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Claire Gaudichon, UMR Physiologie de la Nutrition et du Comportement Alimentaire, INA-PG, Paris Fonctions des protéines Croissance Maintenance : Les protéines font partie intégrante de la plupart des structures (peau, tendons, membranes, muscles, organes, os). Elles assurent la croissance et la réparation des tissus Enzymes : Les protéines facilitent les réactions chiniques Hormones : Les protéines régulent les processus métaboliques (la plupart des hormones sont des protéines) Anticorps : Les protéines inactivent les invasions étrangèrens, et protègent ainsi l’organisme des maladies Fluides et electrolytes : Les protéines aident à maintenit le volume et la composition des fluides corporels Equilibre acido-basique : Les protéines aident à maintenir la balance acidobasiques des fluides corporel en agissant comme des tampons. Transports : Les protéines transportent les substances telles que les lipides, vitamines, minéraux, l’oxygène. Substrat énergétique : Les protéines peuvent aussi servir de réserve énergétique pour les besoins de l’organisme Structure des Acides Aminés Clycine H Structure des Protéines • Primary structure-peptide linkages produce long chains that constitute primary structure. • Secondary structure-results from the springlike coiling of the peptide chain as a result of Hydrogen bonds. • Tertiary structure-secondary coils of peptide chains may fold back on themselves to form compact, globular structure. • Quaternary structure-globular proteins combine with others. • The shape of proteins enable them to perform different tasks. Schéma global et simplifié du métabolisme protéique Apports alimentaires 80g protéosynthèse Turnover 250g Acides aminés libres Protéines corporelles 10 kg protéolyse desamination transamination Kéto-acides NH2 80g oxydation CO2 Glucose, corps cétoniques, lipides SYNTHESE PROTEIQUE - Phénomènes traductionnels et transcriptionnels - Les vitesses de synthèse sont variables entre les protéines DEGRADATION PROTEIQUE Elle fournit 75% des acides aminés de l'organisme. Système lysosomal cathepsines (milieu acide) protéines intracellulaires à 1/2 vie longue membranes cellulaires protéines extracellulaires Enzymes protéolytiques Système calpaïne-calpastatine 2 calpaïnes cytosoliques protéines du cytosquelette Protéasome complexe enzymatique protéines préalablement ubiquitinées myofibrilles musculaires Urée produit principal du catabolisme protéique Nitrogen is waste product of AA metabolism 10-15 g of nitrogen excreted/d - healthy urine Mostly urea, ammonia, free AA & creatinine Nitrogen in Urine Urea g/nitrogen/24 hr 12.9 Ammonia AA Creatinine Uric Acid Hippuric acid 0.7 0.7 0.65 0.3 0.05 Total 15.30 1 N from NH4 Urée 1 N from aspartate C from CO2 NH2-------C-------NH2 O Soluble Peu toxique Cost: 4 ATP/cycle Cycle de l’Urée Catabolisme des acides aminés Perte irréversible du squelette carboné COOH R1 CH SCoA CO2 NH2 R1 CH NH2 COOH R1 CH O O Transamination COOH OU R2 CH NH2 COOH COOH R2 CH R1 CH NH2 O FOIE glucose NH4 glucose pyruvate alanine UREE MUSCLE pyruvate alanine BCAA NH4 glutamine céto-acide aa céto-acide α-cétoglutarate glutamate glutamine Protéines alimentaires valine isoleucine leucine 80-100g NH2 acides aminés aa aa alanine glutamine Veine porte aa aa aa urée glutamine 300g urée aa protéines urée Pertes fécales 8-10g Pertes urinaires 80-100 g Les principaux systèmes biochimiques et physiologiques qui participent au maintien de l'homéostasie des protéines corporelles et des acides aminés sont : - La synthèse protéique Protéines - Le catabolisme protéique Catabolisme - Le catabolisme oxydatif des acides aminés - La synthèse des acides aminés non essentiels Synthèse Acides aminés Ingestion Oxydation synthèse de novo NH3 - L'ingestion d'acides aminés exogènes Urée et CO2 Squelette Carboné Principes d ’études du métabolisme protéique traceur Protéines alimentaires protéolyse intestin foie traceur Protéines corporelles AA sanguins Mesure du métabolisme des protéines alimentaires muscle peau rein protéosynthèse Pertes protéiques Mesure du métabolisme des protéines totales TRACEURS Marqueurs Chimiques Isotopes radioactifs Isotopes stables Radiations Pas de Radiations Innocuité Souvent trop longue 14C ou trop courte 13N Adéquate en métabolisme Demi-vie Coûteux Très Coûteux Coût Produit Moyennement Coûteux Très Coûteux Coût Appareillage Emploi Aisé Emploi Délicat Emploi + coût élimination Traceurs utilisés pour les acides aminés R 15N 2H 13C Flux des acides aminés dans l ’organisme F Ra * * * * * ** * ** * * * * * * Ep * * ** Apports Alimentaires Rd * 80g Acides aminés sanguins 100g Ra: vitesse d ’apparition du tracé dans le pool = production endogène (P) + apport exogène (I) Ep Synthèse 250g Dégradation Protéines Corporelles 10 kg 80g Rd: vitesse de disparition du tracé du pool A l ’équilibre, Ra=Rd F: vitesse d ’infusion du traceur dans le pool Ra=F/Ep Ep: enrichissement du tracé en traceur à l ’équilibre Procédures d'utilisation des traceurs * Par voie orale (souvent 15N ou 13C) - dose de traceur pur - traceur incorporé intrinsèquement dans l'aliment - délivré par sonde gastrique ou intestinale •Par voie intraveineuse (souvent 13C ou 2H) * Administration continue mesure des concentrations du traceur dans le pool * Administration en bolus mesure de la vitesse de disparition du traceur dans le pool INTERPRETATION DES CINETIQUES D ’ENRICHISSEMENT DANS UN POOL UNIQUE Cas d’une infusion continue du traceur dans le pool La cinétique d ’enrichissement est du type Et=b(1-e-kt) ENRICHISSEMENT Eb: enrichissement au plateau isotopique =F/VC.k k: constante d ’élimination On peut en déduire Eb Ra=F/Eb Taille du pool=VC=F/Eb.k Renouvellement du pool=1/k TEMPS Mesurer les taux des synthèse protéique Apports Alimentaires Traceur * Synthèse Acides aminés sanguins Flooding dose 250g Dégradation Perfusion continue * organe h* h h * h h *h FSR (% jour)= (Eprotéine/Epool précurseur)x24x60/temps d’incorporation (min) (Taux fractionnaire de renouvellement protéique en % du pool) Nécessite d’avoir accès à l’organe ou de travailler indistinctement sur l’ensemble des protéines corporelles * * * Concentration Concentration en Leucine marquée Vitesse de renouvellement des protéines Temps Début de perfusion du traceur Exemple de calcul pratique Prélèvements à l ’état stationnaire Soit débit du traceur de 0.05 micromole/minute et un rapport leucine*/leucine de 0.04 (4%) Production de leucine = 0.05 / 0.04 = 1.25 micromole / minute (F / Eb) Pour extrapoler au renouvellement protéique du corps entier Soit leucine = poids moléculaire 131g, 8% des acides aminés, poids corporel = 70 kg Renouvellement protéique = 1.25 * 131 * (1/0.08) * 70 * 60 * 24 * 1 000 000 = 200g Taux de synthèse fractionnaire des protéines tissulaires chez des rats soumis à un régime normoprotéique ou hyperprotéique Foie Muq. intestinale 250 180 Effet régime 150 200 120 150 %/j %/j Effet régime 100 90 60 50 30 0 0 NP HP NP Rein 120 Muscle Effet régime 25 100 20 %/j %/j 80 60 15 10 40 5 20 0 Bos et al, 2004 HP 0 NP HP NP HP À jeun À l’état nourri Mesurer les taux de dégradation protéique Apports Alimentaires Perfusion continue à l’état stationnaire Traceur 13C * * * Acides aminés * sanguins Q= Ra =Rd Soit Q = apport + dégradation = synthèse + oxydation Nécessite de travailler à l’état stationnaire Synthèse 250g Dégradation * Protéines corporelles h* h h * h h *h * Oxydation (13CO2) * Effet de régimes à base de protéines végétales ou animales sur les flux de synthèse et de dégradation chez des femmes âgées Synthèse et dégradation protéique % of du flux total 80 Régime animal Régime végétal 60 40 * 20 0 Synthèse dégradation from Pannemans et al 1998 Autres méthodes de mesure de la dégradation protéique: Incubation ex vivo d’un organe Traceur dans le milieu d’incubation * * * * * * * * * Mesure de la 3 - méthylhistidine Mesure de la dilution du traceur MUSCLE Actine-myosine CH3-HIS 3-MeHis Balenine Acides Aminés Acides Aminés 3 MetHist INTESTIN KIDNEY Urée LIVER 3 MetHist PEAU La 3 Méthylhistidinurie L ’excrétion de 3MH est proportionnelle à la masse myofrillaire musculaire. La 3MH permet l ’expression du catabolisme myofibrillaire et non de la masse musculaire Pour normaliser les mesures on doit rapporter les mesures de 3MH à la créatinurie L ’alimentation carnée apportant de la 3MH exogène, il faut supprimer ce type d ’alimentation 3 jours avant les mesures Il faut tenir compte d’autres sources endogènes de 3MH que celle des muscles striés. Gradient Artério-Veineux La variation des concentrations en acides aminés au cours du passage à travers un organe peut fournir une estimation du gain ou de la perte protéique à travers ce tissu. Ainsi dans la cas du muscle, pour des acides aminés tels que la phénylalanine, tyronise, lysine (pas leucine) le gradient artério-veineux reflète la synthèse et la dégradation des protéines dans leur ensemble. - Dosage doit être couple à la mesure du débit sanguins - limites de précision liée a la faiblesse du gradient A/V - Bilan limité à l’organe étudié - Problème pratique en clinique : catéthérisation de l’artère pénétrant dans l’organe ou le tissu. Principe de la mesure du gradient ARTERIO-VEINEUX VEINE ARTERE FLUX SANGUIN 13C aa ACIDE AMINE-2 13C PROTEINES ACIDE AMINE-1 13C Méthodes moléculaires pour étudier la régulation des voies de synthèse et de dégradation AA indispensables (en particulier Leu) Insuline/autres facteurs de croissance (êê AA) GCN2 eIF2 PKB/Akt P eIF2B Inhibition de la protéosynthèse mTOR P p70S6Kinase S6 P eIF4F 4EBP1 Activation de la protéosynthèse P Synthèse protéique (L6 myoblastes) Inhibition de la synthèse (% du contrôle % inhibition de la synthèse /milieu complet -25% -43% -53% - + 0 Protéolyse (C2C12 myotubes) % augmentation de la protéolyse /milieu complet +14% +11% +26% 20 40 60 80 Leu RAP + + (d’après Kimball et al 1999) Effets partiellement additifs + + (d’après Mordier et al. 2000) Effets totalement additifs Méthodes d’évaluation de l’apport alimentaire * Besoins en protéines et acides aminés * Qualité de l’apport protéique Définition du besoin protéique: C ’est la prise protéique habituelle permettant de maintenir un équilibre azoté chez une personne en bonne santé et de composition corporelle normale, en bilan énergétique normal et en activité physique modérée. Bilan nul La méthode du bilan SORTIES ENTREES Ingéré bilan N (mg) 10 Urines Fécès Peau Autres Besoin adulte Besoin enfant 5 0 -5 -10 protéines ingérées (g/kg/j) Détermination des besoins en acides aminés 13CO 2 entrées AA 13C Pertes urines, fécès Méthode du traceur lysine Méthode du bilan 13C 5 0 -5 0 5 10 15 20 25 -10 lysine ingérée (mg/kg/j) 30 35 oxydation de bilan N (mg) 10 40 30 20 10 0 100 58 35 30 20 12 6 lysine ingérée (mg/kg/j) 2 Mesure du métabolisme de l’azote alimentaire Application à l’étude de la qualité de l’apport Protéine 15N S I protéosynthèse Acides aminés sanguins 15N Protéines corporelles protéolyse Urée corporelle 15N NH3 15N urine D Marquage intrinsèque de la protéine avec un isotope de l ’azote ou du carbone: * protéines laitières uniformément enrichies en ou en un acide aminé 13C * protéines végétales (pois, soja, blé, algues) uniformément enrichies en 15N ou en 13C 15N Exploration métabolique chez l’homme repas Estomac Protéines Protéinesplasmacorporelles corporellestiques prot. plasmatiques RET Intestin grêle AA AA libres libresplasmatiques urée Côlon NH4+ AA plasmatiques urée corporelle DEA Azote urinaire urée urinaire (urée, NH4+…) NH4+ urinaire Transfert de l’azote alimentaire dans l’urée corporelle et les protéines plasmatiques après ingestion de lait ou de soja Urée corporelle 20 N exogène (% de l'ingéré 15 10 5 lait soja 0 0 10 1 2 3 4 5 6 7 8 6 7 8 Protéines plasmatiques 8 6 4 2 0 0 1 2 3 4 5 Temps (h) Modélisation compratimentale: prédiction du transfert dynamique de l’azote alimentaire dans les compartiments azotés Protéines de lait Protéines de soja 50 * : effet du type de protéine % de l’azote ingéré 8 h après le repas 40 * 30 20 10 0 Pertes digestives (1) et métaboliques (2) -10 (2) -20 (1) -30 (2) (1) * Rétention splanchnique Rétention périphérique Conclusions Plusieurs voies d’approches du métabolisme protéique Utilisation des traceurs stables prépondérante * soit en marquant les acides aminés et les protéines corporels * soit en marquant les protéines et acides aminés alimentaires Applications nombreuses: * mesurer le turnover protéique * mesurer les flux de synthèse et de dégradation protéique * mesurer les flux d’oxydation des acides aminés * évaluer les besoins en acides aminés * suivre le devenir des acides aminés alimentaires après ingestion En fonction de: * l’état physiologique (jeune, sportif, personne âgée, enfant,sportif, …) * ou l’état pathologique (état catabolique, dénutrition, ….) * habitudes alimentaires, apports alimentaires, statut nutritionnel, ….
