Nanocristaux semiconducteurs fluorescents ou
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Les traceurs 1- Les traceurs fluorescents Certaines molécules organiques absorbent la lumière à certaines longueurs d'onde ; elles réémettent pendant un temps 1res court (10- 16s) une lumière de plus grande longueur d'onde. principe de la fluorescence : Un photon provenant d'une source lumineuse (laser, lampe à vapeur de mercure, etc.) provoque le passage I d'un électron d'une orbite stable à une orbite instable. Pendant cet état instable (qui dure de l'ordre de l quelques nanosecondes) l'électron perd de l'énergie par interaction avec l'environnent. Il retourne à son orbite stable en émettant un photon d'énergie plus faible que le photon d'excitation et donc de longueur d'onde plus élevée. Le décalage entre les longueurs d’onde d'excitation et d'émission est appelée "décalage de Stokes" (en anglais "Stoke's shift"). 1 Nanocristaux semiconducteurs fluorescents ou "Quantum dots" 2 Leurs propriétés remarquables : Le cœur des QD est généralement contenu dans une coque protectrice, par exemple du sulphite de zinc. Pour des applications en immunohistochimie cette coque hydrophobe est entourée de molécules hydrophiles permettant la fixation des ligands, streptavidine, anticorps, etc. (Goldman et coll. 2002) . 3 Avantages inconvénients Sa fabrication (l’or colloïdal) est extrêmement simple et bon Les conjugués peuvent présenter un marché. excès de charges négatives : les billes d'or peuvent alors donner des marquages non spécifiques en se fixant sur les groupements cationiques présents dans les tissus. Il peut être obtenu en différentes tailles, entre 1 a 100 nm Pratiquement environ (Horisberger, 1981; Mulpfordt, 1982). inutilisables en marquage pré-inclusion pour les tailles supérieures à 2-3 nm de diamètre. *Les billes de grandes tailles sont utilisées en microscopie à balayage *les billes de taille moyenne (10-20 nm) sont adaptées aux marquages de cellules (cellules endocrines par exemple) *enfin les plus petites tailles (au-dessous de 10nm) sont utiles pour les marquages fins (localisation d'antigènes membranaires, d'histones ou de séquences nucléotidiques sur des chromosomes par exemple). l'or colloïdal peut être utilisé aussi bien en microscopie électronique qu'optique (2nm et au-dessous). La réaction peut être intensifiée à l'argent : *en microscopie optique la sensibilité est alors tout a fait semblable a celle des traceurs enzymatiques ; *en microscopie électronique, l'intensification permet de visualiser les billes dont le diamètre est faible (< 3 nm) (car elle augmente la taille des billes). 4 La lumière, généralement émise par un laser (et dans ce cas monochromatique), est réfléchie par un miroir dichroïque vers la lentille objectif. L'objectif focalise le faisceau sur l'échantillon en un « spot » dont la taille peut être réduite à un diamètre de 0,25 μm dans un plan horizontal et 0,5 μm en profondeur. Un système de balayage (non représenté) assure un déplacement du spot dans le plan horizontal et parfois vertical. La fluorescence émise par l'élément éclairé retourne à travers l'objectif, traverse le miroir dichroïque et un système (non représenté) de sélection de la bande de longueur d’onde à observer avant d’atteindre le détecteur. Devant le détecteur, un diaphragme de très petite ouverture (pinhole) ne laisse passer que la lumière émise par les éléments fluorescents présents dans le plan focal : une grande partie de la fluorescence en provenance de plans situés au dessus ou au dessous du plan focal (rayons lumineux représentés en pointillés) est éliminée grâce au diaphragme du détecteur. La source lumineuse, le détecteur et le spot éclairant l'échantillon sont dans le même plan focal, d'où l'appellation « microscope confocal ». 5 2. Les traceurs enzymatiques : Les premiers couplages d'enzymes à des anticorps ont été réalisés par Nakane et Pierce en 1966. Peu après, la peroxydase a pu être visualisée en microscopie électronique grâce à la technique d'osmicarion du dépôt de diaminobenzidine (Graham etKarnovsky, 1966). Traceurs enzymatiques : propriétés et utilisation.Tableau Enzyme Origine Masse Substrats Chromogène molaire Peroxydase Raifort 40000 Couleur Utilisations Brun Bleu Brun Brun Vert ME, MO, ffi MO,IB ELISA ELISA ELISA Idem peroxydase Bleu MO NABP/NF Rouge MO,IB BCIP/NBT Pourpre-noir MO,IB FastredTR/ NaphtolAS-MX PNPP Rouge MO.IB Jaune ELISA H202 DAB 4-CH-Naphtol O-dianisidine OPD Glucose oxydase Aspergillus 150000 niger P-galactosidase E. Coli Phosphatase alcaline E.Coli 595000 (91000) 86000 Glucose (couplage à la peroxydase) BCIG ABTS Idem peroxydase Abréviations : ABTS 2,2'-azino-di-[3-ethylbenzthiazoline sulfonate] BCIG bromochloroindolyl-b-D-galactopyranoside BCIP/NBT 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitro blue tetrazolium DAB diaminobenzidine NABP/NF Naphtol-AS-BI-phosphate/new fuchsin pNPP p-nitrophenyl-phosphate OPD o-phenylenediamine MO Microscopie Optique ME Microscopie Electronique IB blots et ImmunoBlots Les traceurs enzymatiques les plus couramment utilisés sont la peroxydase et la phosphatase alcaline. La peroxydase est généralement préférée pour les tissus animaux car ceux-ci contiennent beaucoup de phosphatases endogènes. A l'inverse, la phosphatase alcaline est utilisée de préférence avec les tissus végétaux qui contiennent très souvent de grandes quantités de peroxydase. 6 3. Les traceurs métalliques : a- L'or colloïdal 7 8
