KOH), les échantillons alcalins en ajoutant du HCl, jusqu’à obtenir un pH 8 env. Laisser reposer pendant env. 15 min. • Traiter les échantillons très colorés avec du Polyvinyl Polypyrolidon (PVPP, par exemple 1g/100ml d’échantillon), ou mesurer chaque échantillon avec un blanc échantillon au lieu d’un blanc réactif (si nécessaire ajuster à pH 8), en se reportant au mode opératoire. • Clarification de Carrez : suivre le protocole habituel de la réaction de Carrez. Mode opératoire Longueur d’onde: Cuvette de mesure: Température: Mesure: 340 nm, Hg 334 nm, Hg 365 nm 1 cm 20 – 25°C / 37°C contre l’air ou l‘eau Mesure avec un blanc échantillon (BE): ∆A = (A2 – fd x A1)échantillon – (A2 – fd x A1)BE Avec fd = facteur de dilution de la densité optique, du fait des volumes de réactifs rajoutés pendant le test : fd = (volume échantillon + R1) / (volume échantillon + R1 + R2) = 0,808. Formule de calcul: CD-glucose [g/l d’échantillon] = avec: V MW d v ε V x MW x ∆A ε x d x v x 1000 (volume total) (masse moléculaire) (cuvette de mesure) (volume d’échantillon) (coefficient d’absorption du NADH) 340 nm = 6,3 334 nm = 6,18 = 2600 [µl] = 180,16 [g/mol] = 1,00 [cm] = 100 [µl] [l x mmol-1 x cm-1] 365 nm = 3,4 Il en résulte pour les différentes longueurs d’onde: c D-Glucose [g/l] = 0,744 x ∆A 340 nm: 334 nm = 0,758 x ∆A 365 nm = 1,378 x ∆A Fructose Mesure avec blanc réactif (BR): ∆A = (A3 – fd x A2)échantillon – (A3 – fd x A2)BR Mesure avec un blanc échantillon (BE): ∆A = (A3 – fd x A2)échantillon – (A3 – fd x A2)BE Avec fd = facteur de dilution de la densité optique, du fait des volumes de réactifs rajoutés pendant le test : fd = (volume échant. + R1 + R2) / (volume échant. + R1 + R2 + R3) = 0,839. Formule de calcul: CD-glucose [g/l d’échantillon] = avec: V MW (volume total) (masse moléculaire) V x MW x ∆A ε x d x v x 1000 = 3100 [µl] = 180,16 [g/mol] Il en résulte pour les différentes longueurs d’onde: c D-Glucose [g/l] = 0,887 x ∆A 340 nm: 334 nm = 0,904 x ∆A 365 nm = 1,643 x ∆A Les formules doivent être recalculées lorsqu’un paramètre est modifié, par ex. le volume de l’échantillon. Si l’échantillon a été dilué, multiplier la concentration trouvée par le facteur de dilution. ENZYTECTM fluid D-Glucose / D-Fructose Ref. n°: 5160 page 2 / 2 Échantillons solides: c D-glucose [g/l ] Contenu D-glucose [g/100 g] = x 100 poids échantillon [g/l solution] c D-fructose [g/l ] Contenu D-fructose [g/100 g] = x 100 poids échantillon [g/l solution] Performances Domaine de mesure Le test a été développé pour déterminer la concentration en D-Glucose et D-Fructose dans un domaine de mesure compris entre 20 et 1000 mg/l (mesure à 340 nm). Lorsque les valeurs dépassent le domaine de mesure, les échantillons doivent être dilués avec de l’eau distillée dans un fourchette de 90 à 1000 mg/l. Multiplier le résultat obtenu par le facteur de dilution. Mode opératoire pour la détermination du Glucose + Fructose sans différentiation (sucres totaux) Spécificité La détermination est spécifique pour le D-Glucose et le D-Fructose. Si le ratio D-Glucose/D-Fructose est supérieur à 10 :1, la précision de la mesure du D-fructose diminue. Des fiches techniques pour automates de chimie sont disponibles sur demande. Longueur d’onde: 340 nm, Hg 334 nm, Hg 365 nm Cuvette de mesure: 1 cm Température: 20 – 25°C / 37°C Mesure: contre l’air ou l‘eau Limite inférieure de détection 4,8 mg/l, mesurés à 340 nm. La limite inférieure de détection correspond à la plus petite concentration statistiquement différente de la concentration zéro. Elle est calculée à partir de trois écarts types d’un échantillon zéro (sans D-glucose ni D-fructose) mesuré 20 fois de suite. Blanc réactif (BR) Échantillon Blanc échantillon (BE, facultatif) 100 µl - 100 µl Eau distillée 100 µl - - Réactif 1 2000 µl 2000 µl 2000 µl Échantillon/ standard Mélanger, incuber pendant 1 min. à 37 °C ou 3 min. à 20 – 25 °C, lire l’absorbance A1, et rajouter : - Réactif 2 500 µl 500 µl Réactif 3 500 µl 500 µl - - - 500 µl Eau distillée Mélanger, attendre la fin de la réaction (incubation d’environ 10 min. à 37°C ou 15 min. à 20 - 25°C), lire l’absorbance A2. Note: R2 et R3 peuvent être pré-mélangés. Mélanger 1 volume de R2 avec 1 volume de R3 (par ex. : 5 ml R1 + 5 ml R2) et utiliser 1000 µl du mélange pour la détermination. La stabilité du mélange est d’une semaine entre 2 et 8°C. Ce mélange de réactifs doit être protégé de la lumière! Calcul des résultats Glucose + Fructose sans différentiation (sucres totaux) Mesure avec blanc réactif (BR): ∆A = (A2 – fd x A1)échantillon – (A2 – fd x A1)BR Mesure avec un blanc échantillon (BE): ∆A = (A2 – fd x A1)échantillon – (A2 – fd x A1)BE Avec fd = facteur de dilution de la densité optique, du fait des volumes de réactifs rajoutés pendant le test : fd = (volume échant. + R1) / (volume échant. + R1 + R2 + R3) = 0,677. Formule de calcul: C sucres totaux [g/l d’échantillon] = avec: V MW d v ε V x MW x ∆A ε x d x v x 1000 (volume total) (masse moléculaire) (cuvette de mesure) (volume d’échantillon) (coefficient d’absorption du NADH) 340 nm = 6,3 334 nm = 6,18 = 3100 [µl] = 180,16 [g/mol] = 1,00 [cm] = 100 [µl] [l x mmol-1 x cm-1] 365 nm = 3,4 Il en résulte pour les différentes longueurs d’onde: 340 nm: c sucres totaux [g/l] = 0,887 x ∆A 334 nm = 0,904 x ∆A 365 nm = 1,643 x ∆A Calibration / contrôle de qualité Pour calibrer le test sur des automates de biochimie, ou pour contrôler la qualité des résultats en utilisation manuelle, utiliser le kit Enzytec Fluid Sugar combination standard (Cat. No. 5440, 3 x 3 ml). Le standard est prêt à l’emploi. Gestion des déchets Suivre les recommandations légales en vigueur v23.06.2007
