1/6 Bioch.cours Enzymologie – Neel. Biochimie. Enzymologie. 1

Bioch.cours
Enzymologie – Neel.
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Biochimie.
Enzymologie.
1) Une nécessité : le catalyseur – enzyme :
les réactions chimiques sont régit par la loi d’action de masse :
A+B↔C+D
Keq =
[C].[D]
[A].[B]
Exemple : 2 CO2 ↔ 2 CO + O2.
Cependant, les réactions sont très lentes et la vie serait impossible sans la présence de
catalyseurs.
Les catalyseurs :
Ils diminuent l’énergie d’activation
et augmentent la vitesse de réaction.
Mais
ils
n’apparaissent
pas
Energie
libre.
Energie
d’activation sans
catalyseur.
dans
l’équation.
Avec
catalyseur.
Etat initial.
Dans 99% des cas, se sont des
protéines = des enzymes (♀). En effet
quelques
ARN
peuvent
être
ΔG de la
réaction
globale.
Etat final.
des
catalyseurs. En général ils catalysent
une réaction spécifique.
1) Nomination des enzymes :
En général, on utilise le suffixe –ase. Si l’enzyme a une fonction spéciale :
Graisse.  Lipase.
Amidon.  Amylase.
Oxydation.  Oxydase.
Déshydrogénation.  Déshydrogénase.
Décarboxylation.  Décarboxylase.
Déroulement
de la réaction
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Le nom est en deux parties :
Radical_ : nom du substrat.
_suffixe : ase.
Exemple :
Hexokinase.
ATP + D-hexose  D-hexose-6-P + ADP.
L’hexokinase est appelée : ATP D-hexose phosphotransférase.
2) Fonctionnement d’une enzyme :
Ce sont des protéines de grande taille qui possède une région spécifique de catalyse : le site
actif.
Les acides aminés des enzymes participent à la fixation du substrat et maintiennent la
structure tridimensionnelle. Ce sont les changements de types de liaison (ionique, Van der Waals)
qui permettent la catalyse. A la fin de la réaction, il y a un retour à l’état initial.
S’il y a une délétion d’un acide aminé au niveau du site actif, l’enzyme ne fonctionne plus.
Mais si cette délétion est proche du site actif, il peut y avoir une baisse de l’activité enzymatique. Les
conséquences varient selon la localisation de la mutation.
Parfois, les enzymes ont besoin de la présence de métaux rares proches de leur site actif pour
fonctionner correctement. Certaines ne peuvent avoir d’activité catabolique qu’en présence d’une
coenzyme.
Système complet : holoenzyme = apoenzyme (l’enzyme proprement dite) + coenzyme.
La coenzyme peut être reliée par une liaison faible (le plus souvent, ionique, Van der Waals)
ou par une liaison covalente. Dans le cas de liaisons faibles la coenzyme est considéré comme un
cosubstrat.
Exemple : rôle important en anaérobie.
CH3 – CO – COOH
Pyruvate.
CH3 – CHOH – COOH
Lactate.
NAD + H+.
Coenzyme : lacticodéshydrogénase.
D + G.
D.
NAD +.
CoE.
A + G.
CoE + G.
A.
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3) les grandes familles de coenzyme :
- facteurs coenzymatique à structure nucléotidique :
l’ATP est une source d’énergie facilement utilisable. Mais elle joue aussi le rôle de
transporteur de phosphore dans l’activation des sucres (oses) et des aminoacides. C’est quasiment
un cosubstrat :
ATP + R–OH  R–OP + ADP.
- nucléotide complexe :
Coenzymes pyrimidiques :
dérivée de la vitamine PP (amide nicotinique) antipellagreuse. Elles servent de transporteur
d’hydrogène avec :-NAD : nicotinamide dinucléotide (= niacine).
-NADP.
Enzymes flaviniques :
dérivée de la vitamine B2 : la riboflavine. Elles servent de transporteurs d’hydrogène (par
exemple : dans le cycle de Krebs).
Ce sont :
-FMN : Flavine Mono Nucléotide.
-FAD : Flavine Adénine Dinucléotide.
ACP : Acyl Carrier Protein :
ce sont des activateurs de la synthèse des acides gras. Ils sont dérivés de l’acide
pantothénique.
La coenzyme A (CoA) :
dérivée de l’acide pantothénique (la vitamine B5). Elles activent les acides gras :
Vit. B5 + Cystéine amine + ADP  CoA.
la méthyl cobalamine / 5’désoxyadénine cobalamine :
elles sont dérivées de la vitamine B12. leur rôle est de participer aux transferts de radicaux
méthyl. Elles sont souvent associées à une autre coenzyme, la THF (Tétra Hydro Folate) :
elle permet le passage du méthyl-malonylCoA au succinylCoA. Elle est dérivée de l’acide
folique. Le folate permet le transport et l’interconversion des radicaux monocarbonés (méthyl,
formyl,…). Une carence en folate entraînera une anémie mégaloblastique.
la B12 participe à la synthèse de bases puriques.
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Exemple clinique :
Une gastrite se traduit par un déficit en facteurs intrinsèques. Il existe donc un problème
d’absorption de B12 donc une carence en folate et donc une anémie mégaloblastique. Il faut
alors injecter la B12 pour corriger l’anomalie (étant donné que la prise de médicament per os sera
inutile).
SH
|
(CH2)2
Homocystéine.
|
H–C–NH3+
|
COO–
Méthionine.
Méthionine synthase.
S–CH3
|
(CH2)2
|
H–C–NH3+
|
COO–
Méthyl-cobalamine.
B12
Méthyl H4 folate.
H4 folate.
Hydroxycobalamine.
(dans le cytosol).
B12
CH3
|
H–C–COO–
|
C–S–CoA
||
O
CH3
|
H–C–H
|
C–S–CoA
||
O
B12
5’ – désoxyadénosylcobalamine.
Méthylmalonyl-CoA-mutase
L-Méthylmalonyl-CoA.
Succinyl-CoA.
dérivé de la vitamine B6 :
ce sont les pyridoxine, pyridoxal phosphate et pyridoxamine. Ils interviennent dans les
réactions de désamination et de transamination.
H
|
R1–CH–COOH + O=C–E
|
pyridoxal
NH2
phosphate.
acide aminé 1
Base de Schiff 1.
Base de Schiff 2.
Base de Schiff 3.
acide aminé 2 + pyridoxal
phosphate.
Base de Schiff 4.
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- les coenzymes dans les réactions de carboxylation :
CH3 –CO–COOH + TPP
les dérivés de la vitamine B1 (thiamine pyrophosphate) :
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COOH
|
CH3 –C–OH
|
TPP
ils interviennent dans les réactions de décarboxylation :
CH3 –C–H + TPP
||
O
CO2
H
|
CH3 –C–OH
|
TPP
la biotine (B8) permet la carboxylation.
l’acide lipoïque :
c’est un transporteur d’hydrogène, lorsque le pont S–S s’ouvre :
CH2
CH2
|
S
CH2
CH2
|
S
CH2
CH2
COOH
CH2
il est impliqué dans la décarboxylation oxydative de l’acide pyruvique et de l’acide αcétoglutarique.
4) Notion de Vitamine :
ce sont des substances azotées indispensables à la vie. Elles doivent être fournies en petites
quantités de façon continue, pour un fonctionnement normal de l’organisme.
 On est incapable de les synthétiser nous même, il nous faut donc les importer grâce à notre
alimentation. Ce sont souvent des coenzymes.
5) Cinétique enzymatique :
a) Notion de produit et de substrat :
A
 B + C (par exemple : clivage catabolique)
A+B
 C + D (échange de groupe)
A+B
 C (synthèse)
Substrat(s).
Il se lie à l’enzyme.
Plusieurs substrats possibles
Produit(s).
Parfois plusieurs produits.
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Les enzymes sont présentes en très petites quantités. La quantification de ces molécules est
donc très difficile. Heureusement, l’activité catalytique des enzymes nous fournit un moyen sensible
et spécifique pour les mesures de la vitesse de la réaction catalysé par cette enzyme. La vitesse est
d’ailleurs souvent proportionnelle à la quantité d’enzyme présente.
On mesure soit la disparition du substrat, soit l’apparition du produit. On effectue des mesures
colorimétriques à l’aide d’un spectromètre selon la loi de Berre Lambert :
DO = cl.
DO : densité optique (sans unité).
 : coefficient d’extinction molaire.
c : la concentration.
l : longueur du trajet optique.
On utilise souvent comme unité le katal : c’est l’apparition d’1 mole de substrat à 30°C
λ doit avoir la longueur d’onde d’absorption maximum.
l
λ
I1
λ
I0
I0 < I1.
On fait ensuite une courbe d’étalonnage en prenant des valeurs connues :
DO
On mesure la densité optique sur le
photospectromètre qui correspond sur la
courbe à une concentration α d’un produit.
A
α
B
C
Concentrations.
Vitesse.
Plusieurs facteurs vont affecter la réaction :
Vmax.
-la concentration du substrat.
-la concentration du produit.
-la présence d’inhibiteur.
-la température (souvent proportionnelle à la
vitesse de réaction) mais si trop élevée,
dénaturation irréversible de la réaction.
-le pH de la réaction. (optimal à 7 sauf dan les
lysosomes ou le pH ≈ 4)
La vitesse dépend de la quantité d’enzyme
présente.
Vitesse.
E1.
E2.
E3.
E1 > E2 > E3.
S