Lire l'article complet

Act. Méd. Int. - Métabolismes - Hormones - Nutrition, Volume II, n°4, août 1998
12
Dossier
insensibilité aux androgènes (IA)
représente plus de la moitié des cas
de pseudo-hermaphrodisme masculin
(PHM) (1), et relève d’une anomalie de
l’action cellulaire des androgènes au niveau
des tissus cibles. Dans sa forme complète
(ICA), le diagnostic repose sur les données
cliniques, biologiques et génétiques. Nous
avions souligné, il y a 10 ans (2), l’hétéro-
généité clinique et biochimique de l’insen-
sibilité partielle aux androgènes (IPA) : de
grands espoirs se sont alors portés vers la
génétique moléculaire, dont les progrès
considérables ces dernières années lais-
saient espérer une réponse aux problèmes
d’ordre diagnostique, physiopathologique,
thérapeutique et pronostique que cette
situation complexe soulève.
Avant d’aborder l’intérêt et les limites de la
génétique moléculaire dans la prise en
charge d’une insensibilité aux androgènes
en 1998, nous rappellerons brièvement les
conceptions actuelles de la structure du
récepteur des androgènes (RcA), du méca-
nisme d’action des androgènes, les anoma-
lies susceptibles d’entraîner une IA et les
méthodes actuelles d’analyse d’une IA.
L’action des androgènes (testostérone, T,
ou dihydrotestostérone, DHT) s’exerce via
un récepteur commun, le récepteur des
androgènes (RcA), facteur de transcription
androgéno-régulé, codé par un gène situé
sur le chromosome X en position q11-12.
Structure
Le RcA appartient à la super-famille des
récepteurs nucléaires, qui regroupe (3) :
– les récepteurs des hormones stéroïdes,
des androgènes : RcAαet RcAß (une
forme tronquée décrite récemment par Gao
et coll. [4], dont le rôle physiologique reste
à préciser), récepteur des glucocorticoïdes
(GRαet GRß), des minéralocorticoïdes
(MR), de la progestérone (PRαet PRß) et
des estrogènes (ERαet ERß) ;
Insensibilités aux androgènes :
génétique moléculaire
Ch. Sultan* ** ***, N. Poujol** ***, S. Lumbroso** ***, B. Terouanne***, V. Georget***,
Ph. Nirde***, B. Tahiri***, F. Audran**, M. Feki* **, Ch. Belon**, R. Dumas*
* Unité d’endocrinologie, gynécologie, pédiatrique, Pédiatrie 1, hôpital Arnaud-de-Villeneuve,
Montpellier.
** Unité de biochimie endocrinienne du développement et de la reproduction, hôpital Lapeyronie,
Montpellier.
*** Inserm U.439, pathologie moléculaire des récepteurs nucléaires, Montpellier.
✎ L’insensibilité aux androgènes
représente plus de la moitié des cas de
pseudo-hermaphrodisme masculin.
✎ Le diagnostic d’insensibilité com-
plète aux androgènes repose sur des
données cliniques (aménorrhée,
absence de pilosité pubienne, déve-
loppement volumineux des seins),
biologiques (testostérone et LH plas-
matique élevées) et génétiques
(mutation du récepteur des andro-
gènes ou RcA) chez un sujet XY.
✎ L’expression phénotypique en est
très variable, allant d’un phénotype
féminin avec organe péno-clitori-
dien à un phénotype masculin où la
stérilité isolée constitue le principal
signe d’appel de l’insensibilité par-
tielle aux androgènes (IPA).
✎ L’évaluation biochimique de la
concentration en sites récepteurs des
androgènes au niveau des organes
génitaux externes ne représente qu’une
approche indirecte du diagnostic.
✎ Environ 200 mutations du gène
du RcA ont été rapportées dans le
monde.
✎ Les mutations du RcA se répar-
tissent sur l’ensemble du gène.
✎ Il n’existe pas de corrélation
stricte entre une mutation donnée et
un phénotype particulier.
✎ Devant une IPA néonatale, le
problème principal est celui du choix
du sexe d’orientation.
✎ La prédiction du phénotype
pubertaire devra tenir compte du
type de mutation, du caractère
conservé de l’acide aminé, du
caractère conservatif de la substi-
tution.
✎ Les bases moléculaires de la
variabilité phénotypique d’une
même mutation relèvent d’une
modulation en amont ou en aval des
androgènes, par l’intermédiaire de
facteurs activateurs-inhibiteurs de la
transcription.
L’

Act. Méd. Int. - Métabolismes - Hormones - Nutrition, Volume II, n°4, août1998
13
– les récepteurs de différents ligands
hydrophobes tels que les récepteurs des
hormones thyroïdiennes (TRαet TRß), de
l’acide rétinoïque (RARα,ß,γet RXRα,ß,
γ), de la 1,25 dihydroxy-vitamine D3 (ou
VDR) ;
– les récepteurs activant la prolifération des
péroxysomes (PPARα,γ);
– plusieurs récepteurs orphelins, pour lesquels
aucun ligand spécifique n’est identifié.
La figure 1 représente les homologies
(en %) des séquences des principaux récep-
teurs nucléaires par rapport au RcA humain.
Comme les autres récepteurs nucléaires, le
RcA est organisé selon une structure
modulaire avec des domaines fonctionnels
interchangeables. Les différentes fonctions
du RcA ont pu être assignées à des
séquences d’acides aminés ou à des régions
plus complexes : on peut distinguer quatre
régions ou domaines principaux :
– le domaine N-terminal, codé par l’exon 1,
impliqué dans l’activation de la transcrip-
tion et participant à la spécificité d’action
tissulaire et cellulaire ;
– le domaine central de liaison à l’ADN
(exons 2 et 3), fortement conservé au sein
de la super-famille, participant également
au processus de dimérisation et de localisa-
tion nucléaire ;
– le domaine charnière (partie de l’exon 3
et de l’exon 4), abritant le signal de locali-
sation nucléaire (NLS) ;
– le domaine C-terminal (exons 4 à 8), res-
ponsable de la liaison de l’hormone mais
possédant également une surface d’interac-
tion pour les protéines de choc thermique
(HSP), une fonction de transactivation
dépendant de la liaison du ligand (AF-2),
une surface impliquée dans les processus
de dimérisation et un signal de localisation
nucléaire hormonodépendant (figure 2).
L’exon 1 comporte deux polymorphismes :
●Le polymorphsime CAG, motif répétitif
de triplets qui codent pour la glutamine,
dont la longueur varie de 11 à 35. Cette
région constitue un polymorphisme très
informatif, propre au récepteur des andro-
gènes humain. On trouve aussi une vingtai-
ne d’allèles de tailles différentes dans la
population générale, et les femmes sont
hétérozygotes pour ce polymorphisme dans
90 % des cas. Ce polymorphisme représen-
te donc un marqueur génétique important
et revêt un intérêt tout particulier pour le
conseil génétique. Une expansion de ce
nombre de triplets CAG est observée dans
la maladie de Kennedy, amyotrophie spino-
bulbaire liée à l’X, à rapprocher de l’en-
semble des pathologies à expansion de tri-
plets comme la chorée de Huntington.
Des études de génétique des populations
Figure 1. Homologies au sein de la super-famille des récepteurs nucléaires.
Figure 2. Principaux domaines fonctionnels du récepteur aux androgènes.

Act. Méd. Int. - Métabolismes - Hormones - Nutrition, Volume II, n°4, août 1998
14
Dossier
ont montré une corrélation négative entre le
nombre de CAG et le cancer de la prostate.
À l’inverse, il existerait une corrélation
positive entre le nombre de CAG et l’infer-
tilité masculine.
●Le polymorphisme polyglycine dont la
longueur varie de 18 à 24, qui présente
moins d’intérêt pour le conseil génétique et
ne semble pas être associé à une affection
partculière.
Mécanisme d’action
des androgènes
Les androgènes ont pour fonctions spéci-
fiques la différenciation et le développe-
ment des canaux de Wolff, la virilisation
des organes génitaux externes et des autres
tissus androgénodépendants.
Les principales étapes du mécanisme d’action
des androgènes dans une cellule cible sont
représentées sur la figure 3. On peut considé-
rer le processus en quatre étapes : liaison de
l’androgène au récepteur, migration du
complexe hormone-récepteur du cytoplasme
jusqu’au noyau, fixation sur l’ADN, trans-
cription des gènes androgéno-régulés (3).
Fixation de l’androgène sur le
récepteur
Le mécanisme intime qui permet la fixa-
tion de l’hormone à son récepteur est
inconnu, mais l’analyse moléculaire de
récepteurs des androgènes mutés (au cours
des syndromes d’insensibilité aux andro-
gènes) a permis de préciser la région du
récepteur responsable de la fixation (région
de 250 acides aminés du côté C-terminal)
et les résidus aminés qui entrent en contact
avec le stéroïde. Précisons que les deux
androgènes actifs (T et DHT) se lient au
même récepteur, avec une affinité pour la
DHT 10 fois supérieure.
La fixation du ligand entraîne une série de
modifications conformationnelles du
récepteur :
• Libération de protéines chaperons. En
l’absence d’hormone, le récepteur des
androgènes se trouve à l’état inactivé dans
le cytoplasme. Cette inactivation résulte du
masquage des sites de liaison de l’hormone
et de l’ADN par trois protéines chaperons,
les protéines de choc thermique (HSP) de
90, 70 et 56 kDa, qui seraient impliquées
également dans la localisation cellulaire
“correcte” du récepteur, notamment après
sa synthèse. Il est maintenant admis que la
fixation de l’androgène entraîne une libéra-
tion de ces protéines accessoires.
• Le récepteur des androgènes en
l’absence d’hormone est une phosphopro-
téine. La liaison de l’hormone entraîne une
hyperphosphorylation (de 2 à 7 fois) par rap-
port au niveau basal. Le rôle de cette aug-
mentation de phosphorylation est inconnu.
Migration nucléaire du com-
plexe récepteur-androgène
La localisation nucléaire du récepteur acti-
vé par la liaison de l’androgène relève du
signal de transfert nucléaire localisé dans la
région charnière. Les mécanismes molécu-
laires de ce transfert ne sont que partielle-
ment élucidés.
Fixation du complexe récepteur-
androgène sur l’ADN
Il est clairement admis que le récepteur des
androgènes se fixe sur l’ADN sous forme
d’homodimère. La fixation du récepteur
des androgènes a lieu au niveau de
séquences cibles spécifiques, les éléments
de réponses aux androgènes (ARE), habi-
tuellement situées en amont des gènes
androgéno-régulés au sein de leur promo-
teur. Ces séquences de fixation sont carac-
térisées par deux demi-sites hexamériques
séparés par trois nucléotides constituant un
palindrome imparfait. La séquence consen-
sus de reconnaissance est TGTTCT. C’est
une région du premier doigt de zinc du
domaine central de liaison de l’ADN, la
boîte P, qui permet la spécificité de re-
connaissance par l’intermédiaire de la
séquence peptidique Gly577-Ser578-
Val581.
Transcription de gènes andro-
géno-régulés
La fixation du RcA sur l’ADN entraînerait
un recrutement de coactivateurs et de fac-
Figure 3. Principales étapes du mécanisme d’action des androgènes dans une cellule cible.

Act. Méd. Int. - Métabolismes - Hormones - Nutrition, Volume II, n°4, août1998
15
teurs généraux de la transcription (GTF)
pour former un complexe transcriptionnel
actif conduisant à un remodelage local de
la chromatine et à l’expression de gènes
cibles (figure 3). Plusieurs coactivateurs du
RcA ont été décrits : Ara 70, TIFII, SRC1,
GRIP-1 et CB1-P300.
On comprend dès lors qu’une anomalie de
cette séquence complexe d’événements
puisse être responsable d’un défaut d’ac-
tion des androgènes, et donc d’une insensi-
bilité aux androgènes.
Expression clinique
des syndromes d’insensibilité
aux androgènes
La première classification proposée par
Wilson (5) (figure 4) permettait d’isoler
deux grandes formes d’insensibilité aux
androgènes :
– le “testicule féminisant” complet et
incomplet,
– le syndrome de Reifenstein, correspon-
dant à des degrés variables d’insuffisance
de virilisation.
Dans la perspective d’une relation génoty-
pe-phénotype c’est-à-dire d’une analyse
plus précise du rôle de la mutation sur le
phénotype, nous préférons souscrire à la
définition des sept stades cliniques de l’in-
suffisance de virilisation (tableau I) que
propose Quigley (6).
Méthodes d’analyse
de l’insensibilité aux androgènes
Méthodes biologiques
À côté du dosage de la testostérone et des
gonadotrophines plasmatiques, deux para-
mètres biologiques peuvent être utilisés
pour renforcer le diagnostic d’insensibilité
aux androgènes : les dosages de la SHBG
et de l’AMH.
Dosages de testostérone, FSH et LH.
Précisons que les résultats de ces dosages
doivent être interprétés en fonction des
valeurs de références masculines (si les
testicules sont encore en place). L’ICA et
l’IPA sont classiquement caractérisées, en
période post-pubertaire, par des taux de T et
de LH normaux ou élevés. En période pré-
pubertaire, les taux sont normaux pour
l’âge. En période néonatale, pour les ICA,
LH et T ne sont pas nécessairement aug-
mentées ; de même le pic de LH et celui de
T, observé vers six semaines chez le garçon
normal, peuvent ne pas apparaître, suggé-
rant une sensibilisation in utero,
androgénodépendante, de l’axe hypothala-
mo-hypophysaire nécessaire à la survenue
du pic néonatal de LH.
En période néonatale, les IPA se caractéri-
sent habituellement par des valeurs de T et
de LH élevées.
Test de stimulation par l’HCG. Devant
toute ambiguïté sexuelle (néonatale) à
caryotype XY, nous réalisons systématique-
ment un dosage de la testostérone et de ses
précurseurs avant et après injection de HCG
(7 x 1 500 UI, 1 jour sur 2). L’insensibilité
aux androgènes se caractérise par une
réponse souvent exagérée de la testostérone
plasmatique en fin de test (> 10 ng/ml).
Test au Stanozolol. Le test au Stanozolol
évalue la capacité d’un androgène à dimi-
nuer la synthèse de SHBG. Une absence de
diminution de la SHBG, plus ou moins
complète, traduirait une résistance aux
androgènes. Ce test est ininterprétable en
période néonatale (immaturité hépatique),
ce qui réduit son intérêt.
La détermination du taux circulant
d’hormone anti-müllérienne (AMH)
mesure la capacité des androgènes à suppri-
mer la sécrétion d’AMH sertolienne.
L’AMH est augmentée dans les insensibi-
lités partielles aux androgènes, davantage en
période néonatale qu’à la puberté. Ce test
n’a pas été validé par
d’autres équipes que
celle qui l’a décrit.
Méthodes de
biologie cellu-
laire
Deux méthodes sont
utilisées à partir de cul-
tures de fibroblastes de
peau génitale :
– les caractéristiques
de liaison du récep-
teur pour son ligand
(Bmax, nombre de
sites de liaison, Kd,
constante de disso-
“testicule
féminisant” “testicule
féminisant”
incomplet Reifenstein insuffisance
de virilisation stérilité isolée
Figure 4. Expression phénotypique des insensibilités aux androgènes. D’après Wilson (5).
Stades 1 2 3 4 5 6 7
Phénotype M M ambigu ambigu F F F
Micropénis – ± + + – – –
Hypospadias – ± + + – – –
Scrotum bifide – – + – – – –
Cryptorchidie – – + + + + +
Organe péno-clitoridien – – + +
Repli labio-scrotal – – +
Fusion post. grandes lèvres – – – – + – –
Orifice périnéal unique – – – + + + +
Pilosité pubienne/puberté N N ↓ ↓↓↓0
Gynécomastie/puberté ± + + + + GM GM
Spermatogenèse – ±N – – – – –
Tableau I. Les différents stades de l’insensibilité aux androgènes en fonction
des données cliniques. D’après Quigley (3).

Act. Méd. Int. - Métabolismes - Hormones - Nutrition, Volume II, n°4, août 1998
16
Dossier
ciation) sont étudiées par courbe de satura-
tion et représentation de Scatchard ;
– la taille et le niveau d’expression du
récepteur des androgènes peuvent être
abordés par Western-Blot.
L’étude de la capacité de liaison des andro-
gènes par les fibroblastes de peau génitale
en culture a constitué pendant longtemps le
seul outil biologique de diagnostic des IA,
et elle reste encore utile à l’heure actuelle.
Cette méthode a permis, avant l’avènement
de la biologie moléculaire, une classifica-
tion biologique des IA en quatre groupes :
– absence de liaison aux androgènes,
– liaison quantitativement diminuée,
– liaison qualitativement anormale (ther-
molabilité du récepteur, constante de disso-
ciation augmentée, altération de la spécifi-
cité de liaison),
– liaison normale.
Il existe donc une importante hétérogénéité
biochimique des IA, parallèle à leur hétéro-
généité clinique.
Il est important de noter que le développe-
ment de techniques de mesure différentes
pose des problèmes de comparaison pour
les résultats provenant de différents labora-
toires (par exemple, la nature du ligand uti-
lisé). De plus, il est fondamental de préci-
ser à quel niveau est effectuée la biopsie
cutanée. En effet, la capacité de liaison des
androgènes est environ trois fois plus
importante (en moyenne 400 à
900 fmoles/mg d’ADN) dans les fibro-
blastes de peau génitale (replis labiaux,
scrotum, prépuce) que dans les fibroblastes
de peau pubienne (200 à 400 fmoles/mg
d’ADN) ou non génitale (100 à
200 fmoles/mg d’ADN). En revanche, l’af-
finité pour les androgènes est similaire
dans ces différents tissus.
Au total, 15 ans après la mise en place des
méthodes de biologie cellulaire, les diffé-
rentes équipes s’accordent pour reconnaître
qu’il n’existe pas de corrélation directe
entre la sévérité clinique de l’insensibilité
et les caractéristiques de liaison des fibro-
blastes de peau génitale (2), même si l’ab-
sence totale de liaison est en général asso-
ciée à une forme complète (3) (figure 5).
Méthodes de biologie molé-
culaire
Identification de l’anomalie génique.
L’identification d’une anomalie génétique,
par séquençage direct ou après dépistage
par DGGE (denaturing gradient gel elec-
trophoresis) ou SSCP (single strand
conformation polymorphism), permet de
confirmer le diagnostic d’insensibilité aux
androgènes suspecté par les données cli-
niques et biologiques. Cependant, dans
10 à 15 % des cas d’ICA, cliniquement et
biologiquement bien définis, on ne retrou-
ve pas d’anomalie de la séquence codante
du gène du récepteur des androgènes. Ce
pourcentage s’élève dramatiquement pour
les IPA : en fait, l’hétérogénéité clinique (et
biologique) des IPA rend difficile la défini-
tion de critères diagnostiques univoque,
conduisant à une analyse génétique du RcA
souvent mal ciblée.
Études in vitro. Les conséquences d’une
mutation sur la fonction du récepteur des
androgènes peuvent être étudiées in vitro,
après reproduction de la mutation en exa-
minant les propriétés physicochimiques et
fonctionnelles du récepteur :
* la transfection, qui permet d’obtenir de
grandes quantités de récepteur, est utilisée
pour réaliser les études de la capacité de
liaison de l’androgène (Kd et Bmax), de la
capacité de liaison à l’ADN (gel retard), de
la taille et du niveau d’expression
(Western-Blot) ;
* la cotransfection est utilisée pour analyser
les caractéristiques de transactivation d’un
gène rapporteur, c’est-à-dire placé sous le
contrôle d’un promoteur androgéno-régulé.
Dynamique intracellulaire du RcA. Nous
avons récemment analysé la dynamique
intracellulaire du récepteur des androgènes
sauvage par l’utilisation d’une protéine de
fusion entre le RcA et la green fluorescent
protein (GFP). Cette protéine chimère
(GFP-RcA), tout en conservant les caracté-
ristiques fonctionnelles du RcA, permet de
suivre la localisation intracellulaire du RcA
in vivo et en temps réel via la fluorescence
(7). Nous avons appliqué cette nouvelle
approche à l’analyse de mutants du RcA
décrits lors d’insensibilités aux androgènes.
Figure 5. Hétérogénéité biochimique des insensibilités aux androgènes : expérience personnelle (n = 150).