– UE VII: – 2016-2017 Sciences biologiques

2016-2017 Sciences biologiques
Analyse enzymatique
– UE VII: –
Annexe : MOODLE – UE VII – Biochimie – Analyse enzymatique
Semaine : n°1 (du 05/09/16 au
11/09/16)
Date : 06/09/2016
Heure : de 16h00 à
17h00 Professeur : Pr. Briand
Binôme : n°9 Correcteur : 27
Remarques du professeur (Diapos disponibles, Exercices sur le campus, Conseils, parties importantes
à retenir, etc.)
•Diapo sur moodle. Clé d'inscription : BIOCH2
•2h CM, 2 ED, 2 séances de TP
PLAN DU COURS
I) Concepts de base
A) Caractéristiques essentielles des enzymes
B) Domaines et applications
C) Structure et spécificité
D) Le complexe enzyme-substrat : notion de site actif
E) Origine du pouvoir catalytique des enzymes
F) Nomenclature
G) Les isoenzymes
II) Cinétique des enzymes michaeliennes
A) Introduction
B) Relation fondamentale de Michaelis-Menten
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I) Concepts de base
A) Caractéristiques essentielles des enzymes
Caractéristiques des enzymes :
•Ce sont des protéines
Exception : ARN qui assurent cette fonction (ribozymes)
•Catalyseurs puissants (augmentent la vitesse de réaction de 106 à 1017)
•Spécificité élevée vis à vis du substrat mais également vis à vis de la réaction
→ Un enzyme catalyse une réaction pour un substrat ou des substrats proches
→ Un enzyme catalyse une seule réaction chimique ou un ensemble de réactions apparentées
•Les enzymes sont régénérés non modifiés : les enzymes servent un grand nombre de fois
•Les enzymes ont fonctionnement autonome : si on les extrait des tissus ou des cellules, on peut les
utiliser comme catalyseurs in-tubo.
B) Domaines et applications de l'enzymologie
Les enzymes sont utilisés dans les réactions biochimiques in vivo. Certaines pathologies liées à un déficit
enzymatique. Ils peuvent être des cibles thérapeutiques (inhiber ou activer des enzymes via des
médicaments) et des marqueurs de pathologies (à telle pathologie peut être associée une quantité particulière
d'une enzyme dans le sang). Les enzymes sont également des outils d'analyse (dosage)
C) Structure et spécificité
L'enzyme est composé de 100 à quelques milliers d'acides aminés. La taille enzyme est toujours très
supérieure à la taille du substrat.
Le site actif est une zone particulière au sein de l'enzyme dans lequel on retrouve :
une région d'interaction Enzyme/Substrat
une région de catalyse
D) Le complexe enzyme-substrat : notion de site actif
Le site actif est une cavité dans laquelle vient se placer le substrat. C'est un micro environnement non
polaire, c'est à dire que les molécules d'eau environnantes sont exclues.
La géométrie est environ complémentaire au substrat, mais pas tout à fait, car elle va évoluer pour devenir
complémentaire à la géométrie du substrat lorsqu'il sera dans son état de transition. Il présente des liaisons
faibles. Il est composé de groupes catalytiques (Histidine His, Sérine Ser, Cystéine Cys, Acide Glutamique
Glu). Du fait du micro-environnement non polaire, ces groupes sont dans un état dissocié.
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E) Origine du pouvoir catalytique des enzymes
Les enzymes accélèrent le déroulement des réactions mais
ne modifient pas le sens de la réaction.
Elles agissent en modifiant l'énergie d'activation. En effet, elles
diminuent l'énergie d'activation des réactions qu'elles
catalysent.
Pour passer de l'état initial à l'état final, le substrat doit se
transformer dans un état de transition qui est caractérisé par une
énergie libre supérieure à l'état initiale. C'est ce qu'on appelle
l'énergie libre d'activation.
La vitesse de la réaction qui passe de l’état initial à l'état final
est inversement proportionnel à l'énergie libre d'activation.
L'effet des enzymes permet une diminution de l’énergie libre d'activation car :
•Le site actif présente une affinité supérieure pour le substrat dans son état de transition grâce à
l'enzyme
•Effets de positionnement et proximité : une fois positionné dans le site actif de l'enzyme, les substrats qui
doivent réagir entre eux sont correctement positionnés ce qui accélère la réaction.
2 phénomènes accessoires qui permettent à l'enzyme de diminuer l'énergie libre d'activation :
Intervention d'outils catalytiques :
•Catalyse acide-base (histidyl = donneur de proton)
•Catalyse covalente (séryl, cystéyl, glutamyl = accepteur d’électrons et vont participer à la formation de
liaisons covalentes transitoires avec le substrat)
F) Nomenclature
Chaque enzyme peut être nommée de trois manières.
Exemple : l'hexokinase a pour nom systématique ATP – D hexose – 6phosphotransférase ce qui permet de
comprendre le rôle de l'enzyme. Enfin chaque enzyme est caractérisée par un numéro de code. Ici, EC 2.7.1.1
2 : Classe (transférases)
7 : Donneur (transfère de groupement phosphate)
1 : Accepteur (contenant un groupe alcool)
1 : Numéro d'ordre (« ordre de découverte)
C'est la commission des enzymes (EC) qui s'occupe du numéro de code des enzymes. Chaque enzyme est
désignée par un numéro de code.
6 classes :
•EC1 : oxydoréductases
•EC2 : transférases
•EC3 : hydrolases
•EC4 : lyases
•EC5 : isomérases
•EC6: ligases
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G) Les isoenzymes
Il s'agit d'un groupe d'enzymes différentes mais qui présentent une forte homologie de séquence primaire. Ils catalysent la
même réaction mais ont des paramètres cinétiques et des paramètres de régulation (km, Vmax) propres à chacune. Ils ont
également une spécificité d'organe et ont un intérêt en biologie clinique.
Exemple : LDH (lactate deshydrogénase)
Elles est formée de 4 sous unités, M ou H et il existe 5 isoenzymes (H4, H3M, H2M2, HM3, M4)
Elles catalysent la réaction :
Distributions tissulaires différentes :
Les isoenzymes sont régulées différemment par le pyruvate : H4 inhibée par pyruvate et M4 insensible au pyruvate.
II) Cinétique des enzymes michaelienne
A) Introduction
Les enzymes ont un fonctionnement autonome, ils peuvent être extraits des tissus et peuvent être utilisés dans
des tubes. On les mélange alors avec du substrat. On va ensuite mesurer les vitesses de réactions.
L'analyse enzymatique et la cinétique michaelienne concernent cette situation dans laquelle l'enzyme est dans un
tube qui contient des constituants connus.
Principe de base :
Enzyme + substrat → On mesure la vitesse de réaction
On mesure la concentration de produit dans le milieu réactionnel en fonction du
temps.
On remarque que le tracé est linéaire, puis à un temps t, le tracé s'incurve. Cela
signifie que pendant un certain temps (partie linéaire du tracé), la vitesse de la réaction
est constante. C'est la phase stationnaire (premières minutes de la réaction).
Pendant la phase stationnaire, la vitesse de la réaction est appelée vitesse initiale.
Vo = tan α
Au delà d'un certain temps, le produit va continuer à apparaître mais de moins en
moins rapidement. On assiste à une réduction progressive de la vitesse à laquelle le produit apparaît. Puis, le tracé
va finir par devenir plat, le produit cesse alors d'apparaitre.
Si l'on refait la même réaction dans différents tubes avec la même quantité d'enzyme
mais avec des quantités croissantes de substrat, on peut faire la même remarque quant
à l’apparence de la courbe d'apparition du produit en fonction du temps.
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Grâce à cette expérience, on trace la vitesse en fonction de la concentration du
substrat, c'est la représentation de michaelis-menten. Cette représentation est une
hyperbole.
B) Relation fondamentale de Michaelis-Menten
La réaction est en équilibre avec des constantes de vitesse (K1 = constante d'activation, K2 = constante de
dissociation , K3 = constante catalytique).
La vitesse d'apparition du produit est alors P = Kcat . [ES]
Pendant la phase stationnaire, la vitesse : Vo = Kcat. [ES]. La vitesse de la réaction (Vo) est constante.
Hypothèse de Michaelis et Menten : [ES] est constante car : vitesse réaction 1 = vitesse réaction 2 + vitesse
réaction 3. En d'autres termes : K1.[E].[S] = K2.[ES]+ Kcat.[ES].
Cela conduit à dire que [E].[S]/[ES] = (K2 + Kcat)/ K1 + Km
Donc : [ES] = [E].[S]/Km
Pour modéliser la relation de michaelis et menten, il y a une dernière loi : la loi de conservation des espèces :
[Et] = [E] + [ES]. Toute l'enzyme apportée est retrouvée lorsque l'on fait la somme de E et ES.
Dernière expression : expression de la Vmax qui découle de (a) :
On aboutit à une expression de la vitesse initiale en fonction de la concentration en substrat. C'est la relation de
michaelis-menten.
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