2016-2017 Sciences biologiques Analyse enzymatique – UE VII: – Annexe : MOODLE – UE VII – Biochimie – Analyse enzymatique Semaine : n°1 (du 05/09/16 au 11/09/16) Date : 06/09/2016 Heure : de 16h00 à 17h00 Binôme : n°9 Professeur : Pr. Briand Correcteur : 27 Remarques du professeur (Diapos disponibles, Exercices sur le campus, Conseils, parties importantes à retenir, etc.) • • Diapo sur moodle. Clé d'inscription : BIOCH2 2h CM, 2 ED, 2 séances de TP PLAN DU COURS I) Concepts de base A) Caractéristiques essentielles des enzymes B) Domaines et applications C) Structure et spécificité D) Le complexe enzyme-substrat : notion de site actif E) Origine du pouvoir catalytique des enzymes F) Nomenclature G) Les isoenzymes II) Cinétique des enzymes michaeliennes A) Introduction B) Relation fondamentale de Michaelis-Menten 1/6 2016-2017 I) Sciences biologiques Concepts de base A) Caractéristiques essentielles des enzymes Caractéristiques des enzymes : • Ce sont des protéines Exception : ARN qui assurent cette fonction (ribozymes) • • Catalyseurs puissants (augmentent la vitesse de réaction de 106 à 1017) Spécificité élevée vis à vis du substrat mais également vis à vis de la réaction → Un enzyme catalyse une réaction pour un substrat ou des substrats proches → Un enzyme catalyse une seule réaction chimique ou un ensemble de réactions apparentées • • Les enzymes sont régénérés non modifiés : les enzymes servent un grand nombre de fois Les enzymes ont fonctionnement autonome : si on les extrait des tissus ou des cellules, on peut les utiliser comme catalyseurs in-tubo. B) Domaines et applications de l'enzymologie Les enzymes sont utilisés dans les réactions biochimiques in vivo. Certaines pathologies liées à un déficit enzymatique. Ils peuvent être des cibles thérapeutiques (inhiber ou activer des enzymes via des médicaments) et des marqueurs de pathologies (à telle pathologie peut être associée une quantité particulière d'une enzyme dans le sang). Les enzymes sont également des outils d'analyse (dosage) C) Structure et spécificité L'enzyme est composé de 100 à quelques milliers d'acides aminés. La taille enzyme est toujours très supérieure à la taille du substrat. Le site actif est une zone particulière au sein de l'enzyme dans lequel on retrouve : une région d'interaction Enzyme/Substrat une région de catalyse D) Le complexe enzyme-substrat : notion de site actif Le site actif est une cavité dans laquelle vient se placer le substrat. C'est un micro environnement non polaire, c'est à dire que les molécules d'eau environnantes sont exclues. La géométrie est environ complémentaire au substrat, mais pas tout à fait, car elle va évoluer pour devenir complémentaire à la géométrie du substrat lorsqu'il sera dans son état de transition. Il présente des liaisons faibles. Il est composé de groupes catalytiques (Histidine His, Sérine Ser, Cystéine Cys, Acide Glutamique Glu). Du fait du micro-environnement non polaire, ces groupes sont dans un état dissocié. 2/6 2016-2017 E) Sciences biologiques Origine du pouvoir catalytique des enzymes Les enzymes accélèrent le déroulement des réactions mais ne modifient pas le sens de la réaction. Elles agissent en modifiant l'énergie d'activation. En effet, elles diminuent l'énergie d'activation des réactions qu'elles catalysent. Pour passer de l'état initial à l'état final, le substrat doit se transformer dans un état de transition qui est caractérisé par une énergie libre supérieure à l'état initiale. C'est ce qu'on appelle l'énergie libre d'activation. La vitesse de la réaction qui passe de l’état initial à l'état final est inversement proportionnel à l'énergie libre d'activation. L'effet des enzymes permet une diminution de l’énergie libre d'activation car : • • Le site actif présente une affinité supérieure pour le substrat dans son état de transition grâce à l'enzyme Effets de positionnement et proximité : une fois positionné dans le site actif de l'enzyme, les substrats qui doivent réagir entre eux sont correctement positionnés ce qui accélère la réaction. 2 phénomènes accessoires qui permettent à l'enzyme de diminuer l'énergie libre d'activation : Intervention d'outils catalytiques : • • F) Catalyse acide-base (histidyl = donneur de proton) Catalyse covalente (séryl, cystéyl, glutamyl = accepteur d’électrons et vont participer à la formation de liaisons covalentes transitoires avec le substrat) Nomenclature Chaque enzyme peut être nommée de trois manières. Exemple : l'hexokinase a pour nom systématique ATP – D hexose – 6phosphotransférase ce qui permet de comprendre le rôle de l'enzyme. Enfin chaque enzyme est caractérisée par un numéro de code. Ici, EC 2.7.1.1 2 : Classe (transférases) 7 : Donneur (transfère de groupement phosphate) 1 : Accepteur (contenant un groupe alcool) 1 : Numéro d'ordre (« ordre de découverte) C'est la commission des enzymes (EC) qui s'occupe du numéro de code des enzymes. Chaque enzyme est désignée par un numéro de code. 6 classes : • EC1 : oxydoréductases • EC2 : transférases • EC3 : hydrolases • EC4 : lyases • EC5 : isomérases • EC6: ligases 3/6 2016-2017 G) Sciences biologiques Les isoenzymes Il s'agit d'un groupe d'enzymes différentes mais qui présentent une forte homologie de séquence primaire. Ils catalysent la même réaction mais ont des paramètres cinétiques et des paramètres de régulation (km, Vmax) propres à chacune. Ils ont également une spécificité d'organe et ont un intérêt en biologie clinique. Exemple : LDH (lactate deshydrogénase) Elles est formée de 4 sous unités, M ou H et il existe 5 isoenzymes (H4, H3M, H2M2, HM3, M4) Elles catalysent la réaction : Distributions tissulaires différentes : Les isoenzymes sont régulées différemment par le pyruvate : H4 inhibée par pyruvate et M4 insensible au pyruvate. II) A) Cinétique des enzymes michaelienne Introduction Les enzymes ont un fonctionnement autonome, ils peuvent être extraits des tissus et peuvent être utilisés dans des tubes. On les mélange alors avec du substrat. On va ensuite mesurer les vitesses de réactions. L'analyse enzymatique et la cinétique michaelienne concernent cette situation dans laquelle l'enzyme est dans un tube qui contient des constituants connus. Principe de base : Enzyme + substrat → On mesure la vitesse de réaction On mesure la concentration de produit dans le milieu réactionnel en fonction du temps. On remarque que le tracé est linéaire, puis à un temps t, le tracé s'incurve. Cela signifie que pendant un certain temps (partie linéaire du tracé), la vitesse de la réaction est constante. C'est la phase stationnaire (premières minutes de la réaction). Pendant la phase stationnaire, la vitesse de la réaction est appelée vitesse initiale. Vo = tan α Au delà d'un certain temps, le produit va continuer à apparaître mais de moins en moins rapidement. On assiste à une réduction progressive de la vitesse à laquelle le produit apparaît. Puis, le tracé va finir par devenir plat, le produit cesse alors d'apparaitre. Si l'on refait la même réaction dans différents tubes avec la même quantité d'enzyme mais avec des quantités croissantes de substrat, on peut faire la même remarque quant à l’apparence de la courbe d'apparition du produit en fonction du temps. 4/6 2016-2017 Sciences biologiques Grâce à cette expérience, on trace la vitesse en fonction de la concentration du substrat, c'est la représentation de michaelis-menten. Cette représentation est une hyperbole. B) Relation fondamentale de Michaelis-Menten La réaction est en équilibre avec des constantes de vitesse (K1 = constante d'activation, K2 = constante de dissociation , K3 = constante catalytique). La vitesse d'apparition du produit est alors P = Kcat . [ES] Pendant la phase stationnaire, la vitesse : Vo = Kcat. [ES]. La vitesse de la réaction (Vo) est constante. Hypothèse de Michaelis et Menten : [ES] est constante car : vitesse réaction 1 = vitesse réaction 2 + vitesse réaction 3. En d'autres termes : K1.[E].[S] = K2.[ES]+ Kcat.[ES]. Cela conduit à dire que [E].[S]/[ES] = (K2 + Kcat)/ K1 + Km Donc : [ES] = [E].[S]/Km Pour modéliser la relation de michaelis et menten, il y a une dernière loi : la loi de conservation des espèces : [Et] = [E] + [ES]. Toute l'enzyme apportée est retrouvée lorsque l'on fait la somme de E et ES. Dernière expression : expression de la Vmax qui découle de (a) : On aboutit à une expression de la vitesse initiale en fonction de la concentration en substrat. C'est la relation de michaelis-menten. 5/6 2016-2017 Sciences biologiques Elle permet d'identifier trois domaines d’intérêt du tracé : • Manière dont évolue la vitesse initiale en fonction du substrat lorsque la concentration en substrat est très basse. Lorsque [E] << Km, en simplifiant la relation de michaelis menten, on obtient Vo = Vmax . [S] / Km. C'est une relation d'ordre 1 → Vitesse initiale proportionnelle à la concentration en substrat. • Lorsque [S] >> Km, la vitesse tend vers Vmax. Vo devient alors indépendante de la concentration en substrat. C'est une relation d’ordre 2. Lorsque [S] = Km, Vo = Vmax/2 • 6/6