2013m

Université Victor Ségalen Bordeaux-2
UFR Sciences de la Vie
Licence de Biochimie
L3-S6 Enzymologie et Purification des Protéines
Mardi 30 Avril 2013
Amphi 5, 9h30
Epreuve Enzymologie 1,5 heures
AUCUN DOCUMENT N’EST AUTORISE
CORRECTION SOMMAIRE
1.Observer que les différentes questions ont été traitées en cours et TD,
mais aussi dans votre cours d’enzymologie en L2
2. Votre réponse doit absolument être justifié (exemple : « Le 2’-ATP
peut être substrat de l’AC parce qu’elle a son OH en 3’ nécessaire pour
la réaction »)
L’AMPc, un messager secondaire intracellulaire, est principalement régulé au niveau de
la synthèse de l'adénylate cyclase (abbréviation AC), l'enzyme qui catalyse la transformation
réversible de l'ATP en AMPc et pyrophosphate.
Plusieurs adénylate cyclases sont des toxines bactériennes qui sont sécrétées par des
bactéries pathogènes et activées lors de leur entrée dans les cellules hôtes par la Calmoduline.
L’AC de Bacillus anthracis (anthrax) augmente la concentration d’AMPc dans les cellules
infectées (100 fois ou plus) avec des effets pathologiques graves. Les propriétés structurales et
catalytiques de l’AC du B. anthracis ont été étudiées.
1. L’AC enzyme peut fixer le substrat en l’absence des ions Mg2+, mais l’activité enzymatique est
nulle. Des études préliminaires ont montré que l’ATP se fixe à l’enzyme en présence et en
l’absence des ions Mg2+. Le schéma de réaction est donc le suivant :
Exemple d’enzyme avec attaque nucléophile sur le phosphate α de l’ATP et PPi comme groupe
partant.
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1a. (2 points) Expliquez pour quelle raison la réaction EMg2+S est-elle représentée dans ce
schéma comme irréversible, tandis que la réaction catalysée par l’AC est réversible.
Si on mesure la vitesse INITIALE. C’est une condition expérimentale et non pas une hypothèse
tel que l’état stationnaire
1b. (4 points) Déduire l’équation de Michaelis qui correspond à ce schéma (S = ATP). On
suppose que [Mg2+] et [S] >> [E]t . Expliquez chaque étape de votre travail et les hypothèses qui
permettent d’obtenir l’équation de Michaelis. Ka1 et Ka2 sont des constantes d’activation.
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1c. (2 points) Discutez l’effet des ions Mg2+ sur les paramètres cinétiques.
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1d. (2 points) Le Km n’est pas une mesure de l’affinité de l’enzyme pour son substrat.
Pourquoi ? Dans quelle situation le Km est proche du Kd ?
2. (2 points) Lequel(s) des nucléotides suivants seront substrats ou inhibiteurs : 2’-désoxyATP,
3’-désoxyATP, GTP
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3. (3 points) Pour mesurer l’activité enzymatique de l’AC dans le sens de la synthèse de l’ATP
on a utilisé un dosage spectrophotométrique couplé, en utilisant les enzymes hexokinase et
glucose-6-phosphate déshydrogénase. Ecrire les réactions catalysées par les deux enzymes.
Expliquez le principe de ce dosage couplé. La ∆A/min est de 0,3 (à une concentration saturante
en substrats), la concentration en enzyme est de 0,1 µg/ml et le coefficient d’extinction
millimolaire du NADPH est de 6,29 mM-1cm-1. Calculez l’activité spécifique et la constante
catalytique de l’enzyme, en s-1. La masse molaire de l’AC est de 60000.
4. (2 points) Donnez un exemple d’enzyme cellulaire activée par l’AMPc.
5. (3 points) La structure tri-dimmensionnelle des complexes enzyme-substrats et/ou produits
ont été résolues. Un schéma du site actif est représentée ci-dessous. Discuter le rôle probable
de l’histidine 351 dans la catalyse. La comparaison avec l’histidine de la triade catalytique des
protéases à sérine est certainement utile.
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ERREURS FREQUENTES
Les constates d’équilibres et de dissociation s’écrivent K majuscule (k sont de constantes de
vitesse)
Concentration [ ] c’est la concentration molaire (jamais mg/ml si parenthèses carrées)
Faites les calculs étape par étape. C’est plus facile à contrôler. Vérifiez les unités !
L’activité spécifique est exprimée en U/mg (ou µmol/min/mg)
L’activité enzymatique est exprimée en µmol/min/ml (JAMAIS µM !)
[s]>>[E] ne veut pas dire que l’enzymes est saturée. La saturation [s] >> Km
Le rôle de l’His : utiliser le mot BASE ; elle est base et non pas nucléophile dans ce schéma de
réaction
L’espèce transférée sur l’His c’est H+ et non pas l’atome d’hydrogène
Km est proche du Kd si k2<<k-1 (et non pas k2 zéro, ou réaction à l’équilibre)
Evitez d’écrire les formules linéaires des sucres ! En solutions 99% cycliques
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