– UE : 7

2016-2017
Biologie cellulaire et moléculaire
Biologie cellulaire et moléculaire
– UE : 7
Prolifération et apoptose contrôle du cycle cellulaire
Semaine : n°17 (du 30/01/17 au
03/01/17)
Date : 01/02/2017
Heure : de 15h00 à
16h00
Binôme : n°9
Professeur : Pr. Paumelle
Correcteur : n°38
Remarques du professeur : diapo disponible sur Moodle
I)
PLAN DU COURS
Destin cellulaire physiologique et pathologique
II) Les protéines de régulation du cycle cellulaire
A) Les complexes cycline/CDK
1)
Définition
2)
rôle
B) Régulation des cyclines
1)
Synthèse
RÉGULATION TRANSCRIPTIONNELLE
RÔLE DES FACTEURS DE CROISSANCE/MITOGÈNES
2)
Dégradation
RÉGULATION POST-TRADUCTIONNELLE
PHOSPHORYLATION, UBIQUITINYLATION
3)
Localisation
RÉGULATION POST-TRADUCTIONNELLE
PHOSPHORYLATION
C) Régulation des CDK
1)
Activité
2)
liaison aux cyclines
III) Les points de contrôle du cycle cellulaire
A) La transition G1/S
B) La transition G2/M
C) La transition métaphase-anaphase
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(Suite de cours)
II) Les protéines de régulation du cycle cellulaire
B) Régulation des cyclines
RÔLE DES FACTEURS DE CROISSANCE/MITOGÈNES
A la sortie de la mitose, l'entrée dans le cycle cellulaire dépend de la présence de facteurs de croissance/
mitogènes
Les facteurs mitogènes sont important pour l'entrée des cellule dans le cycle.
Expérience avec des cellules synchronisées : Si on élimine les facteurs mitogènes, à quel moment le cycle est
bloqué ?
On prends des cellules en phase G1 avec et sans facteurs mitogènes, (idem avec la phase S et G2) :
–
En phase G1 sans facteurs mitogènes la cellules arrête sa progression dans le cycle cellulaire et entre en
phase G0 = phase de quiescence. La cellule restera en phase G0 sans facteur mitogène.
les facteurs mitogènes sont nécessaire en phase G1 pour permettre de déclencher l'entrée des cellules
dans le cycle cellulaire, et permettre un cycle complet.
–
Quand on rajoute aux cellules en phase G0 des facteurs mitogènes, les cellules vont de nouveau rentrer
dans un cycle cellulaire.
L'ajout de facteurs mitogènes ne doit pas se faire sur un temps court !
Pour que les cellules passent le point de contrôle R = point de restriction,il faut une présence de facteur
mitogène pendant 8h
Point R : point de décision (point de restriction) d'entrée de la cellule dans un cycle cellulaire complet.
Remarque: Après passage du point de restriction (R) il n'est plus nécessaire d'avoir des facteurs mitogènes.
Autrement dit si dans notre expérience on enlève les facteurs mitogènes (après que la cellule a passé le point de
restriction) cela n'aura pas d'impact sur le cycle.
Pourquoi 8h de présence de facteur mitogène ?
Nécessite de la synthèse protéine (long), temps que les gènes soient transcrit, que l'ARNm mature et traduction en
protéine.
Le retour dans le cycle cellulaire nécessite du temps (8h)
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Expérience avec cycloheximide :
–
On met des facteurs mitogènes + cycloheximide on constate que l'on reste en phase G0, ainsi la cellule
n'est pas capable de dépasser le point de restriction (car ajout d'inhibiteur)
Le retour dans le cycle cellulaire est inhibé par la cycloheximide
=> le retour dans le cycle cellulaire nécessite donc une synthèse protéique.
Facteur mitogène :
Agissent en fonction de leur nature (polaire ou apolaire), sur des récepteurs membranaires ou nucléaires, pour
conduire à l'activation de l'expression des gènes
•
Facteurs de croissance : EGF, FGF, NGF, PDGF, IGF1
•
hormones peptidiques activant des récepteurs membranaires : Insuline, FSH, LH, ACTH, AT2
•
cytokines : Érythropoïétine (EPO), interleukines (interféron γ), hormone de croissance
•
hormones stéroïdiennes (œstrogènes, cortisol,...) et thyroïdiennes (T3, T4) pénétrant dans la cellule et
activant des récepteurs nucléaires
Rôle des facteurs mitogènes :
•
facteurs de croissance
•
hormones peptidiques activant des récepteurs membranaires
•
cytokines
•
hormones stéroïdienne et thyroïdiennes pénétrant dans la cellule et activant des récepteurs nucléaires
Conséquences :
activation de gènes par transduction de signal
activation directe des gènes par les récepteurs nucléaires
Une centaine de gènes activés :
Activation de la synthèse protéique
Cycline D puis Cycline E
Quand une cellule est en présence de facteur mitogène, ce dernier se
fixe sur un récepteur (ici récepteur tyrosine kinase) cela conduit à
l'activation de RAS via le facteur GES, RAS va venir activé MAP
kinase et conduit à l'activation de gènes régulateur de protéine. Cela va
induire l'expression d'un gène qui est lui même un facteur de
transcription : MYC, qui va induire expression d'autre gène EX :
cycline D et conduire à l'activation cycline G/CDK
Ce sont des transcriptions de gène en cascade suite à l'incubation des
cellules avec les facteurs mitogènes
Présence de gènes précoce exprimé très rapidement. Dès 3-4h on peut
les mesurer, alors que cycline D prends plus de temps, car pour
l'induction de ce facteur il faut déjà induction de son précurseur.
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Vague successive d'activation pour conduire à l'activation cellulaire
Une fois que la cycline D est exprimée (environ 8h), il va se former le complexe cycline D/CDK. Ce complexe va
venir phosphorylé la protéine de rétinoblastome et ainsi rendre le facteur E2F libre et actif.
Le facteur E2F va venir induire l'expression de gène lors de la phase S et activer les cyclines.
La cycline E et la cycline A couplé à la CDK vont venir faire un rétrocontrôle positif sur l'activation du facteur
E2F
Rétro contrôle : cycline S actif va favoriser l'action de E2F, temps que la phase S se déroule, rétro contrôle pour
être sur que la phase S se déroulement correctement
Les facteurs mitogènes vont induire l'expression de toutes les cyclines de façon directe ou indirecte
2) Régulation de leur dégradation :
PHOSPHORYLATION, UBIQUITINYLATION, PROTÉASOME
Les cyclines vont être régulé par dégradation, qui nécessite des événements de : phosphorylation, ubiquitinylation
et dégradation par protéasome
Pour la cycline B CDK1 (de la phase M) : au moment où il va y avoir séparation des chromatines sœurs
(anaphase), cela va déclencher la phosphorylation de la cycline B (ou M) au niveau d'un résidu thréonine, qui va
déclencher son programme de dégradation.
Cela ce fait uniquement au moment de l'anaphase !
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Explication : la phosphorylation va permettre la reconnaissance par APC, qui contient une activité ubiquitine
lyase ; APC va greffer résidu ubiquitine (sur la cycline) ce qui correspond à un signal d'adressage des protéines
vers le protéasome pour être dégradé. Ainsi la cycline B sera dégradé par le protéasome.
Rappel : polyubiquitinylation = signal adressage de la protéine vers le protéasome.
Pour que APC permettre de poly ub la cycline, il faut que APC soit activé. L'APC est activé par une sous unité
Cdc20 (APC est activé au moment de la mitose)
Expérience : Comment savoir qu'elle est bien dégradé par ubiquitinylation ?
Il va falloir purifier la cycline B.
–
Synchroniser les cellules : essayer de récupérer des extraits protéiques en prophase, en métaphase, …
on récupère des extraits protéiques au cours du temps
–
on va purifier la cycline B avec un anticorps (AC) anti cycline B : l'AC est lié a des billes. =
immunoprécipitation
–
on lave ensuite les billes, ce qui reste accroché = les protéines associé au AC
–
on pose ensuite sur un gel polyacrilamide, puis transfère sur une membrane microcellulose puis révélation
par des AC anti cycline B. (révélation de l'ubiquitine par le même système : AC anti ubiquitine)
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Observation :
Au cours de la mitose, on voit une diminution du signal relatif a la cycline B = moins de protéine. (Logique car la
cycline B est dégradée pendant l'anaphase)
Marquage ubiquitine : Augmentation en anaphase et en télophase ;
=>Dégradation de la cycline B (diminution du signal) avec en parallèle une augmentation de l'ubiquitine ; La
cycline est poly Ub est envoyée au protéasome pour être dégradée.
La cycline B est dégradée par le complexe APC
La cycline D et E dégradée par SCF
La cycline A est aussi dégradée par le complexe APC
Les cyclines sont régulés de manière transcriptionnel et post traductionnel : phosphorylation et ubiquitinylation.
Les cyclines sont régulé aussi par leur localisation cellulaire (pas toutes)
3) Régulation de leur localisation cellulaire
CYCLINE E ET A NUCLÉAIRES
CYCLINE
B CYTOPLASMIQUE OU NUCLÉAIRE
Localisation :
–
Cycline E et A sont toujours nucléaires,
–
Cycline B oscille entre cytoplasme et noyau.
Logique, Cycline B/CDK1 s'associe aux microtubules, aux catastrophines et aux map stabilisatrice
localisés dans le cytoplasme
Et cycline B dans le noyau va jouer un rôle sur les lamines et l'histone H1.
Mouvement de la cycline B entre le cytoplasme et le noyau
La présence des cycline B :
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Pendant l'interphase (G2), va osciller entre le noyau et cytoplasme :
–
Importé dans le noyau. La cycline B possède une séquence NLS reconnu par les importines,
–
Exporté du noyau. La cycline B possède une séquence NES reconnu par l'exportine CRM1
La cycline B est importé dans le noyau mais elle sera rapidement exporté.
Pendant l'interphase la cycline B est majoritairement présente dans le cytoplasme.
En phase G2 (fin), la cycline B est majoritairement dans le cytoplasme, permet de réorganiser les microtubules.
Pendant la mitose :
–
La cycline B sera phosphorylé sur 4 résidus sérines, la phosphorylation va empêcher la cycline B d'être
reconnu par l'exportine CMR1
–
en effet cette phosphorylation va masquer la séquence NES (séquence d'exportation nucléaire), la cycline
B va donc s'accumuler dans le noyau.
Logique : en pro métaphase il y a rupture de l'enveloppe nucléaire dû à la phosphorylation des lamines. Au
moment où l'on rentre en mitose il y a nécessité de phosphorylé les lamines et l'histone H1 = les premiers
événement de mitose
Il existe un point de contrôle en phase G2 : permet de détecter qu'il n'y a pas de lésion, mutation, d'erreur intégré
au moment de la réplication de tous les chromosomes.
Si une lésion est détectée : pas de phosphorylation de la cycline B sur ces 4 résidus sérines, même si la cellule est
prête a rentrer en mitose ! Ainsi la cycline B ne pourra pas rester suffisamment longtemps dans le noyau pour
phosphoryler les lamines et histone H1 (les éléments de la mitose ne pourront pas être déclenché) même si la
cycline est bien exprimée !!
La cycline se couple au CDK, complexe déjà actif ? NON !!!! Le complexe cycline CDK ne pourra pas agir
directement au niveau du noyau ; il est nécessaire d'avoir un événement de phosphorylation de la cycline pour
qu'elle s'accumule dans le noyau et donc phosphorylé la lamine et histone H1
Cela permet à la cellule d'avoir des points de contrôle et d'éviter d'engager trop rapidement la mitose en cas de
lésion de l'ADN
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Expérience : Mise en évidence de la localisation de la cycline B
La localisation de la cycline B est dépendante de sa reconnaissance par une exportine.
Expérience pour étudier si l'exportine CMR1 est vraiment impliqué dans le mécanisme de localisation entre
cytoplasme et noyau au cours de la transition G2/M
Mettre en évidence la localisation d'une protéine ? Deux techniques
–
le fractionnement cellulaire, : on fractionne par centrifugation un extrait cellulaire dans lequel on ne
casse pas les organites.
On va lyser doucement la membrane pour libérer le contenu de la membranes pour garder intact les
organites.Ainsi on peut arriver a isoler le noyau du cytoplasme.
Représenté sur le westerbot : séparation du noyau, du cytoplasme et de l'extrait totale ;
On a dans l'expérience traité les celulles avec un inhibiteur de l'exportine CMR1 : la leptomicine B.
Quand on traite on observe que la cycline B s'accumule dans le noyau. En parallèle on voit moins de
cycline B dans le cytoplasme. Quand on bloque l'exportine, on bloque le va et vient de la cycline B entre
le cytoplasme et le noyau, et donc accumulation de la cycline B dans le noyau.
Quand on ne traite pas par l'inhibiteur de l'exportine CMR1 : la cycline B est présente majoritairement
dans le cytoplasme (au moment de la phase G2)
Dans l'expérience la fraction totale permet d'affirmer que les variations d'expression ne sont pas dû à un problème
de dépôt sur le gel. Ici c'est Ok car on observe une quantité identique de cycline B. Cela permet donc de valider
l'expérience
–
immunofluorescence :
immuno : Anticorps (dirigé contre la protéine)
Fluorescence : AC marqué
On peut ici visualiser la localisation de la protéine dans le cellule entière.
Manipulation : traitement des cellules avec leptomycine; on a fixé des cellules, incubé les cellules avec AC
anti cycline B pour marquer la localisation de la cycline B dans la cellule.
Sur l'image de droite on a voulu se repérer dans la cellule par contre marquage des noyaux dans la cellule.
Observation :
Quand on regarde sans traitement, on observe la cycline B dans le cytoplasme et un peu dans le noyau.
Avec traitement à la leptomycine: (4h de traitement) : la localisation de la protéine a changé, fort
marquage fluo dans le noyau des cellules.
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En conclusion : on bloque l'exportine ou bloque la reconnaissance de l'exportine par CMR1
C) régulation des CDK
1)
Régulation de leur activité
Régulation des CDK par :
–
Liaison aux cyclines
–
phosphorylation : kinase
–
déphosphorylation : phosphatase
–
inhibiteurs de CDK : CKI (ils vont bloquer le complexe cycline CDK)
Activation d'une kinase par interaction avec une cycline et phosphorylation par une kinase.
L'année dernière on a vu que l'augmentation de l’expression des cyclines couplés au CDK rends actif le complexe.
Mais ce n'est pas si simple. Il ne suffit pas d'un couplage cycline CDK pour rendre le complexe actif.
Il est nécessaire d'avoir en plus un événement de phosphorylation sur la CDK pour que le complexe soit actif.
Ces événements de phosphorylation sont soit activateur soit inhibiteur. L'idée est qu'ici on peut contrôler
l'activité des complexes par phosphorylation.
–
CDK inactif s'associe avec une cycline
–
modification de la conformation, ce qui rends accessible une boucle.
–
Cette boucle sera accessible à des kinases qui vont phosphoryler sur des résidus thréonines : site activateur
–
La cycline H/CDK7 vient phosphoryler le résidu thréonine au niveau de la boucle.
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=> c'est sous cette forme que les complexes cycline/CDK sont vraiment actif
Mais en plus il faut envisager que les événements du cycle cellulaire doivent être très rapide.
Ex cycline B/CDK : au moment où elle agit sur les protéines, il faut que les événements soient très rapide, on ne
peut pas attendre que les complexes se forment pour ensuite agir.
Il existe donc un mécanisme de régulation du complexe cycline/CDK qui rends le complexe inactif mais prêt à
agir :
La phosphorylation qui se passe au niveau de 2 acides aminées en Nter : thréonine et tyrosine.
Phosphorylation par la kinase Weel, qui va permettre en phosphorylant de rendre le complexe cycline
CDK inactif mais prêt à agir.
Pour activé le complexe cycline/CDK, intervention d'une phosphatase : Cdc25
L'activité des CDK est régulée par phosphorylation et déphosphorylation
Exemple : régulation de l'activité du complexe cycline B/ CDK1 :
La cycline M va se couplé à la CDK1, pour former le complexe cycline/CDK. Ce complexe sera phosphorylé par
CAK et par la kinase Wee : le complexe est donc inactif mais près à agir.
Pour que le complexe devienne actif il y aura action de la phosphatase (déphosphorylation sur les résidus thréonine
et tyrosine de la cycline M/CDK) : Cdc25. Le complexe M/CDK va entretenir l'activation de la Cdc25.
La cellule accumule donc des complexes cyclines/CDK prêt à agir (obtenir une réponse rapide)
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Inhibiteur de CDK : CKI
A partir du moment que complexe cycline CDK actif, il y a des mécanismes qui peuvent intervenir pour bloquer
l'activation du complexe et stoppé l'activation (ex : lésion de l'ADN), inhibiteur de CDK: CKI
Deux familles d'inhibiteur de CDK :
–
CIP (CDK inhibiting protein) : inhibiteur de la plupart des complexes cycline/CDK
Exemple : p21, p27
•
Inhibiteurs lorsqu'ils sont en excès
•
synthèse des CIP inhibée par les facteurs de croissance
•
CIP phosphorylés par E/CDK2 puis dégradés
Ces inhibiteurs sont bloqués par les facteurs mitogènes, car vont à l'inverse des facteurs mitogènes. Quand la
cellule est en présence de facteur mitogène cela va bloquer la synthèse des CYP
–
INK4 : inhibiteur de CDK :
•
Inhibe la formation du complexe cycline D/CK4
•
dégradation des cyclines D non liées (½ vies 10min), quand le CDK4 est associé à INK4, la cycline D
n'est plus associé à CDK4, elle va donc se dégrader facilement.
•
arrêt des cellules en G1, (cellule vont être bloqué en phase G1)
III) Les points de contrôle du cycle cellulaire
Les point de contrôle servent a vérifier l'intégrité de l'ADN pour éviter de transmettre les erreurs à la descendance.
1)
La transition G1/S
Point de contrôle :
Si problème d'intégrité de l'ADN la cellule doit stoppé son cycle cellulaire pour réparer l'ADN :
Il existe différent gènes qui interviennent dans le contrôle de l'intégrité de l'ADN :
–
facteur de transcription p53 : gène suppresseur de tumeur, des mutations sont impliqués dans plus de
50% des cancers, gènes +++ dans le contrôle cycle cellulaire, en cas mutation : impliqué dans
développement des cancers.
–
ATP : ataxia telangietasia mutated : maladie qui induit un vieillissement prématuré et induit des cancers
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de la peau suite à des expositions aux radiations ionisantes.
–
p21 : rôle important dans l’arrêt du cycle cellulaire pour permettre de vérifier l'intégrité ADN
Quand la cellule possède un dommage de l'ADN (problème réplication par exemple) : activation d'une kinase :
ATM qui va aller phosphorylé P53, cette phosphorylation va empêcher sa dégradation.
En cas normal : P53 est une protéine exprimée continuellement dans la cellule mais régulée par dégradation.
Dégradé par le facteur MdM2 qui reconnaît p53 et permet sa dégradation par poly ubi. Normalement, p53 est
exprimé et dégradé continuellement
Quand il y a des lésions a l'ADN, la kinase ATM va phosphorylé p53 qui empêche sa dégradation, car empêche la
reconnaissance par MdM2. En effet la phosphorylation va masquer le site de reconnaissance et p53 sera ne pas
poly ubi, p53 s'accumulera donc dans la cellule.
P53 va jouer un rôle de facteur de transcription, il induit l'expression des P21. Le P21 est un CKI qui va se fixer au
niveau des complexes cyclines/CDK, et donc bloquer le complexe dans une phase du cycle. Le blocage est
bénéfique, il permet de donner le temps à la cellule pour réparer son ADN
Si la réparation se fait correctement, P21 sera dégradé et permettra de relancer le complexe cycline/CDK dans le
cycle.
Si a contrario la lésion ne peut pas être réparée, la cellule va rentrer en senescence ou apoptose.
Remarque : Nous verrons dans le chapitre suivant sur l'apoptose que p53 peut induire des gènes important pour
l'apoptose
P53 joue un rôle important dans la cellule, sans lui la cellule ne serait plus s’arrêter pour réparer ses lésions. Ainsi
les lésions vont se transmettre aux cellules descendantes et aboutir finalement à la formation de tumeur par
exemple.
Certains virus comme papillomavirus vont agir sur P53.
Dans ce cas, le virus exprime E6 qui se fixe sur p53 et accélère sa dégradation, p53 ne peut donc plus étre stabilisé.
Les cellules prolifères et ne sont donc plus arrêté en cas de lésion. Il y a donc plus de risque de développer une
tumeur.
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2)
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La transition G2/M
Point de contrôle :
–
réplication complète des chromosomes (?)
–
intégrité de l'ADN (p53)
Conséquences :
–
activation de cdc25 (phosphatase contrôlant la phosphorylation de CDK1)
–
activation cycline B/ CDK1
–
préparation à la séparation des chromosomes dupliqués : phosphorylation des substats CDK1
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