Résultats et discussion
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REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE UNIVERSITE MOULOUD MAMMERI DE TIZI OUZOU FACULTE DES SCIENCES BIOLOGIQUES ET DES SCIENCES AGRONOMIQUES DEPARTEMENT DES SCIENCES AGRONOMIQUES MEMOIRE DE MAGISTER Spécialité : Sciences Agronomiques Option: Sciences de la vigne et préservation des ressources phytogénétiques THEME Contribution à l’étude des mycoendophytes foliaires du pistachier de l’Atlas (Pistacia atlantica Desf.) de dayate Aiat (Timzerth, Laghouat, Algérie) Présenté par : Melle ZAREB Amina Le : 12 / 11 / 2014 Devant le jury composé de : Mme YAKOUB-BOUGDAL S. Professeur à l’Université Mouloud Mammeri de Tizi Ouzou Présidente Mme SMAIL-SAADOUN N. Professeur à l’Université Mouloud Mammeri de Tizi Ouzou Promotrice Mme BELHADJ S. Professeur à l’Université de Ziane Achour de Djelfa Examinatrice Mr MEDDOUR R. MCA à l’Université Mouloud Mammeri de Tizi Ouzou Examinateur Mr HOUALI K. MCA à l’Université Mouloud Mammeri de Tizi Ouzou Examinateur 2013/2014 Dédicaces Je dédie ce travail à tous ceux qui m’aiment. Remerciements Je dois tout d’abord remercier Madame SMAIL-SAADOUN Noria, qui m’a encadré durant mon mémoire de Magister. Votre appui et votre suivi m’ont beaucoup aidé durant ces mois difficiles. Ils ont été les éléments déclencheurs de mon entrée dans la recherche. Merci d’avoir pris le temps de m’aider dans la réalisation de ce travail. C’est grâce à vous que j’ai pu me lancer dans ce travail ; un immense merci à vous. Je tiens à remercier aussi Mme YAKOUB-BOUGDAL S., d’avoir accepté de présider le jury de soutenance et d’examiner mon travail. Mme BELHADJ S., Mr MEDDOUR R. et Mr HOUALI K.ont accepté de faire partie du jury afin d’examiner ce travail. Qu’ils en soient remerciés. Je remercie également les membres du laboratoire Ressources Naturelles de l’université Mouloud Mammeri de Tizi Ouzou, où j’ai effectué mon mémoire. Dans ce laboratoire, j’ai eu l’occasion de collaborer avec des personnes formidables, Mme REZKISEKHI L., Mme BELKBIR-BOUKAIS A. et Mme FALI-GRAINE L., ainsi que Melles BOUBRIMA Aridj et ACI Louiza et Mr LIMANE Abdelkrim. Je ne vous remercierai jamais assez pour votre aide scientifique et pour votre amitié. Je remercie aussi la Conservation des forêts de la wilaya de Laghouat qui nous ont accompagné tout au long de la période d’échantillonnage, spécialement M. KEDARI Ahmed et Ammi Ali qui nous ont énormément aidé sur le terrain. Je tiens également à remercier tous les chercheurs que j’ai eu l’occasion de rencontrer au cours de ce mémoire et qui m’ont permis d’avancer dans mes questionnements et dans ma vision de la recherche. Liste des abréviations - ADNr : Acide désoxyribonucléique (ribosomal) - ARNr : Acide ribonucléique (ribosomal) - DES : dark septate endophyte ou champignons septés foncés - P : précipitations - PDA : potato-dextrose-agar - ROS : radicaux libres - SNI : structures non identifiées - T : température Liste des figures Fig 01 : cladogramme sur la base actuelle d’hypothèses moléculaires des relations entre les grandes lignées de champignons illustrant la variation des pores du septum chez trois phylums (Lutzoni et al., 2004)………………………………………………………………………….10 Fig 02 : hyphes mélanisées (MH) en continu avec hyphes hyalines (HH) dans le cortex des racines d’Atriplex Canescens (Barrow et Aaltonen, 2001)…………………………………...23 Fig 03 : microsclérotes mélanisées (MM) se développant à partir d’hyphes hyalines septées (HH) dans le cortex des racines d’Atriplex Canescens (Barrow et Aaltonen, 2001)...............24 Fig 04 : hyphes hyalines (H) dans le cylindre central (CC) (Barrow et Aaltonen, 2001)……24 Fig 05 : hyphes de Phialocephala fortinii colonisant un chevelu de racine de Pinus contorta (Jumpponen et Trappe, 1998)…….……………………………………………………..……25 Fig 06: hyphes du Phialocephala fortinii pénétrant à travers la paroi cellulaire dans la racine de Pinus contorta (Jumpponen et Trappe, 1998). …….………………………………..……25 Fig 07 : un microscleroteum d'un champignon endophyte foncé cloisonné dans une racine de Pinus strobus (Wagg et al., 2008). …….………………………………………………..……25 Fig 08 : hyphes de Phialocephala fortinii sur les racines latérales de Pinus contorta (O'Dell et al., 1993 ; Jumpponen et Trappe, 1998)…………………...…………………………………26 Fig 09 : hyphes superficielles de Phialocephala fortinii et une cellule remplie de microsclérotes sur les racines de Pinus contorta (Jumpponen et Trappe, 1998)…………….26 Fig 10 : quelques types de structures obtenues à partir de la croissance fongique dans une racine (Brundrett et al., 1996)………………………………………………………………..27 Fig 11 : développement symbiotique d’endophytes et des agents pathogènes (Kogel et al., 2006)…………………………………………………………………………………….……33 Fig 12 : schéma d’une coupe transversale dans le limbe d’une feuille de Houx (Ilex aquifolium) (Camefort, 1977)…………………………….…………………………………..46 Fig 13 : structure des feuilles (a) Feuille mature (b) Vue en coupe du limbe (Corson, 2008)………………………………………………….………………………………………46 Fig 14 : (a) trichomes peltés sur la surface abaxiale d'une feuille mature. (b) trichome pelté entièrement développé avec la tête de quatre alvéoles. La cuticule est fortement détachée de la paroi cellulaire de la tête formant un grand espace sous-cutanée. Bar = 20 µm (Liu et Liu, 2012)…………………………………………….……………………………………………51 Fig 15 : trichome capité de type I (a). Bar = 10 µm. Flèche qui indique un trichome capité de type II. Bar = 20 µm. (b) surface abaxiale d'une feuille adulte montrant la distribution des trichomes glandulaires capités de type I (flèches). Bar = 100 µm (Liu et Liu, 2012)…..........52 Fig 16 : dessin de détail d’une feuille complète (Camefort, 1977)…..……………….………53 Fig 17 : (a) schéma du réseau vasculaire d’une feuille d’Arabidopsis, (b) Illustration de la régularité des réseaux de nervures. Le niveau de gris en chaque point correspond à la distance à la nervure la plus proche (Corson, 2008)……………………………………….…………..55 Fig 18 : dessin montrant un rameau portant des feuilles et une grappe de fruits de Bétoum (Monjauze, 1980)…….........................................................................................…………….56 Fig 19 : paramètres anatomiques mesurés au niveau d’une coupe transversale d’une feuille de P. atlantica Desf. observée au microscope photonique (X400) (Ait Said et al., 2009)…........58 Fig 20 : poils ciliés sur la marge de la feuille et dépôts de cire (Belhadj, 2007)……….…….59 Fig 21: poil glandulaire et dépôts de cire sur l’épiderme (Belhadj, 2007)……...……………60 Fig 22 : localisation de la ville de Laghouat (google.fr) Fig 23 : situation de la zone d’étude échelle 1/200 000e…….…..62 Echelle 1/200 000 e……….…………...……65 Fig 24 : diagramme ombrothermique de Bagnouls et Gaussen pour la station de Hassi R’mel (1999-2005)…………………………………………………………...………………………66 Fig 25 : zonation écoclimatique de Hassi R’mel selon la méthode de Le Houérou (1995).…68 Fig 26 : sujets 1, 2, 3 et 4 entourés de jujubier……...………………………………………..70 Fig 27 : sujets 5 et 6 entourés de jujubier………………………………………………….…71 Fig 28 : sujets 7, 8, 9, 10 âgés...................................................................................................72 Fig 29 : fréquence de colonisation des feuilles des sujets de pistachier de l’Atlas associés au jujubier (nebkhas)……………………………………………………….……………………81 Fig 30 : fréquence de colonisation des feuilles des sujets âgés de pistachier de l’Atlas (sans nebkhas)…………………………………………..…………………………………………..82 Fig 54 : abondance des genres de champignons endophytes isolés à partir des feuilles des sujets échantillonnés……...…………………………………………………………………..95 Fig 55 : représentation des genres de champignons endophytes et des sujets de Pistacia atlantica sur A.C.P……………………………………………………..….……….105 Liste des tableaux Tab 01 : critères symbiotiques pour caractériser les classes de champignons endophytes (Rodriguez et al., 2008)…………………………………………………………..…………..16 Tab 02 : applications industrielles des enzymes choisies à partir de champignons endophytes (Suryanarayan et al., 2012)………………………..……………………………………….....38 Tabl 03 : description des trichomes non glandulaires (Glas et al., 2012)………...….........…50 Tabl 04 : données et paramètres utilisés dans la classification écoclimatique de la station de Hassi R’mel…………………………………………………………………………………...67 Tabl 05 : caractéristiques générales des sujets échantillonnés...…….……………………….69 Tabl 06 : fréquence de colonisation (FC) par des champignons endophytes isolés à partir de la feuille de Pistacia atlantica après 2 mois d’incubation (%)…………………………...……..78 Tabl 07 : fréquence de colonisation des feuilles de pistachiers de l’Atlas associés au jujubier (nebkhas) (%)…………………………………………………………………………………79 Tabl 08 : fréquence de colonisation des feuilles des sujets du pistachier de l’Atlas âgés sans jujubier (%)……….…………………………………………………………………………..80 Tabl 09 : fréquences de colonisation des feuilles des jeunes sujets du pistachier de l’Atlas………………………………………………………………………………………....82 Tabl 10 : fréquences de colonisation des feuilles des sujets moyens du pistachier de l’Atlas………………………………………………………………………………………....82 Tabl 11 : fréquence de colonisation des feuilles de Pistacia atlantica par des champignons endophytes selon l’âge des sujets (%)………….………………….………………………….84 Tabl 12 : abondance des genres de champignons endophytes isolés à partir des fragments de feuilles du pistachier de l’Atlas mises en culture, après deux mois d’incubation………….....93 Tabl 13 : abondance des genres de champignons endophytes pour les différents sujets du pistachier de l’Atlas de dayate Aiat (%)………...……………………………………………97 Tabl 14 : nombre de genres de champignons endophytes présents au niveau de la feuille du pistachier de l’Atlas par tranche d’âge………………………………………………………..98 Tabl 15 : matrice des corrélations par l’A.C.P…..………………………………………….101 Tabl 16 : type de colonisation par des champignons endophytes au niveau des différents tissus de la feuille de Pistacia atlantica……………………………………………………..119 Sommaire Liste des abréviations Liste des figures Liste des tableaux Introduction générale…………………………………………………………………………..2 Chapitre I : Mycoendophytes ………………………………………………………………..5 1- Introduction…………………………………………………………………………….6 2- Systématique des champignons……………………………………….……………….7 2-1- Introduction…………………………………………………….………………7 2-2- Principaux groupes chez les champignons………………………….………….9 3- Diversité des champignons endophytes………………………………………..………13 3-1- Diversité au sein des plantes entières……………………………..…………..13 3-2- Diversité des champignons endophytes au niveau des différents organes végétaux………………………………………………………………………………………17 3-2-1- Diversité des champignons endophytes au niveau des brindilles et des rameaux……………………………………………………………………………….………17 3-2-2- Diversité des champignons endophytes au niveau des feuilles……..……17 3-3- Facteurs de diversité des champignons endophytes…………………….……. 19 4- Biologie et écologie des champignons endophytes…………………………...……….21 5- Interactions Plante / champignons endophytes…………………………..……………32 5-1- Symbiose endophytes-plante………………………………..……………………32 5-2- Rôles des champignons endophytes ……………………………………………..35 5-2-1- Nutrition……………………………………………...…………………..35 5-2-2- Croissance………………………………………..………………………36 5-2-3- Production des enzymes industrielles……………..……………………….37 5-2-4- Production de métabolites secondaires…………………………………….39 5-2-5- Rôle écologique….………………………..………………………………..40 Chapitre II : Description de la feuille …...…………...…………………………………44 1- Morphologie et structure …………………………..…………………………………45 2- Structure anatomique…………………………………………………………………45 2-1- Tissus protecteurs….……………………………………………………….……47 2-1-1- Stomates…………………………………………………………………48 2-1-2- Trichomes……………………….……………………………………….48 2-2- Mésophylle …………………………………..………………………………..52 2-3- Tissus conducteurs…………………………………………………………..…53 3- Feuille du pistachier de l’Atlas………………………………………………….……55 Caractéristiques anatomiques des feuilles du pistachier de l’Atlas………...………………56 Chapitre III : Matériel et méthodes………………………………………………………..61 1- Description de la zone d’étude……………………………………………………………62 2- Bioclimat de la zone d’étude ……………………………………………………………..64 3- Echantillonnage sur le terrain……………………………………………….……………69 3-1- Mise en culture des feuilles……………………………..………………………… 71 3-1-1- Stérilisation superficielle…………………….………………………………71 3-1-2- Mise en culture ……………………………………...………………………71 3-1-2-1-Composition du milieu PDA……………………………………….72 3-2-2-2- Préparation et stérilisation…………………..…………………….72 3-2- Coloration des feuilles…………………………….………………………………..73 3-3- Identification……………………………………………………………….………73 3-3-1- Identification macroscopique……………………………………..………….73 3-3-2- Observation microscopique………………………………………………..…73 3-5- Analyse statistique……………………………………………………...…………..74 Chapitre IV : Résultats et discussion………………………………………………………75 1- Fréquences de colonisation……………………………..…………………………….76 2- Systématique des champignons endophytes…….……………………….…………...85 3- Colonisation des différents tissus de la feuille par les mycoendophytes……...…….106 Conclusion générale……………………………………………………..…………………121 Références bibliographiques……………………………………………...……………….124 Introduction générale Introduction générale Les plantes indigènes adaptées aux écosystèmes arides sont propices à une contrainte hydrique et nutritive. En effet, ces plantes ont développé des mécanismes uniques telles les associations symbiotiques, qui réduisent ce stress, améliorent la nutrition et la survie (Barrow et Aaltonen, 2001) et favorisent les stratégies de la conservation de l’eau chez la plante (Malinowski et Belesky, 2000 ; Kannadan et Rudgers, 2008). Le bétoum ou pistachier de l’Atlas en est un bon exemple. C’est le plus ubiquiste des arbres du Nord de l’Afrique et du Proche Orient (Monjauze, 1980). Il présente une amplitude écologique et une plasticité remarquables. On le trouve au cœur du Sahara jusqu’aux marges du bioclimat humide (Quézel et Médail, 2003). C’est une espèce protégée par la législation algérienne. Le pistachier de l’Atlas présente un système racinaire très puissant. Dans des conditions de climat semi-aride, il développe principalement un système racinaire superficiel, suffisant pour ses besoins en hydrominéraux importants. Avec l’augmentation de l’aridité climatique et édaphique, la plante adopte une stratégie phréatophytique, en accroissant la longueur et l’épaisseur des racines profondes, en contact avec les niveaux d’humidité profonds, protégés de l’évapotranspiration durant les saisons sèches. C’est d’ailleurs pour cela qu’il constitue un excellent porte-greffe pour le pistachier vrai (Limane et al., 2014). La partie aérienne du bétoum est très importante. C’est un arbre puissant à couronne volumineuse arrondie, qui peut atteindre 15 à 20 m de haut (Quézel et Médail, 2003). Il présente donc un « effet Oasis » pour les espèces présentes sous sa canopée. Ses rameaux feuillés sont utilisés pour tanner le cuir (Ozenda, 2004), mais surtout comme fourrage pendant la saison estivale. Le pistachier de l’Atlas produit une huile commercialisable et aussi importante que l’huile d’olive. En effet, ses graines sont riches en lipides et notamment en acides gras insaturés (oléique et linoléique) et en phytostérols, présentant des intérêts diététiques et nutritionnels (Bennabdellah, 2011). Autrefois très abondante, cette essence ne cesse de régresser d’année en année suite à des actions anthropiques (Dahmani, 2011). Les conditions climatiques de la plupart des régions steppiques, semi-arides et arides de notre pays sont favorables à son extension. Pourtant c’est l’inverse qui est entrain de se produire, l’aire du pistachier ne cesse de décliner en raison, d’une part, du peu d’intérêt des décideurs à cette espèce (budgets très limités pour l’entretien et la régénération des pistacheraies naturelles des dayas), et d’autres part, aggravé par une exploitation anarchique des arbres (bois de chauffage et pâturage) et le mauvais état sanitaire de certaines populations (Benabdellah, 2011). Tous ces problèmes qui menacent la présence du pistachier de l’Atlas dans ces régions, limitent aussi la présence mais aussi la 2 Introduction générale diversité d’autres espèces de bactéries et de champignons. Ces dernières sont mutualistes de cette essence et forment des symbioses mycorhiziennes et endophytiques au niveau du système racinaire et des feuilles. Les champignons endophytes sont omniprésents dans la nature (Arnold et al., 2003 ; Hyde et Soytong, 2008 ; Ghimire et al., 2011). C’est une partie intégrante du microbiome de la plante ; ils infectent et colonisent les végétaux (Algues, Bryophytes, Ptéridophytes, Gymnospermes et Angiospermes) (Hyde et Soytong, 2008 ; Suryanarayanan et al., 2012), sans déclencher de symptômes visibles de la maladie (Arnold et al., 2001 ; Khan, 2007 ; Hyde et Soytong, 2008 ; Moricca et Raggazi, 2008 ; Huang et al., 2009 ; Rodriguez et al., 2009 ; Errasti et al., 2010 ; Suryanarayanan et al., 2012 ; Al Mahi et al., 2013 ; Lakshman et Kurandawad, 2013). Les champignons endophytes pénètrent dans les tissus des végétaux au niveau du système racinaire, cotylédons, tiges, feuilles et fleurs (Li et al., 2012). Ils ont une plasticité beaucoup plus grande que les plantes, et restent viables et actifs à des potentiels hydriques bien inférieurs à ceux essentiels à leurs hôtes (Duniway, 1979 ; Moricca et Raggazi, 2008). Ils confèrent des bénéfices à leurs hôtes à travers l’amélioration de l’absorption des nutriments (Mandaym et Jumpponen, 2005 ; Dupont et al., 2007). Ils renforcent la croissance végétative (Raktoniariania, 2007), par la production de phytohormones qui sont des molécules essentielles pour la croissance, le développement et la défense des plantes. De plus, ils confèrent une résistance accrue aux agents pathogènes (Stovall et Clay, 1988 ; Ghimire et al., 2011). En effet, en relation avec le mode hétérotrophe et la capacité d’exploiter une variété importante de substrats et d’habitats, les champignons ont une capacité polyvalente de synthèse. Les endophytes produisent donc des produits naturels d’importance pharmaceutique et agricole (Suryanarayanan et al., 2009). Cette biodiversité microbienne est peu connue dans les zones arides. Elle est considérée comme l’une des composantes de l’écosystème de l’arbre dans ces zones menacées. 3 Introduction générale Dans le cadre des activités de recherche du laboratoire Ressources Naturelles de l’Université Mouloud Mammeri de Tizi Ouzou (U.M.M.T.O), notre travail a pour but la contribution à l’étude des champignons endophytes de la feuille du pistachier de l’Atlas de dayate Aiat (région de Timzerth, Laghouat, Algérie). C’est la première fois qu’une étude s’intéresse à cette problématique chez le pistachier de l’Atlas. Nous nous sommes intéressés dans ce travail à la diversité des champignons endophytes au niveau de la feuille de Pistacia atlantica, mais aussi à leur répartition au niveau des différents compartiments de cette feuille et à leur fréquence de colonisation du milieu, lors de leur culture. L’approche a été réalisée en quatre grands chapitres : - le chapitre1 concerne la description des mycoendophytes et de leur écologie et diversité ; - le chapitre 2 concerne la description de l’anatomie de la feuille ; - le chapitre 3 présente le matériel et les méthodes utilisées; - le chapitre 4 concerne les résultats et la discussion de ces derniers. Nous avons terminé le travail par une conclusion générale. 4 Chapitre 1. Les mycoendophytes Chapitre 1 Mycoendophytes 1-Introduction La phyllosphère supporte de nombreux microorganismes. Il y a plusieurs raisons de considérer la phyllosphère comme un système modèle pour tester les concepts et les théories écologiques. La première est sa grande hétérogénéité à l'environnement. Par exemple, la disponibilité des nutriments pour les microorganismes sur les feuilles est très variable dans l'espace et le temps. La microbiologie de la phyllosphère a aussi le potentiel pour tester des théories écologiques très controversées, telles que les théories de la biodiversité (Meyer et Leveau, 2012). En outre, la phyllosphère est très accessible à la manipulation expérimentale, facilitant les expériences avec la réplication suffisante et des tests statistiques avec une puissance considérable (Remus-Emsermann et Leveau, 2010 ; Meyer et Leveau, 2012). Les champignons endophytes sont riches en diversité des espèces et peuvent jouer un rôle important dans l'aptitude de leurs plantes hôtes (Lv et al., 2010). Comme les arbres ont des temps très longs de production et, par conséquent, un rythme lent de l'évolution moléculaire, la lutte contre l'évolution rapide des agents pathogènes et des herbivores avec la diversité génétique plutôt que la vitesse d'évolution est susceptible d'être favorisée par ces espèces. La présence d'un mycota diversifié, notamment, les endophytes non systémiques ajouterait une diversité phénotypique au sommet de la diversité génétique, ce qui pourrait donner un avantage évolutif aux arbres avec de multiples espèces endophytes associées (Albrectsen et al., 2010). Le terme «endophytes» a été introduit par De Bary (1866) (Moricca et Ragazzi, 2008 ; Selvanathan et al., 2011) et a été d'abord appliqué à un organisme existant dans une plante (Toofanee et Dulymamode, 2002), au moins pendant une partie ou la totalité de son cycle de vie. Il est caractérisé comme un stade asymptomatique d'un microorganisme qui, est alors symbiotique pendant une partie de sa colonisation (Wilson, 1995 ; Hamilton et al., 2012). Les champignons endophytes sont omniprésents dans la nature (Arnold et al., 2003 ; Hyde et Soytong, 2008 ; Ghimire et al., 2011). C’est une partie intégrante du microbiome de la plante ; ils infectent et colonisent les végétaux (Algues, Bryophytes, Ptéridophytes, Gymnospermes et Angiospermes) (Hyde et Soytong, 2008 ; Suryanarayanan et al., 2012), sans déclencher de symptômes visibles de la maladie (Wilson, 1995 ; Arnold et al., 2001 ; Khan, 2007 ; Hyde et Soytong, 2008 ; Huang et al., 2008 ; Morica et Reggazi, 2008 ; 6 Chapitre 1 Mycoendophytes Rodriguez et al., 2009 ; Huang et al., 2009 ; Errasti et al., 2010 ; Tejesvi et al., 2010 ; Suryanarayanan et al., 2012 ; Al mahi et al., 2013 ; Lakshman et kurandawad, 2013). Mycoendophytes est le nouveau terme proposé pour ces champignons vivant dans les plantes (Rodriguez et al., 2009 ; Rai et al., 2012). Ils ont été trouvés dans les tissus sains de tous les taxons de végétaux étudiés à ce jour. Les endophytes envahissent les tissus des plantes et résident dans les tissus entre les cellules végétales vivantes (Rai et al., 2012). Ils sont parfois confondus avec des champignons mycorhiziens qui vivent en symbiose avec les racines des plantes (Tao et al., 2008 ; Purahong e t Hyde, 2011). La définition du terme peut englober les champignons mycorhiziens, mais ils ont été exclus de ce groupe parce que leurs modes de vie sont différents (Hyde et Soytong 2008 ; Purahong e t Hyde, 2011). La relation entre le champignon endophyte et son hôte a été généralement considérée comme une relation mutualiste (Clay et al., 1993 ; Vesterlund et al., 2011), mais elle peut varier du mutualisme à l'antagonisme, en fonction du génotype du champignon et de l'hôte, ainsi que des conditions environnementales, en particulier chez les herbes et les arbustes indigènes (Faeth et Sullivan, 2003 ; Vesterlund et al., 2011). 2- Systématique des champignons 2-1-Introduction Les champignons ont longtemps été considérés comme des végétaux, plus précisément des Cryptogames, à la reproduction "cachée", par opposition aux Phanérogames, ou plantes à fleurs donc à organes reproducteurs bien visibles. Durant la seconde moitié du XXème siècle, le caractère végétal des champignons a été contesté. Les progrès de la biologie moléculaire confirment que les champignons peuvent constituer un règne à part nommé Mycota ou Fungi (ou encore règne fongique). Malgré tout, on ne sait pas encore où classer avec certitude certains groupes très particuliers. Actuellement, plus de 40000 espèces de champignons ont été recensées et il est sûr que ceci ne se représente qu’une partie de l’ensemble de ces champignons (Laberche, 1999). Les champignons ou Mycètes sont des organismes eucaryotes uni ou pluricellulaires, incluant des espèces macroscopiques (macromycètes) et d’autres microscopiques (micromycètes) d’aspect filamenteux ou lévuriforme. Ces derniers peuvent devenir visibles lorsque leur développement est important (Tabuc, 2007). 7 Chapitre 1 Mycoendophytes Les champignons sont des Eucaryotes pluricellulaires, rarement unicellulaires chez lesquels les noyaux se trouvent dans un mycélium fondamentalement continu ; ce mycélium se cloisonne dans certains groupes et certains stades du cycle de développement (Raven et al., 2007). L’appareil végétatif des champignons est un thalle composé de filaments : les hyphes, souvent étendues et dont l’ensemble forme le mycélium. Ces filaments peuvent être organisés en siphons, ou segments. La plupart des champignons ont une paroi cellulaire constituée de chitine, qui est une substance du règne animal constituant l’exosquelette des insectes. Quelques champignons cependant possèdent une paroi cellulosique (Laberche, 1999). Les champignons sont hétérotrophes ; ils se nourrissent par absorption. Avec les bactéries hétérotrophes, les champignons sont les principaux agents responsables des décompositions dans la biosphère ; ils décomposent les matières organiques et recyclent le carbone, l’azote et les autres composants du sol et de l’air. En raison de leurs activités de décomposition, ils entrent souvent en conflit direct avec les intérêts de l’Homme, en s’attaquant pratiquement à toutes les substances. La plupart des champignons sont saprophytes. Cela signifie qu’ils vivent de la matière organique des organismes morts. Beaucoup de champignons s’attaquent cependant aux organismes vivants et sont la cause d’importantes maladies chez les plantes, les animaux domestiques et l’Homme. Plusieurs champignons ont une importance économique pour l’Homme parce qu’ils détruisent des denrées alimentaires et d’autres matières organiques. Le règne des Fungi comprend également des levures, les moisissures des fromages, les champignons comestibles, ainsi que les Penicilliums et les autres producteurs d’antibiotiques (Raven et al., 2007). Une caractéristique majeure des champignons est leur mode de reproduction ; ils produisent un grand nombre de spores, ce qui leur assure un pouvoir de contamination considérable. Les spores sont issues de plusieurs modalités de reproduction asexuée ou sexuée qui représentent le principal critère de leur classification (Tabuc, 2007). Deux développements récents et importants ont grandement influencé et provoqué d'importants changements dans les concepts traditionnels de la systématique. Ce sont les approches phylogénétiques et l'incorporation des techniques de la biologie moléculaire, en particulier l'analyse des séquences nucléotidiques d’ADN, dans la systématique moderne. Les analyses des séquences d'ADNr et d'ARNr constituent un complément important des critères morphologiques nécessaires pour permettre aux champignons d’être plus facilement identifiés et placés sur un arbre phylogénétique unique (Guarro et al., 1999 ; Tabuc, 2007). 8 Chapitre 1 Mycoendophytes 2-2- Principaux groupes chez les champignons La systématique des champignons est basée essentiellement sur des critères morphologiques (Guarro et al., 1999 ; Sanchez Marquez et al., 2007 ; Tabuc, 2007). De nombreuses approches alternatives ont été développées, y compris les études nutritionnelles et physiologiques, les tests sérologiques, métabolites secondaires, des systèmes d'ubiquinone et les acides gras. Bien que certaines d'entre elles sont très utiles pour identifier les champignons peu différenciés tels que les levures, elles ne sont que des outils complémentaires de données morphologiques dans la plupart des cas (Guarro et al., 1999). Chez les champignons, on distingue 4 divisions (ou phylums) (Lutzoni et al., 2004) (Figure 1). Les Chytridiomycota ont été considérés comme ayant les traits les plus primitifs parce qu'ils sont les seuls champignons qui ont conservé la reproduction par des spores flagellées (zoospores). Ils comprennent des formes unicellulaires ou filamenteuses qui produisent des cellules flagellées à un certain moment de leur cycle de vie (Lutzoni et al., 2004 ; Raven et al., 2007). Les cellules mobiles possèdent le plus souvent un seul flagelle postérieur lisse. Les parois cellulaires sont formées de chitine, mais il peut exister aussi d’autres polymères, et leurs réserves sont composées de glycogène. Il existe environ 790 espèces (Raven et al., 2007). Ils vivent dans les habitats aquatiques et terrestres (Lutzoni et al., 2004). 9 Chapitre 1 Mycoendophytes Figure 1 : cladogramme sur la base actuelle d’hypothèses moléculaires des relations entre les grandes lignées de champignons illustrant la variation des pores du septum chez trois phylums (Lutzoni et al., 2004). Les dessins sont des interprétations de micrographies publiées des cloisons végétatives, sauf pour Sordaria humana, qui sont fondées sur des cloisons d’asque matures (MA) et immatures (IA) et Gilbertella persicaria, qui est basée sur le septum gametangial. Six variations sur l'organisation des pores du septum sont illustrées: septum multiperforé avec plasmodesmes et desmotubules (D; Powellomyces variabilis, Spizellomycétales; Gilbertella persicaria, Endomyces geotrichum, Saccharomycotina), le septum multiperforé avec des pores périphériques et pore central branché (Allomyces macrogynus), le septum uniperforé avec une cavité lenticulaire, occlusion de pores non menbranaires lenticulaires, et en association avec des globules non membranaire (Dimargaris cristalligena, Dimargaritales, groupe frère possible de Kickxellales), septum uniperforé avec les organismes Woronin (BM; Aspergillus nidulans, Eurotiomycetidae), et de la cloison uniperforée avec tore et 10 Chapitre 1 Mycoendophytes rayonnant un saccule tubulaire ou bouchon poreux membraneux subsphériques (Sordaria humana IA et MA, respectivement). LW, paroi latérale de l’hyphe. Illustrations de haut en bas interprétées à partir Meyer et Fuller (1985), Powell (1974) et Lutzoni et al., (2004). Les Zygomycètes comprennent environ 1060 espèces décrites, dont certains font partie des endomycorhizes présentes chez environ 80% de toutes les plantes vasculaires. Ce sont des champignons terrestres dont les hyphes ne sont cloisonnées que dans les organes reproducteurs (Raven et al., 2007); ils sont donc coenocytiques (pas de filaments septés) et soumis à la reproduction sexuée par la formation d'une spore à paroi épaisse appelée zygospore (Schußler et al., 2001). Les parois cellulaires comportent souvent de la chitine. Il est généralement possible de reconnaitre les Zygomycètes à leurs hyphes abondantes, à croissance rapide (Raven et al., 2007). Les Zygomycètes comprennent un assemblage diversifié de taxons qui comprennent les saprophytes du sol (Mucorales), les symbiotes des Arthropodes (Trichomycètes), et les champignons mycorhiziens à arbuscules des plantes (Glomérales); maintenant reconnues comme un phylum à part : les Gloméromycètes (Schußler et al., 2001). Ils sont principalement filamenteux et ne montrent pas de flagelles au niveau des spores (Lutzoni et al., 2004). Les Gloméromycètes sont des champignons qui forment des mycorhizes à arbuscules (AM) avec les racines de l’ordre des deux tiers de toutes les espèces végétales (Fitter et al., 2011). Les phyla des Ascomycota et Basidiomycota forment le groupe des Dicaryotes et représentent la majorité des espèces de champignons décrites, en l’occurrence 67000 espèces sur les 100.000 recensées (Le Calvez, 2009). Ils sont unis par la possession d'hyphes cloisonnées et une étape de la vie dicaryotique, mais différents dans les structures impliquées dans la méiose et la sporulation (Lutzoni et al., 2004). Les organismes du phylum des Ascomycota comptent 45000 espèces décrites à ce jour (Le Calvez, 2009) et constituent la quasi-totalité des champignons capables de former des associations lichéniques (Lutzoni et al., 2004 ; Tabuc, 2007). Le groupe des Ascomycètes contient le plus grand nombre d'espèces décrites, y compris les espèces modèles importantes telles que Saccharomyces cerevisiae (Lutzoni et al., 2004), utilisées en agroalimentaire ou en pharmacologie comme Penicillium chrysogenum (Le Calvez, 2009) et Neurospora crassa (Lutzoni et al., 2004), des espèces pathogènes pour l’homme et les animaux (levures ascosporées ou champignons filamenteux comme les Aspergillus) (Tabuc, 2007). Des modes de vie saprophytes et parasites sont également largement répandus (Lutzoni et al., 2004 ; 11 Chapitre 1 Mycoendophytes Tabuc, 2007). Les Ascomycètes sont des champignons terrestres et aquatiques dont les hyphes sont cloisonnées, mais les cloisons sont perforées ; des cloisons complétées isolent les structures reproductrices, telles que les spores (Raven et al., 2007). Les Ascomycota sont caractérisés par des spores formées à l'intérieur de cellules fertiles : les asques (Lutzoni et al., 2004 ; Tabuc, 2007). L’asque est formé au cours de la reproduction sexuée, il renferme un nombre défini d’ascospores (Tabuc, 2007 ; Raven et al., 2007). C’est là que se déroule la méiose et que se forme les ascospores (Raven et al., 2007). Ce sporocyste, globuleux, cylindrique ou plus ou moins claviforme, avec une paroi simple ou double représente un important critère d’identification (Tabuc, 2007). Chez de nombreux Ascomycètes, les hyphes s’agglomèrent en structures complexes appelées ascomes (Raven et al., 2007). A côté de cette forme sexuée ascogène (forme parfaite ou téléomorphe), la majorité des Ascomycètes se reproduisent par multiplication asexuée (forme imparfaite ou anamorphe) à l’aide de conidies. Les Deutéromycètes sont les champignons imparfaits ou Fungi imperfecti (Tabuc, 2007), ou champignons à conidies (Raven et al., 2007). Ils réunissent le plus grand nombre d’espèces pathogènes pour l’homme et les animaux. Cette division, très hétérogène englobe toutes les espèces de champignons, pour lesquelles la reproduction sexuée n’est pas connue. La majorité de Deutéromycètes sont des formes imparfaites d’Ascomycètes. Ces champignons sont unicellulaires ou à thalle filamenteux septé. Les Deutéromycètes sont divisés en 3 classes (Tabuc, 2007) : - les Blastomycètes qui réunissent des levures ; - les Hyphomycètes : champignons filamenteux, stériles ou produisant des spores directement sur les hyphes ou sur des conidiophores simples ou agrégés (Moniliales) ; - les Coelomycètes : Champignons auxquelles les conidies sont produites dans des structures de protection : les pycnides (Sphaeropsidales) et les acervules (Mélanconiales) ; généralement parasites de végétaux, forment des structures de fructification aplaties (acervules), sous l’épiderme ou la cuticule des cellules de la plante-hôte (Tabuc, 2007). Les Hyphomycètes et les Coelomycètes comprennent des agents de biodégradation, mais aussi des moisissures utiles aux biotechnologies. Les Hyphomycètes sont des champignons pour lesquels les conidies naissent de cellules banales ou de cellules spécialisées souvent portées par un filament différencié, le conidiophore. Certaines Hyphomycètes 12 Chapitre 1 Mycoendophytes (Rhizoctonia, Sclerotium) ne forment jamais de spores ; ils sont classés dans le groupe Micellia sterilia (Tabuc, 2007). Les spores peuvent être (Tabuc, 2007) : a) des chlamydospores, spores de résistance, souvent à paroi épaisse, terminales ou intercalaires, différenciées par transformation de cellules du mycélium (Trichoderma, Fusarium) ou de conidies (Fusarium) ; b) des arthrospores (arthroconidies) formées par fragmentation d’hyphes non différenciées ; c) des conidies proprement dites, souvent bourgeonnées par des cellules spécialisées nommées phialides ; la forme, les dimensions, la couleur, la structure (unicellulaires, bicellulaires, etc…), l’ornementation des conidies représentent un ensemble de caractères très varié, qui constitue des critères d’identification de genres et d’espèces (Tabuc, 2007) ; d) les sclérotes, présents sous la forme de masses mycéliennes compactes, souvent dures, globuleuses, ellipsoïdales ou allongées, sont considérés comme des organes de conservation (Botrytis, Aspergillus, Penicillium). Les organismes du phylum des Basidiomycota regroupent 22000 espèces décrites. Leur mode de vie est principalement saprophyte : ce sont d’ailleurs les organismes fongiques ayant les capacités de dégradation de matériels ligno-cellulolytique les plus élaborées. On retrouve également des organismes symbiotiques de plantes ou parasites d’animaux (Le Calvez, 2009). Les champignons Basidiomycètes sont des champignons terrestres dont les hyphes sont perforées ; des cloisons complètes isolent les structures reproductrices, telles que les spores. La reproduction sexuée implique la formation de basides : la méiose s’y déroule et sur elles se forment les basidiospores. Les Basidiomycètes sont dicaryotiques pendant la plus grande partie de leur cycle de développement. Ils représentent l’élément fongique de la plupart des ectomycorhizes (Raven et al., 2007). 3- Diversité des champignons endophytes 3-1- Diversité au sein des plantes entières La diversité des champignons endophytes est élevée, avec de nouvelles espèces de champignons encore non décrites (Albrectsen et al., 2010). Les champignons sont associés à 13 Chapitre 1 Mycoendophytes des végétaux depuis plus de 400 millions d'années (Krings et al., 2007 ; Sun et al., 2011), ils ont été isolés à partir de différentes plantes telles que les mousses (Jakucs et al, 2003; Sun et al., 2011), les fougères (Sun et al., 2011), les Graminées (Muller et Krauss, 2005; Sun et al., 2011), les plantes arbustives (Barrow et al., 2004 ; Sun et al., 2011), les plantes à feuilles caduques, des conifères (Albrectsen et al., 2010) et les lichens (Sun et al., 2011). Le nombre d'espèces endophytes détectées chez les végétaux dans le monde augmente chaque année. On estime qu’il est de 500.000 à 600.000 espèces. Plus de 100 taxons endophytes ont été identifiés (González et Tello, 2011) et environ 465.000 d'entre elles ne sont pas encore décrites (Botella et Diez, 2011). La biodiversité des endophytes chez certaines espèces de plantes peut être remarquable (Sun et al., 2011). La grande diversité des champignons endophytes (Arnold et Lutzoni, 2007 ; Hyde et Soytong, 2008 ; Sun et al., 2011 ; Lakshman et Kurandawad, 2013), leur capacité à produire divers produits chimiques bioactifs (Aly et al., 2010 ; Sun et al., 2011 ; Rivera-Orduna et al., 2011), la promotion de la croissance et de la résistance de leur hôte (Rodriguez et al., 2009 ; Sun et al., 2011 ; Lakshman et Kurandawad, 2013), font que l'étude des endophytes est devenu l'un des plus importants points de la recherche en mycologie (Sun et al., 2011). La plupart des espèces identifiées sont des Ascomycètes, seulement 9 espèces sont des Basidiomycètes et 2 des Zygomycètes. Les Ascomycètes identifiés appartiennent à 54 genres différents, et la plupart pourraient être regroupés au sein de 22 familles. Soixante-dix sont des espèces uniques, représentées par un seul isolat, et 39 espèces sont plurielles, échantillonnées plus d'une fois. La courbe cumulative des espèces calculées à partir de tous les isolats suggère que l'augmentation du nombre de plantes analysées donnerait d'autres espèces. Les genres les plus abondants recueillis sont les suivants: Penicillium (34 isolats), Cladosporium (21 isolats), Acremonium (20), Helgardia (18), Podospora (18), Fusarium (17), Phaeosphaeria (17), Epicoccum (15), Epichloe (8), Alternaria (7), Chaetomium (9) et Lewia (7). Ces 12 genres représentaient 57% de tous les isolats obtenus, mais ne représentaient que 25% de toutes les espèces enregistrées (Sanchez Márquez et al., 2007). L’identification des champignons endophytes est basée principalement sur des méthodes morphologiques, à l'aide des caractères du phénotype lors de la culture des champignons concernant la colonie ou les hyphes, les caractères de la spore, ou de la structure de reproduction, si ces fonctions sont visibles (Selim et al., 2012 ; Tabuc, 2007). Mais certains isolats endophytes peuvent ne pas produire les structures de reproduction, même 14 Chapitre 1 Mycoendophytes après plusieurs mois. Ces isolats sont encouragés à sporuler sur un milieu contenant des fragments ou d'un extrait de la plante hôte (Selim et al., 2012). Les isolats stériles doivent être vérifiés régulièrement pour les organes de fructification sur une période de 3 à 4 mois et les isolats qui n’ont pas sporulé sont appelés mycéliums stériles, et sont divisés en différents morphotypes en fonction de leurs caractéristiques de culture. Ces groupes de champignons sont communs dans les études d’endophytes (Lacap et al., 2003 ; Selim et al., 2012). Les mycoendophytes se répartissent en 4 classes : 9 les endophytes de la classe 1 sont des Clavicipitacées (Rodriguez et al., 2009 ; Rai et al., 2012 ; Premjanu et Jayanthy, 2012) ; 9 les classes 2 et 4 incluent des endophytes non–Clavicipitacées, ils montrent la capacité de coloniser asymptomatiquement et confèrent des avantages aux espèces hôtes génétiquement éloignées des habitats pouvant réunir à la fois les Monocotylédones et les Dicotylédones, la plupart de ces champignons endophytes appartiennent aux Ascomycètes avec quelques Basidiomycètes ; les endophytes de la classe 2 colonisent les racines, tiges et feuilles et sont responsables des infections importantes au sein des plantes, ils sont transmis par des graines et des rhizomes et présentent une faible abondance dans la rhizosphère, et ont généralement des fréquences d’infection élevées (90%-100%) dans la culture de plantes des habitats très stressés (Rodriguez et al., 2009 ; Rai et al., 2012) ; les endophytes de la classe 4 sont des champignons Ascomycètes sous forme de conidies ou stériles et qui forment des structures telles que des hyphes mélanisées inter et intracellulaires et des microsclérotes dans les racines (Rodriguez et al., 2009 ; Rai et al., 2012) ; 9 les endophytes de la classe 3 comprennent des champignons endophytes très diversifiés associés à des feuilles de plantes non vasculaires, des plantes vasculaires sans graines, des Conifères, des Angiospermes ligneuses et herbacées, dans les biomes allant des forêts tropicales à la forêt boréale et à l’arctique (Rodriguez et al., 2009 ; Rai et al., 2012). En résumé, les champignons endophytes peuvent être divisés en deux groupes (Clavicipitacées et non Clavicipitacées), et plus récemment, les membres du groupe des nonClavicipitacées ont été séparés en trois groupes en fonction de la gamme d'hôtes, des tissus 15 Chapitre 1 Mycoendophytes colonisés, de la transmission, la colonisation de la plante, la biodiversité et les avantages de remise en forme conférés aux hôtes (Tableau 1). Les champignons endophytes Clavicipitacées ont des gammes d'hôtes étroites, limitées à certaines espèces de Graminées, tandis que les champignons endophytes non-Clavicipitacées ont de larges gammes d'hôtes présentes dans les plantes non vasculaires et vasculaires à la fois (Rodriguez et al., 2009 ; Purahong et Hyde, 2011). Tableau 1 : critères symbiotiques pour caractériser les classes de champignons endophytes (Rodriguez et al., 2009). Critères Clavicipitacées Non-Claviciptacées Classe 1 Classe 2 Classe 3 Classe 4 Limitée Vaste Vaste Vaste Tissu(s) Pousses et Pousses, racines Pousses Racines colonisé rhizomes et rhizomes Colonisation Extensive Extensive limitée Extensive Basse Basse Elevée Inconnue Horizontale et Horizontale et Horizontale Horizontale verticale verticale NHA NHA et HA NHA NHA Classe d’hôte dans la plante Biodiversité au niveau de la plante Transmission Avantages NHA : avantages comme la tolérance à la sécheresse, augmentation de la croissance. HA : avantages résultent de la spécificité d’habitat et les pressions de sélection comme le pH, température et la salinité. 16 Chapitre 1 Mycoendophytes 3-2- Diversité des champignons endophytes au niveau des différents organes végétaux 3-2-1- Diversité des champignons endophytes au niveau des brindilles et des rameaux Les brindilles de Pinus halepensis montrent une richesse en espèces d’endophytes. Alternaria alternata est l'espèce la plus abondante, suivie par Aureobasidium pullulans, Cyclaneusma niveum, Fusarium proliferatum et Lophodermium pinaster. Au contraire, Leptosphaeria sp., Phoma herbarum, Paraconiothyrium sp. et Brunchorstia pinea ne sont apparues que dans un seul endroit et juste dans les rameaux (Botella et Diez, 2011). De fort taux de colonisation par des champignons endophytes au niveau des rameaux de Quercus ilex et Quercus faginea ont été observés (76% à 82%) (Sun et al., 2011). Les champignons concernés sont Ascochytopsis vignae, Coniothyrium olivaceum, Coniothyrium sp., Paraconiothyrium brasiliense, Phoma glomerata, Phomopsis archeri et Phomopsis sp. Ils sont significativement plus faibles dans les rameaux d’un an que ceux de 2 et 3 ans (Sun et al., 2011). Les rameaux sont durables ; ils accumulent plus de propagules fongiques avec le temps (Wang et Guo, 2007 ; Sun et al., 2011). 3-2-2- Diversité des champignons endophytes au niveau des feuilles Les champignons endophytes peuvent être découverts chez toutes les feuilles de plantes et dans différentes régions du monde (Petrini et Carroll, 1981 ; Petrini et al., 1992 ; Larran et al., 2002). De nombreuses enquêtes dans les trois dernières décennies ont montré que les endophytes sont abondants dans les feuilles de nombreux conifères. La plupart des endophytes des feuilles de conifères sont des Ascomycètes filamenteux. Contrairement aux endophytes Clavicipitacées des Graminées, les endophytes des conifères sont généralement transmis entre les hôtes via une propagation contagieuse (transmission horizontale), et se présentent sous de nombreuses infections localisées, ce qui augmente la diversité et la densité des espèces avec l’augmentation de l'âge des feuilles. Jusqu'à 110 espèces de champignons endophytes ont été trouvées dans les feuilles de certaines espèces comme Pseudotsuga menziesii (Carroll et Carroll, 1978 ; Arnold et al., 2007), mettant en évidence la capacité des conifères à s'engager dans des symbioses avec une très grande diversité de champignons dans leurs tissus présents au dessus du sol (Arnold et al., 2007). Les Leotiomycètes ont été 17 Chapitre 1 Mycoendophytes désignés comme la classe prédominante chez les Gymnospermes, et en particulier l’ordre des Helotiales. Ils sont représentés par des champignons pathogènes reconnus de Pinus sp. et en particulier de Pinus halepensis en Espagne (Ghimire et al., 2011). Chez Pinus halepensis, seuls les champignons ubiquistes sont omniprésents : Chaetomium, Fusarium proliferatum et Pestalotiopsis besseyi sont décrits comme endophytes des Pins (Botella et Diez, 2011). La microflore associée aux chênes est aussi surabondante et très diversifiée. Les membres de l’ordre des Sordariomycètes constituent principalement ces endophytes foliaires, ils se trouvent couramment chez la famille des Fagaceae (Ghimire et al., 2011). Des études récentes ont montré que la plupart des champignons qui sont initialement censés être des facteurs contributifs dans le dépérissement des chênes sont en réalité des endophytes d'arbres, qui ont provoqué des infections chez les Chênes, sans symptômes ou maintenus aux plus bas niveaux d'infections symptomatiques sur les arbres affaiblis (Moricca et Ragazzi, 2008). La classe la plus riche et la plus abondante est celle des Dothidéomycètes représentée par les ordres suivants : Pléosporales, Botryosphaeriales et Capnodiales. La classe des Sordariomycètes est représentée par l’ordre des Hypocréales, Xylariales, Sordariales et Diaporthales. Cette classe est la deuxième la plus diversifiée en ce qui concerne la composition en espèces, et la troisième sur la fréquence d'apparition des champignons. Les ordres des Helotiales et Rhytismatales correspondent à la classe des Leotiomycètes. Dans ce cas, les espèces identifiées ont une fréquence d'apparition élevée. Les classes les moins abondantes sont la classe des Pezizomycètes comprenant l’ordre des Pezizales et des Eurotiomycètes représentée par l’ordre des Eurotiales. Bien que ces deux dernières classes aient présentées le même nombre d'espèces identifiées, la fréquence d'occurrence de la classe des Pezizomycètes est légèrement plus élevée (Botella et Diez, 2010). Les champignons endophytes semblent être très diversifiés dans un large éventail d'Angiospermes tropicales (Gamboa et Bayman, 2001 ; Arnold et al., 2001). Toutes les feuilles de ces espèces contiennent des champignons endophytes (Petrini et al., 1982 ; Arnold et al., 2001). De nombreuses études examinent la structure de la communauté microfongique d'un certain nombre de plantes dans une variété d'habitats (Kumaresan et Suryanarayanan, 2002 ; Khidir et al., 2010). Les feuilles sénescentes de Rhizophora apiculata sont plus diversifiées par rapport aux jeunes feuilles. Cette diversité peut être faible au mois de Mars chez les 18 Chapitre 1 Mycoendophytes feuilles matures de Rhizophora apiculata par rapport à tous les autres mois, malgré une fréquence de colonisation maximale. Cela indique que la sensibilité des feuilles à des champignons endophytes augmente avec l’âge et les feuilles continuent de recruter certaines espèces de champignons endophytes (Suryanarayanan et Thennarasan, 2004). Par ailleurs, dans les feuilles, il peut y avoir des variations dans les champignons endophytes entre le pétiole, le limbe et la nervure médiane (Gasser et al., 2011), mais aussi entre les types de cellules (Petrini, 1991 ; Toofanee et Dulymamode, 2002). Ils sont plus fréquents dans les nervures et les pétioles que dans les tissus internervaires. Les endophytes du limbe de la feuille de Licula ramsayi ont tendance à se concentrer dans la nervure de la feuille. Cela peut s’expliquer par les propriétés physiques de la feuille notamment le comportement de l'eau, le profil des eaux de ruissellement et de l'évaporation qui favorisent le pétiole et la nervure centrale, parce qu’ils ont tendance à avoir plus de vaisseaux que la région internervaires, et donc aider les champignons endophytes plus en terme de nutrition, de rétention et de déposition des spores. En outre, les stomates situés sur des parties spécifiques de la feuille leur permettent de jouer un rôle dans la colonisation par suspension dans l’air (Toofanee et Dulymamode, 2002). 3-3- Facteurs de diversité des champignons endophytes Les champignons endophytes cohabitent avec les saprophytes et les pathogènes. Une seule espèce fongique peut développer différents modes de vie en raison de l'influence des variations de l'environnement sur le génome fongique (Promputtha et al., 2007; Botella et Diez, 2011 ; Albrectsen et al., 2010). Parmi les facteurs qui font que les champignons sont génétiquement très diversifiés (Arnold et al., 2000 ; Botella et Diez, 2011), nous pouvons citer la latitude, la température moyenne ou les précipitations annuelles (Arnold et Lutzoni, 2007), le degré de perturbation subi dans une communauté végétale et l'état phytosanitaire de la plante hôte (Arnold et al., 2003 ; Gamboa et Bayman , 2001). Il y a aussi d’autres facteurs, tels que l’âge des tissus, la spécificité tissulaire ou la végétation associée (Carroll et Carroll, 1978 ; González et Tello, 2011). Plusieurs auteurs ont suggéré que les endophytes sont très différents dans les forêts tropicales (Arnold et al., 2000 ; Hawksworth, 2001 ; Bottela et Diez, 2011 ; Sowparthani et Kathiravan, 2011 ; Mayerhofer et al., 2012 ; Dhanalakshmi et al., 2013). Les données 19 Chapitre 1 Mycoendophytes préliminaires recueillies par des études de ce type ont été utilisées pour appuyer les arguments concernant l'hyperdiversité des champignons dans son ensemble (Hawksworth, 2001 ; Arnold et Lutzoni, 2007). Au niveau des forêts tropicales humides, jusqu'à 17 espèces d’endophytes ont été récupérées à partir d'une seule feuille, avec des domaines d'infection généralement sur l'échelle de seulement 2 mm2 de tissu foliaire (Gamboa et Bayman, 2001 ; Arnold et Lutzoni, 2007). Tous les biomes étudiés montrent des communautés d'endophytes uniques et diversifiées. Cependant, les arbres tropicaux et les feuilles qu'ils portent semblent être les points chauds de la diversité des espèces fongiques particulières (Arnold et Lutzoni, 2007). Les champignons endophytes se trouvent dans les tissus photosynthétiques de toutes les principales lignées de plantes terrestres (Arnold et al., 2000 ; Arnold et Lutzoni, 2007 ; Amirita et al., 2012). Les symbiotes cryptiques sont clairs, mais l'ampleur de leur diversité, gamme d'hôtes, et les distributions géographiques sont inconnues. Pour explorer l’hyperdiversité présumée des endophytes foliaires, des communautés endophytes ont été comparées sur un vaste gradient latitudinal de l'arctique canadien à la forêt tropicale de la plaine du centre du Panama, par l’utilisation des données des séquences moléculaires de 1403 souches endophytes, afin de montrer que l'augmentation de l'incidence des endophytes et la diversité des hôtes est étendue de l'arctique à des sites tropicaux. Des communautés endophytes des plus hautes latitudes sont caractérisées par des espèces relativement peu nombreuses de différentes classes d'Ascomycètes, alors que les communautés d’endophytes tropicales sont dominées par un petit nombre de classes avec un très grand nombre d'espèces endophytiques (Arnold et Lutzoni, 2007). L'incidence des infections endophytes est passée de l'arctique aux tropiques. Comme de nombreux organismes, les symbiotes endofoliaires augmentent en diversité avec la diminution de la latitude, tant en termes de communautés associées à des hôtes individuels, mais aussi au niveau communautaire. La majorité des espèces présentes dans ces régions géographiques (arctique / zones boréales, tempérées et tropicales) sont propres à ces domaines ; 71,2% des espèces sont spécifiques à une seule zone biogéographique (Arnold et Lutzoni, 2007). La région méditerranéenne semble avoir moins de richesse en champignons endophytes (Botella et Diez, 2011). L'activité microbienne dans les sols désertiques dépend fortement des 20 Chapitre 1 Mycoendophytes caractéristiques telles que la température, l'humidité et la disponibilité en carbone. Parmi ceux-ci, la disponibilité en eau est la principale contrainte affectant la diversité, la communauté microbienne et l’activité de la structure (Bhatnagar et Bhatnagar, 2005). L’analyse typologique de la microflore endophytique des arbres a suggéré que le facteur géographique influe sur les modes de distribution des endophytes d’une manière plus significative que le facteur saisonnier. Par exemple le facteur géographique influe de manière décisive sur les modes de répartition des populations de champignons endophytes de Q ilex, car les fréquences des espèces, sont clairement dépendantes du site au niveau duquel les arbres ont été échantillonnés (Collado et al., 1999). La diversité et l’abondance varient dans l'espace et dans le temps et à la suite de l'effort d'échantillonnage. En plus des variations dues à des facteurs temporels et spatiaux, la richesse des endophytes varie avec l'intensité d'échantillonnage (Arnold et al., 2000 ; Hyde et Soytong, 2008 ; Albrectsen et al., 2010). 4- Biologie et écologie des champignons endophytes Les champignons endophytes pénètrent dans les tissus végétaux au niveau du système racinaire, cotylédons, tige, feuille et fleur et ils peuvent soit se localiser au point d'entrée ou se propager dans toute la plante (Li et al., 2012). Les communautés d’endophytes peuvent varier spatialement dans de nombreux types de plantes (Kumar et Hyde, 2004 ; Rivera-Orduña et al., 2011). Chaque plante des quelques 270.000 espèces de plantes existantes sur terre est l'hôte d'un ou plusieurs endophytes (Hyde et Soytong, 2008 ; Rivera-Orduña et al., 2011). La longévité des arbres, la diversité de leurs organes et des tissus (racines, tronc, écorce, brindilles, branches, feuilles, bourgeons et fleurs), et les variations de l'environnement local des différents tissus conduisent à de nombreuses niches différentes, qui sont colonisées plus ou moins par des ensembles différents de champignons endophytes (Moricca et Ragazzi, 2008). La colonisation des tissus de l'hôte par des champignons endophytes dépend également de la réussite de la pénétration des couches protectrices externes, qui ne peut se faire que par la rupture mécanique des tissus de protection ou par digestion enzymatique des couches cuticulaires et épidermiques (Toofanee et Dulymamode, 2002 ; Jumpponen et Trappe, 1998). 21 Chapitre 1 Mycoendophytes Les endophytes colonisent les espaces inter et intracellulaires des tissus de végétaux vivants. Plusieurs centaines d'espèces de ces microorganismes peuvent être isolées à partir d'une seule plante, mais très peu seraient spécifiques de la plante hôte (Zhang et al., 2006). Les plantes supérieures constituent ainsi une véritable niche écologique, réservoir potentiel d'une vaste diversité microbiologique (Kogel et al., 2006). Les espaces intercellulaires sont formés par la juxtaposition de trois à quatre cellules et la dissolution de la lamelle médiane. Ils sont très différents dans les feuilles et les tiges, par opposition aux racines. Ils constituent une partie significative de la plante (Kuldau et Bacon, 2008 ; Garcia et al., 2012), 6% des tissus de la feuille se composent d'espaces intercellulaires (Tetlow et Farrar, 1993 ; Kuldau et Bacon, 2008). L’espace intercellulaire est riche en substances nécessaires pour soutenir la croissance des champignons endophytes. De plus, les concentrations de sucres signalées dans l'apoplasme non endophytique sont suffisantes pour soutenir la croissance fongique (Farrar et Farrar, 1986 ; Kuldau et Bacon, 2008). En modifiant le pH de l'apoplasme, des champignons endophytes peuvent modifier indirectement l'activité des enzymes spécifiques et la cinétique d’absorption de sucres des cellules hôtes, en augmentant ainsi la concentration de sucres dans l'apoplasme. L'apparition dans l'apoplasme de protéines, ammonium, nitrate, nitrite, plusieurs acides aminés, acides organiques et sucres, sert à réguler l'activité biologique des champignons endophytes et contribue à la diversité des métabolites secondaires produits par des génotypes spécifiques de chaque espèce ou souche endophyte (Kuldau et Bacon, 2008). Cette colonisation peut se faire par des hyphes hyalines qui sont des extensions internes des hyphes, mais aussi des microsclérotes mélanisés. Ces hyphes hyalines sont plus fréquentes dans les racines des plantes physiologiquement actives, contrairement aux hyphes et aux microsclérotes mélanisées plus abondantes dans les racines de végétaux qui sont en phase de dormance. Les hyphes hyalines se connectent aux hyphes mélanisées et cloisonnées (Figure 02) et forment des microsclérotes mélanisées (Figure 03). Les hyphes hyalines internes non colorées sont protégées par l'environnement interne de la racine, elles manquent de chitine et de mélanine, elles sont donc minces, hyalines, plus perméables, avec un potentiel accru pour l'échange de ressources avec l'hôte et sont considérées comme des phases actives de champignons endophytes foncés septés de racines (Dark septate endophytes ou DSE), contrairement aux hyphes externes qui ont des parois épaisses et mélanisées, leur permettant de fonctionner dans un sol sec (Barrow et Aaltonen, 2001). 22 Chapitre 1 Mycoendophytes Figure 02 : hyphes mélanisées (MH) en continu avec hyphes hyalines (HH) dans le cortex des racines d’Atriplex canescens (Barrow et Aaltonen, 2001). En effet, une étude des endophytes des plantes du désert faite sur plusieurs années, à différentes saisons et des conditions climatiques variables révèle que des structures caractéristiques mélanisées sont les plus fréquentes chez les racines des végétaux en période de dormance (Barrow et al., 2008), contrairement aux plantes physiologiquement actives où, la structure de la paroi fongique a varié de mélanisée à hyaline, parce que les champignons fonctionnent souvent sans parois comme protoplastes liées à la membrane et échappent à la détection par des méthodes classiques de coloration (Barrow et Aaltonen, 2001 ; Barrow, 2003 ; Barrow et al., 2008). Figure 03 : microsclérotes mélanisées (MM) se développant à partir d’hyphes hyalines septées (HH) dans le cortex des racines d’Atriplex canescens (Barrow et Aaltonen, 2001). 23 Chapitre 1 Mycoendophytes Dans le cylindre central, les hyphes hyalines sont plus étendues et avec un plus petit diamètre (1-2 µm). Leurs parois se distinguent moins et leurs vacuoles colorées de part la présence de lipides (Figure 04). CC Figure 04 : hyphes hyalines (H) dans le cylindre central (CC) (Barrow et Aaltonen, 2001). Vare et al. (1992) ont révélé que 40% des espèces de plantes dans une zone norvégienne antarctique sont colonisées par des champignons bruns foncés à la fois sombres et hyalins, fonctionnellement mutualistes plutôt que saprophytes ou pathogènes (Barrow et Aaltonen, 2011). Ces résultats indiquent que les champignons DSE sont polymorphes et produisent des structures différentes colorées, mélanisées et des tissus hyalins (figures 05, 06 et 07). Figure 05 : hyphes de Phialocephala fortinii colonisant un chevelu de racine de Pinus contorta (Jumpponen et Trappe, 1998). 24 Chapitre 1 Mycoendophytes Figure 06: hyphes du Phialocephala fortinii pénétrant à travers la paroi cellulaire dans la racine de Pinus contorta (Jumpponen et Trappe, 1998). Figure 07 : un microscleroteum d'un champignon endophyte foncé cloisonné dans une racine de Pinus strobus (Wagg et al., 2008). La colonisation par les DSE a été également observée simultanément avec celle des mycorhizes à arbuscules ou des champignons ectomycorhiziens (Horton et al., 1998 ; Jumpponen et Trappe, 1998), car elle est caractérisée par des hyphes superficielles qui ont été appelées «canaux d’hyphes» (Deacon, 1973 ; Jumpponen et Trappe, 1998) (Figures 8 et 9). La morphologie des racines colonisées par des DSE peut ressembler à celle des ectomycorhizes (O'Dell et al., 1993 ; Jumpponen et Trappe, 1998) et des pseudomycorhizes (Wang et Wilcox, 1985 ; Jumpponen et Trappe, 1998). 25 Chapitre 1 Mycoendophytes Hyphes mycéliennes Figure 8 : hyphes de Phialocephala fortinii sur les racines latérales de Pinus contorta (O'Dell et al., 1993 ; Jumpponen et Trappe, 1998). Hyphes superficielles Microsclérotes Figure 9 : hyphes superficielles de Phialocephala fortinii et une cellule remplie de microsclérotes sur les racines de Pinus contorta (Jumpponen et Trappe, 1998). Jumpponen et Trappe (1998) ont examiné des DSE qui colonisent une grande variété d'espèces végétales dans les écosystèmes perturbés. Ces derniers sont morphologiquement différents de la symbiose mycorhizienne classique (Barrow et Aaltonen, 2001). Barrow et al. (1997) ont examiné les racines d’Atriplex canescens récoltées à partir de populations indigènes sur les sites des parcours arides avec différentes humidités du sol. Les DSE sont les colonisateurs fongiques les plus dominants sur l'ensemble des sites et se sont exprimés par des hyphes colorées et mélanisées et des microsclérotes dans le cortex (Jumpponen et trappe, 1998 ; Yuan et al., 2012). La colonisation simultanée par des champignons non septés a été observée occasionnellement pour les sites de haute altitude (plus humides). Ces champignons ont été principalement observés sous forme d’hyphes inter et intracellulaires et des vésicules 26 Chapitre 1 Mycoendophytes colorées, tandis que les arbuscules ont été extrêmement rares (Figure 10) (Barrow et Altonen, 2001). Appressorium au point d’entrer Epiderme Hypoderme Hyphe intracellulaire Cortex Hyphe interacellulaire Arbscules Vésicules Figure 10 : quelques types de structures obtenues à partir de la croissance fongique dans une racine (Brundrett et al., 1996). La recherche sur les champignons endophytes des arbres au cours des deux dernières décennies a montré que pratiquement toutes les feuilles et la tige d’un arbre sont infectées par des champignons endophytes (Suryanarayanan et Thennarasan, 2004). Cependant, certains endophytes trouvés dans les jeunes feuilles sont absents ou ont été moins fréquents dans les feuilles matures. Cela peut s’expliquer par l'environnement intrinsèque des feuilles qui a subit des changements (Toofanee et Dulymamode, 2002). Les feuilles âgées supportent plus d’endophytes et elles sont très densément colonisées par des Coelomycètes par rapport aux feuilles plus jeunes qui sont moins colonisées et dominées par des Hyphomycètes (Suryanarayanan et Thennarasan, 2004). Les feuilles à mesure qu'elles grandissent favorisent donc des endophytes différents. Les feuilles matures subissent plus de photosynthèse et offrent également de grandes quantités de nutriments aux champignons endophytes (Toofanee et Dulymamode, 2002). La fréquence de colonisation par les endophytes augmente avec l'âge de la feuille et atteint un maximum quand les feuilles sénescentes sont sur le point d'être répandues, mais aussi à la période où il y a le moins de précipitations. Cette même constatation a été faite chez le Douglas (Suryanarayanan et Thennarasan, 2004). Chez les Ericacées (Okane et al., 1998 ; Suryanarayanan et Thennarasan, 2004), les feuilles sénescentes ont plus d’endophytes dans les parois de leurs cellules que les 27 Chapitre 1 Mycoendophytes jeunes feuilles (Suryanarayanan et Thennarasan, 2004). Cette colonisation accrue des feuilles âgées est due à une surinfection des feuilles au fil du temps par l’inoculum aérien (Rodrigues et al., 1993 ; Suryanarayanan Vijaykrishna, 2001 ; Suryanarayanan et Thennarasan, 2004). Kumaresan et Suryanarayanan (2002) ont montré que les communautés endophytes des feuilles ne sont pas statiques, mais subissent des changements après la chute des feuilles. Ce qui montre, pour la première fois, que la communauté endophyte est dynamique, même dans les feuilles intactes et de tels changements dans les communautés sont susceptibles d'être plus visibles chez les espèces à feuilles caduques que celles à feuilles persistantes (Suryanarayanan et Thennarasan, 2004). Une colonisation par des champignons DSE semble plus fréquente dans les parties anciennes du système racinaire, suggérant que les DSE préfèrent des tissus racinaires vieillis où ils font le recyclage des racines sénescentes ou mortes en nutriments pour les nouvelles cellules des racines actives (Suryanarayanan et al., 2012). La production de plusieurs enzymes extracellulaires importantes (Kumaresan et Suryanarayanan, 2002 ; Suryanarayanan et al., 2012), offrent une meilleure stratégie de décomposition (Suryanarayanan et al., 2012), comme celle observée chez les aiguilles de sapin en Norvège (Sun et al., 2011). Suryanarayanan et al. (2012) ont rapporté qu’un champignon endophyte Coccomyces sp. de Camellia japonica a été le premier à décomposer la litière, il a stimulé la décomposition ultérieure par d'autres champignons. Les champignons endophytes influent sur les taux de décomposition de deux manières principales : en affectant la qualité de la litière et la communauté des décomposeurs, par la modification de certaines voies métaboliques de la plante hôte, ce qui entraîne une augmentation des substances toxiques, qui peuvent réduire directement la qualité de la litière et / ou modifier indirectement la communauté de décomposition, entraînant une diminution des taux de décomposition (Grime et al., 1996 ; Purahong et Hyde, 2011). Les champignons endophytes peuvent accélérer ou ralentir le taux de décomposition en fonction des interactions entre leurs plantes hôtes et la communauté des décomposeurs (Suryanarayanan et al., 2012). Sous forme de saprophytes de feuilles mortes (Promputtha et al., 2002), certains endophytes comme Colletotrichum (anamorphique Glomerella) et Phomopsis (anamorphique Diaporthe) ont été isolés à partir des feuilles de Magnolia liliifera en Thaïlande. Ils décomposent les feuilles mortes d’hôtes en communautés (Sun et al., 2011). Dans ce cas, une 28 Chapitre 1 Mycoendophytes augmentation de la diversité des mycoendophytes peut accélérer le taux de décomposition. Cependant, de nombreuses études ont rapporté des interactions négatives, telle que la concurrence entre les champignons endophytes décomposeurs et des champignons saprophytes secondaires (Dowson et al., 1988 a et b; Purahong et al., 2011). Nombreux sont capables de décomposer des substances organiques complexes et de nombreux polyphénols, telles que les lignines (Purahong et Hyde, 2011). Une interaction interspécifique entre deux champignons Ascomycètes endophytes des rameaux: Phomopsis et Xylaria et deux champignons saprophytes Basidiomycètes des rameaux fournit un exemple pour démontrer que les champignons endophytes sont en mesure d'exclure les Basidiomycètes saprophytes secondaires. Pour cela, les champignons endophytes infectent les brindilles saines et la litière ligneuse avant qu’elles ne tombent au sol. Ce sont donc des colonisateurs primaires, ils sont en concurrence pour exclure d’autres saprophytes. Certains champignons endophytes sur brindilles de la litière sont des colonisateurs primaires dominants, mais sont remplacés par des saprophytes secondaires lors de la décomposition (Dowson et al., 1988 a et b ; Purahong et Hyde, 2011), et cela peut retarder ou accélérer la décomposition. Des résultats révèlent un possible changement dans le mode de vie des champignons endophytes en saprophytes. Ceci peut avoir une grande influence sur les taux de décomposition de la litière. Mais il est peu probable que tous les champignons endophytes se développent en saprophytes (Osono, 2006 ; Purahong et Hyde, 2011), du fait de leur relation intime avec leur plante hôte. Certaines études suggèrent que les champignons endophytes deviennent saprophytes, lorsque les feuilles des plantes sont sénescentes (Promputtha et al., 2007 ; Purahong et Hyde, 2011). Chez Quercus ilex, Pseudonectria sp. a aussi une fréquence d'isolement beaucoup plus élevée au printemps qu'à l'automne, cela pourrait être lié à sa grande spécificité d'organes. Cette espèce est assez spécifique des feuilles, qui sont plus exposées à des conditions chaudes et sèches de l'été. Mais, les sécheresses persistantes sont devenues de plus en plus fréquentes dans la région méditerranéenne au cours des trois ou quatre dernières décennies comme une conséquence du réchauffement climatique, et comme premier effet de cette pénurie d'eau c’est la réduction de la disponibilité en eau de l’apoplaste (Moricca et Ragazzi, 2008). Un faible potentiel hydrique réduit la viabilité globale des champignons, par une baisse de développement du mycélium et des niveaux d'infection (Duniway, 1979 ; Moricca et Ragazzi, 2008), ce qui explique la réduction de la charge endophytique à la fin de la saison de la croissance (Moricca et Ragazzi, 2008). 29 Chapitre 1 Mycoendophytes Le feuillage de certaines Cupressaceae échantillonnées dans l'Oregon semblait être infecté à une plus large mesure par des champignons, lorsque les échantillons ont été prélevés sur les hôtes poussant dans des zones avec une plus grande densité de la végétation. Ceci a été interprété comme l'effet de la canopée, qui protège les tissus foliaires des agents externes (Petrini et Carroll, 1981 ; Collado et al., 1999). Le même constat a été fait sur la microflore de Pinus au Canada. Le degré d'infection par les endophytes et la diversité des espèces fongiques ont été significativement plus élevées au printemps. Cela pourrait s’expliquer par l'abondance à cette saison des espèces saprophytes tels que Alternaria alternata ou Penicillium funiculosum, qui sont absentes dans les échantillons prélevés à l'automne. Les fréquences de la majorité des espèces dominantes à l'un des sites dépendaient fortement de la saison, les différences entre leurs fréquences d'isolement dans les deux saisons sont statistiquement significatives. D'autres espèces, telle que Pseudonectria sp., Pseudonectria funiculosum et Alternaria alternata, sont plus fréquentes ou ont même été isolées presque exclusivement au printemps. Le printemps semble être associé à la mise en place de plus de souches fongiques endophytes dans les tissus de la plante. Les précipitations plus importantes dans cette saison pourraient favoriser la dispersion des spores fongiques et les températures modérées permettraient une plus grande viabilité des propagules fongiques et donc leur succès dans la colonisation des tissus de la plante (Collado et al., 1999). Une forte corrélation a été observée entre les niveaux d'infection d’endophytes et les précipitations cumulées (Suryanarayanan et Thennarasan, 2004). Ceci à déjà été observé chez le Chêne, où l’eau libre et l'humidité élevées favorisent l'activité et la colonisation fongique de l’hôte (Vannini et al., 1996 ; Moricca et Ragazzi, 2008). Le même constat est noté chez Plumeria rubra, où les précipitations sont les principaux facteurs qui influencent l'infection par des endophytes foliaires. Les feuilles échantillonnées pendant la saison des pluies portent plus d’endophytes que celles prélevées durant la saison sèche (Suryanarayanan et Thennarasan, 2004). Les feuilles les plus fortement colonisées se trouvent plus près du sol ou de la litière, où les conditions d'humidité élevée facilitent la pénétration et la colonisation par des champignons endophytes (Toofanee et Dulymamode, 2002). L’importance relative de deux, géographiques et saisonniers et l'analyse typologique suggèrent que l'influence de la géographie serait plus importante que l'influence potentielle de la saison d’échantillonnage. L'influence de la géographie sur les modes de répartition des champignons endophytes de 30 Chapitre 1 Mycoendophytes Quercus ilex a déjà été signalée par Fisher et al. (1994) ; les arbres semblent être regroupés principalement par site d'échantillonnage, et non par saison (Collado et al., 1999). Les variations des taux d'infection peuvent s’expliquer par l'échelle d'échantillonnage requise lorsque l'on travaille avec des hôtes ligneux, par exemple : Coelomycete anamorphe de Discula quercina est connu comme un endophyte commun sur le Chêne. Certaines espèces de Discula ne présentent pas un stade sexuel connu et sont identifiées en tant qu’Ascomycètes à reproduction asexuée, appartenant à un genre dont les membres présentent des variations considérables dans la morphologie, la physiologie et la spécificité d'hôte. La biologie des champignons endophytes est délicate à étudier. Cela est du au fait qu’ils ne provoquent souvent aucun symptôme chez l'hôte et que leur mode de transmission est parfois incertain (Moricca et Ragazzi, 2008). En effet, Il existe deux modes de reproduction chez les champignons endophytes - Reproduction via la croissance végétative Ce groupe de champignons endophytes se développe complètement dans le tissu de la plante et ne produit jamais de structure externe ou des corps de fructification. La reproduction de ce groupe endophyte est complètement interne (Selosse et Scardl, 2007 ; khan, 2007). Leur reproduction aboutit à travers la croissance végétative des hyphes au développement des ovules de l’hôte, dont elle cause une infection des graines (khan, 2007). - Reproduction via les spores Ce groupe de champignons produit un tissu stromatique tout autour du développement de l’inflorescence. Les inflorescences sont déformées par les endophytes infectieux. Les conidies sont formées sur les tissus, les taux de la manifestation externe de l’infection dépend de l’hôte (khan, 2007). La transmission horizontale du champignon est commune chez les plantes ligneuses (Faeth et Fagan, 2002 ; khan, 2007). Les champignons endophytes ont une plasticité beaucoup plus grande que les plantes, et restent viables et actifs à des potentiels hydriques bien inférieurs à ceux essentiels à leurs hôtes (Moricca et Ragazzi, 2008). 31 Chapitre 1 Mycoendophytes Conformément à leurs stratégies de vie, les endophytes peuvent être soit «obligatoires» : ils sont strictement dépendants de la plante hôte pour leur croissance et leur survie et leur transmission à d'autres plantes se produit verticalement ou par des vecteurs ou «facultatifs» : leur cycle de vie possède un stade dans lequel il existe d’autres plantes hôtes (Li et al., 2012). Les champignons endophytes confèrent dans leur association symbiotique à la plante hôte une amélioration de son état de santé en synthétisant certains métabolites fonctionnels et en retour bénéficient de la protection et des nutriments de la plante (Kogel et al., 2006). 5- Interactions Plante / champignons endophytes 5-1- Symbiose endophytes-plante Les endophytes sont susceptibles d'adopter la même stratégie que les champignons pathogènes afin de pénétrer dans une plante hôte (Sieber, 2007 ; Stone et Petrini, 1997 ; Suryanarayanan et al., 2009). Dans le cas de la pénétration directe des champignons pathogènes, la surface de l'épiderme de l'hôte est la première ligne de défense (Heath, 2002 ; Suryanarayanan et al., 2009). L’induction de phytoalexines et de protéines liées à la pathogénèse observées pour les interactions hôte-pathogène (Suryanarayanan et al., 2009) sont également actives pour les interactions hôte-endophyte (Sieber, 2007 ; Suryanarayanan et al., 2009) ( Figure 11 ). 32 Chapitre 1 Mycoendophytes Endophyte Pathogène Détection, germination, embranchement de signalisation. Reprogrammation de la reconnaissance d’hôte, préparation des cellules pour la pénétration. Pénétration, réorganisation cellulaire. Colonisation. Entretien de la compatibilité, survie de la cellule hôte, transfert de nutriment, effets systémiques, propagation fongique. Figure 11 : développement symbiotique d’endophytes et des agents pathogènes (Kogel et al., 2006). (a) Une fois les spores AM ou d’endophyte germent et le tube germinatif se rapproche d'une racine, la dominance apicale est abandonnée et la ramification des hyphes est déclenchée par 5-désoxy-strigol. Lors du contact physique, le champignon forme un appressorium, qui semble induire le mouvement du noyau de la plante vers le site de contact. (b) Des éléments du cytosquelette et le réticulum endoplasmique forment le dispositif de pré-pénétration dans l'axe du mouvement nucléaire. (c) La structure est formée par une hyphe d’infection, d'où (d) La colonisation du cortex racinaire commence. L’infestation initiale s'accompagne d'une induction équilibrée des gènes de défense. (e) Lorsque le champignon a atteint finalement l’intérieur du cortex, il pénètre dans la paroi de la cellule et construit une structure arborescente d'hyphes « l’arbuscule ». Les cellules contenant des Arbuscules de structures spécifiques du cytosquelette et accumulent des ROS. Bien que les arbuscules se développent et meurt, le champignon se propage plus loin dans la racine et colonise aussi le sol environnant. Là, il faut les nutriments minéraux, qui sont transportés dans la racine et échangés contre des hydrates de carbone. (f) un champignon du mildiou germe, il forme un appressorium pour la pénétration des parois de la cellule hôte. (g) Appressorium semble sortir des signaux pour la formation de domaines membranaires (jaune), dans lequel les facteurs de susceptibilité de l’hôte et des facteurs de défense sont recrutés. Dans une interaction compatible, le noyau se déplace de façon transitoire à l’hôte au site de tentative de pénétration (non représenté) et des filaments d'actine (rouge) se polarisent vers ce site. (h) Lors de la pénétration, la membrane cellulaire hôte est formée autour de la structure d'alimentation fongique (vert), qui est enveloppée 33 Chapitre 1 Mycoendophytes étroitement par les filaments d'actine et dirigée par un anneau d'actine autour de la pointe de croissance. (i) Lorsque le suçoir mûrit, un maillage de l'actine corticale est maintenue autour du cou haustorial, alors que la polarisation de l'actine se résout. (j) Finalement, le parasite secondaire établit des suçoirs et remplit son cycle de vie en produisant une nouvelle génération de conidies (Kogel et al., 2006). Des résultats récents issus des études des interactions hôte-champignon compatibles ont amélioré la compréhension de ce qui détermine, si le champignon se comporte comme un endophyte ou un parasite, et de la façon dont les plantes évitent l'exploitation par des parasites nuisibles, mais bénéficient d’endophytes mutualistes. Le résultat d'une telle interaction peut varier du mutualisme au parasitisme. Dans la plupart des cas, la plante hôte ne souffre pas, en fait, elle gagne souvent un avantage de la colonisation par un champignon. Cette prestation est basée sur un équilibre finement élaboré entre les exigences de l'envahisseur et la réponse des plantes. Si l'interaction est déséquilibrée, les symptômes de la maladie apparaissent et le champignon est exclu par les réactions de défense induites par l'hôte (Kogel et al., 2006). La stabilité ou la variabilité de l'interaction asymptomatique dépend de nombreux facteurs tels que le stress de l'environnement, la sénescence des hôtes, la virulence des endophytes, la réponse de défense d'un hôte (Rakotoniriana et al., 2007), les génotypes des espèces en interactions (Saari et al., 2009 ; Wali et al., 2009 ; Ellouz, 2011), le mode de transmission, l’âge de la plante, la nutrition, l’allélopathie etc... (Saikkonen et al., 1998 ; Hamilton et al., 2012). Outre les facteurs environnementaux, des facteurs métaboliques interviennent donc dans le contrôle du mutualisme plante-champignon. Ce sont des métabolites secondaires structuralement très variés montrant des activités biologiques antibiotiques, antioxydantes et immunosuppressives, Les endophytes sont également une source de produits naturels d’intérêt (Dupont et al., 2007). En dehors de l'hypothèse antagonisme équilibrée proposée par Schulz et al. (1999) et Suryanarayanan et al. (2009) pour expliquer le type d'interactions entre les champignons endophytes et leurs plantes hôtes, il y a peu d'informations sur les étapes de post-pénétration et de l’interaction endophytes-hôte. L'observation de Moricca et Ragazzi (2008) indique que le type d'interaction entre un endophyte et une plante est contrôlée par les gènes de ces deux organismes et modulés par l'environnement, elle implique éventuellement l'évolution des stratégies contre les mutualistes (Suryanarayanan et al., 2009). Les symbioses sont en général des interactions complexes avec le contexte écologique évolutif, ce dernier est susceptible de 34 Chapitre 1 Mycoendophytes conduire à différents résultats au niveau de la population et communautés (Hamilton et al., 2012). 5-2- Rôles des champignons endophytes Dans les écosystèmes terrestres, la plupart des plantes vivent en symbiose avec des champignons endophytes et des champignons mycorhiziens arbusculaires. Ces symbioses assurent la tolérance à plusieurs stress qui pourraient limiter la croissance des plantes (Ellouz, 2011). 5-2-1- Nutrition Les endophytes sont d’importants colonisateurs fongiques des racines de plantes dans l'écozone des prairies semi-arides caractérisées par un déficit hydrique (Khidir et al., 2010). Les interactions au sein des associations entre plantes et endophytes ont été considérées largement comme mutualistes, car les champignons endophytes confèrent des bénéfices à leurs hôtes à travers l’amélioration de l'absorption des nutriments (Mandyam et Jumpponen, 2005 ; Dupont, 2007). La colonisation intercellulaire et intracellulaire, ainsi que la capacité à coloniser une large variété de plantes hôtes, ont conduit les chercheurs à dire que les endophytes racinaires non mycorhiziens, peuvent former des connexions entre les végétaux qui pourraient être impliquées dans le transport des nutriments ou photosynthétats comme celles des systèmes ectomycorhiziens (Simard et al., 1997 a et b ; Jumpponen et Trappe, 1998). Le mode d'absorption et de nutrition chez les champignons ont conduit à l'évolution et à la sécrétion d'une batterie d'enzymes qui catabolise des complexes de polymères organiques dans l'environnement en petits constituants, absorbés ensuite par leurs cellules pour le métabolisme. Le mode de nutrition et la diversité des substrats que les différents groupes écologiques de champignons exploitent, par un large éventail d'enzymes extracellulaires telles que des amylases, cellulases, chitinases, laccases, lipases, protéases, polyphénols oxydases pour se développer (Suryanarayan et al., 2012), sont aussi produites par des champignons endophytes telles que les souches du groupe des DSE, avec des activités variables selon les souches (Jumpponen et Trappe, 1998). Le phosphore (P) est un macroélément essentiel à la croissance et au développement biologique. P soluble est souvent l'élément nutritif limitant de la production de la biomasse 35 Chapitre 1 Mycoendophytes dans les écosystèmes naturels. Certains isolats endophytiques solubilisent le phosphate minéral. Piriformospora indica est un champignon endophyte colonisateur de la racine qui permet aux plantes de pousser dans un stress extrême en éléments nutritifs. Ce champignon contient des quantités substantielles d'une phosphatase acide, qui a le potentiel de solubiliser les phosphates dans le sol et les remettre à la plante-hôte, améliorer l'absorption de nitrates et réguler le métabolisme du carbone (C) et du soufre (S). D’autres endophytes solubilisant les phosphates ont été rapportés également par Fitter et al. (2011). L'inoculation avec l'endophyte n’a pas seulement un effet sur la croissance, mais elle augmente la concentration en phosphore foliaire (Mandyam et Jumpponen, 2005 ; Rai et al., 2012). Le fer est un cofacteur nécessaire à de nombreuses réactions enzymatiques et donc un élément nutritif essentiel pour pratiquement tous les organismes. Dans des conditions aérobiques, le fer existe principalement à l'état ferrique (Fe3+) et réagit pour former des hydroxydes et oxyhydroxydes hautement insolubles, qui sont très peu disponibles pour les plantes et les microorganismes. L’association des végétaux avec des bactéries pourrait améliorer la phytoextraction en modifiant la solubilité, la disponibilité et le transport de métaux lourds et de nutriments à travers la production d'acides organiques, la libération des chélateurs ou des changements redox. Mais de nombreux producteurs de sidérophores par les endophytes de différentes plantes ont été signalés, contributifs de la croissance végétale dans les environnements à faible nutrition (Fitter et al., 2011). Ces sidérophores, chélateurs du fer à faible masse moléculaire, augmentent l'absorption dans les habitats pauvres et améliorent les performances d'hôte dans une variété de contextes (Harman et al., 2004 ; Harman, 20002006 ; Hamilton et al., 2012). La concentration en azote dans les racines est aussi significativement affectée par des champignons DSE (Phialocephala fortinii et S vaccinii) (Alberton et al., 2010). 5-2-2- Croissance Les champignons endophytes offrent dans leur association symbiotiques avec les plantes un renforcement de la croissance végétative (Rakotoniriana et al., 2007), par la production de phytohormones qui sont des molécules essentielles pour la croissance, le développement et la défense des plantes. Les cytokinines et les gibbérellines sont impliquées dans une multitude de procédés de développement chez la plante, tels que la croissance cellulaire, dominance apicale, tropismes, initiation des racines adventives et latérales, 36 Chapitre 1 Mycoendophytes différenciation cellulaire vasculaire, développement des étamines et résistance aux stress biotiques et abiotiques. Certains endophytes produisent des auxines pour améliorer la croissance de la plante hôte (Li et al., 2012). Les DSE sont capables de libérer de l’AIA (Alberton et al., 2010). D'autre part, Piriformospora indica augmente la quantité de la méthionine synthéase, qui joue un rôle crucial dans la biosynthèse de polyamines et d'éthylène (Peškan-Berghöfer et al., 2004 ; Baltruschat et al., 2008). Plusieurs études suggèrent que les plantes cultivées en association avec certains champignons endophytes produisent une plus grande biomasse, et ont une résistance accrue aux agents pathogènes (Stovall et Clay, 1988 ; Clay et al., 1989 ; Ghimire et al., 2011). Le nombre de fruits et la biomasse à la première récolte sont significativement plus élevés (Hamilton et al., 2012). 5-2-3- Production des enzymes industrielles Les enzymes de champignons endophytes trouvent probablement de nombreuses applications dans les domaines de la santé, la production alimentaire, l'énergie et l'environnement. Des résultats préliminaires sont encourageants dans la démonstration de nombreuses enzymes microbiennes, exploitées pour des applications dans l'industrie alimentaire dans un large éventail de champignons endophytes (Tableau 2). Seulement cinq genres (Aspergillus, Humicola, Penicillium, Rhizopus et Trichoderma) représentent les trois quarts des 60% d’enzymes fongiques utilisées dans les procédés industriels (Suryanarayan et al., 2012). 37 Chapitre 1 Mycoendophytes Tableau 2 : applications industrielles des enzymes choisies à partir de champignons endophytes (Suryanarayan et al., 2012). Enzyme Applications Références Chitine Préparation du chitosane à partir de la chitine, le contrôle Zhao et al. déacétylase biologique des insectes nuisibles, humains et végétaux pathogènes Chitinases et Médicaments pour traiter l'asthme, le cancer, le diabète, Hartl et al. Chitosanases l'inflammation des plaies, anti - bactérien / fongique infections; (2012) (2010) modulation de l’immunité, la production d'acide sialique, cosmétiques et traitement des eaux usées Protéase La médiation de la libération du médicament nettoyant pour les Gupta et alcaline prothèses dentaires, cosmétiques, la production d'hydrolysats de al. (2002) protéines, brasserie, pâtisserie, aliments pour animaux, traitement des eaux usées, dégommage de la soie, additifs détergent, procédés de tannage et balayage d'argent du film radiographique Acide protase Aide à la digestion, préparation des aliments fermentés et Rao et al. Tannase assaisonnement des matériaux (1998) Agent clarifiant des jus, du thé, du vin et des fruits RamírezCoronel et al. (2003) Asparaginase Médicament pour le traitement de la leucémie lymphoblastique Schrey aiguë. Laccase et al., 2010 Traitement des jus de fruits, du vin, de la bière, pâtisserie, Kunamnen délignification, bioremédiation des composés phénoliques et bio- et blanchiment al. (2008) β-glucosidase Production de biocarburants à partir de biomasse lignocellulosique Chauve et al. (2010) 38 Chapitre 1 Mycoendophytes 5-2-4- Production de métabolites secondaires Les champignons endophytes associés aux plantes médicinales utilisées traditionnellement pourraient être une source importante de métabolites fonctionnels (Huang et al., 2008 ; Suryanarayanan et al., 2009). À cet égard, l'association endophytes-plante pourrait également être exploitée pour améliorer la production de métabolites utiles à la plante hôte. En plus des plantes des forêts tropicales humides, celles qui poussent dans des habitats difficiles tels que les déserts chauds et froids, les sols salins ou acides et les habitats marins doivent être examinés pour des endophytes producteurs de métabolites bioactifs (Khidir et al., 2010). Les médicaments existants d'origine fongique comprennent les β-lactamines, griséofulvine, cyclosporine A, taxol, alcaloïdes de l'ergot et la lovastatine, mais de plus en plus de nouveaux produits naturels de structures chimiques variées sont découverts (Mitchell et al., 2008 ; Suryanarayanan et al., 2009). En relation avec le mode hétérotrophe et la capacité d'exploiter une variété de substrats et habitats, les champignons ont une capacité polyvalente de synthèse. Les endophytes produisent donc des produits naturels d'importance pharmaceutique et agricole, car ils semblent être métaboliquement plus innovants que les champignons du sol (Schulz et al., 2002) du fait de la production importante de composés bioactifs bien connus (Suryanarayanan et al., 2009). Les endophytes cultivés peuvent être amenés à produire les mêmes rares et importants composés bioactifs, comme lorsqu'ils sont associés avec leurs plantes hôtes, ce qui permet de réduire la nécessité de récolter des plantes à croissance lente et peut être rares (Rai et al., 2012). Ils ont la capacité de produire une énorme diversité chimique de composés, tels que les alcaloïdes, stéroïdes, peptides, terpénoïdes, isocoumarines, quinones, phénylpropanoïdes, lignanes, phénols, acides phénoliques, composés aliphatiques, lactones et autres (Suryanarayanan et al., 2009). Chaetomium produit de la chaetominine, un alcaloïde qui montre une cytotoxicité contre la leucémie humaine K562 plus élevée que le médicament 5-fluorouracile. Les isolats du champignon endophyte Phaeosphaeria avenaria donnent deux nouveaux dérivés de la phaeosphoramide A et B, qui sont des inhibiteurs du signal de la transduction et activateur de la transcription et qui jouent un rôle essentiel dans la régulation de la croissance et la survie cellulaire, constituant une cible pour la thérapie anticancéreuse (Wijeratne et al., 2006). 39 Chapitre 1 Mycoendophytes La chitine est le biopolymère le plus abondant après la cellulose. Elle se trouve dans l'exosquelette des Crustacés, des insectes et dans les parois des cellules fongiques. La chitine et la chitosane améliorent la réponse anti-inflammatoire (Suryanarayan et al., 2012). Bien que l'avènement de la chimie combinatoire a déplacé l'accent loin de la recherche des produits naturels, des champignons endophytes continuent à servir de source pour de nouveaux médicaments (Berdy, 2005 ; Mitchell et al., 2008 ; Strobel et Daisy, 2003 ; Suryanarayanan et al., 2009), et de produits naturels pour la synthèse combinatoire (Suryanarayanan et al., 2009). Entre 2000 et 2005, 23 nouveaux médicaments obtenus à partir de plantes et de microorganismes pour le traitement de différentes maladies humaines telles que le cancer, troubles neurologiques, maladies infectieuses et cardiovasculaires, maladies métaboliques, troubles immunologiques et génétiques ont été mis sur le marché (Chin et al., 2006 ; Suryanarayanan et al., 2009). Depuis 1993, environ 1500 métabolites ont été signalés chez des champignons pour avoir une activité antitumorale ou antibiotique (Suryanarayanan et al., 2009). Il est pertinent de mentionner que, parmi les champignons microscopiques, seuls certains genres tels que Aspergillus et Penicillium ont été rigoureusement sélectionnés pour des composés bioactifs (Berdy, 2005 ; Suryanarayanan et al., 2009). Ces endophytes peuvent ouvrir de nouvelles perspectives pour le développement de nouveaux médicaments et de produits agricoles (Strobel et Daisy, 2003 ; Aly et al., 2010 ; Gonzalez e t T e l l o , 2 0 1 1 ; Rai et al., 2012). Le problème de la résistance multi-médicamenteuse chez les microbes souligne la nécessité de poursuivre les recherches sur les nouveaux métabolites obtenus à partir des mycoendophytes (Rai et al., 2012). 5-2-5- Rôle écologique Le rôle des endophytes dans la décomposition des litières est également important, mais peu d'études ont été réalisées sur cet aspect écologique (Purahong et Hyde, 2011). Chaque groupe de champignon joue un grand rôle écologique dans les écosystèmes du sol (Fitter et al., 2011). Le nouveau point de vue considère les endophytes comme agents écologiques importants, dont le partenariat avec les plantes photosynthétiques a été déterminant pour l’évolution de la flore terrestre (Moricca et Ragazzi, 2008). Les effets des DSE sur les plantes hôtes varient avec les conditions de croissance des hôtes et leur abondance dans certains milieux naturels. Ceci suggère un rôle écologique important 40 Chapitre 1 Mycoendophytes (Jumpponen et Trappe, 1998), parce qu’ils produisent de la mélanine et de la chitine qui affectent directement leur morphologie et augmentent la rigidité de la paroi et réduisent sa perméabilité. Ces deux substances protègent les champignons, quant ils envahissent les environnements sévères (Henson et al., 1999 ; Barrow et Aaltonen, 2001). les champignons endophytes modifient les communautés d'invertébrés dans les populations d'herbe à la fois cultivées et sauvages (Omacini et al., 2001 ; Vesterlund et al., 2011). Une protection contre les agents phytopathogènes ou les herbivores (Rakotoniriana et al., 2007 ; Rivera-Orduna et al.,2011), a été observée chez des microorganismes endophytes qui jouent un rôle clé dans les interactions hôte-pathogène, avant le déclenchement de la maladie. Ils peuvent induire des mécanismes de résistance systémique et l'expression de gènes de défense contre l'attaque de certains agents pathogènes chez leurs hôtes (Arnold et al., 2003 ; Cao et al., 2009), par la production de métabolites secondaires (Carroll et Carroll, 1978 ; Cao et al., 2009 ; Aly et al., 2010) et / ou d’enzymes qui dégradent les mycoparasites (Cao et al., 2009 ; González et Tello, 2011). Ces oxylipines auraient donc un rôle de signal dans la régulation des cascades métaboliques, agissant comme un véritable langage moléculaire. L'inhibition de la production de mycotoxines par les oxylipines fongiques pourrait donc conférer un avantage écologique aux champignons endophytes, au bénéfice de la plante-hôte, lors de leur compétition avec les phytopathogènes. Il s'agit là des premiers résultats supportant l'hypothèse de l'induction de composés de défense chez un champignon endophyte au moment de la compétition avec un pathogène. Cette étude ouvre de nouvelles perspectives dans la lutte contre les champignons producteurs de mycotoxines susceptibles de contaminer les aliments et les fourrages (Combès et al., 2012). Ils peuvent aussi produire des antibiotiques qui inhibent la croissance d'autres champignons. En outre, les espèces endophytes pourraient éventuellement concurrencer les champignons pathogènes des plantes pour l'espace et les nutriments (González et Tello, 2011). Les champignons endophytes Clavicipitacées tel que Neotyphodium associés à l'herbe, produisent des alcaloïdes chez les plantes hôtes qui protégent les plantes contre les herbivores (Purahong et Hyde, 2011). Les arbres peuvent également bénéficier de la présence d'endophytes, car ces derniers limitent la croissance et la survie des insectes herbivores (Faeth et Hammon, 1997 ; Alberctsen et al., 2010), ou augmentent la résistance pathogène à l'hôte (Alberctsen et al., 2010). 41 Chapitre 1 Mycoendophytes Alternaria alternata ou Fusarium proliferatum sont identifiées comme agents de lutte biologique prometteurs contre les pathologies spécifiques, tel que le mildiou de la vigne causé par Plasmopara viticola (Falk et al., 1996 ; Bakshi et al., 2001 ; González et Tello, 2011). Fusarium proliferatum est considéré aussi comme un mycoparasite, champignon insensible au froid, capable de contrôler le développement de Plasmopara viticola via la sécrétion d'enzymes extracellulaires glucanolytiques (Bakshi et al., 2001 ; González et Tello, 2011). Epicoccum nigrum représente un autre agent de lutte biologique prometteur, actuellement en cours de développement dans le commerce en raison de sa capacité à produire des métabolites secondaires avec une activité antibiotique (González et Tello, 2011), Plusieurs souches ont été isolées appartenant aux genres Acremonium, Phoma (Phoma glomerata), Chaetomium (Chaetomium globosum), Epicoccum (Epicoccum nigrum), Fusarium (Fusarium proliferatum) ou Aureobasidium (Aureobasidium pullulans). Certaines d'entre elles ont été signalées présentant une activité antagoniste contre certains pathogènes. Les auteurs ont constaté que les communautés endophytes peuvent constituer une source de nouveaux agents fongiques de lutte biologique utiles pour contrôler les maladies, en particulier celles qui sont associées au déclin de jeunes plants produits dans les pépinières (El-Tarabily et Sivasithamparam, 2006 ; González et Tello, 2011). Le champignon endophyte Phomopsis liquidambari peut produire des enzymes pour dégrader les acides phénoliques allélochimiques libérés par la décomposition du feuillage, qui ont des impacts négatifs sur la croissance des plantes et des microbes dans le sol (Chen et al., 2011 ; Li et al., 2012). Dai et al. (2010) ont démontré que l’endophyte Ceratobasidum stevensii pourrait dégrader le phénanthrène, hydrocarbures aromatiques polycycliques, mettant ainsi en évidence une application nouvelle pour la bioremédiation des champignons endophytes (Suryanarayan et al., 2012). Une grande variété de produits chimiques anthropiques, tels que les hydrocarbures pétroliers (HCP), hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP), hydrocarbures halogénés, pesticides, solvants, sels et métaux lourds ont été introduits dans l'environnement et ont causé de vastes problèmes environnementaux (Meagher, 2000 ; Li et al., 2012). Pour surmonter ces problèmes, des microorganismes de la rhizosphère assistés par phytoremédiation peuvent être utilisés (Lebeau et al., 2008 ; Li et al., 2012). Des rapports récents ont mis en évidence des possibilités de bioremédiation inattendus sur la base de champignons endophytes (Suryanarayan et al., 2012). Ces derniers ont été utilisés avec succès 42 Chapitre 1 Mycoendophytes dans la phytoremédiation pour la décontamination in situ des sols contaminés, parce qu’ils possèdent plusieurs traits capables d’altérer la toxicité des contaminants par la production de sidérophores, chélateurs de fer, acides organiques et diverses enzymes de dégradation (Li et al., 2012). Certains endophytes ont montré une mobilisation des métaux lourds par la sécrétion de faible masse moléculaire d’acides organiques. Ils jouent un rôle clé dans l'adaptation de la plante hôte aux environnements pollués et ils peuvent améliorer la phytoremédiation en mobilisant, dégradant ou immobilisant les contaminants dans le sol, favorisant la croissance des plantes, ce qui diminue la phytotoxicité, et l'amélioration de la tolérance aux métaux par des plantes (Germaine et al., 2009 ; Li et al., 2012). Les plantes indigènes adaptées aux écosystèmes arides sont propices à une contrainte hydrique et nutritive. Mais, ces plantes ont développé des mécanismes uniques et des associations symbiotiques qui réduisent ce stress, améliorent la nutrition et la survie (Barrow et Altonen, 2001) et favorisent les stratégies de la conservation de l’eau chez la plante (Malinowski et Belesky, 2000 ; Kannadan et Rudgers, 2008). Les DSE possèdent un rôle de substituant des mycorhizes, en particulier dans les habitats exposés à un stress récurrent (Jumpponen et al., 1998 ; Jumpponen et Trappe, 1998). Ainsi, les hôtes non mycorrhizés peuvent s'appuyer sur des endophytes racinaires pour prélever dans les aléas des milieux extrêmes ou ceux encore stables, mais stressants (Johnson et al., 1997 ; Jumpponen 1999 ; Jumpponen et Trappe, 1998 ; Jumpponen et Jones, 2010 ; Mandyam et Jumpponen, 2012 ; Hamilton et al., 2012). Mandyam et Jumpponen (2005) suggèrent que les champignons mélanisés assurent la protection de la plante contre les températures extrêmes. Bien que les mécanismes ne soient pas bien définis, ils pensent que la présence constante et omniprésente de ces DSE, en particulier dans les régions arides, indique qu'ils jouent un rôle important dans l'écologie et l'évolution de ces écosystèmes. 43 Chapitre 2. Description de la feuille Chapitre 2 Description de la feuille 1- Morphologie et structure Les feuilles sont des organes végétatifs, généralement aplatis, portées par des tiges, ou par les rameaux au niveau d’un nœud (Camefort, 1996 ; Botin, 2012). Leur forme et leur structure interne sont très diverses (Raven et al., 2007). La feuille des Dicotylédones possède généralement un limbe et un pétiole bien développés, alors que la base foliaire peut être parfois très réduite (Camefort, 1977). Le pétiole est la partie de la feuille dont la forme est la plus simple. Toujours étroite, il peut être légèrement déprimé sur sa face supérieure, ou bien être à peu près cylindrique (Camefort, 1996). Les feuilles des Dicotylédones au sens strict sont soit simples, soit composées. Chez les feuilles simples, le limbe n’est pas divisé en parties distinctes, mais il peut être profondément lobé. Le limbe des feuilles composées est divisé en folioles qui possèdent généralement chacune un petit pétiole (le pétiolule). On peut reconnaitre deux types de feuilles composées : les feuilles composées pennées et les feuilles composées palmées. Dans les feuilles composées pennées, les folioles sont situées des deux côtés d’un axe : le rachis, comme les barbes d’une plume (le rachis est un prolongement du pétiole). Les folioles d’une feuille composée palmée divergent au sommet du pétiole et le rachis est absent (Raven et al., 2007) 2- Structure anatomique La structure des feuilles d’Angiospermes diffère beaucoup en fonction de l’habitat. La quantité d’eau disponible est un facteur particulièrement important dans la détermination de leur forme et de leur structure. En fonction de leurs besoins et de leurs adaptations à l’égard de l’eau, on distingue les mésophytes, les hydrophytes et les xérophytes. Ces distinctions ne sont cependant pas rigoureuses, et les feuilles montrent souvent une combinaison de caractères correspondant à des types écologiques différents. Quelle que soit leur forme, les feuilles adultes des Angiospermes sont des organes spécialisés en vue de la photosynthèse et, comme les racines et les tiges, elles comportent des systèmes de tissus protecteurs, fondamentaux et conducteurs (Raven et al., 2007). Une étude de la structure d’un limbe foliaire de Houx (Ilex aquifolium) montre tout d’abord un parenchyme chlorophyllien très important ; c’est là en effet que se déroule la photosynthèse. De la face supérieure à la face inférieure, on distingue un épiderme, un 45 Chapitrre 2 Desccription de la l feuille parenchhyme et dess tissus condducteurs (L Laberche, 19 999). Les feeuilles préseentent une structure s stratifiée. L’épideerme infériieur et suupérieur en nserrent less tissus innternes c'eest-à-dire parenchhymes et tiissus vascuulaires. On distingue sur la face supérieurre de la feeuille le parenchhyme palissaadique qui est le princcipal site dee la photosyynthèse, et lla surface in nférieure le pareenchyme lacuneux dont d les espaces e inttercellulairees formentt des caviités qui communniquent aveec l’extérieuur par les stoomates, et assurent a unee importantee surface d’’échange (Corsonn, 2008) (Fiigure 12 et 13). Figure 12 : schém ma d’une coupe transvversale dan ns le limbee d’une feuuille de Ho oux (Ilex aquifoliium) (Cameefort, 1977).. Figure 13 : structuure des feuuilles (a) Feuille F matu ure (b) Vuee en coupe du limbe (Corson, ( 2008). 4 46 Chapitre 2 Description de la feuille 2-1- Tissus protecteurs L’épiderme est l’assise cellulaire externe de la structure anatomique primaire. Il constitue le tissu protecteur ou de revêtement des feuilles (Raven et al., 2007). Chez de nombreux végétaux, les cellules épidermiques constituent une seule assise de cellules formant un épiderme simple, mais chez certaines espèces, les parenchymes sont entourés par plusieurs assises de cellules constituant un épiderme composé. Les cellules épidermiques ont des formes variables selon les espèces considérées. Mais quelque soit leur forme, les cellules épidermiques sont toujours étroitement juxtaposées ; on ne distingue pas de méats entre elles (Camefort, 1996). Ce sont des couches compactes de cellules qui ne contiennent pas de chloroplastes, qui protègent la feuille et qui contribuent à son maintien (Bousquet, 2007). Les feuilles assurent la photosynthèse. Leur surface doit permettre d’optimiser l’absorption de la lumière, mais elle entraine aussi d’importantes pertes en eau. Afin de limiter ces pertes, l’épiderme produit une cuticule externe, faite de cire et de cutine, des substances lipidiques imperméables à l’eau. Certaines plantes produisent une couche de cire supplémentaire contre les risques de dessiccation. La surface lisse produite par la cuticule et la couche de cire empêche l’adhérence et la germination des spores fongiques, et crée une zone peu praticable pour les insectes. Ils assurent également la régulation des échanges gazeux comme le CO2, l’O2 et la vapeur d’eau. L’épiderme de la feuille composé d’une seule assise cellulaire dérivant du protoderme, protège la feuille contre la déperdition en eau, mais aussi contre les abrasions et l’entrée de champignons et de bactéries pathogènes (Nabors, 2008). L’importance de la cuticule, sur les deux faces foliaires, varie suivant les espèces. Chez celles qui sont adaptées aux milieux secs, une transpiration excessive est empêchée par une cuticule très épaisse, qui peut même être doublée extérieurement par un revêtement cireux. Par contre les végétaux vivant dans les milieux humides ont des feuilles à cuticule réduite, voir absente (Camefort, 1996). En plus de cellules relativement peu spécialisées qui forment la plus grande partie de l’épiderme, on y trouve les stomates, ainsi que d’autres types de cellules spécialisées et de nombreux types d’appendices ou trichomes (Raven et al., 2007 ; Bousquet, 2007). 47 Chapitre 2 Description de la feuille 2-1-1- Stomates A la surface des parties aériennes de la plante, on remarque parmi les cellules épidermiques étroitement imbriquées des stomates (Raven et al., 2007). Un stomate est essentiellement constitué par une ouverture ou ostiole délimité par deux cellules réniformes, les cellules stomatiques, s’affrontant par leurs bords concaves. Deux faits importants qui caractérisent la cytologie des cellules stomatiques : d’une part la présence de chloroplastes (alors que les cellules épidermiques en sont dépourvues), d’autre par, l’épaississement de la membrane cellulosique en regard de l’ostiole. Selon les espèces, les cellules stomatiques peuvent être au même niveau que les cellules épidermiques voisines, ou bien être situées dans un plan inférieur à celui de l’épiderme (Camefort, 1996). La répartition des stomates sur les deux faces du limbe est généralement inégale ; la densité en stomates de l’épiderme dorsal étant bien plus grande que celle de l’épiderme ventral. Chez les végétaux des milieux secs, la transpiration stomatique est souvent ralentie, par la localisation des stomates dans des cryptes stomatiques, invagination de l’épiderme inférieur dans le mésophylle (Camefort, 1996). Comme chez de nombreuses xérophytes, les stomates sont enfoncés dans des dépressions de la face inférieure des feuilles. Les dépressions peuvent également renfermer de nombreux poils épidermiques (Raven et al., 2007). 2-1-2- Trichomes Le terme trichomes dérivant du mot grec « Trichs », qui signifie cheveux sont des extensions de l’épiderme dont ils sont issus. Les trichomes sont produits par la plupart des espèces végétales (Dalin et al., 2008), Ils se trouvent principalement sur les tiges, les feuilles et ils peuvent se produire, selon les espèces, sur les pétioles, les pédoncules, les pétales et les graines (Glas et al., 2012). Les caractéristiques uniques des trichomes ont fait qu’ils ont été traditionnellement utilisées comme clé taxonomique dans la classification des plantes (Xiang et al., 2010 ; Choi et Kim, 2013). On peut trouver des poils épidermiques sur l’une ou l’autre des faces de la feuille ou sur les deux (Raven et al., 2007). La forme et la structure des poils épidermiques sont très variables (Raven et al., 2007 ; Evert et al., 2006). Les trichomes des feuilles peuvent augmenter la résistance au stress abiotique. Ils peuvent augmenter la tolérance à la sécheresse par la réduction de l’absorbance du 48 Chapitre 2 Description de la feuille rayonnement solaire, accroitre la couche limite de la surface de la feuille, faciliter la condensation de l’humidité de l’air sur la surface de la plante, ils peuvent aussi protéger la feuille des dommages causés par le rayonnement solaire UV (Dalin et al., 2008), et les basses températures (Argrawal et al., 2004 ; Dalin et al., 2008). Les trichomes ont différentes fonctions. Les recherches sur les plantes vivantes dans les milieux arides montrent que l’augmentation de la pubescence des feuilles confère une grande réflectance des rayons solaires, abaisse en conséquence la température des feuilles et réduit les pertes d’eau. De nombreuses plantes « aériennes » comme les Broméliacées épiphytes se servent des trichomes foliaires pour absorber de l’eau et des minéraux. Au contraire chez l’Atriplex vivant dans un sol salin, les trichomes sécrètent le sel à partir des tissus foliaires protégeant ainsi la plante d’une accumulation de substances toxiques (Raven et al, 2007). Il existe deux principaux types de trichomes : les trichomes glandulaires et non glandulaires (Peter et Shanower, 1998). Des trichomes non glandulaires sont présents sur la plupart des Angiospermes (Glas et al., 2012). Leur densité diminue avec le développement des feuilles et l’âge. Les trichomes non glandulaires réduisent la charge thermique des plantes, augmentent la tolérance au gel, maintiennent l’équilibre de l’eau dans les feuilles et dévient le rayonnement (Johson, 1975 ; Liu et Liu, 2012). Ils peuvent modifier les propriétés optiques de la surface de la feuille et pourraient aider à conserver la chaleur et/ou l’humidité (Peter et Shanower, 1998). Ils ne secrètent pas des produits chimiques, mais peuvent s’enchevêtrer pour entraver la locomotion des insectes par des interactions physiques (Szyndler et al., 2013). Tous les trichomes non glandulaires sont considères comme une barrière physique contre les herbivores (Tableau 3) (Steinite et Levinsh, 2003). 49 Chapitre 2 Description de la feuille Tableau 3 : description des trichomes non glandulaires (Glas et al., 2012). Type Description I. Trichomes non glandulaires courts (0,2-1,0 mm), de base globulaire et multicellulaire. II. Trichomes fins non glandulaires constitués de 4-8 cellules et 0,4-1,0 mm de long, avec une base unicellulaire et plate. III. Trichomes plus courts (0,2-0,4 mm), avec une cellule glandulaire dans la pointe. Base de Trichome unicellulaire et plate. IV. V. Trichomes tecteurs unicellulaires. Trichomes non glandulaires composés d'une base cellulaire épaisse avec une cellule se penchant dans la pointe. Les trichomes glandulaires contiennent ou sécrètent un mélange de produits chimiques. Les trichomes glandulaires présents chez certaines espèces cultivées confèrent une résistance contre les insectes nuisibles et les pathogènes (Glas et al., 2012). La défense chimique contre les herbivores peut être associée avec différents types de trichomes, les trichomes glandulaires contiennent parfois des métabolites de défense toxiques (Steinite et Levinsh, 2003). Ils sont responsables d’une part importante de la chimie secondaire d’une plante (Glas et al., 2012). Les caractéristiques de ces trichomes et la composition des substances secrétées varient fortement entre les espèces (Xiang et al., 2010 ; Choi et Kim, 2013). La distribution des trichomes n'est pas uniforme sur toute la surface de la feuille (Turner et al., 2000 ; Choi et Kim, 2013). La densité des trichomes glandulaires diminue avec la maturité des feuilles ; les jeunes feuilles ont des revêtements de trichomes denses (Auge et al., 2003 ; Nguefack et al., 2004 ; Liu et Liu, 2012). La large diversité des types de trichomes sur différentes espèces de 50 Chapitre 2 Description de la feuille plantes pose une difficulté pour généraliser le rôle spécifique de ces structures dans la défense contre un herbivore. Il existe aujourd’hui un intérêt croissant pour la compréhension de la chimie des exsudats des trichomes glandulaires, afin de profiter de leurs utilisations potentielles (Peter et Shanower, 1998). Les trichomes glandulaires sont des poils spécialisés trouvés à la surface de l’ordre de 30% de toutes les plantes vasculaires (Glas et al., 2012). Ce sont des poils pluricellulaires dont les cellules sont issues de la prolifération d’une cellule épidermique (Raven et al., 2007). Ils sont composés d’une base différenciée, d’une tige et de cellules apicales (Glas et al., 2012), Ces trichomes sont localisés plus sur les nervures de la feuille et les extrémités foliaires, et beaucoup plus en dessous de la feuille (Steinite et al., 2003). Les trichomes glandulaires ont été classés morphologiquement en deux types : peltés et capités et pouvant se distinguer par la taille de la tête et la longueur de la tige (Ko et al., 2007 ; Baran et al., 2010 ; Choi et Kim, 2013). • Trichomes peltés : ils consistent en une cellule basale, une tige courte unicellulaire et une tête large contenant quatre cellules sécrétrices (parfois la tête se compose de trois, cinq ou six cellules) ; ces trichomes glandulaires ont une tête sphérique caractéristique, en raison du développement des grands espaces sous-cutanées et l'accumulation de sécrétions (Figures 14 a et b) ; les trichomes peltés sont situés dans des dépressions épidermiques dans la feuille mature ; Les sécrétions des trichomes peltés sont incolores, et abondantes, et située dans la chambre sous-cutanée (figure 15 g) (Liu et Liu, 2012). a b Figure 14 : (a) trichomes peltés sur la surface abaxiale d'une feuille mature. (b) trichome pelté entièrement développé avec la tête de quatre alvéoles. La cuticule est fortement détachée de la paroi cellulaire de la tête formant un grand espace sous-cutanée. Bar = 20 µm (Liu et Liu, 2012). 51 Chapitre 2 Description de la feuille • Trichomes capités : il existe deux types de trichomes capités qui diffèrent à la fois dans la structure et la taille, les capités de type I sont composés d'une cellule basale, une cellule de tige courte et une tête bicellulaire (Figure 15a) ; les Capités de type II sont composés d'une cellule basale, deux à quatre cellules pour la tige et une tête globuleuse unicellulaire ou ressemblant à une poire (Figure 16 b) (Liu et Liu, 2012). a b Figure 15 : trichome capité de type I (a). Bar = 10 µm. Flèche qui indique un trichome capité de type II. Bar = 20 µm. (b) surface abaxiale d'une feuille adulte montrant la distribution des trichomes glandulaires capités de type I (flèches). Bar = 100 µm (Liu et Liu, 2012). Les trichomes peltés sécrètent surtout des substances lipidiques, les trichomes capités secrètent des produits polysaccharidiques (Huang et al., 2008 ; Choi et Kim, 2013). 2-2- Mésophylle Le mésophylle est composé de parenchymes. Ces derniers sont formés de cellules isodiamétriques allongées dont les vacuoles sont bien développées (Camefort, 1996), les cellules ont des noyaux fonctionnels et sont capables de se diviser, mais aussi de stocker de la nourriture et de l'eau (Evert et al., 2006). Les cellules parenchymateuses ont une paroi primaire très fine et sont généralement dépourvues de paroi secondaire. Ce qui leur permet de prendre des formes variées afin d’occuper les espaces libres (Nabors, 2008). Le mésophylle se différencie en parenchyme palissadique et parenchyme spongieux ou lacuneux dans le cas des Dicotylédones. Le parenchyme palissadique est constitué de cellules cylindriques régulièrement arrangées, alors que les cellules du parenchyme spongieux ont des formes plus variées, avec un arrangement spatial désordonné (Bousquet, 2007). Les cellules du parenchyme lacuneux sont très variables. Elles peuvent ressembler aux cellules palissadiques, avoir un même diamètre ou être allongées parallèlement à la surface de la feuille. Cependant, le parenchyme lacuneux est caractérisé par la présence de lacunes autour desquelles se connectent les cellules spongieuses (Fahn, 1969). Pour Nultsch (1998), les cellules palissadiques peuvent se rencontrer directement sous une couche de cellules 52 Chapitrre 2 Desccription de la l feuille hypoderrmiques (Fiigure 16). Ills peuvent s’observer s sur s les deuxx faces du liimbe foliairre, tandis que le parenchyme p e spongieuxx (lacuneuxx) est situé dans la paartie moyennne. Chez certaines c plantes, en particullier chez les xérophytees, il existe souvent duu parenchym me palissad dique des deux côôtés de la feuille (Raven et al., 2007). Un U des parramètres duu rendemen nt de la photosyynthèse estt la surfacce de conntact entre les parois cellulairees et les espaces intercelllulaires rem mplis d'air. Cette C surfacce est imporrtante dans le l parenchyyme spongieeux où le tissu chlorophyllienn présente de d grandes lacunes l (Bo ousquet, 20007). Figure 16 1 : dessin de d détail d’uune coupe de d feuille d’Angiosperm me (Ilex quuifolium) (Camefort, 1977). 2-3- Tiissus cond ducteurs L xylème est le princcipal tissu conducteur Le c de l’eau chez c les plaantes vascullaires. Il contribuue aussi auu transport des sels miinéraux, au u soutien ett au stockagge des mattières de réserve.. Les princiipales celluules conducttrices du xy ylème sont appelées éléments xy ylémiens. Ce sontt des cellulees allongéess possédant une paroi secondaire et e dépourvues de protop plastes à maturitéé ; leur parooi peut compporter des ponctuations p s (Raven et al., 2007). Lee phloème est e le princippal tissu connducteur dee la sève orgganique dess plantes vassculaires (Raven et al., 20007). Le phlloème des plantes à fleurs est composé c dee cellules appelées a élémentts criblés, à cause de leeurs parois transversalles percées de pores. L Les élémentts criblés sont dees cellules vivantes v em mpilées les unes au dessus d des autres pourr former des tubes criblés, ils assurentt la conducttion de la sèève élaboréee provenantt des feuilles, vers le reeste de la plante. Ils résulttent de laa différenttiation de cellules méristémattiques. L’u une des 5 53 Chapitre 2 Description de la feuille caractéristiques des éléments criblés est la présence des plages criblées, des parois transversales percées de pores limitées par la membrane plasmique. Ainsi, la sève élaborée passe de cellule en cellule, sans devoir franchir les membranes plasmiques et les parois cellulaires. Bien que vivants, les éléments criblés sont anucléés et leurs cytoplasmes a disparu. Seuls subsistent quelques débris d’organites situés contre le plasmalemme et des protéines appelées protéines P. Ces éléments criblés sont associés toujours à une cellule compagne, nuclée, riche en cytoplasme et en ribosomes. Elles sont reliées entre elles par de nombreux plasmodesmes, ramifiées du côté de la cellule compagne. Ces deux cellules constituent une unité ontogénique et fonctionnelle (Nabors, 2008). Les tissus conducteurs des feuilles sont en continuité avec ceux de la tige. Au niveau de chaque nœud, un ou plusieurs fuseaux cribro-vasculaires appelés traces foliaires, se ramifient à partir du système conducteur de la tige, pour se diriger vers le limbe en passant par le pétiole. Les faisceaux cribro-vasculaires constituent les nervures. La formation des nervures est sous l’influence des hormones, particulièrement l’auxine. Dans les nervures, le xylème est toujours du côté de la face supérieure de la feuille. Tandis que le phloème est sur la face inférieure. En plus de leur rôle dans la conduction, les nervures apportent un soutien mécanique à la feuille, d’autant qu’elles sont souvent entourées par une gaine périvasculaire. La nervation peut être réticulée ou parallèle. Chez la plupart des Dicotylédones qui présentent une nervation réticulée, les nervures constituent un réseau (Nabors, 2008). L’organisation typique des nervures d’une feuille de Dicotylédone, que l’on peut décrire comme un réseau hiérarchique, est représentée sur la figure 17. Une nervure principale s’étend le long de l’axe de la feuille, reliée aux bords de la feuille par des nervures secondaires. Un réseau de nervures d’ordres plus élevés ou réticulum divise la surface de la feuille en domaines appelés aréoles (Corson, 2008). 54 Chapitrre 2 Desccription de la l feuille Nervurees secondairess Figure 17 1 : (a) schhéma du réseau vasculaaire d’une feuille fe d’Araabidopsis, ((b) Illustratiion de la régulariité des réseaaux de nervvures. Le nivveau de griss en chaquee point correespond à la distance à la nervvure la pluss proche (Coorson, 20088). L nervures transporteent les nutriiments foliaaires et partticipent au m Les maintien géénéral du limbe. Une U enveloppe compacte de celluules entouree les vaisseaaux conduccteurs de sèève brute (xylèmee) et de sèvve élaborée (phloème). Les nervu ures contiennnent peu oou pas de pigments p photosyynthétiques (Bousquet, 2007). 3- Feu uille du pistachier de l’Atlass L feuilless de Pistaccia atlanticca sont caaduques en hiver (Zoohary, 1996 Les 6 ; Kadi Bennanne, 2004 ; Maameri, M 20008 ; Yaaqobbi et al., 2009). Elles sont s compossées imparip pennées. Elles coomportent 3 à 5 foliolees (Maamerri, 2008), 5 à 7 foliolees (Sheibanni, 1996), ou u 7 à 11 folioles (Monjauzee, 1980), 2 à 6 paires de folioles (Belhadj, 2007), 2 3 à 4 paires de folioles d paires (Nègre, 1962 ; Meiikle, 1977 ; Kadi Bennnane, 2004).. Selon Alyaafi (1979), lle nombre de ainsi quue la couleeur des follioles sont des caractééristiques très t affectéees par les facteurs écologiqques. 5 55 Chapitrre 2 Desccription de la l feuille Les feuilles du d pistachiier de l’Attlas sont géénéralemennt lancéoléees (Yaltirik k, 1967 ; Zohary,, 1987). Ellees peuvent être rétréciees à la base,, les extrém mités peuvennt être obtusses, avec le mucron apical trrès petit, ou en positionn surbaissée ou tout à faait absent (M Monjauze, 1980). 1 L feuilles présentent un rachis non ou à peine ailé (Négre, 19962). Le rachis des Les feuilles et le pétiolle sont parffois élargis et aplatis pour p formerr une expannsion ressem mblant à une ailee (Belhadj, 2007). 2 Foolioles latérrales Foolioles terminales Racchis Feu uille com mposée Rameaau Figure 18 1 : dessin montrant unn rameau portant des feuilles f et une u grappe dde fruits de Bétoum (Monjauuze, 1980). Caractéristiiques anattomiques des feuillles du pisstachier de l’Atlas L coupess anatomiquues de la feuille de Pistacia atlantica Deesf. présenttent une Les structurre simple. La feuille est entourrée d’une seule assisse épiderm mique supérrieure et 5 56 Chapitre 2 Description de la feuille inférieure accompagnée directement d’une assise de cellules hypodermiques. Le mésophylle est composé en majorité d’un parenchyme palissadique accompagné de 2 à 3 cellules de parenchyme spongieux. Les vaisseaux sont généralement de forme ovale et rarement circulaire avec des perforations simples (El Oqlah, 1995 ; Al-Saghir, 2006 ; Ait Said et al., 2009 ; Ait Said et al., 2011) (Figure 19). Pour Kadi-Bennane (2004), l’étude de l’anatomie de la feuille de trois populations du pistachier de l’Atlas, à savoir : Ain Oussera, Messaad et la Taissa a permis d’observer et de déterminer la structure interne des feuilles du bétoum. Les observations des coupes ont permis de déterminer la structure anatomique suivante : - une cuticule épaisse qui couvre la totalité de la surface foliaire ; - un épiderme simple à une seule assise cellulaire de forme cubique sur la face supérieure et inférieure, il est de type polygonal ; - un hypoderme composé d’une seule assise de cellule observée sous chaque épiderme ; - un mésophylle composé d’un parenchyme assimilateur situé directement sous l’hypoderme, il est constitué de deux assises de cellules allongées. Toutes semblables et riches en chloroplastes et caractérisées par la présence de 2 à 3 cellules spongieuses (aquifères ou cubiques) ; - des vaisseaux conducteurs (les nervures principales et secondaires) présentent des amas de cellules collenchymateuses, directement sous l’épiderme de la feuille pour la nervure principale et au centre du collenchyme autour des vaisseaux conducteurs. 57 Chapitrre 2 Desccription de la l feuille Figure 19 1 : paramèètres anatom miques mesuurés au niveeau d’une cooupe transvversale d’un ne feuille de P. attlantica Dessf. observéee au microsccope photon nique (X 4000) (Ait Said et al., 2009 9). L L’examen p phytodermol logique dess feuilles dee Pistacia atlantica Deesf. révèle l’’absence totale des d stomatees sur la faace supérieuure. Au niv veau de laa face inférrieure, les stomates s présenteent un légerr enfoncemeent dans l’éépiderme. Les feuilles de d Pistacia atlantica Desf D sont de type hypostomaatique (Kadii Bennane, 2004). 2 Danss une étude comparativve des épideermes de la feuillle de huit populations p du pistachier de l’Atllas faite parr Belhadj (22007), les stomates s sont répparties aléattoirement sur s la surfacce abaxiale mais, sur la l surface aadaxiale où ù ils sont localisés au niveauu de la nervuure. Il y a lieu de noter aussi la présencee de poils. L’ensemble L des populattions préalaablement étudiéess présententt des feuillees pubescenntes et recou uvertes de cires. La ciire se préseente sous forme de d couches fines ou de d flocons, avec quelq ques dépôtss de cristauux sur les surfaces foliairess et autour des d stomates (Belhadj, 2007). L L’observatio on au microoscope phottonique a permis p de noter n la présence d’un nombre importaant de poils sur les deuux faces dess feuilles dee Pistacia atlantica, nootamment au u niveau de la poopulation de d Messaad et de la Taaessa. Il y a deux typees de poils.. Des poils tecteurs simples unicellulaiires trouvés généralemeent sur les bordures b et au centre ddes feuilles ; ce type montre une sectionn subcirculaaire ; il est généralemeent long et effilé et parrfois court et érigé. Les poiils glanduleux sont couurts et présentent une tète pluriceellulaire, à ppied unisérrié (Kadi Bennanne, 2004). 5 58 Chapitre 2 Description de la feuille Alyafi (1978) rapporte la présence de poils glandulaires pluricellulaires chez toutes les provenances de Pistacia atlantica, parmi lesquelles figuraient deux provenances algériennes. Une étude faite par Belhadj et al. (2007) montre l’existence de poils glandulaires unicellulaires chez cette espèce. Les surfaces foliaires abaxiale et adaxiale sont recouvertes avec des trichomes dans tous les sites étudiés. Les trichomes glandulaires sont distribués sur la totalité des surfaces foliaires. Les trichomes tecteurs sont irrégulièrement distribués tout au long des nervures et sont situés sur les extrémités foliaires. La densité des trichomes est une caractéristique influencée par les conditions écologiques. L’altitude et les valeurs positives des températures minimales peuvent jouer un rôle important dans leur répartition et leur densité sur les feuilles (Figure 20 et 21). Figure 20 : poils ciliés sur la marge de la feuille et dépôts de cire (Belhadj, 2007). 59 Chapitre 2 Description de la feuille Figure 21: poil glandulaire et dépôts de cire sur l’épiderme (Belhadj, 2007). Il semblerait selon plusieurs investigations entre autre celles faites par Weaver et Cléments (1938) et Schields (1950) que les trichomes ne jouent qu’un faible rôle dans la réduction de la transpiration au moment où les stomates sont ouverts. Scheilds (1950) note également que les poils vivants, perdent eux-mêmes de l’eau et ne protègent que la surface contrairement aux poils morts qui forment un écran protecteur. Selon ce dernier, le phénomène d’explosion du nombre de poils au niveau d’une espèce des milieux arides est un symptôme de perte excessive d’eau, qu’une structure de protection contre l’évaporation et/ ou la transpiration excessive. 60 Chapitre 3. Matériel et méthodes Chapitre III Matériel et méthodes 1- Description de la zone d’étude La wilaya de Laghouat est située à 400 km au sud d’Alger sur l'axe routier AlgerGhardaia. Elle se trouve à 750 m d'altitude sur le flan sud de l'Altlas Saharien. Elle s'étale sur une superficie de 25 052 Km2 (Amghar et Kadi-Hanifi, 2002). Cette wilaya est limitée au nord par les wilayas de Tiaret et Djelfa, à l’Est par la wilaya de Touggourt et El Oued, à l’Ouest par la wilaya d’El Bayadh et au sud par la wilaya de Ghardaïa (Figure 22). Figure 22 : localisation de la wilaya de Laghouat (google.fr) échelle 1/200 000e 62 Chapitre III Matériel et méthodes De par sa position géographique et ses caractéristiques climatiques, la wilaya de Laghouat fait partie du groupe des neufs wilayas pastorales du pays. Sur le plan naturel, elle est constituée de deux zones distinctes (Anonyme, 2010). 1- La zone de l'Atlas Saharien caractérisée par des altitudes allant de 1000 à 1700 m avec, des pentes de 12,5 à 25%. Cette zone est au Nord ouest de la wilaya (régions d'Aflou et de la Brida) ; elle est constituée de vieux massifs forestiers d'une superficie de 47.095 ha, de nappes alfatières couvrant une superficie de 315.125 ha, ainsi que de pacages et parcours d'une superficie de 1.531.766 ha. 2- La zone des Hauts Plateaux et des Plateaux Sahariens caractérisée par des altitudes allant de 700 à 1000 m et des pentes de 0 à 3% ; cette zone est constituée de vastes étendues steppiques d'une superficie de 1900000 ha, dont une grande partie a été dégradée sous l'effet des sécheresses prolongées et de l’influence de l’homme. Notre station d’étude Dayate Aiat dans la région de Timzerth, est située à 50 Km au sud de la ville de Laghouat (Figure 23). La daya est du type peu déprimé (Pouget, 1980). Elle est située au cœur de la région des Dayas qui selon Monjauze (1982), est un haut plateau dont l’altitude moyenne passe de 500 à 1000 mètres de l’ouest à l’est. Ce plateau couvre environ 30 000 Km² ; il longe l’Atlas Saharien central par son grand côté, s’appuie au sud sur la dorsale touranienne de la Chebka du M’zab, à l’ouest sur des plateaux descendant vers le grand Erg Occidental et à l’est s’atténue en pente douce en direction des grands oueds. Les dayas de Laghouat sont à fond très plat, jamais complètement imperméables, de forme régulière et peuplées de Pistacia atlantica Desf. Elles couvrent environ 2% de la surface des terrains de parcours. Leur densité est d’une unité par Km², leur diamètre de 100 à 300 mètres, leur profondeur de 2 à 4 mètres. La daya naît par effondrement sous-jacent, accueille la végétation, se développe, puis tourne à la stérilité finale par infiltration généralisée. Le choix de cette daya s’explique par les nombreux travaux déjà réalisés sur ces pistachiers de l’Atlas. Nous pouvons citer ceux concernant l’architecture racinaire (Chebieb, 2008 ; Boubrima, en cours) et les symbioses racinaires (Raab, 2010), le sol jacent aux différents sujets échantillonnés (Deguiche, 2008 ; Adi, 2014 ; Amroun, 2013 ; Boubrima, en cours). 63 Chapitre III Matériel et méthodes 2- Bioclimat de la zone d’étude De part sa situation géographique, la wilaya de Laghouat appartient au domaine saharien, et au sous-domaine saharien nord occidental selon l’esquisse phytochorologique des domaines et secteurs biogéographiques de l’Algérie (Barry et al., 1958 in Kebci, 2008). La zone d’échantillonnage étudiée est dépourvue de station météorologique. Nous avons donc utilisé les données thermiques et pluviométriques de la station de Hassi R’mel qui a été mise en place en 1994. Elle est située à 764 m d’altitude, à une latitude de 32° 56’ N et une longitude de 03° 18’ E, et ceci pour une période de 07 années (1999-2005), recueillis par l’Office National de la Météorologie (O.N.M) d’Alger. Nous avons tout d’abord tracé le diagramme ombrothermique de Bagnouls et Gausen, afin de déterminer la durée de la saison sèche. Etablissant une relation entre les précipitations moyennes mensuelles et la température moyenne du mois, Bagnouls et Gaussen (1953) considèrent qu’un mois est sec quand le total des précipitations (en mm) est inférieur au double de la température (en °C), c’est à dire ; lorsque le rapport : P ≤ 2T Sur le diagramme ombrothermique de Bagnouls et Gaussen, les températures sont portées à une échelle double de celle des précipitations (Figure 24). 64 Chapitre III Matériel et méthodes Laghouat Dayate Aiat Figure 23 : situation de la zone d’étude Echelle 1/200 000 e 65 Chapitre III Matériel et méthodes Précipitations 35 70 30 60 25 50 20 40 15 30 10 20 5 10 0 0 J F M A M J Mois Jlt A S O N Précipitations températures Temperatures D Figure 24 : diagramme ombrothermique de Bagnouls et Gaussen pour la station de Hassi R’mel (1999-2005). D’après le diagramme ombrothermique de Bagnouls et Gaussen, la période sèche est très longue ; elle est de 11 mois. Elle débute en février et se termine en décembre (Figure 24). Le Houérou (1995) s’est basé sur un rapport appelé quotient pluvio-évapotranspiratoire (P/ETPp), ETP étant l’évapotranspiration calculée à partir de la formule de Penman. Outre le mérite de sa simplicité, elle présente une précision suffisante à l’échelle zonale. Sachant que le seuil P= 2 * t de démarcation entre la saison sèche et la saison pluvieuse, mis en évidence par Bagnouls et Gaussen (1953) correspondant sensiblement à 0,35 ETP, estimé par la méthode de Penman, on peut ainsi par subterfuge évaluer de façon approchée l’ETPp à l’échelle annuelle, ETP= 68,64 x (M+m/2). Le Houérou (1995) a ainsi dressé une zonation écoclimatiques des régions arides de l’Afrique du Nord en portant sur les ordonnées le quotient pluvio-évapotranspiratoire, et sur les abscisses les moyennes des températures minimales du mois le plus froid (Figure 25). 66 Chapitre III Matériel et méthodes Le tableau 04 retrace les différents calculs effectués pour classer notre station dans la zonation écoclimatiques de Le Houérou (1995). Tableau 04 : données et paramètres utilisés dans la classification écoclimatique de la station de Hassi R’mel. Station Hassi P M m M+m/2 t° M-m (mm) (°C) (°C) (°C) (°C) (°C) 116,6 39,9 1,9 20,9 19,9 12,8 R’mel ETPp P/ETP 1366 0,08 Classification Aride inférieur frais (AI-f) L’analyse du climat à travers ses différentes composantes sur une période allant de 1999 à 2005 a révélé que sur le climagramme de Le Houérou, notre station se place dans l’étage bioclimatique aride inférieur ou selon le même auteur appelé aussi aride accentué ou présaharien ou subdésertique à hiver frais (Figure 25), qui se caractérise par la présence et la dominance d’espèces steppiques strictes, l’infiltration de certaines espèces sahariennes et la quasi-inexistence d’espèces d’affinité forestière en dehors des zones favorisées par le ruissellement (Le Houérou, 1995). 67 Chapitre III Matériel et méthodes P × 100 ETP Sub humide 45 Semi aride sup 36 Semi aride inf 28 Aride supérieur 21 Aride moyen 15 Aride inférieur Hassi R’mel 8 Hyperaride 0 -5 -4 H.g glaciaux -3 -2 -1 0 Très froid Froid 1,9 Frais 3,3 4 Tempéré 5 6 7 Doux 8 Chaud 9 10 11 Très chaud 12 Sub.tropical m (°C) Figure 25: zonation écoclimatique de Hassi R’mel selon la méthode de Le Houérou (1995). 68 Chapitre III Matériel et méthodes 3- Echantillonnage sur le terrain Les feuilles du pistachier de l’Atlas, objet de notre étude ont été récoltées au mois d’avril 2013. L’échantillonnage des feuilles s’est porté sur des sujets qui ont été choisis d’une manière subjective. Dix arbres sont choisis au niveau de Dayate Aiat, dans la région de Timzerth (Figures 26, 27 et 28). Les caractéristiques générales des sujets sont résumées dans le (Tableau 5). Tableau 5 : caractéristiques générales des sujets échantillonnés. Numéro Classe d’âge Altitude (m) Latitude Longitude du sujet 1 Sujet jeune mâle entouré de jujubier. 873,55 33° 31.145 N 2° 56-414 E 2 Sujet jeune immature il se trouve sur une 883,92 33° -31 159 N 2° 56-375 E butte de sable bien entouré de jujubier. 3 Sujet jeune immature, entouré du jujubier 879,33 33°31.148 N 2°56.466 E 4 Sujet jeune immature, entouré du jujubier 880,2463 33°31.147 N 2°56.374 E 5 Sujet femelle moyen, il se trouve sur une 878,7223 33°31. 195N 2°56.450E 880,2463 33°31.197N 2°56.460 E butte de sable bien entouré de jujubier. 6 Sujet femelle moyen, entouré de jujubier 7 Sujet mâle âgé, absence de jujubier 880,26 33°-31. 177 N 2° 56-427 E 8 Sujet mâle âgé, absence de jujubier 882,70 33°-31.196 N 2° 56-437 E 9 Sujet mâle âgé, absence de jujubier. 866,83 33°31.203 N 2°56.428 E 10 Sujet mâle âgé, absence de jujubier. 882,37 33°31.117 N 2°56.388 E 69 Chapitre III Matériel et méthodes 1 2 3 4 Figure 26: sujets 1, 2, 3 et 4 entourés de jujubier. Sujet 5 Sujet 6 Figure 27 : sujets 5 et 6 entourés de jujubier 70 Chapitre III Matériel et méthodes 7 8 9 10 Figure 28 : sujets 7, 8, 9, 10 âgés. Le choix a concerné des sujets qui sont en bon état phytosanitaire. Pour chaque arbre choisi, 20 feuilles / arbres sont cueillies tout autour de l’arbre. Une fois récoltées, les feuilles doivent être maintenues à l’état frais, elles sont ainsi mises dans des sacs en papier et transportées ensuite dans une glacière au laboratoire. Il est recommandé de laisser un temps très court entre la récolte des feuilles et le début des mises en culture au laboratoire (24 h à 36 h au maximum). Pour éviter la pourriture des feuilles qui provoque l’installation des souches pathogénes. 3-1- Mise en culture des feuilles 3-1-1- Stérilisation superficielle Le but de la stérilisation superficielle est d’éliminer les organismes épiphytes qui demeurent au niveau de phylloplan. Pour cela, nous avons adopté le protocole de Helander et al. (1994-in Ould Amrouche et Hadj Benamane, 2008). 71 Chapitre III - Traitement à l’éthanol 95% pour une durée de 2 minutes ; - rinçage à l’eau distillée stérilisée ; - traitement à l’eau de javel pour une durée de 03 minutes ; - 2 éme rinçage à l’eau distillée stérilisée ; - 2 éme traitement à l’éthanol 95% pour une duré de 30 secondes ; - 3 éme rinçage à l’eau distillée stérilisée ; Matériel et méthodes Une fois stérilisées, les feuilles sont séchées en utilisant du papier buvard stérile. Elles sont ensuite coupées à l’aide d’un bistouri stérilisé. Les fragments de folioles et de rachis obtenus sont ensemencés sur les milieux de culture P.D.A. 3-1-2- Mise en culture Nous avons utilisé un milieu semi-synthétique P.D.A (Potato-dextrose-agar), dont la composition est la suivante : - 200 g de pomme de terre ; - 20 g de glucose ; - 20 g d’agar-agar ; - 1000 ml d’eau distillée. 3-1-2-1- Préparation et stérilisation Les pommes de terre sont pelées, lavées et coupées en tranches minces. Elles sont ensuite cuites dans 200 ml d’eau pendant 15 à 20 mn. Le mélange obtenu est filtré. Le filtrat est versé dans un erlen meyer d’un litre placé sur un agitateur chauffant. On rajoute au filtrat le glucose et l’agar-agar, puis on complète le volume à 1000 ml. L’erlen meyer est retiré de la plaque lorsque le milieu est homogène et clair. Le milieu prêt est versé dans un flacon d’un litre pour la stérilisation à l’étuve à une température de 1200C. Quelques grammes d’antibiotiques (amoxicilline) sont ensuite incorporé au milieu préparé. Après refroidissement du milieu, ce dernier est coulé dans des boites de pétri sous une hôte entre deux becs bunsen. Vingt feuilles par sujets sont choisies pour la mise en culture. Les fragments de folioles et de rachis sont déposés sur ce milieu, à raison de 5 explants/boite de Pétri pour les folioles et 4 explants/boite de Pétri pour les rachis. Au total, 1800 explants sont répartis sur le milieu de 72 Chapitre III Matériel et méthodes culture P.D.A. Toutes ces manipulations se font entre deux becs bunsens sous une hotte. Les désinfectants (eau savonneuse, hypochlorite de sodium et alcool) sont utilisés pour éviter les risques de contamination venant de l’extérieur. L’incubation s’effectue à température ambiante pendant deux mois. 3-2- Coloration des feuilles La méthode de coloration a été faite selon le protocole de Phillips et Hyman (1970), et cela consiste à : - un rinçage des feuilles à l’eau courante ; - mettre les feuilles dans du KOH à l’étuve pendant 90 °C (remplacer la solution du KOH aussitôt qu’elle devient foncée) ; - faire plusieurs rinçages à l’H2O2 (10%), à l’étuve à 90°C pendant 10 à 20 mn ; - rinçer à l’eau courante ; - neutraliser les feuilles dans un bain d’acide lactique (10%) pendant 3 à 4 mn ; - mettre les feuilles dans une solution colorante (bleu de trypan) à l’étuve à 90°C ; - rinçer à l’eau courante ; - mettre dans du glycérol pour la conservation. Après coloration, les folioles et les rachis des feuilles colorées sont placées entre lames et lamelles. Des observations ont été réalisées sous microscope photonique. Des photos sont prises à différents grossissements. 3-3- Identification 3-3-1- Identification macroscopique L’observation macroscopique est une technique utilisée en microbiologie pour qualifier une souche microbienne. Les caractères morpho-culturaux sur un milieu de culture solide sont étudiés (couleur, contours, relief, consistance, transparence, aspect de la surface et taille). 3-3-2- Observation microscopique L’observation microscopique des champignons consiste à étudier la morphologie d’une colonie au niveau de laquelle les pycnides, asques, zygospores, sclérotes, chlamydospores et basides sont identifiés. Les spores, ainsi que leurs dispositions (solitaire, chaîne, bouquet) sont observées. 73 Chapitre III Matériel et méthodes A l’aide de la clé de détermination de Tabuc (2007), une identification a été faite jusqu’au genre. 3-4- Analyse statistique La fréquence de colonisation FC(%) est calculée selon la formule suivante FC(%)= (Nombre de fragments colonisés / Nombre total de fragments) ×100. Des histogrammes concernant les différences de fréquences de colonisation sont tracées. Des analyses de variances (Anova) sont faites grâce au logiciel Stat Box 6.40, pour mettre en évidence la présence de différences significatives entre les différents sujets échantillonnées. Concernant les fréquences les genres dénombrés au niveau des feuilles des différents sujets de pistachier de l’Atlas, des diagrammes sont établis. Une analyse en composante principale (A.C.P) est réalisée en vue de mettre en évidence la distribution spatiale des différents genres de mycoendophytes en fonction des sujets échantillonnés, grâce au logiciel Stat Box 6.40. 74 Chapitre 4. Résultats et discussion Résultats et discussion 1- Fréquences de colonisation La majorité des feuilles de pistachier de l’Atlas mises en culture montrent la présence de mycoendophytes. Les différents segments de feuilles présentent une fréquence de colonisation (FC) en mycoendophytes importante. Elle est en moyenne de 68,7% pour les feuilles avec respectivement 71.3% pour les folioles et 66.1% pour les rachis (Tableau 6). La recherche sur les champignons endophytes des arbres au cours des deux dernières décennies a montré que pratiquement toutes les feuilles et les tiges d’un arbre sont infectées par des champignons endophytes (Suryanarayanan et Thennarasan, 2004). Ils peuvent jouer un rôle important dans l’aptitude de leurs plantes hôtes (Lv et al., 2010). Les interactions entre les plantes et les endophytes ont été considérées largement comme mutualistes, car les champignons endophytes confèrent des bénéfices à leurs hôtes à travers l’amélioration de l’absorption des nutriments (Mandyam et Jumpponen, 2005 ; Dupont, 2007). La promotion de la croissance et de la résistance de leur hôte (Sun et al., 2011 ; Lakshman et Kurandawad, 2013 ; Rodriguez et al., 2009) font que l’étude des endophytes est devenue l’un des plus importants point de la recherche en mycologie (Sun et al., 2011). Ce fort taux de colonisation par des champignons endophytes des feuilles de Pistacia atlantica peut être expliqué par la période d’échantillonnage. Beaucoup de champignons endophytes se développent dans les tissus végétaux au printemps, les précipitations au printemps peuvent augmenter la dispersion des spores fongiques (Göre et Bucak, 2007 ; ElNagerabi et al., 2013). Le printemps semble être associé à la mise en place de souches fongiques endophytes dans les tissus de la plante. Les précipitations plus importantes dans cette saison pourraient favoriser la dispersion de spores fongiques et les températures modérées permettraient une plus grande viabilité des propagules fongiques et donc leurs succés dans la colonisation des tissus de la plante (Collado et al., 1999). En effet, une forte corrélation a été observée entre les niveaux d’infection d’endophytes et les précipitations cumulées (Suryanarayanan et Thennarasan, 2004). La disponibilité en eau joue un rôle important pour l’infection des plantes hôtes par des champignons endophytes. Petrini (1991) suppose qu’il pourrait y avoir une corrélation entre l’humidité et l’infection des feuilles d’arbres par des endophytes (Almut Reiher, 2011). Ceci a été déjà observé chez le chêne, où l’eau libre et l’humidité élevées favorisent l’activité et la colonisation fongique de l’hôte (Morrica et Raggazzi, 2008). 76 Résultats et discussion L’aspect vert des feuilles du jujubier et des sujets du pistachier attirent les herbivores et les pathogènes. Mais les sujets du pistachier de l’Atlas montrent un bon état phytosanitaire, qui peut être dû à la forte fréquence de colonisation par des champignons endophytes. Ces résultats confirment les résultats de Omacini et al. (2001) et Vesterlund et al. (2011), qui montrent que les Champignons endophytes modifient les communautés d'invertébrés dans les populations d'herbes à la fois cultivées et sauvages. Les mycoendophytes peuvent aussi induire des mécanismes de résistance systémique et l'expression de gènes de défense contre l'attaque de certains agents pathogènes chez leurs hôtes (Arnold et al., 2003 ; Cao et al., 2009), par la production de métabolites secondaires (Carroll et Carroll, 1978 ; Cao et al., 2009 ; Aly et al., 2010) et / ou d’enzymes qui dégradent les mycoparasites (Cao et al., 2009 ; González et Tello, 2011). Ils peuvent aussi produire des antibiotiques qui inhibent la croissance d'autres champignons. En outre, les espèces d’endophytes pourraient éventuellement concurrencer les champignons pathogènes des plantes pour l'espace et les nutriments (González et Tello, 2011). Les champignons endophytes Clavicipitacées tel que Neotyphodium associés à l'herbe, produisent des alcaloïdes chez les plantes hôtes qui protègent ces dernières contre les herbivores (Purahong et Hyde, 2011). Des scientifiques ont aussi mis en évidence la sécrétion spécifique d'une douzaine de petites molécules par le champignon endophyte, lorsqu'il est en compétition avec le phytopathogène. Deux d'entre elles ont été identifiées comme étant des oxylipines, des composés dérivés de l'oxydation des acides gras polyinsaturés et responsables de la communication chez de nombreux êtres vivants. Si ces molécules ne sont pas directement impliquées dans l'inhibition de la croissance du phytopathogène, elles suggèrent l'existence d'un langage beaucoup plus complexe. Ces oxylipines auraient donc un rôle de signal dans la régulation des cascades métaboliques, agissant comme un véritable langage moléculaire. L'inhibition de la production de mycotoxines par les oxylipines fongiques pourrait donc conférer un avantage écologique aux champignons endophytes, au bénéfice de la plante-hôte, lors de leur compétition avec les phytopathogènes. Cette étude ouvre de nouvelles perspectives dans la lutte contre les champignons producteurs de mycotoxines susceptibles de contaminer les aliments et les fourrages (Combès et al., 2012). Une différence hautement significative des fréquences de colonisation par des champignons endophytes a été observée au niveau des feuilles des pistachiers de l’Atlas de dayate Aiat (Tableau 6). 77 Résultats et discussion Tableau 6 : fréquence de colonisation (FC) par des champignons endophytes isolés à partir de la feuille de Pistacia atlantica après 2 mois d’incubation (%). Organes considérés FC± erreur standard Rachis 61.1±7.70*** Folioles 71.3±5.11*** Feuille 68.7±4.93*** *** : différence hautement significative : P < 0.001. La feuille de Pistacia atlantica est une feuille composée. La fréquence de colonisation par des champignons endophytes présente une différence hautement significative entre les différentes feuilles des différents sujets échantillonnés, concernant les rachis et les folioles. La fréquence de colonisation par des champignons endophytes est plus élevée au niveau des folioles comparées aux rachis. Ceci s’explique par la nature tissulaire des différentes parties de la feuille et la spécificité tissulaire des champignons endophytes, le type d’activité physiologique et la richesse en éléments nutritifs. Le rachis est constitué de tissus vasculaires jouant un rôle de conduit de la sève brute pour assurer la photosynthèse au niveau de la feuille, les folioles sont moins riches en tissus vasculaires et assurent la synthèse de la sève élaborée. Ceci est confirmé par les résultats de Rodriguez et al. (2009), Sun et al. (2011), ElNagerabi et al. (2013) et Lakshman et Kurandawad,(2013), qui montrent que les différences de structures et la composition nutritionnelle des tissus de la plante provoquent une différence de fréquence de colonisation par des champignons endophytes. Wilson et Carroll (1994) montrent une forte densité d’infection par des champignons endophytes tout au long du limbe, et spécialement à la base de la feuille plus que la lamelle marginale. Ceci est dû probablement aux différences de dispositifs et de rétention de spores, par la surface de la feuille et la disponibilité en eau tout au long du limbe qui provoque une augmentation des taux de germination de spores (Almut Reiher, 2011). Notre échantillonnage a concerné des individus âgés, mais aussi d’autres plus jeunes présents au niveau de la nebkha formée par les buissons du jujubier. Une différence hautement significative des fréquences de colonisation des feuilles des différents sujets de Pistacia atlantica a été observée entre les sujets jeunes et moyens présents dans des nebkhas 78 Résultats et discussion (1, 2, 3, 4, 5 et 6). Un fort taux de colonisation par des champignons endophytes est observé chez les feuilles des sujets présents au milieu de la butte du jujubier (Tableau 7) (Figure 29), par rapport aux sujets âgés 7, 8, 9, et 10 affranchis de cette dernière. Pour ces derniers, des différences hautement significatives concernent les fréquences de colonisation en mycoendophytes des rachis. Alors que les folioles et les feuilles, les différences entre les individus âgés sont non significatives (Tableau 8) (Figure 30). Ceci peut s’expliquer par le microclimat clément et riche en humidité et en litière végétale de la nebkha présent tout autour des sujets jeunes et moyens de pistachier de l’Atlas, et qui semble favorable à une meilleure colonisation par des champignons endophytes. Ces résultats confirment ceux de Toofane et Dalymamode (2002), qui ont montré que les feuilles les plus fortement colonisées se trouvent plus près du sol ou de la litière, où les conditions d’humidité élevées facilitent la pénétration et la colonisation par des champignons endophytes. Todd (1988 in Marié Criel et al., 2000) montre qu’il existe une corrélation entre le site et les fréquences de colonisation par des endophytes. Ceci pourra être attribué au microclimat plus favorable à la colonisation fongique, quand le feuillage est plus dense (Marié Criel et al., 2000). Les sujets entourés de jujubier qui joue le rôle d’une espèce facilitatrice favorise la colonisation par des champignons endophytes par rapport aux sujets trouvés seuls. Tableau 7 : fréquence de colonisation des feuilles des sujets jeunes et moyens de pistachiers de l’Atlas associés au jujubier (nebkhas) (%). Sujet S1 S2 S3 S4 S5 S6 Moyenne FCFe FCFo FCRa 61 57 65 70.5 53 88 99 98 100 94 95 93 82 90 74 51.5 62 41 75,83±7.69*** 76,03±8.09*** 75.93±8.15*** FCFo : fréquence de colonisation par des champignons endophytes au niveau des folioles de la feuille du pistachier de l’Atlas. FCRa : fréquence de colonisation par des champignons endophytes au niveau des rachis de la feuille du pistachier de l’Atlas. FCFe : fréquence de colonisation par des champignons endophytes au niveau de la feuille du pistachier de l’Atlas. 79 Résultats et discussion *** : différence hautement significative P<0.001. 120 100 80 60 FCFo FCRa 40 20 0 S1 S2 S3 S4 S5 S6 Figure 29 : fréquence de colonisation des feuilles des sujets jeunes et moyens de pistachier de l’Atlas associés au jujubier (nebkhas). Tableau 8 : fréquence de colonisation des feuilles des sujets du pistachier de l’Atlas âgés sans jujubier (%). Sujet S7 S8 S9 S10 Moyenne FCFo FCRa 72 25 60 60 70 35 56 80 64,5±3.34 ns 50±10.75*** FCFe 48.5 60 52.5 68 57.25±3.72 ns FCFo : fréquence de colonisation par des champignons endophytes au niveau des folioles de la feuille du pistachier de l’Atlas. FCRa : fréquence de colonisation par des champignons endophytes au niveau des rachis de la feuille du pistachier de l’Atlas. FCFe : fréquence de colonisation par des champignons endophytes au niveau de la feuille du pistachier de l’Atlas. *** : différence de fréquence de colonisation hautement significative P<0.001. 80 Résultats et discussion ns : différence de fréquence de colonisation non significative P≥0.05. 90 80 70 60 50 FCFo 40 FCRa 30 20 10 0 S7 S8 S9 S10 Figure 30 : fréquence de colonisation des feuilles des sujets âgés de pistachier de l’Atlas (sans nebkhas). Les sujets présents au milieu de la nebkha de jujubier n’ont pas le même âge. Certains sont jeunes et immatures, d’autres sont moyens et leurs fleurs montrent s’ils sont mâles ou femelles. Les plus jeunes sujets de Pistacia atlantica 1, 2, 3 et 4 (Tableau 9) présentent une forte fréquence de colonisation par des champignons endophytes au niveau de leurs feuilles par rapport à celles des feuilles des sujets moyens 5 et 6 (Tableau 10). Le jujubier peut expliquer cette différence de colonisation par des champignons endophytes, car il forme une canopée tout autour des plus jeunes sujets. Ces résultats confirment ceux de Petrini et Carroll (1981) et Collado et al., (1999), où le feuillage de certaines Cupressaceae échantillonnées dans l’Oregon semblait être beaucoup plus infecté, lorsque les échantillons ont été prélevés sur les hôtes poussant dans les zones avec une plus grande densité de végétation. Ceci a été interprété comme l’effet de la canopée qui protège les tissus foliaires des agents externes. Le même constat a été fait sur la microflore de Pinus au Canada (Collado et al., 1999). 81 Résultats et discussion Tableau 9 : fréquences de colonisation des feuilles des jeunes sujets du pistachier de l’Atlas. Sujet S1 S2 S3 S4 Moyenne FCFe FCFo FCRa 61 57 65 70.5 53 88 99 98 100 94 95 93 75.75±10.41*** 86.5±6.56* 81.125±7.91*** FCFo : fréquence de colonisation par des champignons endophytes au niveau des folioles des feuilles du pistachier de l’Atlas. FCRa : fréquence de colonisation par des champignons endophytes au niveau des rachis des feuilles du pistachier de l’Atlas. * : fréquence de colonisation significative P<0.05 *** : fréquence de colonisation hautement significative P<0.001 Tableau 10 : fréquences de colonisation des feuilles des sujets d’âge moyen du pistachier de l’Atlas. Sujet S5 56 Moyenne FCFe FCFo FCRa 82 90 74 51,5 62 14 76±9.92* 43±15.57* 66.75±10.81*** FCFo : fréquence de colonisation par des champignons endophytes au niveau des folioles des feuilles du pistachier de l’Atlas. FCRa : fréquence de colonisation par des champignons endophytes au niveau des rachis des feuilles du pistachier de l’Atlas. *** : fréquence de colonisation hautement significative P<0.001. * : fréquence de colonisation significative P<0.05. Le jujubier joue le rôle d’une espèce facilitatrice pour le pistachier de l’Atlas. Il a un effet refuge contre les stress environnementaux UV solaires, prédations, concurrence, disponibilité en ressources (eau, matière organique, humidité, décolmatage du sol etc..), mais aussi la facilitation du transport de propagules. 82 Résultats et discussion La facilitation est décrite comme un ensemble d’interactions positives incluant des changements de l’environnement abiotique ou l’interférence d’autres organismes (Callaway et Walker, 1997 ; Vieira et al., 2013). Dans les environnements arides et semi-arides, l’introduction de conditions de microenvironnements est une clé des processus structurant la communauté. La facilitation a une importance notable dans la succession de ces derniers. C’est une interaction d’actes continuels sur la diversité et la fonction de la végétation dans les environnements les plus dégradés. Dans un environnement semi-aride soumis à des niveaux élevés de radiations solaires, le microclimat réalisé par la canopée d’un buisson peut être un facteur primaire qui facilite l’établissement des espèces ligneuses, qui sont moins tolérantes aux conditions environnementales rigoureuses (Vieira et al., 2013). Cette habilité des organismes à modifier les conditions de leurs environnements locaux joue un rôle important dans plusieurs écosystèmes, en particulier les environnements difficiles. Dans les écosystèmes arides, le stress sévère résulte d’un déficit en eau et en nutriments, de températures extrêmes, de la dessiccation par le vent et l’érosion du sol (Callaway et Walker, 1997 ; Vieira et al., 2013). Dans ces conditions extrêmes, la protection physique et l’ombre augmentent la disponibilité en ressources sous la canopée des plantes nurses, ce qui crée des conditions pour la réalisation de la croissance d’autres espèces protégées dans ses plantes nurses. En effet. L’augmentation de concentration des nutriments dans la canopée peut résulter de feuilles, de la décomposition fécale ou des restes d’aliments des oiseaux et des mammifères (Vieira et al., 2013). De très nombreux échanges nutritifs s’établissent entre ces organismes. Considérés sur le plan des échanges de matière et d’énergie, la communauté constitue un écosystème. Dans celui-ci, on trouve des producteurs (végétaux), des consommateurs (animaux), mais aussi des décomposeurs (champignons et bactéries). Ces derniers dégradent les molécules complexes de la matière organique par la minéralisation et libèrent des éléments simples qui seront repris et remétabolisés ultérieurement par les végétaux chlorophylliens. Pour que le cycle des éléments fonctionne, il est donc indispensable que la minéralisation de la matière organique s’effectue. Les décomposeurs sont tout aussi importants et utiles que les producteurs. Les bactéries et les champignons effectuent le recyclage des éléments carbonés et azotés à partir des déchets (excréments, débris végétaux…….), issus de tous les êtres vivants. Leur qualité et leur diversité atteignent dans le sol des valeurs souvent méconnus (Laberche, 1999). Le jujubier forme une canopée pour les sujets les plus jeunes. Il possède des rameaux qui sont riches en champignons endophytes. Les rameaux sont durables ; ils accumulent plus de propagules fongiques avec le temps (Wang et Guo, 2007 ; Sun et al., 2011). Cette richesse 83 Résultats et discussion en champignons endophytes au niveau des rameaux du jujubier peut donner des propagules qui vont se transmettre et atteindre les feuilles des sujets immatures, car la transmission horizontale de champignons endophytes est commune chez les plantes ligneuses (Faeth et Fagan, 2002 ; Khan, 2007). Pour les jeunes sujets, nous remarquons une forte fréquence de colonisation par des champignons endophytes chez les feuilles des sujets 3 et 4. La situation des deux sujets à l’intérieur de la daya augmente la chance du libre déplacement des propagules entre les sujets. Ces résultats concordent avec ceux de Macarthur et Mcgee, (2000), où l’augmentation de la fréquence de colonisation par des champignons endophytes résulte probablement de l’expansion des propagules. Concernant les sujets 1 et 2, ils sont proches des bordures de la daya. Les sujets moyens présentent la fréquence de colonisation par des champignons endophytes la plus faible au niveau de leurs feuilles (Tableau 11), malgré le fait qu’ils soient eux aussi entourés du jujubier. Le jujubier ne forme plus une canopée qui entoure le pistachier de l’Atlas. En effet, les individus moyens sont plus grands. Ils dépassent aisément le buisson du jujubier, mais ils ne sont pas aussi grands que les individus âgés. Tableau 11 : fréquence de colonisation des feuilles de Pistacia atlantica par des champignons endophytes selon l’âge des sujets (%). Fréquence de colonisation Feuille Jeunes Moyens Agés 81.125±7.91** 66.75±10.81** 70.12±3.725ns 84 Résultats et discussion 2- Systématique des champignons endophytes Plusieurs isolats de champignons endophytes ont été prélevés à partir des 400 échantillons mis en culture. La détermination de ces genres de champignons s’est basée sur des caractéristiques morphologiques macroscopiques (forme, aspect et couleur de la colonie) et microscopiques (filaments mycéliens et spores) (Tabuc, 2007). Les isolats identifiés au niveau des feuilles du pistachier de l’Atlas appartiennent aux genres Acremonium (Figure 31), Alternaria (Figure 32), Aspergillus (Figure 33), Aureobasidium (Figure 34), Bipolaris (Figure 35), Chaetomium (Figure 36), Cladosporium (Figure 37), Cordyceps (Figure 38), Curvularia (Figure 39), Epicoccum (Figure 40), Geotrichum (Figure 41), Monilia (Figure 42), Mucor (Figure 43), Neoscytalidium (Figure 44), Nigrospora (Figure 45), Phomopsis (Figure 46), Phoma (Figure 47), Rhizoctonia (Figure 48), 31a 50). Certains champignons 31b Scedosporium (Figure 49) et Xylaria (Figure ont été identifiés au 1b niveau spécifique. C’est le cas d’Aspergillus nidulans (Figure 51), Cladosporium herbarum (Figure 52) et Paraphaesphaeria recurvifoliae (Figure 53). Tous ces genres de champignons appartiennent aux classes de champignons endophytes suivantes : Agaricomycètes, Dothideomycètes, Euascomycètes, Eurotiomycètes, Leotiomycètes et les Sordariomycètes 3b (Tableau 12). Plusieurs auteurs ont montré que des champignons endophytes présents chez plusieurs plantes appartiennent aux classes des Dothideomycètes, Sordariomycètes, Leotiomycètes, Eurotiomycètes et les Pezizomycètes (Higgins et al., 2007 ; Jumpponen et 31c Jones, 2009 ; Porras-Alfaro et Bamyan, 2011). Les Zygomycètes et les Basidiomycètes endophytes sont communs chez les herbacées et les tissus ligneux et les racines (Porras-Alfaro et Bamyan, 2011). 85 32a 33a 33b Résultats et discussion Tableau 12 : abondance des genres de champignons endophytes isolés à partir des fragments de feuilles du pistachier de l’Atlas mises en culture, après deux mois d’incubation. Genres de Champignons Acremonium Alternaria Aspergillus Aureobasidium Bipolaris Chaetomium Cladosporium Cordyceps Curvularia Epicoccum Geotrichum Monilia Mucor Neoscytalidium Nigrospora Phoma Phomopsis Rhizoctonia Scedosporium Xylaria Paraphaesphaeria recurvifoliae SNI Abondance (%) 0,5 2,75 27,25 2 1 1 4,5 1,5 1 25,6 1,5 2 0,25 0,25 0,25 1,75 0,5 0,5 0,5 1,3 0,25 1,250 Phylum Ordre Famille Ascomycota Ascomycota Ascomycota Ascomycota Ascomycota Ascomycota Ascomycota Ascomycota Ascomycota Ascomycota Ascomycota Ascomycota Zygomycota Ascomycota Ascomycota Ascomycota Ascomycota Bsidiomycota Ascomycota Ascomycota Ascomycota Hypocréales Pléosporales Eurotiales Dothidéales Pléosporales Sordariales Capnodiales Hypocréales Pléosporales Pléosporales Saccharomycètes Hélotiales Mucorales Botryosphaeriales Hyphales Sphaeropsidales Diaporthales Cantharellales Microascales Xylariales / Hypocréacées Pléosporacées Trichocomacées Dothioracées Pléosporacées Chaetomiacées Daridiellacées Cordycipitacées Pléosporacées Leptosphaeriacés Endomycetacées Sclérotiniacées Mucoracées Botryosphaeriacées Dematiacées Sphaerioidacées Diaporthacées Ceratobasidiacées Microascacées Xylariacées / / / / 86 Résultats et discussion Acremonium Alternaria Aspergillus Aureobasidium Bipolaris Chaetomium Cladosporium Cordyceps Curvularia Epicoccum Geotrichum Monilia Mucor Neoscytalidium Nigrospora Phoma Phomopsis Rhizoctonia Scedosporium Xylaria Paraphaesphaeria recurvifoliae SNI Figure 54 : abondance des genres de champignons endophytes isolés à partir des feuilles des sujets échantillonnés. D’après les isolats recensés, nous remarquons une diversité en champignons endophytes importante au niveau des feuilles de Pistacia atlantica. Ces résultats confirment les résultats de Kumar et Hyde (2004) et Lakshman et Kurandawad. (2013), qui montrent que l’un des traits les plus caractéristiques des champignons endophytes est leur diversité exceptionnelle. Malgré l’aridité qui caractérise la daya étudiée, les champignons endophytes présentent une diversité remarquable au niveau des feuilles de tous les sujets du pistachier de l’Atlas. Ces résultats confirment ceux de Bezerra et al. (2013), qui suggèrent une forte diversité fongique chez Cactus jamacaru où 60 et 51 espèces de champignons endophytes ont été répertoriés, dans les tissus de 15 arbres différents dans les forêts cacidufoliées des zones arides. Ceci contredit certaines études ayant indiquées que la diversité endophytique dans les régions arides et/ou désertiques est faible, parce que certains facteurs comme la pluviométrie et la densité végétative sont faibles (Arnold et al., 2000 ; Suryanarayanan et al., 2002 a, 2003, 2005 ; Bezerra et al., 2013). Les endophytes colonisent les espaces inter et intracellulaires des tissus de végétaux vivants. Plusieurs centaines d’espèces de ces microorganismes peuvent être isolées à partir d’une seule plante, mais très peu seraient spécifiques de la plante hôte. Les plantes 87 Résultats et discussion supérieures constituent ainsi une véritable niche écologique, réservoir potentiel d’une vaste diversité microbiologique (Kogel et al., 2006). Les sources de microorganismes colonisant la phyllosphère sont multiples. Les épiphytes peuvent coloniser la surface foliaire via l’atmosphère (Cordier, 2012), les insectes (Coluccio et al., 2008 ; Feldman et al., 2008 ; Cordier, 2012), les projections par la pluie (Wilson et Carroll, 1994 ; Cordier, 2012) ou encore les oiseaux. L’inoculum ambiant peut varier qualitativement et quantitativement en fonction du cycle de vie des champignons, en réponse à l’environnement (pluie, températures extrêmes et vents) (Kinkel, 1997 ; Talley et al., 2002 ; Cordier, 2012). Il a été aussi montré que les bactéries du sol peuvent coloniser l’intérieur des racines et devenir endophytes dans les feuilles via le système vasculaire de la plante (Lamb et al., 1996 ; Wulff et al., 2003 ; Cordier, 2012). Ce comportement microbien pourrait abriter une proportion importante de champignon inconnus (Porras et Bayman, 2011 ; Cordier, 2012). Ces assemblages fongiques sont dominés par quelques taxons endophytes (Arnold et al., 2007 ; Hashizume et al., 2008 ; Cordier, 2012) ou épiphytes (Inacio et al., 2002 ; Inacio et al., 2010 ; Cordier, 2012). Les champignons endophytes qui colonisent les feuilles des plantes typiquement à bois appartiennent à la 3 éme classe des endophytes (Rodriguez et al., 2009 ; Almut Reiher, 2011), comme un groupe très diversifié de transmission horizontale, qui est restreint aux tissus de la partie aérienne et forme des infections localisées, le succès de l’établissement de ces infections peut être affecté par les caractéristiques de la distribution d’habitats, comme les radiations solaires et le microclimat ou alternativement par les limites de dispersion (Almut et Reiher, 2011). La majorité de ces champignons appartiennent aux Ascomycètes. Ces résultats confirment ceux de Selim et al. (2012) et Selvanathan et al. (2011), qui ont montré que la plupart des champignons endophytes appartiennent aux Ascomycètes et plus exactement aux champignons asexués. Bien que les Ascomycètes semblent dominer les assemblages endophytes (Higgins et al., 2007 ; Sanchez Marquez et al., 2007), des Basidiomycètes ont aussi été décrits (Crozier et al., 2006 ; Sanchez Marquez et al., 2007). L’incidence des endophytes Zygomycètes semble être très faible (Gonthier et al., 2006 ; Sanchez Marquez et al., 2007). Ces résultats confirment les nôtres, car seuls deux genres Rhizoctonia et Mucor isolés à partir de la feuille 88 Résultats et discussion du pistachier de l’Atlas, appartiennent respectivement aux phylums des Basidiomycètes et des Zygomycètes. Les genres dominants au niveau de la feuille du pistachier de l’Atlas sont Aspergillus et Epicoccum (Tableau 12) (Figure 54). Ces deux genres sont cosmopolites et peuvent se développer à des températures élevées. Les spores sèches d’Epicoccum sont facilement dispersées par le vent et les mouvements hygroscopiques. Certains isolats de champignons endophytes sont très faiblement répandus, tels que Mucor, Rhizoctonia, Nigrospora, Acremonium et Paraphaesphaeria recurvifoliae. Ces résultats confirment ceux de Toofane et Dalymamode (2002), qui ont montré que plusieurs taxons ont été récupérés de façon sporadique, suggérant qu’il est possible que les facteurs environnementaux ne soient pas propices à leur croissance ou que les endophytes plus compétitifs ont déjà atteint une colonisation importante du tissu de l’hôte. Les travaux de Gamboa et al. (2002) ont montré par contre que plusieurs microorganismes ne peuvent pas croitre en milieu de culture artificiel, et sont difficiles à identifier en culture. C’est le cas des nombreuses structures non identifiées recensées dans ce travail. La composition du microbiome peut dépendre de multiples facteurs, incluant la plante hôte, la densité de la végétation, la disponibilité en nutriments, les conditions environnementales et les interactions avec le microbiome externe, tels que les champignons du sol et les bactéries (Porras-Alfaro et Bayman, 2011). La richesse en champignons endophytes au niveau de la feuille du pistachier de l’Atlas est variable d’un sujet à un autre (Tableau 13), ce qui peut s’expliquer par la variation des facteurs environnementaux externes et les variations biologiques entre les sujets du pistachier de l’Atlas. On remarque des sujets jeunes, moyens et âgés et de sexes différents. Ces résultats confirment ceux de Bürgmann (2010), qui montrent que la composition des communautés microbiennes dépendrait essentiellement des conditions environnementales et Porras-Alfaro et Bayman (2012), qui ont montré que les différences de composition en endophytes entre les feuilles peuvent refléter les différences des facteurs environnementaux externes et aussi les différences biologiques entre les organes et les tissus. Chaque arbre possède une complexité génétique qui lui semble spécifique, cette dernière fait créer une diversité en champignons endophytes entre les différents sujets (Porras-Alfaro et Bayman, 2012). 89 Résultats et discussion Tableau 13 : abondance des genres de champignons endophytes pour les différents sujets du pistachier de l’Atlas de dayate Aiat (%). Genres de Champignons S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S1 Acremonium - 2.50 - - - 2.50 - - - - Alternaria - - 2.50 17.50 5 - - 2.50 - - Aspergillus 30 42.50 17.50 20 25 22.50 37.50 22.50 25 37.50 Aureobasidium 2.50 - - - 5 - - 5 2.50 2.50 Bipolaris 2.50 - 2.50 - 2.50 - - 2.50 - - Chaetomium 2.50 - - 2.50 - - - 2.50 - 2.50 Cladosporium - 2.50 2.50 5 15 2.50 7.50 7.50 - 2.50 Cordyceps - - 2.50 2.50 2.50 - - - - 2.50 Curvularia - - 2.50 - - - - 5 - 2.50 Epicoccum 20 25 52.50 42.50 27.50 30 5 12.50 17.50 47.50 Geotrichum - 2.50 5 2.50 - - - - 5 - Monilia 2.50 2.50 5 2.50 - - - 2.50 2.50 - Mucor - - - - - - 2.50 - - - Neoscytalidium - 2.50 - - - - - - - - Nigrospora - - - - - - 2.50 - - - 2.50 - 5 5 - - 2.50 - - 2.50 Phomopsis - 2.50 2.50 2.50 - 2.50 - - - - Rhizoctonia - - 2.50 2.50 - - - - - - Scedosporium - - 5 - - - - - - - Xylaria Paraphaesphaeria recurvifoliae 5 - - 5 - - 2.50 - - 2.50 2.50 - - - - - - - - SNI - 2.50 - 2.50 5 - - - 2.50 - Phoma - Les jeunes sujets présentent une importante diversité en champignons endophytes par rapport aux sujets moyens et âgés (Tableau 14). Cette différence de diversité peut être expliquée par la présence d’une canopée tout autour des jeunes sujets. Elle crée un microclimat très riche en humidité, favorisant l’augmentation de la richesse en champignons endophytes. Ces résultats concordent avec ceux de González et Tello (2011) et Carroll et Carroll (1978), qui montrent que la composition de la communauté endophyte peut être influencée par la végétation associée. Quand la canopée devient saturée par la pluie, le brouillard, la rosée ou l’humidité, il y a formation de larges gouttes sur les feuilles et sous les canopées. Les stades de survie des endophytes sont également présents sur la litière emprisonnée entre les branches (Mrié Criel et al., 2000). 90 Résultats et discussion Tableau 14: nombre de genres de champignons endophytes présents au niveau de la feuille du pistachier de l’Atlas par tranche d’âge. Sujets Jeunes Moyens Agés Nombres de genres recensés 21 9 16 Certains genres tels que Acremonium, Neoscytalidium, Paraphaesphaeria recurvifoliae, Phomopsis, Scedosporium et Rhizoctonia, sont trouvés seulement au niveau des feuilles des jeunes sujets du pistachier de l’Atlas de dayate Aiat (Tableau 13). Lee et al. (2005) ont montré que le champignon Paraphaesphaeria recurvifoliae exige des conditions d’humidité pour qu’il apparaisse. Ceci peut aussi s’expliquer aussi par la nécessité du contrôle biologique des ravageurs, car l’aspect touffu crée des conditions adéquates aux attaques par des agents biotiques. Prestidje et al. (1994) montrent que le genre Acremonium permet un contrôle biologique, car il affecte toutes les populations de ravageurs. Selvanathan et al. (2011) montrent que le genre Phomopsis est considéré comme une source de production de métabolites bioactifs. Le champignon endophyte Phomopsis liquidambari peut produire des enzymes pour dégrader les acides phénoliques allélochimiques libérés par la décomposition du feuillage et qui ont des impacts négatifs sur la croissance des plantes et des microbes dans le sol (Chen et al., 2011 ; Li et al., 2012). Neoscytalidium montre aussi une activité antifongique très élevée (Abdel-Motaal et al., 2010). De nombreux producteurs de sidérophores par les endophytes de différentes plantes ont été signalés, contributifs de la croissance végétale dans les environnements à faible nutrition (Fitter et al., 2011). Ces sidérophores, chélateurs du fer à faible masse moléculaire, augmentent l'absorption dans les habitats pauvres et améliorent les performances d'hôte dans une variété de contextes (Harman et al., 2004 ; Harman, 2000-2006 ; Hamilton et al., 2012). Le genre Scedosporium est connu pour ses sidérophores qui sont des molécules chélatrices de fer. Ces dernières sont connues aussi pour leur activité antioxydante (Bertrand, 2009). L’association de jeunes sujets à ce champignon peut améliorer leur approvisionnement en fer, oligoéléments très important pour la croissance. Certains champignons endophytes comme Alternaria alternata, sont identifiées comme agents de lutte biologique prometteurs contre les pathologies spécifiques tel que le mildiou de la vigne causé par Plasmopara viticola (Falk et al., 1996 ; Bakshi et al., 2001 ; González et Tello, 2011). Epicoccum nigrum représente un autre agent de lutte biologique prometteur, 91 Résultats et discussion actuellement en cours de développement dans le commerce, en raison de sa capacité à produire des métabolites secondaires avec une activité antibiotique (González et Tello, 2011). Plusieurs souches appartenant aux genres Acremonium, Phoma (Phoma glomerata), Chaetomium (Chaetomium globosum) ou Aureobasidium (Aureobasidium pullulans) ont été signalées présentant une activité antagoniste contre certains pathogènes. Les auteurs ont constaté que les communautés d’endophytes peuvent constituer une source de nouveaux agents fongiques de lutte biologique utiles pour contrôler les maladies, en particulier celles qui sont associées au déclin de jeunes plants produits dans les pépinières (El-Tarabily et Sivasithamparam, 2006 ; González et Tello, 2011). Tous ces résultats concordent avec ceux obtenus à partir de la feuille du pistachier de l’Atlas des jeunes sujets. Cette diversité en champignons endophytes au niveau des feuilles de jeunes sujets du pistachier de l’Atlas donne un important pouvoir adaptatif à la plante par rapport aux variations climatiques récurrentes. Ce pouvoir adaptatif facilite le bon déroulement de la croissance de jeunes sujets. Ces résultats confirment ceux obtenus par Rodriguez et al. (2009) et Waquas et al. (2012), qui ont montré que les champignons endophytes aident la plante hôte à répondre aux variations environnementales, par la régulation de la croissance de la plante et le développement, utilisant des substances bioactives. Le rôle des endophytes dans la décomposition des litières est également important, mais peu d’études ont été réalisées sur cet aspect écologique (Purahong et Hyde, 2011). Phomopsis et Xylaria en tant qu’endophytes sont en mesure d’exclure les Basidiomycètes saprophytes secondaires. Pour cela, les champignons endophytes infectent les brindilles saines et la litière ligneuse, avant qu’elles ne tombent au sol. Ce sont donc des colonisateurs primaires, ils sont en concurrence pour exclure d’autres saprophytes. Certains champignons endophytes sur brindilles de la litière sont des colonisateurs primaires dominants, mais sont remplacés par des saprophytes secondaires lors de la décomposition (Dowson et al., 1998 a et b ; Purahong et Hyde, 2011). Ceci peut avoir une grande influence sur les taux de décomposition de la litière. Mais il est peu probable que tous les champignons endophytes se développent en saprophytes (Purahong et Hyde, 2011), du fait de leur relation intime avec leur plante hôte. Certaines études suggèrent que les champignons endophytes deviennent saprophytes, lorsque les feuilles des plantes sont sénescentes (Hudson, 1968 ; Promputha et al., 2007 ; Purahong et Hyde, 2011). Tous ces résultats concordent avec les notre et montrent qu’une colonisation des 92 Résultats et discussion feuilles des sujets jeunes par des champignons endophytes est indispensable, parce qu’elle assure une décomposition plus importante de la litière. Les champignons endophytes peuvent lutter contre les variations des facteurs abiotiques tels que la sécheresse. Kannadan et Rudgers (2008) et Porras-Alfaro et Bayman, (2011) ont montré que les communautés endophytes affectent la réponse de la plante aux aspects différents de changements climatiques. L’association des plantes avec des endophytes peut améliorer les effets négatifs de la sécheresse. Les plantes du Cacao colonisées par l’endophyte Trichoderma bamatum montrent une expression de gènes dans des conditions de sécheresse (McLellan et al., 2007 ; Porras-Alfaro et Bayman, 2011). Ces résultats peuvent expliquer l’importante diversité en champignons endophytes au niveau des feuilles des sujets âgés du pistachier de l’Atlas de dayate Aiat, et leur exposition directe à des variations environnementales telles les UV. En effet, nous remarquons que beaucoup de champignons dont les hyphes sont mélanisées sont recensés au niveau des feuilles des sujets âgés. Pour essayer de comprendre les différentes interactions qui existent entre les genres de mycoendophytes recensés au niveau des feuilles du pistachier de l’Atlas, nous avons fait une matrice de corrélation (Tableau 15). Cette dernière donne des coefficients de corrélation entre les genres de champignons endophytes pris deux à deux. Parmi les corrélations significatives certaines sont positives (ce qui signifie que les variables varient dans le même sens), d’autres sont négatives (ce qui signifie que les variables varient dans des sens opposés). 93 dium Résultats et discussion Bipolaris Epicoccum Xylaria Monilia Chaetomium Phoma Phomopsis Neoscytalidium Acremonium Cladosporium Paraphaesphaeria Geotrichum Scedosporium Rhizoctonia Cordyceps Curvularia -0,43 -0,30 0,11 -0,41 -0,05 -0,25 -0,24 0,60 0,28 -0,10 0,60 -0,32 -0,43 -0,57 -0,30 -0,22 0,57 -0,27 -0,19 -0,18 0,31 -0,48 -0,73 -0,30 -0,45 0,48 -0,30 -0,35 -0,30 -0,45 0,05 0,42 1 0,01 -0,10 0,38 0,17 0,05 -0,25 -0,27 -0,41 0,33 -0,27 -0,10 0,41 0,10 0,17 0,43 0,01 1 0,08 0,28 0,15 0,58 0,53 -0,07 -0,02 -0,18 -0,07 0,34 0,56 0,67 0,81 0,13 -0,10 0,08 1 -0,04 0,66 0,61 -0,10 -0,25 -0,38 -0,20 -0,25 -0,25 -0,25 0,25 0,15 -0,26 0,38 0,28 -0,04 1 0,06 0,42 0,38 0,16 -0,16 -0,42 0,16 0,74 0,68 0,62 0,06 0,28 0,17 0,15 0,66 0,06 1 0,31 -0,25 -0,27 -0,41 -0,14 -0,27 -0,36 -0,27 0,10 0,17 0,43 0,05 0,58 0,61 0,42 0,31 1 0,31 -0,30 -0,45 -0,19 -0,30 0,29 0,55 0,83 0,57 0,04 -0,25 0,53 -0,10 0,38 -0,25 0,31 1 0,41 0,61 -0,26 0,41 0,41 0,41 0,61 0,17 -0,18 -0,27 -0,07 -0,25 0,16 -0,27 -0,30 0,41 1 0,67 -0,15 1,00 0,17 -0,11 -0,17 -0,27 -0,20 -0,41 -0,02 -0,38 -0,16 -0,41 -0,45 0,61 0,67 1 -0,23 0,67 -0,06 -0,17 -0,25 -0,41 -0,30 0,33 -0,18 -0,20 -0,42 -0,14 -0,19 -0,26 -0,15 -0,23 1 -0,15 -0,42 -0,15 -0,09 0,33 0,07 -0,27 -0,07 -0,25 0,16 -0,27 -0,30 0,41 1,00 0,67 -0,15 1 0,17 -0,11 -0,17 -0,27 -0,20 -0,10 0,34 -0,25 0,74 -0,36 0,29 0,41 0,17 -0,06 -0,42 0,17 1 0,58 0,56 0,15 -0,08 0,41 0,56 -0,25 0,68 -0,27 0,55 0,41 -0,11 -0,17 -0,15 -0,11 0,58 1 0,67 0,41 0,30 0,10 0,67 0,25 0,62 0,10 0,83 0,61 -0,17 -0,25 -0,09 -0,17 0,56 0,67 1 0,61 0,08 0,17 0,81 0,15 0,06 0,17 0,57 0,17 -0,27 -0,41 0,33 -0,27 0,15 0,41 0,61 1 0,12 0,43 0,13 -0,26 0,28 0,43 0,04 -0,18 -0,20 -0,30 0,07 -0,20 -0,08 0,30 0,08 0,12 1 -0,04 0,36 0,45 0,17 0,35 0,51 0,35 -0,18 -0,27 0,29 -0,18 0,14 -0,02 0,70 0,55 -0,10 -0,27 -0,52 0,17 -0,36 -0,27 0,13 -0,27 -0,11 -0,17 0,23 -0,11 -0,25 -0,11 -0,17 -0,27 -0,20 -0,27 -0,52 0,17 -0,36 -0,27 0,13 -0,27 -0,11 -0,17 0,23 -0,11 -0,25 -0,11 -0,17 -0,27 -0,20 Tableau 15: matrice des corrélations par l’A.C.P. 94 Résultats et discussion Des corrélations positives et fortes sont notées comme celles entre Paraphaesphaeria recurvifoliae et Neoscytalidium (1) et Nigrospora et Mucor (1). D’autres sont positives mais, moins fortes telles celles entre Rhizochtonia et Phoma (0.83), Cordyceps et Epicoccum (0.81), Geotrichum et Monila (0.74), Alternaria et Rhizoctonia (0.70), Scedosporium et Monlia (0.68), Rhizoctonia et Epicoccum (0.67), Paraphaesphaeria recurvifoliae et Acremonium (0.67), Neoscytalidium et Acremonium (0.67), Rhizoctonia et Scedosporium (0.67), Scedosporium et Monilia (0.68), Chaetomium et Xylaria (0.66). Certaines corrélations sont négatives comme celles entre Phomopsis et Aureobasidium (-0.73). Une forte corrélation positive entre les deux genres de champignons endophytes peut s’expliquer par la nécessité de ces deux champignons d’exister ensemble pour accomplir leur rôle convenablement, car l’absence de l’un limite la présence de l’autre (c’est une synergie). Cette relation intime indissociable entre les deux genres de champignons permet de générer des propriétés avantageuses aux deux genres de champignons et à la plante. Les corrélations positives moins fortes, peuvent être expliquées par une interaction de type compétitif, ce qui confirme le résultat de Vivas et al. (1997), qui montrent que le développement simultané de plusieurs champignons sur un milieu entièrement colonisé provoque des phénomènes de compétition. Cependant de nombreuses études ont rapporté des interactions négatives. Cela peut s’expliquer par la concurrence entre les champignons endophytes saprophytes secondaires (Dowson et al., 1988 a et b ; Purahong et Hyde., 2011). Le pouvoir compétitif des champignons pourra faciliter la présence d’un genre donné. En fait, la corrélation négative entre certains champignons endophytes peut être expliquée par la forte relation antagoniste. Certains champignons limitent la présence d’autres champignons sur le même substrat. Une analyse en composantes principales a aussi été réalisée. Le plan 1-2 de l’analyse en composantes principales (ACP) explique 49% du phénomène avec pour l’axe 1, 27% et pour l’axe 2, 21% de l’inertie totale. Selon l’axe 1 ; trois groupes s’individualisent (Figure 55). Le premier groupe A inclut les individus 3 et 4 dont les feuilles montrent une dominance d’Epicoccum. Le deuxième groupe B englobe les sujets 1, 5, 6, 8, 9 et 10. Ces derniers montrent une codominance entre Epicoccum et Aspergillus. Le troisième groupe C 95 Résultats et discussion inclut les sujets 2 et 7, caractérisés par une dominance d’Aspergillus au niveau de leurs feuilles. Selon l’axe 2 ; le deuxième groupe contient deux sous groupes, le premier inclut les sujets 6 et 9 et le second inclut les sujets 1, 5, 8 et 10. Les deux sous-groupes sont fonction des interactions entre Aspergillus et Epicoccum d’un coté et les autres mycoendophytes recensés dans ce travail. 96 Résultats et discussion axes F1 et F2 : 49% 4 S2 3 C B 2 Neoscytalidium Paraphaesphaeria S6 Acremonium axe F2 (21%) 1 Aspergillus 0 S7 S9 Mucor Nigrospora Cladosporium Aureobasidium -1 S1 S10 A Phomopsis Geotrichum Monilia Epicoccum Cordyceps Scedosporium PhomaRhizoctonia Xylaria Alternaria Curvularia Bipolaris Chaetomium S3 S4 S5 S8 -2 -3 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 axe F1 (27%) Figure 55 : représentations des genres de champignons endophytes et des sujets de Pistacia atlantica sur A.C.P. 97 Résultats et discussion Les groupes formés comportent un mélange de sujets jeunes, moyens et âgés. Ce n’est pas le cas du premier groupe qui englobe les sujets jeunes 3 et 4. Ceci peut s’expliquer par le rôle important joué par les champignons endophytes, notamment dans la croissance, le développement et le renforcement des capacités de défense contre les stress abiotiques et biotiques des jeunes sujets, et surtout pour ceux qui sont physiologiquement immatures. Ce qui est le cas des sujets 3 et 4. Ces résultats concordent avec ceux de Lv et al. (2010) qui montrent que les champignons endophytes ont une hyperdiversité et peuvent jouer un rôle important dans l’aptitude de leurs plantes hôtes. L’observation des prélèvements de champignons endophytes réalisés à partir des milieux de culture au microscope optique, a permis de montrer l’existence de plusieurs genres sur la même lame (Figure 56). Selon la théorie de l’effet mosaïque, de nombreux endophytes peuvent protéger les plantes hôtes en créant une composition chimique hétérogène au sein et entre les organes de la plante qui sont uniformes (Kursari et al., 2012). Ces résultats peuvent expliquer la répartition différentielle des champignons endophytes chez les feuilles du pistachier de l’Atlas. 3- Colonisation des différents tissus de la feuille par les mycoendophytes Les observations au microscope optique sur les feuilles de pistachier de l’Atlas colorées au bleu Trypan révèlent une colonisation inter et intracellulaire des différents tissus de la feuille par les champignons endophytes. Les observations au microscope optique révèlent la présence des hyphes mycéliennes pigmentées au niveau des espaces inter et intracellulaires des cellules épidermiques des feuilles de Pistacia atlantica (Figure 57). Ces résultats confirment ceux de Sun et al. (2011) et El-Nagerabi et al. (2013), qui montrent la présence des mêmes structures au niveau des feuilles du jujubier de Oman (El Jabel El Akhdar), sachant que le mycélium pigmenté et foncé augmente la résistance de l’hôte aux microbes et aux enzymes hydrolytiques. Ces résultats concordent avec ceux de BernadiWenzel et al. (2010) et Orlandelli et al. (2012), qui ont montré que les champignons b endophytes peuvent former des associations à partir d’une colonisation inter et intracellulaire des tissus de la plante hôte. 98 Résultats et discussion Les espaces intercellulaires sont formés par la juxtaposition de trois à quatre cellules et la dissolution de la lamelle médiane. Ils sont très différents dans les feuilles et les tiges, par opposition aux racines. Ils constituent une partie significative de la plante (Kuldan et Bacon, 2008 ; Garcia et al., 2012), 6% des tissus de la feuille se composent d’espaces intercellulaires (Tetlow et Farrar, 1986 ; Kuldan et Bacon, 2008). L’espace intercellulaire est riche en substances nécessaires pour soutenir la croissance des champignons endophytes. De plus, les concentrations de sucres signalées dans l’apoplasme non endophytique sont suffisantes pour soutenir la croissance fongique (Ferrar et Ferrar, 1986 ; Kuldan et Bacon, 2008). Les stomates présentent une répartition aléatoire sur toute la surface foliaire (Figure 58) et sont observés de part et d’autre au niveau de la nervure principale de la feuille (Figure 59). Ces résultats concordent avec ceux de Belhadj (2007), où dans une étude des épidermes de la feuille de huit populations du pistachier de l’Atlas, les stomates sont répartis aléatoirement, sur la surface abaxiale, mais sur la surface adaxiale et sont localisés au niveau de la nervure. L’introduction des hyphes de mycoendophytes peut se faire directement dans l’épiderme intact par les appressoriums, ou à travers des stomates de la feuille intacte. Elle peut être facilitée par des lésions sur les tissus de la plante causés par des dommages mécaniques ou les herbivores (Almut Reiher, 2011). Une présence de points bleus au niveau des ostioles, cellules de garde et espaces intercellulaires (entre les cellules épidermiques et les cellules de garde) de la feuille de Pistacia atlantica de dayete Aiat a été observée (Figure 60). Ces résultats confirment les résultats de Harvey et al. (1975), qui montrent que les hyphes les plus larges peuvent être intercellulaires et peuvent être observées entre les couches de cellules. La présence de champignons endophytes au niveau des stomates semble importante du fait de la grande importance de ces derniers. Les champignons endophytes, peuvent altérer les niveaux hormonaux qui contrôlent le comportement stomatique et l’ajustement osmotique (Malinowski et Belesky, 2000 ; Mandyam et Jumpponen, 2005 ; Bezzerra et al., 2013). L’observation au microscope optique des feuilles de Pistacia atlantica a permis de montrer la présence des trichomes glandulaires (Figure 61) et tecteurs (Figure 62) sur toute la 99 Résultats et discussion surface foliaire et les trichomes tecteurs et sont aussi au niveau de l’extrémité des feuilles (Figure 63). Ces résultats confirment les résultats de Kadi-Bennane (2004), dont l’observation au microscope photonique concernant l’architecture tissulaire a permis de noter la présence d’un nombre important de poils sur toutes les faces des feuilles des différentes populations de Pistacia atlantica Desf, notamment au niveau de la population de Messaad et de la Taissa. Dans ce cas, la face inférieure est largement recouverte de deux types de poils. Des poils tecteurs simples unicellulaires trouvés généralement sur les bordures et au centre des feuilles ; ce type montre une section subcirculaire ; il est généralement long et effilé et parfois court et érigé. Les poils glanduleux sont courts et présentent une tête pluricellulaire à pied unisérié. Alyafi (1978) rapporte la présence de poils glandulaires pluricellulaires chez toutes les provenances de Pistacia atlantica, parmi lesquelles figuraient deux provenances algériennes. Dans une étude similaire faite par Belhadj et al. (2007), ces auteurs notent l’existence de poils glandulaires chez cette espèce. Les deux surfaces foliaires abaxiale et adaxiale sont recouvertes avec des trichomes dans tous les sites étudiés. Les trichomes glandulaires sont distribués sur la totalité des surfaces foliaires. Les trichomes tecteurs sont au niveau de la nervure principale. Ils sont irrégulièrement distribués tout au long des nervures, par contre ils sont situés sur les marges foliaires. La densité des trichomes est une caractéristique influencée par les conditions écologiques. L’altitude et les valeurs positives des températures minimales peuvent jouer un rôle important dans leur répartition et leur densité sur les feuilles (Belhadj, 2007). Les feuilles de Pistacia atlantica contiennent 49 composés identifiés. Parmi ceux-ci 22 sont des monoterpènes (8 hydrocarbones et 14 oxygénes) et 25 sont des sesquiterpènes (16 hydrocarbones et 9 oxygènes), les terpènes isolés sont le spathulenol, α pinene, verbenone, β pinene, germacrene, camphene, δ-cadinene et le β copaene (Ait Said et al., 2011). Raktoniariania et al. (2007) montrent que les plantes productrices de terpènes comme Sequoia sempervirens développent une activité différentielle sur la croissance des endophytes foliaires. Les endophytes sont capables de produire des composés bioactifs à leurs plantes hôtes (Tan et Zou, 2001 ; Ramdanis et al., 2012). Les produits naturels des champignons endophytes ont un large spectre d’activité biologique. Ils peuvent être regroupés en plusieurs catégories. Ce sont des alcaloïdes, stéroïdes, terpénoïdes, isocoumarine, quinones, phénylpropanoides et lignines, phénols et acides phénoliques, métabolites aliphatiques, 100 Résultats et discussion lactone (Zhang et al., 2006 ; Ramdanis et al., 2012), benzopyranones, flavonoïdes, tétratones et xanthones (Tan et Zou, 2001 ; Sunitha et al., 2013). Elles font une large utilité aux applications industrielles, antibiotiques, immunosuppressives, antiparasitaires, antioxydants et agents anticancéreux (Gunatilaka, 2006 ; Sunitha et al., 2013). Les terpènes sont l’une des familles les plus diverses de composés chimiques découverts dans le règne des plantes, ils exercent des rôles majeurs dans la défense et la communication de la plante. Dans la réponse aux conditions de sécheresse, des changements significatifs des émissions de terpènes sont montrés dans de nombreuses espèces méditerranéennes (Ait Said et al., 2011). Les monoterpènes et les sesquiterpènes ont un rôle dans la protection des plantes des dommages liés à la température (Peñuelas et Llusiá, 2002 ; Loreto et al., 2004 ; Llusiã et al., 2005 ; Peñuelas et al., 2005 ; Ait Said et al., 2011). Les terpènes sont reconnus comme étant relativement stables, aussi comme précurseurs de nombreux composants potentiels physiologiques, incluant les régulateurs de croissance (Ait Saϊd et al., 2011). Une autre propriété de ces composés est leur grande variabilité dans le temps ; ils dépendent de la distribution géographique des espèces, comme montrée par plusieurs études en littérature (Hillig, 2004 ; Ait Saϊd et al., 2011). Les concentrations en terpènes augmentent avec le degré d’aridité. La plus grande quantité de Spathulénol découverte pour les feuilles du pistachier de l’Atlas récoltées dans les stations arides peut être interprétée comme un mécanisme de défense contre les effets des détritivores, des interactions biotiques et de la lumière UV en été. L’augmentation de monoterpènes pourra être considérée comme un régulateur, qui protège la machine photosynthétique de l’oxydation et des dommages thermiques (Ait Saϊd et al., 2011). La défense chimique contre les herbivores peut être associée avec différents types de trichomes, les trichomes glandulaires contiennent parfois des métabolites de défense toxiques (Steinite et Levinsh, 2003). Ils sont responsables d’une part importante de la chimie secondaire d’une plante (Glas et al., 2012). Les trichomes glandulaires sont l’une des structures les plus communes qui produisent des huiles essentielles chez les plantes. Les taux les plus élèves en terpènes ont été montrés chez la population de Pistacia atlantica de Béchar et peuvent être reliés à la forte densité des trichomes glandulaires dans ces populations. La synthèse des terpènes au niveau des trichomes glandulaires peut expliquer la présence de champignons endophytes au niveau de ces derniers chez Pistacia atlantica de dayate Aiat (Ait Said et al., 2011) (Figure 64). 101 Résultats et discussion Figure 64 : observation microscopique d’un trichome glandulaire (tg) colonisé par des champignons endophytes et d’un trichome tecteur (tt) non colonisé par des champignons endophytes au niveau de la feuille du pistachier de l’Atlas (X 400). L’absence des champignons endophytes au niveau des trichomes tecteurs (Figure 64) peut être expliquée par l’absence de synthèse de métabolites de défense au niveau des ces structures. En fait, les trichomes tecteurs assurent beaucoup plus un rôle mécanique contre les facteurs abiotiques et biotiques (Szyndler et al., 2013). La richesse en champignons endophytes des feuilles est corrélée avec la teneur en eau, le ratio de la matière fraiche/la matière sèche et le poids spécifique de polyphénols de la feuille (Sanchez-Azofeira et al., 2012). Les communautés d’endophytes varient selon les espèces de plantes hôtes et le type de l’ontogenèse de l’organe végétal. La richesse en endophyte augmente au cours du développement de la feuille (Arnold, 2005 ; Arnold et al., 2003 ; Sanchez-Azofeira et al., 2012). Ceci est probablement due aux changements dans les propriétés structurales (cire, fibres, espace d’air et de biomasse) (Epinosa Garcia et Laugenheim, 1990 ; Sanchez-Azofeira et al., 2012) et des propriétés chimiques (nutriments, composés secondaires), qui évoluent avec le cycle de vie des feuilles (Arnold, 2005 ; Epinosa Garcia et Langenheim, 1990 ; Sanchez-Azofeira et al., 2012). Le contenu en humidité des tissus peut affecter la croissance, la fréquence de l’émergence endophytique, mais aussi l’interaction avec les symbiotes endophytiques (Sanchez-Azofeira et al., 2012). Les observations microscopiques des feuilles du pistachier de l’Atlas montrent l’existence de champignons endophytes à l’intérieur et entre les cellules du parenchyme (Figure 65). Les endophytes sont généralement endémiques dans le parenchyme (SanchezAzofeira et al., 2012). Ces résultats confirment les résultats de Harvey et al. (1975), qui montrent que les hyphes les plus larges peuvent également être observés entre le parenchyme palissadique et spongieux. Garcia et al. (2012) observent un stock d’hyphes à la surface des cellules du parenchyme palissadique de la feuille de Citrus limon avec un microscope électronique à balayage. La colonisation du mésophylle foliaire par des hyphes fongiques montre des hyphes entre le parenchyme palissadique et lacuneux, colonisant le tissu vasculaire. Il est possible de vérifier la colonisation fongique du parenchyme foliaire par une incubation des coupes transversales des feuilles de Sapindus saponaria avec une préincubation (incubation des feuilles dans le milieu PDA pendant 24h) et l’observation d’une 102 Résultats et discussion forte coloration après l’incubation, indiquant la présence d’endophytes, comme montré par Bernadi-Wenzel et al. (2010), qui utilisent la microscopie optique et électronique à balayage et observent les champignons endophytes qui colonisent les espaces inter et intracellulaires dans les feuilles (Garcia et al., 2012). Les observations microscopiques des feuilles du pistachier de l’Atlas ont permis de noter aussi la présence de champignons endophytes au niveau des tissus conducteurs (phloème et xylème) de la nervure principale (Figure 66), des nervures secondaires (66) et du rachis (67). Les endophytes sont aussi endémiques dans le xylème et le phloème (Sanchez-Azofeira et al., 2012). Les endophytes colonisent aussi bien les espaces intercellulaires que les cellules du xylème et du phloème (Garcia et al., 2012). Les petites hyphes sont observées sous la cuticule et entre les cellules épidermiques, les hyphes plus longues sont dans tous les tissus incluant les épidermes, le mésophylle (parenchyme palissadique et spongieux) et les tissus vasculaires (Harvey et al., 1975). Ces résultats peuvent expliquer la présence d’une forte coloration en bleu de la nervure principale (Figure 68), de certaines nervures secondaires (Figure 69), du rachis (Figure 70) et de plages au niveau des espaces internervaires (aréoles) (Figure 71) des feuilles de Pistacia atlantica. Le tableau 16 représente un tableau récapulatif concernant tous les compartiments de la feuille du pistachier de l’Atlas colonisées par des champignons endophytes. Tableau 16 : type de colonisation par des champignons endophytes au niveau des différents tissus de la feuille de Pistacia atlantica. Type de tissus Epiderme Stomates Trichomes Parenchyme Vaisseaux palissadique conducteurs Type de colonisation Intercellulaire + + - + + Intracellulaire + + + + + + : présence de champignons endophytes - : absence de champignons endophytes 103 Conclusion générale Conclusion générale La présente étude a pour objectif une approche des mycoendophytes foliaires de Pistacia atlantica de dayate Aiat, dans la région de Timzerth, wilaya de Laghouat. L’échantillonnage a concerné dix arbres de différents âges (jeunes, moyens et âgés). Vingt feuilles de chaque arbre ont été prélevées et conservées au frais, avant de les mettre en culture afin de montrer la présence et la diversité en champignons endophytes. D’autres feuilles ont été colorées au bleu trypan selon le protocole de coloration de Phillips et Hayman (1970) dans le même but. Une culture des fragments de feuilles (folioles et rachis) de pistachier de l’Atlas sur un milieu PDA a été faite, suivie d’une isolation et d’une identification morphologique (macroscopique et microscopique) de certains genres de champignons endophytes. Nos résultats ont concerné d’abord l’estimation de la fréquence de colonisation (FC%) par les champignons endophytes. Ils montrent que cette espèce possède une forte fréquence de colonisation en champignons endophytes. Ceci peut s’expliquer par la période d’échantillonnage. En effet, le printemps est la saison la plus propice à l’installation et au développement des mycoendophytes. Une différence hautement significative des fréquences de colonisation par des champignons endophytes entre les feuilles de différents sujets échantillonnés a été déterminée. Si nous considérons les arbres étudiés par tranche d’âge, nous pouvons remarquer que les sujets les plus jeunes montrent les fréquences de colonisation les plus élevées et que les différences entre les sujets sont significatives. Les sujets d’âge moyen ont les fréquences de colonisation les plus basses. Les différences sont significatives. Quant aux sujets âgés, les fréquences de colonisation sont intermédiaires et les différences entre les arbres ne sont pas significatives. Le recours du pistachier de l’Atlas à une plante nurse, à savoir le jujubier pour sa croissance, semble expliquer ces différences. En effet, les sujets les plus jeunes sont presque complètement entourés par cette espèce facilitatrice, qui peut constituer une réserve de propagules fongiques. De plus, le microclimat créé par l’association jujubier – pistachier est plus favorable au développement des différents champignons, de part l’humidité qu’on peut y retrouver. Les sujets âgés sont affranchis de la plante nurse. Pour les sujets moyens, l’arbre a grandi et le jujubier n’entoure encore que le tronc des arbres. La détermination de certains prélèvements sous microscope optique montre une importante diversité en champignons endophytes. 21 genres et quelques espèces de champignons endophytes ont été déterminés au niveau des feuilles de pistachier de l’Atlas. Les jeunes sujets ont une diversité importante (21 genres), les sujets âgés ont une diversité 121 Conclusion générale moyenne (16 genres). Par contre, les sujets moyens présentent la diversité la plus faible au niveau de leurs feuilles (9 genres seulement). La majorité des genres recensés sont cosmopolites. Les genres dominants sont Aspergillus ou Epicoccum. Chez certains sujets, nous assistons à une co-dominance des deux genres de champignons. La présence des genres peu abondants dépend du genre dominant. Il semble que chaque genre se caractérise par son propre cortège fongique. En effet, une matrice de corrélation a montré les différentes interactions qui existent entre les différents genres de champignons recensés. Certains genres montrent des interactions synergiques, d’autres sont antagonistes. L’observation microscopique des feuilles de Pistacia atlantica Desf. colorées au bleu Trypan montre la présence de champignons endophytes au niveau de presque tous les compartiments de la feuille (cellules épidermiques, stomates, trichomes glandulaires, parenchyme palissadique et tissus conducteurs) de tous les sujets échantillonnés. Ce premier travail quoi que important doit être compléter et enrichi par des études futures plus approfondies englobant une identification précise des espèces de mycoendophytes. Il n’en demeure pas moins que cette étude doit être reconduite sur plusieurs saisons et sur plusieurs années, afin de vérifier l’existence d’autres genres de champignons endophytes. Elle doit être aussi étendue à d’autres populations de pistachier de l’Atlas présentes dans un bioclimat aride, mais aussi dans d’autres bioclimats où nous pouvons recenser cette essence. Vu le rôle important que joue les champignons endophytes dans la résistance aux variations climatiques, il est important d’étudier l’interaction existant entre la plante et ces champignons et les avantages que peuvent offrir ces derniers à leurs hôtes. En effet, il serait intéressant de procéder à l’extraction des métabolites secondaires synthétisés par ces microorganismes. Ces derniers peuvent satisfaire les besoins de l’industrie pharmaceutique et protéger ainsi cette essence si précieuse, dans ces régions si fragiles. 122 Références bibliographiques Références Bibliographiques 1- Abdel-Motaal, F.F., Nassar, M.S.M., El-Zayat, S.A., El-Sayed, M.A., et Ito, S.0., 2010. Antifungal activity of endophytic fungi isolated from egyptian Henbane (Hyoscyamus muticus). Pak. J. 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Les observations sous microscope optique des feuilles de Pistacia atlantica colorées au bleu Trypan montrent la présence de différents champignons endophytes au niveau de tous les compartiments de la feuille. Les différences apparaissent au niveau des couleurs des filaments mycéliens. Des fragments de folioles et de rachis sont mis en culture sur un milieu PDA. Les champignons endophytes présents au niveau des feuilles du pistachier de l’Atlas présentent une fréquence de colonisation importante, elle est de 68,7%, avec respectivement 71,3% pour les folioles et 61,7% pour les rachis. Ce fort taux de colonisation peut être expliqué par la période d’échantillonnage (printemps). Cette étude a permis aussi d’isoler et d’identifier plusieurs champignons endophytes. Au total 21 genres et 3 espèces des champignons endophytes sont isolés. En se basant sur des traits macroscopiques et microscopiques, les champignons identifiés comme Acremonium, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Bipolaris, Chaetomium, Cladosporium, Cordyceps, Curvularia, Epicoccum, Geotrichum, Monilia, Mucor, Neoscytalidium, Nigrospora, Paraphaesphaeria, Phomopsis, Phoma, Rhizoctonia, Scedosporium et Xylaria. Certains champignons ont été identifiés au niveau spécifique. C’est le cas d’Aspergillus nidulans, Cladosporium herbarum et Paraphaesphaeria recurvifoliae. Plusieurs formes de mycéliums stériles sont notées. Les résultats de cette étude suggèrent que le pistachier de l’Atlas de dayate Aiat est un hotspot de biodiversité en mycoendophytes foliaires. Ces derniers sont considérés comme une source importante de métabolites secondaires. Mot- clés : mycoendophytes foliaires, pistachier de l’Atlas, aridité, Timzerth, Laghouat, Algérie. Abstract- In Algeria, the pistachio Atlas is the tree of choice for steppe areas. It has an ecological, economic and medicinal importance. It shows a great adaptation to aridity. The purpose of this work is to show the presence, but also the important diversity of mycoendophytes in leaves of pistachio Atlas. We have chosen for this the population of dayate Aiat, located in the region of Timzerth, wilaya of Laghouat. The mycoendophytes are an integral part of the plant Microbiome. They infect plants without causing any visible symptoms of the disease. The relationship is mutual and gives the host a lot of benefits. Observations under an optical microscope leaves of Pistacia atlantica stained with trypan blue showed the presence of different endophytic fungi at all compartiments of the leave. The differences appear in the colors of hyphae. The fragments of leaves and spine are cultured on a PDA medium. The endophytic fungi present in the leaves of pistachio Atlas have a frequency of colonization important, it is 68.7%, with 71.3% for the leaves and 61.7% for the spine. This high rate of colonization may be explained by the sampling period (spring). This study also isolate and identify several endophytic fungi. A total of 21 genera and 3 species of endophytic fungi were isolated. Based on the macroscopic and microscopic features, fungi identified as Acremonium, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Bipolaris, Chaetomium, Cladosporium, Cordyceps, Curvularia, Epicoccum, Geotrichum, Monilia, Mucor, Neoscytalidium, Nigrospora, Paraphaesphaeria, Phomopsis, Phoma, Rhizoctonia, Scedosporium and Xylaria. Some fungi were identified to species level. This is the case of Aspergillus nidulans, Cladosporium herbarum and Paraphaesphaeria recurvifoliae. Several forms of sterile mycelia are noted. The results of this study suggest that the pistachio Atlas of dayate Aiat is a biodiversity hotspot in mycoendophytes leaf. They are considered an important source of secondary metabolites. Key-word : mycoendophytes leaf, pistachio Atlas, aridity, Timzerth, Laghouat, Algeria.
