2012TOU30226

%NVUEDELOBTENTIONDU
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-6/*7&34*5²%&506-064&
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$ÏLIVRÏPAR
Université Toulouse III Paul Sabatier (UT3 Paul Sabatier)
$ISCIPLINEOUSPÏCIALITÏ
Physiopathologie
0RÏSENTÏEETSOUTENUEPAR
Xavier GAME
21 Décembre 2012
LE
4ITRE
Régulation par les oestrogènes
du contrôle nitrergique du bas appareil urinaire
%COLEDOCTORALE
Biologie, Santé, Biotechnologies
(BSB)
5NITÏDERECHERCHE
INSERM U1048
$IRECTEURSDE4HÒSE
Professeur Bernard MALAVAUD
2APPORTEURS
Professeur Emmanuel CHARTIER-KASTLER
Professeur Alain
RUFFION
MEMBRESDUJURY:
Professeur Jean-François ARNAL
Professeur Emmanuel CHARTIER-KASTLER
Professeur Bernard MALAVAUD
Docteur Jalesh N. PANICKER
Professeur Pascal RISCHMANN
Professeur Alain RUFFION
Résumé
Chez la femme, la prévalence des symptômes du bas appareil urinaire varie en fonction de la
vie hormonale. Ils sont ainsi plus fréquents pendant la grossesse et après la ménopause. Le
monoxyde d’azote est un médiateur endogène ubiquitaire produit par la monoxyde d’azote
synthase (NOS) dont l’expression est modulée par l’œstradiol au niveau du système nerveux.
Nous montrons que l’œstradiol module également l’expression de l’isoforme neuronale de la
NOS au niveau uréthral. Alors qu’après castration, elle est augmentée, le traitement au long
cours avec des doses gestationnelles d’œstradiol augmente le tonus uréthral et diminue
l'expression de l’isoforme neuronale de la NOS (nNOS) à ce niveau. Nous montrons
également que le sildénafil diminue les résistances uréthrales et ce quel que soit le statut
hormonal et que cet effet passe par la voie de la nNOS. Enfin, nous montrons
qu’indépendamment du statut hormonal, le sildénafil augmente la lubrification vaginale et
que cet effet est nNOS indépendant.
Ces travaux expliquent l’augmentation physiologique du tonus uréthral pendant la grossesse,
suggèrent un effet bénéfique de la délivrance locale d'œstrogènes à doses gestationnelles ou
d’uroSERM dans le traitement de l’incontinence urinaire postménopausique et que, quel que
soit le statut hormonal, le sildénafil pourrait être envisagé comme traitement chez la femme
d’une obstruction sous-vésicale fonctionnelle et comme traitement des troubles de la
lubrification vaginale.
Abstract
In women, the prevalence of lower urinary tract symptoms changes with hormonal life.
Therefore, they are more common during pregnancy and after menopause. Nitric oxide is a
ubiquitous transmitter produced by nitric oxide synthase (NOS) whose expression in the
central nervous system is modulated by estradiol. We show that estradiol modulates NOS
neuronal isoform (nNOS) expression in the urethra. While it is increased after castration,
supraestrus levels of estradiol increase urethral tone and decrease nNOS expression in the
urethra. We also show that sildenafil decreases urethral resistances irrespective of hormonal
status and that this effect depends on the nNOS pathway. Finally, we show that, irrespective
of the hormonal status, sildenafil increases vaginal lubrication in a nNOS independent
manner.
These works explain the physiological increase of urethral tone during pregnancy, suggest a
positive effect of supraestrus doses of estradiol or UroSERM as post-menopausal urinary
incontinence treatments and that sildenafil may be considered as a treatment for functional
bladder outlet obstruction in women and vaginal lubrication disorders, irrespective of
hormonal status.
1
Sommaire
RÉSUMÉ ........................................................................................................................................................... 1
ABSTRACT ........................................................................................................................................................ 1
SOMMAIRE ................................................................................................................................................... 2
TABLE DES FIGURES ET TABLEAUX ...................................................................................................... 4
ABRÉVIATIONS ................................................................................................................................................. 5
INTRODUCTION ............................................................................................................................................. 6
REVUE GÉNÉRALE ......................................................................................................................................... 9
LES TROUBLES DU BAS APPAREIL URINAIRE DE LA FEMME ............................................................................ 10
EPIDÉMIOLOGIE .................................................................................................................................................... 10
En France ..................................................................................................................................................... 10
Dans le monde ............................................................................................................................................. 10
Retentissement ............................................................................................................................................ 11
CLASSIFICATION DES TROUBLES DU BAS APPAREIL URINAIRE ............................................................................................ 11
Les symptômes du bas appareil urinaire ..................................................................................................... 12
Les troubles fonctionnels du bas appareil urinaire ...................................................................................... 14
PHYSIOPATHOLOGIE DES TROUBLES DU BAS APPAREIL URINAIRE ..................................................................................... 14
Physiopathologie de l’hyperactivité vésicale ............................................................................................... 14
Physiopathologie de l’hypoactivité vésicale ................................................................................................ 19
L’hyperactivité de la voie excrétrice uréthrale ............................................................................................. 22
L’hypoactivité de la voie excrétrice uréthrale .............................................................................................. 24
MÉTHODES D’ÉVALUATION DES TROUBLES DU BAS APPAREIL URINAIRE ............................................................................. 28
Le catalogue mictionnel ............................................................................................................................... 28
Le bilan urodynamique ................................................................................................................................ 29
L’uréthrocystographie rétrograde et mictionnelle ....................................................................................... 32
L’échographie vésicale avec mesure du résidu post-mictionnel .................................................................. 32
La fibroscopie uréthro-vésicale .................................................................................................................... 33
ŒSTROGÈNES ................................................................................................................................................. 34
ŒSTROGÈNES ET RÉCEPTEURS AUX ŒSTROGÈNES......................................................................................................... 34
Les œstrogènes ............................................................................................................................................ 34
Les récepteurs des œstrogènes .................................................................................................................... 36
Mécanismes d’action des récepteurs aux œstrogènes ................................................................................ 41
ŒSTROGÈNES ET BAS APPAREIL URINAIRE ................................................................................................................... 43
Œstrogènes et vessie ................................................................................................................................... 44
Œstrogènes et urèthre ................................................................................................................................. 48
Œstrogènes et commande neurologique du bas appareil urinaire.............................................................. 53
Traitement hormonal après la ménopause et bas appareil urinaire ........................................................... 55
Œstrogènes et monoxyde d’azote au niveau du bas appareil urinaire ........................................................ 57
VOIE DU MONOXYDE D’AZOTE ....................................................................................................................... 59
STRUCTURE ET PROPRIÉTÉS PHYSICO-CHIMIQUES DU NO ............................................................................................... 59
LA VOIE DU MONOXYDE D’AZOTE .............................................................................................................................. 62
La synthèse du NO ....................................................................................................................................... 62
Mécanismes d’action du NO ........................................................................................................................ 68
MODULATION DE LA VOIE DU MONOXYDE D’AZOTE ...................................................................................................... 72
Les inhibiteurs des NOS ................................................................................................................................ 73
2
Amplification des effets de la voie du monoxyde d’azote par diminution du catabolisme du second
messager : le GMPc ..................................................................................................................................... 74
EXPRESSION DES DIFFÉRENTES ISOFORMES DE LA MONOXYDE D’AZOTE SYNTHASE ET DES PDE5 AU NIVEAU DU BAS APPAREIL
URINAIRE FÉMININ ................................................................................................................................................. 77
Expression des différentes isoformes de la monoxyde d’azote synthase au niveau du bas appareil urinaire
féminin ......................................................................................................................................................... 77
Expression des phosphodiestérases V au niveau du bas appareil urinaire féminin ..................................... 79
MONOXYDE D’AZOTE, PDE5 ET FONCTION VÉSICALE .................................................................................................... 80
Monoxyde d’azote et physiologie vésicale .................................................................................................. 80
PDE5 et physiologie vésicale ........................................................................................................................ 82
NOS, PDE5 et pathologies vésicales ............................................................................................................. 82
NO ET FONCTION DE L’URÈTHRE ............................................................................................................................... 85
NO et physiologie uréthrale ......................................................................................................................... 85
PDE5 et physiologie uréthrale...................................................................................................................... 86
NOS, PDE5 et physiopathologie uréthrale ................................................................................................... 86
NOS ET COMMANDE NEUROLOGIQUE DU BAS APPAREIL URINAIRE................................................................................... 87
MATÉRIEL ET MÉTHODES .......................................................................................................................... 90
EXPÉRIMENTATION ANIMALE ........................................................................................................................ 91
PRODUITS UTILISÉS ................................................................................................................................................ 91
MANIPULATIONS HORMONALES ............................................................................................................................... 92
EXPLORATIONS FONCTIONNELLES PHYSIOLOGIQUES ..................................................................................... 93
CALENDRIER MICTIONNEL........................................................................................................................................ 93
CYSTOMANOMÉTRIE .............................................................................................................................................. 93
PRESSION VÉSICALE AU POINT DE FUITE ...................................................................................................................... 94
STIMULATION CERVICO-VAGINALE ET MESURE DE LA LUBRIFICATION VAGINALE .................................................................. 95
ETUDE ANATOMO-PATHOLOGIQUE ............................................................................................................... 95
PRÉLÈVEMENT DE L’APPAREIL URINAIRE ..................................................................................................................... 95
ETUDE HISTOLOGIQUE ............................................................................................................................................ 96
ETUDE HISTOMORPHOMÉTRIQUE .............................................................................................................................. 96
EXTRACTION ET IMMUNOEMPREINTE PROTÉIQUE ......................................................................................................... 98
RÉSULTATS EXPÉRIMENTAUX ....................................................................................................................... 100
ESTRADIOL INCREASES URETHRAL TONE THROUGH THE LOCAL INHIBITION OF NEURONAL NITRIC OXIDE
SYNTHASE EXPRESSION ................................................................................................................................ 102
INFLUENCE OF SILDENAFIL ON MICTURITION AND URETHRAL TONE IN OVARIECTOMIZED AND NONOVARIECTOMIZED MICE ............................................................................................................................... 109
VAGINAL LUBRICATION AFTER CERVICOVAGINAL STIMULATION IS FACILITATED BY PHOSPHODIESTERASE-V
INHIBITION IN OVARIECTOMISED MICE. ....................................................................................................... 115
DISCUSSION ET PERSPECTIVES ............................................................................................................... 132
EFFETS DES TAUX GESTATIONNELS D’ŒSTRADIOL SUR LA FONCTION ET LA MORPHOLOGIE DU BAS APPAREIL
URINAIRE ET SUR L’EXPRESSION URÉTHRALE DE LA NNOS. .......................................................................... 133
IMPACT DU SILDÉNAFIL, INHIBITEUR SPÉCIFIQUE DE LA PHOSPHODIESTÉRASE DE TYPE V, SUR LE TONUS
URÉTHRAL EN FONCTION DU STATUT ŒSTROGÉNIQUE ............................................................................... 134
IMPACT DU SILDÉNAFIL, SUR LA LUBRIFICATION VAGINALE EN FONCTION DU STATUT ŒSTROGÉNIQUE .... 135
BIBLIOGRAPHIE ........................................................................................................................................ 137
3
Table des Figures et Tableaux
Figures
Figure 1: Prévalence (%) dans la population générale des différents types d’incontinence et du
syndrome clinique d’hyperactivité vésicale selon l’étude EPIC réalisée au Canada,
Allemagne, Italie, Suède et Royaume-Uni ............................................................................... 13
Figure 2: Diagramme schématique des différentes structures, des neurotransmetteurs et des
facteurs de croissance intervenant dans la sensibilité vésicale................................................. 19
Figure 3: Mécanisme de survenue d’une rétention d’urine dans le désordre primaire de la
relaxation sphinctérienne ou syndrome de Fowler ................................................................... 22
Figure 4 : Voie principale de la biosynthèse des œstrogènes ................................................... 35
Figure 5: Représentation schématique de l’organisation génique et protéique d’ERα ............ 37
Figure 6: Structure du gène ESR2 et de la protéine ERβ ......................................................... 40
Figure 7: Mécanisme d’action des récepteurs aux œstrogènes. ............................................... 43
Figure 8: Structure de Lewis du monoxyde d'azote ................................................................. 59
Figure 9: Voie et mode d’action direct du monoxyde d’azote ................................................. 62
Figure 10: Synthèse endogène de l’arginine à partir de la Citrulline ....................................... 64
Figure 11: Fonctionnement général des NOS .......................................................................... 65
Figure 12 : Cascade chimique conduisant à la production de monoxyde d’azote à partir de LArginine .................................................................................................................................... 67
Figure 13: Représentation schématique des trois mécanismes d’action du NO....................... 72
Figure 14: Calendrier mictionnel ............................................................................................. 93
Figure 15: Cystomanométrie .................................................................................................... 94
Figure 16: Pression vésicale au point de fuite. ......................................................................... 94
Figure 17: Stimulation cervico-vaginale .................................................................................. 95
Figure 18: A : Coupe d'uretère au microscope optique X 400. Coloration trichrome bleu de
Masson ..................................................................................................................................... 97
Figure 19: A : Coupe d'urèthre au microscope optique X 100. Coloration trichrome bleu de
Masson ..................................................................................................................................... 97
Figure 20: A : Coupe de la paroi vésicale au microscope optique X 160. Coloration trichrome
bleu de Masson. ........................................................................................................................ 97
Figure 21: A: Coupe de la paroi vaginale au microscope optique X40. Coloration trichrome
bleu de Masson. ........................................................................................................................ 97
Tableaux
Tableau 1 : Estimation du nombre de femmes dans le monde qui avaient des symptômes du
bas appareil urinaire en 2008 et répartition selon leur type ..................................................... 11
Tableau 2 : caractéristiques des trois isoformes de NO-synthases ........................................... 65
Tableau 3: Affinité des inhibiteurs pour les différentes NOS .................................................. 74
Tableau 4: Sélectivité relative des NOS ................................................................................... 74
Tableau 5: Distribution cellulaire des isoformes de la PDE5 .................................................. 75
Tableau 6 : Propriétés pharmocologiques des trois inhibiteurs des PDE5 disponibles en France
.................................................................................................................................................. 76
4
Abréviations
ADMA : Asymmetric dimethylarginine
ATP : Adénosine triphosphate
CGRP : Calcitonin Gene-Related Peptide
DBD: DNA-Binding Domain
E1 : Estrone
E2 : Œstradiol
E3 : Estriol
eNOS : Isoforme endothéliale de la monoxyde d’azote synthase
ER : Récepteurs aux œstrogènes
ERE : Estrogen Responsive Elements
GMPc : Guanosine MonoPhosphate cyclique
GCs : Guanylate cyclase soluble
GTP : Guanosine TriPhosphate
iNOS : Isoforme inductible de la monoxyde d’azote synthase
LBD: Ligand-Binding Domain
L-NMMA : N-méthyl-L-arginine
L-NAME : N1-nitro-L-arginine méthylester
NGF: Nerve Growth Factor
NADPH : β-nicotinamide adénine dinucléotide réduit
NO : Monoxyde d’azote
NOS : Monoxyde d’azote synthase
nNOS : Isoforme neuronale de la monoxyde d’azote synthase
PDE : Phosphodiestérase
SERM: Modulateurs sélectifs des récepteurs des œstrogènes
TGF β : Transforming Growth Factor β
TRPV 1: Transient Receptor Potential Vanilloïde 1
7-NI: 7-Nitroindazole
5
Introduction
6
La prévalence des symptômes du bas appareil urinaires chez la femme est élevée. Elle
était en 1993, en France de 39,1% (1). Elle augmente dans deux périodes hormonales
particulières de la vie féminine: la grossesse et la ménopause (2). Cette dernière fait évoquer
un facteur hormonal, œstrogénique notamment, dans la genèse de ces troubles.
Le monoxyde d’azote (NO) est un médiateur endogène ubiquitaire synthétisé par trois
isoformes de la monoxyde d’azote synthase (NOS), l’isoforme neuronale de la NOS (nNOS
ou NOS I, l’isoforme inductible de la NOS (iNOS ou NOS-II) et l’isoforme endothéliale de la
NOS (eNOS ou NOS-III).
Trois observations distinctes ont attiré notre attention sur les relations existant entre
l’œstradiol, la fonction uréthro-vésicale et la nNOS.
Il s’agit premièrement d’une observation originale (JF Arnal, Inserm U397, Laboratoire
d’Endocrinologie et de Communication Cellulaire, Toulouse) selon laquelle l’imprégnation
œstrogénique prolongée à des taux gestationnels de souris femelles ovariectomisées était
associée à une dilatation vésicale et du haut appareil urinaire.
La deuxième observation, rapportée en 1997 par Burnett (3), indiquait que l’invalidation du
gène de la nNOS chez des souris transgéniques était associée à l’apparition de troubles
mictionnels associant des mictions fréquentes de faibles volumes et une dilatation vésicale et
du haut appareil urinaire.
La troisième observation est la modulation par l’œstradiol de l’expression de la nNOS au
niveau du système nerveux central et périphérique (4, 5).
7
Les objectifs de notre travail étaient :
1. d’évaluer les effets des taux gestationnels d’œstradiol sur la fonction et la morphologie du
bas appareil urinaire et sur l’expression uréthrale de la nNOS.
2. d’évaluer en fonction du statut œstrogénique l’impact du sildénafil, inhibiteur spécifique
de la phosphodiestérase de type V, sur le tonus uréthral.
3. d’évaluer en fonction du statut œstrogénique l’impact du sildénafil, sur la lubrification
vaginale.
8
Revue générale
9
Les troubles du bas appareil urinaire de la femme
Epidémiologie
En France
En France, en 1993, 39,1% des femmes adultes présentaient des symptômes du bas appareil
urinaire, 25 % une pollakiurie, 24 % une urgenturie et 21 % une incontinence urinaire (1). La
dysurie était plus rare. Récemment, Lasserre rapportait une prévalence de l’incontinence
urinaire chez la femme de 26,8 % et que la répartition en fonction du type était une
incontinence urinaire d’effort dans 45,2 % des cas, une incontinence urinaire mixte dans 42,1
% des cas, une incontinence urinaire par urgenturie dans 10,9 % des cas et de type
indéterminé dans 2 % des cas (6).
L’incidence de ces symptômes du bas appareil urinaire varie en fonction de l’âge et de la vie
hormonale (7, 8). Ainsi, elle augmente avec l’âge et est particulièrement élevée dans deux
périodes hormonales particulières de la vie féminine: la grossesse et la ménopause (9, 10).
Pendant la grossesse, jusqu’à 90 % des femmes ont des symptômes du bas appareil urinaire.
Soixante pour cent ont une pollakiurie, 32 % des fuites d’urine, 30 % une rétention chronique
d’urine et 25 % une dysurie (10). Ces symptômes sont spontanément résolutifs après la
grossesse. Après la ménopause, jusque 63 % des femmes présentent des symptômes du bas
appareil urinaire (1, 2). Quarante pour cent ont des fuites d’urine (11).
Dans le monde
Dans le monde, les symptômes de la phase de remplissage sont les plus fréquents et
affectaient 35,4 % des femmes en 2008 (12). La prévalence des symptômes de la phase
mictionnelle et de la phase post-mictionnelle chez la femme étaient respectivement de 18,5 %
et 13,8 %. Ces symptômes sont par ordre décroissant plus fréquents en Asie, Europe, Afrique,
Amérique du Nord et Amérique du Sud et une augmentation de leur prévalence de 15,5 %
d’ici 2018 est attendue.
10
La répartition des différents symptômes urinaires du bas appareil est présentée dans le tableau
1.
Type de troubles
Tous types de troubles
Symptômes de la phase de remplissage
Nycturie≥2
Urgenturie
Pollakiurie
Incontinence urinaire
Incontinence urinaire d’effort
Incontinence urinaire par urgenturie
Incontinence urinaire mixte
Symptômes de la phase mictionnelle
Jet haché
Faiblesse du jet
Miction par poussée
Gouttes terminales
Symptômes de la phase post-mictionnelle
Sensation de vidange vésicale incomplète
Gouttes retardataires
Nombre
1 382 747 558
1 252 107 326
464 940 904
249 837 613
160 947 117
250 205 314
127 568 529
27 268 012
42 645 806
402 617 124
148 382 880
122 766 573
83 353 097
210 911 393
297 620 365
257 979 864
64 037 018
Tableau 1 : Estimation du nombre de femmes dans le monde qui avaient des symptômes du bas
appareil urinaire en 2008 et répartition selon leur type (12).
Retentissement
L’ensemble de ces symptômes du bas appareil urinaire ont un retentissement psychologique,
social et professionnel et ont des conséquences financières élevées (13). Ils sont également
responsables d’une altération de la qualité de vie. Robertson rapporte à partir des études
BACH et UREPIK que des symptômes modérés du bas appareil urinaire sont responsables
d’une altération de la qualité de vie du même ordre qu’un diabète, un cancer ou une
hypertension artérielle (14). De par leur fréquence et du fait de leur retentissement, les
troubles du bas appareil urinaire constituent un réel problème de santé publique.
Classification des troubles du bas appareil urinaire
Les troubles du bas appareil urinaire peuvent être classés de deux manières : soit en se basant
sur les seuls symptômes, soit en se basant sur une approche fonctionnelle divisant le bas
11
appareil urinaire en région vésicale et voie excrétrice pendant le remplissage et la vidange et
classant l’activité en excessive, normale ou insuffisante.
Les symptômes du bas appareil urinaire
La définition des symptômes présentée ici correspond à la traduction française proposée par
l’Association
Française
d’Urologie
et
la
Société
Interdisciplinaire
Francophone
d’UroDynamique et de Pelvi-Périnéologie de la terminologie adoptée par l’International
Continence Society (ICS) en 2002 (15, 16). Ils sont séparés en trois groupes : les symptômes
de la phase de remplissage, les symptômes de la phase mictionnelle et les symptômes de la
phase post-mictionnelle.
Les symptômes de la phase de remplissage
L’urgenturie correspond à un désir soudain, impérieux et fréquemment irrépressible d’uriner.
La pollakiurie est définie par une augmentation de la fréquence des mictions ou des besoins.
La diurèse quotidienne est inchangée mais les volumes urinés par miction sont diminués.
La nycturie est définie comme un besoin d’uriner réveillant le patient.
L’incontinence urinaire est définie comme étant une fuite involontaire d’urine. L’incontinence
urinaire est de deux types : l’incontinence à l’effort ou incontinence d’origine uréthrale et
l’incontinence par urgenturie ou incontinence d’origine vésicale. L’incontinence urinaire à
l’effort est une fuite involontaire d’urine lors d’un effort physique, lors de la toux et
d’éternuements. L’incontinence urinaire par urgenturie est une fuite involontaire d’urine
accompagnée ou immédiatement précédée par une urgenturie. Ces deux formes
d’incontinence peuvent être associées. Nous parlons alors d’une incontinence urinaire mixte.
La répartition des différents types d’incontinence dans la population générale féminine est
présentée figure 1.
12
Figure 1: Prévalence (%) dans la population générale des différents types d’incontinence et du
syndrome clinique d’hyperactivité vésicale selon l’étude EPIC réalisée au Canada, Allemagne, Italie,
Suède et Royaume-Uni (8).
OAB : Hyperactivité vésicale ; UUI : incontinence urinaire par urgenturie ; MUI : incontinence
urinaire mixte ; SUI : incontinence urinaire d’effort ; UI : incontinence urinaire.
Les symptômes de la phase mictionnelle
Les différents symptômes de la phase mictionnelle sont une faiblesse du jet définie par la
perception d’une diminution de la force du jet urinaire pendant le miction, un jet en arrosoir,
un jet haché défini par une miction interrompue à une ou plusieurs reprises, un jet hésitant
défini par un retard à l’initiation de la miction, une miction par poussée définie par un jet
urinaire obtenu avec une poussée abdominale concomitante et enfin des gouttes terminales ou
miction traînante correspondant à un achèvement progressif et lent de la miction qui se
termine par un écoulement en goutte à goutte.
Les symptômes de la phase post-mictionnelle
Ils correspondent aux symptômes ressentis immédiatement après la fin de la miction. Ils sont
de deux types : la sensation de vidange vésicale incomplète définie comme une impression
subjective que la vessie ne s’est pas totalement vidée après la miction et les gouttes
retardataires correspondant à une perte involontaire d’urine survenant immédiatement après la
miction, le plus souvent en se levant des toilettes pour la femme.
13
Les troubles fonctionnels du bas appareil urinaire
Dysfonction vésicale
Vessie hyperactive
Le syndrome clinique d’hyperactivité vésicale est défini par la survenue d’urgenturies avec ou
sans incontinence urinaire, habituellement associées à une pollakiurie ou une nycturie. Ce
syndrome est évocateur d’une vessie hypersensible et/ou d’une hyperactivité détrusorienne
qui seront mis en évidence par la réalisation d’un bilan urodynamique.
Vessie hypoactive
La contractilité vésicale est diminuée voire abolie. Cela se traduit cliniquement par un
syndrome dysurique.
Voie excrétrice uréthrale et plancher pelvien
Voie excrétrice uréthrale hypoactive
Les résistances uréthrales sont abaissées. Cela se traduit cliniquement par une incontinence
urinaire à l’effort.
Voie excrétrice uréthrale hyperactive
Les résistances uréthrales sont augmentées. Cela se traduit cliniquement par un syndrome
dysurique, parfois une incontinence par regorgement, une rétention chronique ou aigue
d’urine, une pollakiurie et une urgenturie.
Physiopathologie des troubles du bas appareil urinaire
Le bon fonctionnement du bas appareil urinaire impose une intégrité du support anatomique,
histologique et de la commande neurologique.
Physiopathologie de l’hyperactivité vésicale
L’hypersensibilité vésicale
14
Elle est liée à des facteurs neurogènes, psychogènes, inflammatoires ou des troubles de la
perméabilité de la muqueuse.
L’hypersensibilité vésicale d’origine neurogène peut être en rapport avec une augmentation
du nombre de récepteurs vésicaux, une modification de la répartition du type de fibres
nerveuses (augmentation du nombre de fibres C) ou une diminution de l’inhibition centrale
soit en rapport avec une lésion suprapontique soit en rapport avec une lésion des voies
spinales inhibitrices descendantes.
L’hypersensibilité vésicale d’origine psychogène est en rapport avec une levée d’inhibition
centrale survenant dans des situations émotionnelles importantes (peur, orgasme, fou rire…),
de stress (angoisse…) ou selon le lieu (syndrome de la clé dans la serrure).
L’hypersensibilité d’origine inflammatoire est liée à une augmentation des stimuli locaux
comme cela se rencontre lors d’une infection urinaire, d’un carcinome urothélial, d’une
lithiase urinaire, d’instillation d’agents cytotoxiques ou d’immunothérapie (mitomycine,
BCG…).
L’hypersensibilité par trouble de la perméabilité de la muqueuse vésicale correspond à une
destruction de la couche de glycosaminoglycanes. Cela se rencontre dans le syndrome
douloureux vésical/cystite interstitielle (17).
L’hyperactivité détrusorienne
L’hyperactivité détrusorienne peut être d’origine neurologique, secondaire à une
hypersensibilité vésicale, une obstruction sous-vésicale, des troubles du plancher pelvien, des
modifications de la paroi vésicale liées à l’âge et au déficit œstrogénique ou être idiopathique.
L’hyperactivité détrusorienne d’origine neurologique fait suite le plus souvent à une atteinte
du système nerveux central au niveau médullaire (au-dessus de T10) ou suprapontique. Ces
patients perdent la capacité d’inhiber volontairement le centre de la miction (18).
L’hyperactivité détrusorienne est alors médiée par un réflexe spinal.
15
Dans de plus rares cas, elle peut être liée à une neuropathie périphérique.
L’hyperactivité détrusorienne secondaire à une obstruction sous-vésicale peut avoir plusieurs
mécanismes. Elle peut être en rapport avec une dénervation partielle qui conduit à une
hypersensibilité du détrusor à l’acétylcholine et à l’adénosine triphosphate (ATP), des
changements de propriétés du détrusor (diminution de la propagation de l’activité électrique
entre les cellules musculaires conduisant à une plus grande instabilité du potentiel
membranaire favorisant la dépolarisation cellulaire et activant les canaux calciques de type L)
(19, 20) et une augmentation de l’expression du Nerve Growth Factor (NGF) conduisant à une
hypertrophie des fibres afférentes et efférentes aboutissant à une facilitation du réflexe
mictionnel spinal (21, 22). Le mécanisme de dénervation reste encore mal connu. Une des
hypothèses la plus fréquemment rapportée est une réduction du flux sanguin secondaire à
l’augmentation de la pression intravésicale soit lors de la miction soit lors du remplissage
chez les patients ayant une hypertrophie de la paroi vésicale. Ces hypothèses sont étayées par
des études chez le chien et le porc montrant que l’obstruction sous-vésicale était associée à
une ischémie de la paroi vésicale (23, 24). Plus récemment, a été rapporté que l’isoforme
inductible de la monoxyde d’azote synthase était nécessaire pour prévenir les
dysfonctionnements du détrusor secondaires à une obstruction (25). Ainsi le monoxyde
d’azote induisant une vasodilatation et diminuant l’agrégation plaquettaire diminue l’ischémie
pariétale vésicale.
L’hyperactivité détrusorienne secondaire aux troubles du plancher pelvien fait intervenir les
connections entre les afférences uréthrales et le réflexe mictionnel. En 1931, Barrington
rapportait que, chez le chat, l’écoulement d’eau à travers l’urèthre et la distension de sa
portion proximale entrainait l’apparition d’une contraction vésicale (26). Cela a depuis été
confirmé en particulier par Jung qui a montré que la perfusion de l’urèthre facilitait la
contractilité détrusorienne et que l’instillation de lidocaïne au niveau de l’urèthre diminuait la
16
fréquence des contractions vésicales (27). Parallèlement, Robain a montré chez la brebis
éveillée qu’après occlusion du col vésical, l’instillation de sérum physiologique dans la partie
proximale de l’urèthre induisait une contraction du détrusor et que cette réponse disparaissait
après anesthésie locale de la muqueuse uréthrale (28). Ainsi chez les patients ayant une
béance du col vésical ou ayant un défaut de support de l’urèthre, l’urine s’écoule facilement
dans l’urèthre postérieur induisant ainsi une hyperactivité détrusorienne.
L’hyperactivité détrusorienne est dite idiopathique lorsque toutes les causes connues de
contractions non inhibées du détrusor ont été éliminées. Elle peut avoir une origine
myogénique, être en rapport avec des modifications du fonctionnement de l’urothélium et du
sous-urothélium et des récepteurs muscariniques. Brading a montré que des modifications du
comportement et des connections entre les fibres musculaires lisses étaient nécessaires pour la
survenue d’une hyperactivité détrusorienne (29, 30). De plus, sur des biopsies du détrusor de
patients ayant une hyperactivité du détrusor idiopathique a été mise en évidence une
diminution importante de l’innervation vésicale. Il a alors été supposé que cette dénervation
partielle était responsable d’une augmentation de l’excitabilité et du couplage des cellules
musculaires (31). Trois types de connexines sont exprimées au niveau de la paroi vésicale de
l’homme : la connexine 43 est exprimée au niveau des cellules musculaires lisses (32), et des
cellules myofibroblastiques du suburothélium (33-35), la connexine 45 est présente au niveau
des cellules musculaires lisses (36) et la connexine 40 au niveau des cellules endothéliales
vasculaires (33-35). Roosen a rapporté une augmentation de l’expression de la connexine 43 à
la fois chez les patients ayant une hyperactivité détrusorienne neurogène et chez ceux ayant
une hyperactivité détrusorienne idiopathique (37). Phé a récemment confirmé le rôle de la
connexine 43 et a montré celui de la connexine 45 dans l’hyperactivité du détrusor neurogène
(38). Cependant, d’autres ont rapporté que le couplage des gap jonctions était plutôt diminué
chez ces patients (35).
17
Le rôle de l’urothélium et des myofibroblastes sous-urothéliaux dans l’activation de
l’afférence fait actuellement l’objet de multiples travaux et semble jouer un rôle prédominant
dans l’hyperactivité détrusorienne qu’elle soit idiopathique ou neurogène. Les terminaisons
des fibres C afférentes sont habituellement situées au niveau du sous-urothélium vésical mais
elles peuvent parfois être également présentes au niveau de l’urothélium (39). Au niveau de
ces terminaisons, sont présents des récepteurs à l’ATP (P2X3 et P2Y) et des récepteurs
vanilloïdes (Transient Receptor Potential Vanilloïde 1, TRPV1). Chez les patients ayant une
hyperactivité détrusorienne, il a été rapporté une augmentation de l’expression de ces deux
types de récepteurs (40). Parallèlement, il a été rapporté que chez la femme ayant une
hyperactivité détrusorienne idiopathique, la densité des fibres sensibles à la substance P et au
calcitonin gene-related peptide (CGRP) était augmentée au niveau du sous-urothélium (41).
Enfin il a été montré par des techniques de microdialyse que l’urothélium était capable de
libérer de l’Acétylcholine et que cette libération intervenait lors de l’étirement de la paroi
vésicale (42). Au niveau de l’urothélium, se trouvent des récepteurs muscariniques qui sont
principalement de type M2 (43). Au niveau des myofibroblastes ont également été mis en
évidence des récepteurs muscariniques de type M2 et M3. Ainsi, l’acétylcholine libérée par
l’urothélium peut activer les récepteurs muscariniques locaux par un effet autocrine mais
aussi les voies afférentes. Yoshida a rapporté que la production d’Acétylcholine par
l’urothélium était âge dépendante et plus fréquente après 65 ans (42) et Mukerji a rapporté
une augmentation de l’expression des récepteurs M2 et M3 au niveau des myofibroblastes
chez les patients ayant une hyperactivité détrusorienne idiopathique (44).
Ainsi, en réponse à une stimulation qui peut être mécanique (étirement) ou chimique (pH) ou
thermique (froid), l’urothélium va libérer des neurotransmetteurs tels que l’acétylcholine,
l’ATP et des neuropeptides tels que la substance P (figure 2). Parallèlement, des
prostaglandines et du monoxyde d’azote sont synthétisés au niveau de la muqueuse et de la
18
musculeuse et libérés lors de la distension vésicale (45, 46). Il est fort probable qu’une
cascade de médiateurs activateurs (ATP, Prostaglandines, tachykinines) et inhibiteurs (NO)
soit impliquée dans les mécanismes activant les fibres afférentes sensitives lors du
remplissage vésical (47).
Figure 2: Diagramme schématique des différentes structures, des neurotransmetteurs et des facteurs de
croissance intervenant dans la sensibilité vésicale. Les flèches indiquent les connections augmentées
dans l‘hyperactivité détrusorienne. Les flèches fines correspondent à la voie purinergique au sein de
laquelle l’ATP libérée par l’urothélium va activer les récepteurs P2X3-P2Y urothéliaux et sousurothéliaux et va potentialiser la réponse des récepteurs TRPV1 aux mêmes niveaux. Les flèches en
fins pointillés montrent la voie cholinergique au sein de laquelle l’acétylcholine (Ach) libérée par
l’urothélium va activer les fibres nerveuses urothéliales et sous-urothéliales et les récepteurs
muscariniques du détrusor. Les flèches en pointillés épais correspondent à la voie de la substance P
qui, libérée au niveau du sous-urothélium va activer les récepteurs NK1 au niveau de la couche des
myofibroblastes et potentialiser l’activation des récepteurs TRPV1-P2X3. Les flèches épaisses
correspondent à l’impact du NGF qui module l’expression urothélial et sous-urothéliale des récepteurs
TRPV1. d’après Apostolidis (48)
Physiopathologie de l’hypoactivité vésicale
La physiopathologie de l’hypoactivité vésicale a été nettement moins étudiée que celle de
l’hyperactivité vésicale. Elle peut être d’origine neurologique, myogénique, secondaire à une
inhibition pharmacologique ou liée à une hyperactivité du plancher pelvien.
19
L’hypoactivité vésicale d’origine neurogène peut être en rapport avec une atteinte des centres
mictionnels encéphaliques, le plus souvent au niveau du tronc cérébral, du cervelet, des
noyaux gris de la base du crâne, de la moelle épinière (choc spinal ou atteinte médullaire en
dessous de T10), du cône médullaire, de la queue de cheval, des voies périphériques de
conduction afférentes ou efférentes et des relais ganglionnaires. La cause de l’inhibition de
l’afférence vésicale peut aussi être liée à un excès de stimulation périnéale (inhibition réflexe
viscéro-viscérale ou nociceptive) comme c’est le cas, par exemple après chirurgie
proctologique, un accouchement traumatique, en présence d’un fécalome…
L’origine myogénique est liée à une atteinte de la fibre musculaire lisse soit en rapport avec
une dystrophie musculaire, une modification des constituants de la paroi vésicale (Amylose),
soit secondaire à une obstruction sous-vésicale soit liée à l’âge. Dans cette dernière situation,
il a été rapporté une dédifférenciation musculaire lisse par déplétion en caveolae conduisant à
une altération de la mobilisation du calcium intracellulaire et ainsi à une hypocontractilité
vésicale (49). L’obstruction sous-vésicale prolongée va être responsable d’altérations du
fonctionnement vésical soit sous la forme d’une hyperactivité vésicale comme décrit ci-dessus
soit sous la forme d’une hypoactivité vésicale. L’étirement prolongé et répété de la paroi
vésicale ainsi que la lutte contre un obstacle lors de la contraction permictionnelle du détrusor
induisent des zones d’hypoxie par ischémie au niveau de la paroi vésicale, une déplétion en
fibre musculaire lisse et en fibre nerveuse (50-52). La dénervation focale intramurale du
détrusor est très précoce et survient chez l’animal dès la première semaine d’obstruction (53)
et est responsable lors des études en bains d’organes isolés d’une diminution de la réponse
contractile à la stimulation électrique. L’importance de l’hypoxie dépend de l’espèce étudiée,
ainsi le rat y est moins sensible que le lapin (51). Toutefois les phénomènes d’ischémie
reperfusion sont responsables de production de radicaux libres et ainsi d’atteinte des fibres
nerveuses et musculaires (54, 55). Une des voies en cause dans les remaniements au niveau de
20
la musculeuse est l’expression abondante au sein de l’urothélium d’une cytokine
proinflammatoire, le macrophage migration inhibitory factor concourant à la survie des
fibroblastes et à l’apoptose des fibres musculaires lisses (56). Dans le même sens, l’expression
augmentée du Transforming Growth Factor β (TGF β) favorise également une augmentation
de la densité des structures extracellulaires induisant en particulier la production de fibrose
(57).
L’hypocontractilité vésicale d’origine iatrogène médicamenteuse est fréquente. Elle est liée
soit à une action directe sur la paroi vésicale soit sur la commande neurologique dans sa
composante afférente ou efférente. Les familles en cause les plus fréquentes sont les
neuroleptiques, les antidépresseurs, les anticholinergiques et atropiniques, les morphiniques et
dérivés, les anesthésiants en particulier locorégionaux, certaines benzodiazépines, les
antagonistes des canaux calciques et les injections intradétrusoriennes de toxine botulique
(58).
Une hyperactivité du plancher pelvien, quel qu’en soit la cause, peut être responsable d’une
inhibition de la contractilité vésicale. Le mécanisme sous-jacent a été récemment décrit dans
le syndrome de Fowler grâce à la neuromodulation des racines sacrées postérieures et
l’imagerie fonctionnelle. La première en permettant une rapide restauration d’une miction
normale accompagnée d’une contractilité détrusorienne retrouvée nous a indiqué que la
rétention chronique d’urine était de nature fonctionnelle et non structurale (59). L’imagerie
fonctionnelle par tomographie à émission de positons a montré que les patientes atteintes de
ce syndrome avaient une hypoactivité au niveau du mésencéphale, plus précisément de la
substance grise périaqueducale et un renforcement de l’activité du cortex limbique et que la
neuromodulation permettait un retour à un fonctionnement normal du contrôle neurologique
de l’appareil vésicosphinctérien (60). Récemment, Kavia a proposé comme hypothèse
physiopathologique à partir d’études par imagerie par résonance magnétique fonctionnelle
21
que l’hyperactivité sphinctérienne générait des signaux afférents anormalement augmentés qui
inhibaient les voies afférentes vésicales désactivant ainsi la substance grise périaqueducale et
les centres sus-jacents (figure 3) (61).
Figure 3: Mécanisme de survenue d’une rétention d’urine dans le désordre primaire de la relaxation
sphinctérienne ou syndrome de Fowler. Adapté d’après Kavia (61). L’hyperactivité sphinctérienne
génère des signaux afférents uréthraux anormalement augmentés inhibant les voies afférentes vésicales
et désactivant la substance grise périaqueducale et les centres sus-jacents.
Le
dernier
mécanisme
de
survenue
d’une
hypoactivité
vésicale
est
l’origine
psychofonctionnelle où l’inhibition est psychogène (conversion hystérique, psychose…).
L’hyperactivité de la voie excrétrice uréthrale
Physiologiquement, les résistances uréthrales sont nulles lors de la miction afin que la vidange
vésicale soit aisée et complète. A l’inverse, en cas d’hyperactivité de la voie excrétrice
uréthrale, les résistances uréthrales sont augmentées. Nous n’allons pas détailler ici les
obstructions anatomiques et nous limiter aux causes fonctionnelles.
L’augmentation
des
résistances
uréthrales
peut
avoir
une
origine
neurologique,
comportementale, génétique et myogène.
Les atteintes de la moelle épinière au-dessus de T10 et du tronc cérébral sont responsables de
la survenue d’une dyssynergie vésico-sphinctérienne correspondant à un renforcement de la
contraction sphinctérienne lors de la contraction vésicale. Les atteintes médullaires plus bas
22
situées et en particulier les atteintes du cône médullaire sont fréquemment associées à la
survenue d’une hypertonie sphinctérienne et un défaut de relâchement sphinctérien lors de la
vidange vésicale.
Les causes comportementales se manifestent par une augmentation du tonus sphinctérien
s’intégrant le plus souvent dans une exacerbation plus générale du tonus périnéal (anisme,
vaginisme chez la femme…). Plusieurs pathologies ont ainsi été décrites tels que le syndrome
d’Hinman chez l’enfant (62), le syndrome du plancher périnéal spastique, l’hyperactivité du
plancher pelvien et l’hypertonie du plancher pelvien d’origine non neurogène (63, 64).
Plusieurs facteurs favorisant ont été rapportés : une invalidité ou une maladie chronique, un
divorce ou un désordre familial, un syndrome de Munchausen by proxy, l’alcoolisme, profil
particulier du père (père dominateur et castrateur), des sévices sexuels, le placement des
enfants, des troubles de l’attention et des antécédents de pathologies douloureuses périnéales
(65, 66). Les différentes hypothèses physiopathologiques sont une augmentation du tonus
orthosympathique, des mécanismes réflexes locaux en particulier en présence de pathologie
douloureuse pelvi-périnéale et une exacerbation de la stimulation pudendale d’origine
centrale.
Les pathologies génétiques responsables d’une augmentation des résistances uréthrales sont
constituées principalement par le syndrome d’Ochoa (67) qui est lié à une anomalie située sur
le chromosome 10q23-q24 et dont la transmission est autosomique récessive (68). Plusieurs
hypothèses quant au support anatomique et physiologique de ce syndrome, ont été proposées.
La plus fréquemment retenue est une lésion au niveau du tronc cérébral où sont localisés les
centres régulant la miction et l’expression faciale (69). Cependant, toutes les explorations
cliniques (examen neurologique) et paracliniques neurologiques (IRM, tomographie à
émission de positons) n’ont jamais mis d’anomalie en évidence.
23
L’augmentation des résistances uréthrales peuvent aussi avoir une origine myogène comme
c’est le cas dans le syndrome de Fowler ou désordre primaire de la relaxation sphinctérienne,
pathologie ne survenant que chez la femme (70, 71). L’hypothèse initiale était l’existence
d’un désordre hormonal par hypoprogestéronémie. Cette hypothèse a ensuite été renforcée par
les caractéristiques cliniques de ces patientes qui en dehors d’une fréquence élevée de
syndrome
des
ovaires
polykystiques
avaient
également
des
signes
cliniques
d’hyperandrogénie (hirsutisme et acné) et une incidence élevée pour l’âge d’antécédents de
chirurgie gynécologique à type de curetage ou d’hystérectomie, le plus souvent réalisés pour
traiter des ménorragies (72). Parallèlement, la progestérone a un effet stabilisateur connu de la
membrane cellulaire. Son déficit pourrait donc favoriser l’apparition de communications
éphatiques. Les données électromyographiques sont d’ailleurs évocatrices d’un tel
dysfonctionnement et suggèrent une altération de la stabilité de la membrane musculaire
conduisant à des communications anormales entre les cellules responsables d’un état
d’hyperexcitabilité des fibres musculaires. Cette situation est considérée comme
caractéristique des pathologies des canaux voltage-dépendants ou "channélopathies" (73). Il
s’agirait donc ici d’une "channélopathie" hormono-dépendante.
L’hypoactivité de la voie excrétrice uréthrale
Pendant la phase de remplissage vésical, les résistances uréthrales doivent être en permanence
supérieures à la pression intravésicale et ce au repos et à l’effort. Pour cela, plusieurs
mécanismes rentrent en jeu : un tonus uréthral intrinsèque suffisant qui augmentera à l’effort
et tout au long du remplissage et des structures de soutien et de suspension de l’urèthre
efficientes (74, 75). Nous allons ici centrés notre propos uniquement sur les mécanismes
incriminés dans l’abaissement du tonus uréthral intrinsèque.
Les principaux composants du tonus uréthral sont la muqueuse, la musculeuse lisse, la
musculeuse striée et les vaisseaux péri-uréthraux. La diminution des résistances uréthrales
24
peut donc être en rapport avec une atteinte neurologique, musculaire et des troubles de la
trophicité et de la vascularisation locale.
Toutes les lésions neurologiques allant de l’étirement à la section et responsables d’une
altération plus ou moins complète de l’innervation uréthrale conduisent à une hypotonie. Il
peut s’agir de lésions médullaires en dessous de T10, de lésions de la queue de cheval ou de
l’innervation périphérique comme cela peut se rencontrer après chirurgie pelvienne ou
radiothérapie externe. Ainsi Peng a montré chez le rat que la section du nerf pudendal était
responsable d’une atrophie du sphincter strié uréthral et d’une diminution importante de son
activité à l’électromyographie (76). Chez le cochon, il a été montré que la curarisation,
responsable d’une dénervation chimique, était responsable d’une diminution de la pression
uréthrale de clôture de 50 % (77). Récemment, Sajadi a montré que l’étirement du nerf
pudendal était responsable d’une diminution de l’activité du sphincter externe de l’urèthre
(78). Une atteinte de l’innervation autonome est aussi responsable d’une diminution du tonus
uréthral comme cela a été rapporté par Ali-El-Dein chez le chien qui après dénervation
autonome avait une baisse du tonus uréthral au niveau de l’urèthre proximal de 45 % (79).
Chez la femme, Allen a montré que l’accouchement par voie vaginale avait des conséquences
en terme de dénervation pelvipérinéale et que l’importance des signes électromyographiques
de dénervation était corrélée avec l’incontinence urinaire d’effort
(80).
Dans le même sens,
Snooks a rapporté que les patientes ayant une incontinence anale et une incontinence urinaire
d’effort par insuffisance sphinctérienne avaient une augmentation de la latence du nerf
pudendal (81). Haab rapportait en 1996 que la dénervation sphinctérienne se manifestait par
une diminution des unités motrices électromyographiques avec absence de recrutement lors
des contractions volontaires et par des potentiels de fibrillation au repos (82).
La diminution du tonus uréthral peut aussi être secondaire à une atteinte de la musculature qui
peut être d’origine traumatique (traumatismes obstétricaux, fracturaires (fracture du bassin) ou
25
chirurgicaux), constitutionnelle, ischémique ou dégénérative. Chez l’animal, les traumatismes
directs de la musculature uréthrale induisent une hypotonie et une incontinence urinaire.
Chermansky a ainsi rapporté chez le rat que l’électrocautérisation des tissus périuréthraux
était responsable d’une altération des fibres musculaires avec très peu de lésions nerveuses et
que cela s’associait à une diminution de la pression uréthrale (83).
L’âge est un élément important. Chez la femme, Perucchini, dans une étude portant sur 25
sujets anatomiques, a observé que la richesse en fibres musculaires striées diminuait avec
l’âge au niveau de la paroi ventrale de l’urètre. Il a d’ailleurs calculé que la diminution en
nombre était proche de 2 % par an, alors que leur diamètre moyen ne diminuait pas
significativement (84). Dans une étude distincte portant sur 23 cadavres dont sept femmes,
Strasser a mis en évidence un lien entre l’âge et l’apoptose des cellules musculaires striées du
rhabdomyosphincter urétral. Chez les sujets de moins de 20 ans, aucune cellule apoptotique
n’a été trouvée alors que l’index d’apoptose augmentait ensuite proportionnellement à l’âge,
les cellules musculaires striées étant progressivement remplacées par des adipocytes et du
tissu conjonctif (85). A noter que les femmes nullipares âgées semblaient moins affectées par
ce phénomène de diminution du volume musculaire strié périuréthral. Les études
histologiques réalisées à partir de biopsies musculaires périnéales chez des femmes
incontinentes ont fait état d’anomalies témoignant d’une atteinte primitivement myopathique
dans le muscle élévateur de l’anus (86, 87). Gilpin a observé la présence de fibres nécrotiques
et de fibres centronucléées témoignant d’un processus myopathique avec des phénomènes de
régénération (88).
Une autre hypothèse
physiopathologique
concerne le phénomène de fatigabilité
neuromusculaire à l’effort, qui pourrait toucher tous les muscles striés jouant habituellement
un rôle dans la continence. Vereecken en 1975 rapportait lors de l’étude de l’effet des
contractions musculaires périnéales que les sphincters anal et uréthral se fatiguaient très
26
rapidement (en moins d’une minute) (89). Plus récemment, Poortmans et Wyndaele dans une
expérience d’électrostimulation ex vivo sur des muscles périnéaux (iliococcygien et
pubococcygien) prélevés chez le rat ont montré une fatigue supérieure de ces muscles en la
comparant à celle présentée par un muscle squelettique classique, le muscle soléaire, lui aussi
électrostimulé ex vivo après prélèvement. Ils ont également mis en évidence que plus la
période de repos entre deux stimulations était importante, moins la fatigabilité musculaire
était marquée. Enfin, même en optimisant les protocoles d’électrostimulation (longues
périodes de repos), les muscles périnéaux se fatiguaient toujours plus que le soléaire. Les
auteurs expliquent cette différence de fatigabilité par la différence de proportion en fibres
musculaires rapides et lentes dans les différents muscles striés : les fibres musculaires rapides
(type 2) sont, en effet, prépondérantes dans les muscles périnéaux, leur conférant ainsi une
fatigabilité supérieure (90).
Il convient toutefois de souligner la fréquence des causes mixtes associant atteintes
neurogènes et myogènes chez les patientes ayant une insuffisance sphinctérienne uréthrale (91).
Les troubles de la trophicité et de la vascularisation sont également des causes de diminution
des résistances uréthrales. Il a été montré chez les femmes ayant une insuffisance
sphinctérienne des modifications de la composition en collagène (92, 93). De même Edwall,
comparant des biopsies uréthrales de femmes ayant une incontinence urinaire d’effort à celles
de femmes sans pathologie urologique, a rapporté que les premières avaient un faible niveau
de collagène lié à une diminution de son renouvellement ce qui affectait l’étirement et
l’élasticité des tissus (94). Comparant la vascularisation, Rud a montré chez la femme que le
clampage des artères hypogastriques lors de la réalisation d’hystérectomies s’accompagnait
d’une diminution de 28 % en moyenne de la pression de clôture et d’une disparition du
« pouls uréthral » (95). Bump et Raz ont rapportés des résultats similaires après clampage
respectivement de l’aorte et des artères iliaques chez le singe et le chien (96, 97).
27
Enfin des causes comportementales ont été identifiées sous la forme d’une incapacité de
contracter le plancher pelvien à cause d'un trouble proprioseptif, de force ou de coordination.
Méthodes d’évaluation des troubles du bas appareil urinaire
Le catalogue mictionnel
Il consiste à noter tous les évènements mictionnels ainsi que les symptômes ressentis sur une
période de quelques jours.
Trois niveaux de recueils sont envisagés :
- Catalogue mictionnel niveau 1 consistant en un recueil des horaires des mictions jour et nuit
sur une période d’au moins 24 heures.
- Catalogue mictionnel niveau 2 consistant en un recueil des horaires des mictions ainsi que
des volumes mictionnels jour et nuit pendant au moins 24 heures.
- Catalogue mictionnel niveau 3 consistant en un recueil des horaires des mictions ainsi que
des volumes mictionnels jour et nuit, de la fréquence et de l’importance des épisodes
d’incontinence, du nombre de protections utilisées, et/ou des épisodes d’urgenturie.
Les informations déduites de l’étude du catalogue mictionnel de niveau 2 ou 3 sont la
fréquence mictionnelle diurne (nombre de mictions pendant la période d’éveil, incluant la
première miction matinale et la dernière miction avant endormissement), la nycturie (nombre
de mictions pendant la période de sommeil : chaque miction doit être précédée et
immédiatement suivie d’une période de sommeil), la fréquence mictionnelle journalière
(somme de la fréquence mictionnelle diurne et nocturne), la diurèse des 24 heures (recueil
urinaire sur 24 heures), la diurèse nocturne (volume mictionnel produit au cours des mictions
nocturnes en excluant la dernière miction avant endormissement mais en incluant la première
miction matinale), le volume mictionnel maximal (volume mictionnel maximal produit en une
seule miction) et volume mictionnel moyen (rapport de la diurèse sur le nombre de mictions).
28
Le bilan urodynamique
Il permet d’évaluer les paramètres physiques de l’appareil vésico-sphinctériens lors du
remplissage et de la vidange vésicale.
Il comprend trois temps : la débitmétrie mictionnelle, la cystomanométrie et la profilométrie
uréthrale.
La débitmétrie mictionnelle
Elle permet une analyse globale de la miction. Le patient urine pour un besoin habituel dans
un appareil appelé débitmètre. Ce dernier fournit une courbe permettant d’apprécier le débit
urinaire qui peut être continu ou intermittent. Les informations fournies par cette évaluation
sont le débit urinaire maximum (débit maximum enregistré pendant la miction), le volume
uriné (volume total expulsé à travers l’urètre lors de la miction), le temps de miction (durée
totale de la miction, incluant éventuellement d’éventuelles interruptions), le débit moyen
(rapport du volume uriné sur le temps de la miction) et le temps au débit maximum (temps
écoulé depuis le début de la miction jusqu’au débit maximum).
La cystomanométrie
Une sonde composée de plusieurs voies est placée jusque dans la vessie. Une voie sert à
remplir la vessie, une autre à enregistrer la pression dans l’urèthre en regard du sphincter
externe et une autre à enregistrer la pression dans la vessie. Parallèlement, une sonde est
placée dans le rectum et enregistre la pression intra-rectale reflétant la pression abdominale.
La cystomanométrie est séparée en deux périodes : la cystomanométrie de remplissage et
l’étude pression/débit.
Initialement, la vessie est vide. Elle est progressivement remplie par de l’eau à température
ambiante à une vitesse constante habituellement entre 30 et 50 ml/min.
Pendant le remplissage sont étudiés : la sensibilité vésicale, l’activité détrusorienne, la
compliance vésicale, la capacité cystomanométrique maximale et le comportement uréthral.
29
La sensibilité vésicale est déterminée par la première sensation de remplissage vésical
(première sensation que le patient a lors de la cystomanométrie de remplissage, indiquant
qu’il prend conscience d’un remplissage de la vessie), le premier besoin (première sensation
de besoin mais que le patient peut aisément différer) et le besoin intense d’uriner (apparition
d’un besoin d’uriner persistant, mais sans crainte de perdre les urines).
L’activité détrusorienne est définie par la présence ou non de contractions pendant le
remplissage vésical. Dans la vie quotidienne, les individus inhibent leur activité détrusorienne
jusqu’à ce qu’ils soient dans une situation permettant la miction. Ainsi, une fois l’analyse de
la phase de remplissage effectuée, et quand le patient désire uriner, une permission d’uriner
est donnée. Ce moment est indiqué sur les courbes d’urodynamique. Toute activité du
détrusor avant cette “permission” est définie comme une activité détrusorienne involontaire.
La première contraction involontaire est définie par le volume d’apparition de la première
contraction non inhibée du détrusor et par son amplitude.
La compliance vésicale correspond à la relation entre le volume vésical et la pression
détrusorienne. Elle est calculée en divisant la variation de volume par la variation de la
pression intra détrusorienne. Elle est exprimée en ml/cm d’eau.
La capacité cystomanométrique maximale correspond au volume de remplissage auquel le
patient ressent un besoin intense et sans possibilité de différer la miction.
Pendant le remplissage vésical, le système de clôture uréthrale permet d’assurer une pression
uréthrale de clôture positive, même en cas d’augmentation de la pression intra abdominale,
bien que cette résistance sphinctérienne puisse être dépassée par une hyperactivité
détrusorienne. Cela permet d’assurer une continence pendant le remplissage vésical. Des
mécanismes insuffisants de clôture uréthrale sont définis par l’apparition d’une fuite d’urine,
en l’absence d’une contraction détrusorienne. Elle peut être liée à une relaxation uréthrale
anormale définie par une fuite associée à une baisse de la pression uréthrale et ce en l’absence
30
d’augmentation de la pression abdominale ou d’hyperactivité détrusorienne. Elle peut être liée
à une incontinence urodynamique à l’effort définie comme une perte involontaire d’urine
pendant une augmentation de la pression abdominale en l’absence de contraction
détrusorienne. La fonction uréthrale est évaluée par la pression uréthrale correspondant à la
pression de perfusion nécessaire pour ouvrir un urètre fermé, la pression abdominale de fuite
(Abdominal leak point pressure) correspondant à la pression intravésicale à partir de laquelle
apparaît une fuite urinaire lors d’une augmentation de la pression abdominale, en l’absence de
contraction détrusorienne et la pression détrusorienne de fuite (Detrusor Leak Point Pressure)
correspondant à la pression détrusorienne minimale à partir de laquelle apparaît une fuite
urinaire en l’absence de contraction détrusorienne véritable ou d’augmentation de la pression
intra abdominale. Elle reflète les résistances uréthrales.
L’étude pression/débit a pour objectif d’évaluer la relation entre la pression intra vésicale et le
débit urinaire pendant une miction. La phase mictionnelle débute quand la permission d’uriner
est donnée ou quand d’une manière incontrôlée, la miction survient et la fin de cette phase est
considérée quand la miction est finie suivant l’appréciation du patient.
Elle permet d’étudier le débit urinaire, le volume uriné, le temps de miction, les pressions
intravésicales, abdominales, détrusoriennes et uréthrales.
La profilométrie uréthrale ou profil de pression urétrale
Elle évalue les pressions de perfusion nécessaires pour ouvrir un urèthre fermé. Elle indique
ainsi la pression intra-luminale tout au long de l’urèthre.
Vont ainsi être déterminés le profil de pression de clôture urétrale correspondant à la
soustraction de la pression uréthrale moins la pression vésicale, la pression uréthrale
maximale correspondant à la pression maximale mesurée sur le profil uréthral et la pression
de clôture uréthrale maximale obtenue par la soustraction de la pression uréthrale maximale à
la pression intravésicale correspondante.
31
L’uréthrocystographie rétrograde et mictionnelle
L'uréthrocystographie rétrograde et mictionnelle est un examen radiologique qui consiste à
réaliser un cliché d'abdomen sans préparation et d’opacifier par voie rétrograde le bas appareil
urinaire. En l'absence d’infection urinaire, une sonde uréthrale est placée au niveau des
derniers centimètres de l'urètre. Le remplissage rétrograde de produit de contraste débute et
est poursuivi jusqu'à l'obtention d’une envie pressante d'uriner. Des clichés mictionnels de
face et de profil sont ensuite effectués. Un cliché de face est réalisé après l'arrêt de la miction.
Le cliché d’abdomen sans préparation de face recherche des lithiases à projection urinaire ou
gynécologique, une anomalie rachidienne ou un encombrement colique.
Les clichés rétrogrades permettent d'étudier la perméabilité de l'urètre et la capacité vésicale.
La cystographie permet d'étudier la forme de la vessie, l'aspect de ses contours, de rechercher
un reflux vésico-rénal et d'évaluer le degré de fermeture du col vésical. Des clichés
dynamiques peuvent être associés. Ils recherchent une anomalie de position de la vessie au
repos, lors d’efforts de poussée et en retenue. Les clichés mictionnels permettent d'analyser la
morphologie uréthrale et vésicale. La vessie doit prendre un aspect sphérique lié à la
contraction du détrusor avec une ouverture symétrique des deux berges antérieure et
postérieure du col. L'urètre doit avoir un calibre harmonieux sans rupture brutale entre le col
et la petite dilatation rétroméatique. La situation de la base et du col vésical est aussi apprécié.
Le cliché post-mictionnel s'assure de l'absence de résidu post mictionnel et de l'absence
d'opacification urétérale.
L’échographie vésicale avec mesure du résidu post-mictionnel
L’échographie vésicale comporte deux séquences : vessie pleine et après une miction.
L'échographie vessie pleine permet d'étudier la capacité vésicale, les contours de la vessie,
l'épaisseur de sa paroi, sa forme et son contenu. Peuvent y être associé une étude dynamique
et une étude de l'urèthre.
32
L'étude post-mictionnelle permet de déterminer la persistance au non d'urine dans la vessie et
de la quantifier.
La fibroscopie uréthro-vésicale
La fibroscopie uréthro-vésicale permet de rechercher une anomalie endouréthrale (tumeur,
inflammation, sténose, corps étranger, obstacle, pertuis ou communication anormale). Au
niveau vésical, elle recherche la présence d'un corps étranger, d'une tumeur, d'un aspect
anormal de la muqueuse vésicale, une déformation de la paroi, un pertuis ou une
communication anormale.
33
Œstrogènes
Œstrogènes et récepteurs aux œstrogènes
Les œstrogènes
Les œstrogènes sont des hormones sexuelles primaires stéroïdes à 18 atomes de carbones
(C18), dérivées du cholestérol. Les trois principaux œstrogènes naturels sont : l’œstradiol (E2,
forme majoritaire secrétée par l’ovaire chez la femelle non gestante, obtenue par
aromatisation de la testostérone), l’estriol (E3, produit principalement au cours de la gestation
par le placenta) et l’estrone (E1, produit pendant la ménopause par aromatisation de
l’androstènedione). Chez la femme, ils sont produits en premier lieu par le développement
des follicules des ovaires, le corps jaune et le placenta. Certains œstrogènes sont également
produits en plus petites quantités par d'autres tissus tels que le foie, les glandes surrénales,
les seins et le tissu adipeux.
La voie de biosynthèse des œstrogènes initiée à partir du cholestérol passe par la formation de
progestérone puis d’androgènes (Figure 4). Ces derniers sont synthétisés dans les cellules
thécales ovariennes puis diffusent dans les cellules de la granulosa où ils sont convertis en
œstrogènes par une aromatase. Pendant la phase lutéale, le corps jaune sécrète également de
grande quantité d'œstrogènes. La production des œstrogènes est stimulée par les hormones
antéhypophysaires, la FSH (Follicle-Stimulating Hormone ou Hormone Folliculo-Stimulante)
et la LH (Luteinizing Hormone ou Hormone lutéinisante).
Chez les femmes ménopausées, la synthèse d’E2 s’interrompt au niveau des ovaires. Les
œstrogènes proviennent de la transformation des androgènes surrénaliens par l'aromatase des
tissus périphériques.
34
Figure 4 : Voie principale de la biosynthèse des œstrogènes d’après Hall et Phillips (98)
Les œstrogènes peuvent aussi avoir une origine exogène. C’est le cas des phyto-œstrogènes
qui sont des composés d’origine végétale apportés par l’alimentation. Ils proviennent soit
directement de la plante d’origine, soit sont ingérés sous forme de précurseurs qui sont ensuite
métabolisés in vivo par la flore intestinale tels que les isoflavones, les lignans (comme
l’entérolactone), les flavonoïdes ou encore les stilbènes (comme le resveratrol).
Il existe aussi des composés de synthèse ou SERM (modulateurs sélectifs des récepteurs des
œstrogènes) qui ont comme principale caractéristique de posséder des activités mixtes
antagonistes et/ou agonistes vis-à-vis des récepteurs des œstrogènes (ER) selon le tissu cible.
Dans l’espèce humaine, les œstrogènes sont transportés dans le sang, liés à des protéines de
transport : 2% seulement de l’œstradiol circulant est sous forme libre, le reste étant soit lié de
façon non spécifique à l’albumine (60%) soit de façon spécifique à la globuline liant les
stéroïdes sexuels (GBG : Gonadal steroid-Binding Globulin, 38%). Chez la souris, il existe
35
très peu de protéines porteuses : les concentrations plasmatiques totales en œstradiol sont
presque identiques à celles des concentrations libres.
Les œstrogènes sont convertis en métabolites glucuro- ou sulfo-conjugés dans le foie et
majoritairement excrétés dans l’urine, un cinquième environ étant secrété dans la bile pour
être ensuite réabsorbé dans la circulation.
Les récepteurs des œstrogènes
Les œstrogènes, lipophiles, diffusent rapidement et facilement à travers les membranes
cellulaires pour agir sur leurs récepteurs, appartenant à la superfamille des récepteurs
nucléaires et à la classe des récepteurs des hormones stéroïdes. Toutefois, nous verrons plus
loin qu’il existe plusieurs modes d’action des œstrogènes dont certains sont indépendants des
récepteurs.
Il existe deux récepteurs aux œstrogènes (ER) : le récepteur alpha (ERα) et le récepteur béta
(ERβ). Tous deux sont des récepteurs protéiques agissant comme des facteurs d’activation de
la transcription (99). L’ERα a été découvert en 1958 mais n’a pu être cloné qu’en 1986, à
partir de tissu utérin (100, 101). En 1995, à partir de prostate de rat, a été mis en évidence
l’ERβ (102). Ces deux récepteurs ont un haut degré de séquences similaires au niveau du
domaine central de l’ADN et du domaine ligand C-terminal. De ce fait, ces deux récepteurs
communiquent avec des éléments de réponse identiques et ont des profils d’affinité identiques
pour l’ensemble des œstrogènes endogènes, synthétiques ou naturels (103, 104). Ces
récepteurs, et par conséquent l’action physiologique de chacun, diffèrent principalement par
leur localisation (105). L’ERα est largement exprimé et est le sous-type prédominant au
niveau de la glande mammaire, de l’utérus, des vaisseaux et de l’os. L’ERß est exprimé
principalement au niveau de l’ovaire, de la prostate, du testicule, du poumon, du thymus, de la
rate, et dans certaines régions du système nerveux central (106). Enfin, ERß est impliqué dans
la régulation de l’ovulation, dans certains comportements et dans la réponse immunitaire
36
(107, 108). Il a également été montré une interaction entre les deux types de récepteurs avec
un effet inhibiteur d’ERß sur ERα (109).
Le récepteur des œstrogènes α (ER α)
Organisation du gène
Dans l’espèce humaine, le gène d’ERα, nommé ESR1 (Estrogen Receptor locus 1) est localisé
sur le locus chromosomique 6q25.1 chez l’homme (110, 111), s’étend sur plus de 140
kilobases et comporte 8 exons séparés par 7 introns. L’exon 1 code pour le domaine A/B, les
exons 2 et 3 pour une partie du domaine C, l’exon 4 pour une partie du domaine C, le
domaine D ainsi qu’une partie du domaine E, le restant étant codé par une partie de l'exon 4 et
8 et les exons 5,6 et 7. La fin de l’exon 8 code pour le domaine F (Figure 5) (112).
A l’exception de l’extrémité 5’ non traduite, la séquence de ce gène est fortement conservée
entre les espèces. La variabilité au niveau de l’extrémité 5’ s’explique par l’existence de
promoteurs multiples permettant une régulation ayant une sélectivité tissulaire pour
l’expression de variants d’ARNm codant pour ERα (113).
Figure 5: Représentation schématique de l’organisation génique et protéique d’ERα. (D'après BillonGales (114))
Structure protéique
ERα a une structure protéique composée de domaines fonctionnels désignés, de l’extrémité Nterminale à l’extrémité C-terminale, de A à F (Figure 5). Le domaine de liaison à l’ADN
(DNA-Binding Domain : DBD, situé dans la région C) et celui de l’hormone (Ligand-Binding
Domain : LBD, situé dans la région E) sont hautement conservés entre les espèces. En
37
revanche, le domaine A/B situé en région N-terminale et la région D, sont moins conservés.
La région C-terminale F contiguë avec le domaine E a un rôle moins connu (115).
La région A/B possède une fonction de transactivation appelée AF-1 (116) qui est impliquée
dans des interactions protéines-protéines et dans l’activation transcriptionnelle de gènes cibles
(117, 118). Cette fonction peut être activée aussi bien de manière "ligand dépendante" que
"ligand indépendante", après phosphorylations par exemple. Cette région peut également
interagir avec divers cofacteurs (coactivateurs ou facteurs de transcription).
La région C de domaine de liaison à l’ADN contient une structure dite en "doigt de zinc" qui
joue un rôle important dans la dimérisation du récepteur et dans la liaison aux séquences
spécifiques d’ADN appelées "Estrogen Responsive Elements" (ERE) (119).
Le domaine D sert de "charnière" entre le DBD et le LBD, permettant la rotation du DBD et
l’adoption de différentes conformations du DBD et du LBD. Ce domaine possède également
un "Nuclear Localization Signal", permettant une localisation nucléaire du récepteur (120).
Le domaine E/F de liaison du ligand est fonctionnellement plus complexe car il permet la
fixation du ligand, la dimérisation du récepteur, sa translocation nucléaire et la transactivation
de gènes cibles, via la fonction de transactivation AF-2. Cette dernière dépend d’une région
complexe dont la structure et la fonction sont gouvernées par la liaison du ligand. La surface
d’interaction d’AF-2 est composée d’acides aminés provenant des hélices 3, 4, 5 et 12. La
fixation de l’E2 sur le récepteur entraine un basculement de l’hélice 12 qui referme la poche
de liaison du ligand. Ce réarrangement s’accompagne d’une compaction générale du LBD,
entraînant la stabilisation du dimère de récepteurs sur les séquences régulatrices des
promoteurs, une dissociation des corépresseurs et la création de nouvelles surfaces
d’interaction pour des coactivateurs. Différents ligands peuvent induire des conformations
différentes du récepteur et le positionnement de l’hélice 12 est à l’origine des effets agonistes
ou antagonistes des œstrogènes (115, 116, 121, 122).
38
Modifications post-traductionnelles
ERα peut être le siège de nombreuses modifications post-traductionnelles qui sont étroitement
liées à ses différents types d’action. Ainsi l’acétylation des résidus Lysine 266 et 268
augmente sa capacité de fixation à l’ADN via le domaine C (120). La méthylation au niveau
de l’Arginine 260 du domaine C a pour effet de le localiser au niveau cytoplasmique (123). La
nitrosylation par le monoxyde d’azote de résidus Cystéine dans le domaine C induit une
baisse de la capacité du récepteur à se lier à l’ADN (124). La palmitoylation sur le résidu
Cystéine 447, dans la région E est la modification post-traductionnelle indispensable à la
localisation membranaire d’ERα et à son interaction avec la Cavéoline-1 (125). De multiples
sites de phosphorylation de ce récepteur sont connus sur les résidus Sérine 104, 106, 118, 167
dans le domaine A/B. Elles résultent de l’activation de différentes kinases comme Akt (126).
La phosphorylation de la Sérine 236 dans la région C par la Protéine Kinase A régule la
dimérisation du récepteur (127). Au niveau du domaine E, la phosphorylation de la Tyrosine
537 par c-Src module sa capacité de liaison à l’ADN et sa dimérisation (128). Les
phosphorylations de la fonction AF-1 participent à l’activité transcriptionnelle du récepteur
par le recrutement de co-activateurs. Enfin, l’ubiquitination du récepteur sur des résidus
Lysine de la région C, plus précisément au niveau du site de liaison à l’ADN, permet la
dégradation du récepteur, en absence de ligand, vers le protéasome.
Le récepteur des œstrogènes β (ER β)
Organisation du gène
Le gène humain d’ERβ (ESR2) est localisé sur le locus chromosomique 14q23.2. Il s’étend
sur environ 63,2 kilobases et comprend huit exons espacés par sept introns, les exons ON Ok
en position 5’ et l’exon ox en position 3’ n’étant pas traduits (figure 6). Un épissage alternatif
peut intervenir entre l’exon 7 et l’exon ox afin de produire une isoforme ERβ2 (102).
39
Figure 6: Structure du gène ESR2 et de la protéine ERβ (d’après Zhao (129))
Structure protéique
La protéine ERβ humaine est constituée de 530 acides aminés (130), alors que celle de la
souris en comprend 539 (131). ERβ possède des caractéristiques structurales communes aux
autres membres de la superfamille des récepteurs nucléaires et plus particulièrement à ERα, à
savoir cinq domaines distincts A/B, C, D, E, F.
La comparaison des séquences des protéines ERα et ERβ de pleines tailles montre une forte
conservation des acides aminés dans le domaine C (95% d’homologie) mais pas pour les
autres domaines: A/B (20%), D (30%), E (55%) et F (20%).
Toutefois, malgré ces différences de séquences, ces domaines conservent des fonctions
analogues à celles décrites précédemment pour ERα. Les domaines de liaison du ligand du
ERα et ERβ ont des structures tridimensionnelles très proches, mais les acides aminés reliant
le ligand et la poche diffèrent en deux positions (132). Enfin, la taille de la poche d’ERβ est
significativement plus petite, ce qui pourrait avoir de forte implication pour l’affinité et la
pharmacologie des ligands. De façon classique, ERβ possède deux domaines de
transactivation AF-1 et AF-2, situés respectivement dans les régions A/B et E (Figure 6).
Modifications post-traductionnelles
40
ERβ peut être soumis à la palmitoylation nécessaire à sa localisation au niveau de la
membrane plasmique (133) et à une phosphorylation au niveau de la fonction AF-1 par les
MAPK, ce qui provoque le recrutement de SRC-1 (Steroid Receptor Coactivator-1) et induit
une activation transcriptionnelle.
Mécanismes d’action des récepteurs aux œstrogènes
Les différents mécanismes d’action sont résumés figure 7.
Activité transcriptionnelle ERE dépendante : mécanisme classique ou direct
En absence de ligand, le récepteur se présente sous forme monomérique, associé à des
protéines chaperonnes HSP (Heat Shock Proteins), principalement HSP70 et HSP90 et est
localisé dans le noyau ou le cytoplasme. La liaison du ligand entraine un changement
conformationnel du récepteur, qui se dissocie des HSP, se dimérise avec un autre récepteur et
est transféré vers le noyau (134). Le dimère peut alors se fixer à des ERE situés en amont des
gènes cibles puis active leur transcription via ses fonctions de transactivation AF-1 et AF-2,
qui recrutent des cofacteurs impliqués dans le remodelage de la chromatine et l’activation
transcriptionnelle (135). En fonction du type cellulaire et des promoteurs mis en jeu, le
récepteur peut alors exercer une activité stimulatrice ou inhibitrice vis-à-vis de l’expression
des gènes cibles (136).
Activité transcriptionnelle non liée aux ERE
L’ER est capable d’induire la transcription de gènes dépourvus de séquence ERE, par liaison
indirecte de l’ADN, via l’interaction avec un complexe formé de deux facteurs de
transcription fos et jun également appelé AP-1 (Activator Protein 1) (137). Cette voie de
signalisation est impliquée dans la transcription des gènes tels qu’IGF-1 (Insulin-like Growth
Factor-1). L’expression de certains gènes contenant des séquences promotrices riches en
bases GC, est activée via l’interaction avec le complexe SP1 (Stimulating Protein 1) (103). Un
dernier exemple est l’interaction entre ERα et la sous-unité c-rel du complexe NF-κB, qui
inhibe l’expression de l’interleukine-6 (138).
41
Activité transcriptionnelle indépendante du ligand
En parallèle d’une activation hormono-dépendante, l’activité du récepteur des œstrogènes
peut être modulée par d’autres voies de signalisation. Les facteurs de croissance EGF
(Epidermal Growth Factor) et IGF-1 sont capables d’activer le récepteur et d’induire
l’expression de gènes cibles (139). L’activation de MAP kinases par des facteurs de
croissance (EGF, IGF-1, insuline) entraîne la phosphorylation de la serine 118 localisée au
niveau de la fonction AF-1 et permettent au récepteur de potentialiser la transcription de
gènes cibles (140, 141).
Activation à partir d’un récepteur localisé à la membrane
A côté des effets génomiques, il existe des effets dits "rapides", usuellement appelés effets
"non génomiques", et pouvant cependant être à l'origine d'effets transcriptionnels et survenant
quelques secondes ou quelques minutes après l’ajout d’œstradiol. Ces effets font notamment
intervenir l’activation de kinases et de phosphatases.
Le récepteur membranaire est localisé au niveau de cavéoles et est associé à des protéines
comme la cavéoline (142). La localisation membranaire du récepteur est permise grâce à des
modifications post-traductionnelles, en particulier la S-palmitoylation de la cystéine 447
(143). La liaison du ligand met alors en jeu diverses cascades de signalisation telles que
l’activation des MAP kinases, des phophatidyl-inositol 3-kinases (PI3K), de la phospholipase
C (PLC), de la protéine kinase C (PKC), de la monoxyde d’azote synthase endothéliale
(eNOS), ou encore de la voie de l'EGFR (Epidermal growth factor receptor) (144). ERα non
lié au ligand est également capable de moduler la croissance et la différentiation cellulaire.
Par exemple, il inhibe la croissance neuronale par une régulation négative de la voie des
MAPK et PI3K/Akt. Cette action n'implique pas les domaines de transactivation et de liaison
à l'ADN, suggérant qu'elle serait indépendante de toute activité transcriptionnelle (145).
42
Figure 7: Mécanisme d’action des récepteurs aux œstrogènes.
1- Mécanisme d’action classique (direct) : après activation par le ligand, les dimères du
récepteur se lient à l’ADN au niveau de séquences spécifiques (ERE).
2- Mécanisme d’action ERE indépendant (indirect) : les dimères de récepteurs se lient à
l’ADN via des interactions protéiques.
3- Mécanisme d’action ligand-indépendant : des facteurs de croissance activent des kinases
qui phosphorylent les récepteurs et se fixent à l’ADN au niveau des séquences spécifiques
ERE.
4- Mécanisme d’action non-génomique : les récepteurs localisés au niveau de la membrane
cellulaire activent des kinases, conduisant à des modifications rapides de protéines
cytoplasmiques ou bien à des régulations transcriptionnelles.
D’après Reid et Heldring (134, 146)
Œstrogènes et bas appareil urinaire
Les œstrogènes ont un effet physiologique important sur l’appareil génital féminin tout au
long de la vie adulte. Ils sont responsables de changements histologiques et fonctionnels.
43
L’origine embryologique commune entre l’appareil génital féminin et l’appareil urinaire, à
partir du sinus urogénital, plaide pour une sensibilité de ce dernier aux œstrogènes. La mise en
évidence de récepteurs aux œstrogènes et à la progestérone au niveau du vagin, de l’urèthre,
de la vessie et des muscles du plancher pelvien a renforcé le concept d’un rôle des hormones
sexuelles féminines sur la physiologie uréthro-vésicale (147, 148).
L’influence des hormones sexuelles féminines sur la miction a été rapporté pour la première
fois en 1966 (149). Depuis de nombreuses études épidémiologiques ont montré la présence de
liens entre les œstrogènes et en particulier le déficit œstrogénique, et l’apparition de
dysfonctionnements de l’appareil vésico-sphinctérien (150-153). De plus, l’incidence de ces
dermiers augmente avec l’ancienneté du déficit (154).
Enfin, il a été montré que les œstrogènes permettaient de prévenir après la ménopause, la
survenue de cystites (155), d’atrophie de l’appareil urinaire (156) et d’une hyperactivité
vésicale (157).
Œstrogènes et vessie
Les récepteurs aux œstrogènes au niveau vésical
Au niveau vésical, Iosif, le premier a montré la présence dans l’espèce humaine de récepteurs
aux œstrogènes (147). Il les a identifiés au niveau du trigone et de la partie mobile de la
vessie. Depuis, de nombreuses études ont étudié la distribution des différents types de
récepteurs aux œstrogènes au niveau vésical et l’impact de l’imprégnation hormonale sur leur
expression. Il apparaît que les deux types de récepteurs sont présents au niveau de la vessie au
sein des cellules urothéliales et des cellules musculaires lisses (158). La proportion de chaque
type de récepteur au niveau vésical chez l’être humain est mal connue. En revanche, il a été
montré chez la souris et la rate que le type de récepteur prédominant était l’ERβ (159-161). La
localisation des récepteurs dans l’épaisseur de la paroi vésicale diffère toutefois entre le dôme
vésical et le trigone. Blakeman a montré que les ER étaient exprimés au niveau de
l’urothélium trigonal mais absent au niveau de l’urothélium du dôme vésical. En revanche, ils
44
étaient présents de manière équivalente au niveau du sous-urothélium dans les deux cas (162).
Aucune étude réalisée sur des échantillons humains ou animaux n’a montré de différence
selon le sexe en termes d’expression ou de localisation des récepteurs aux œstrogènes (158,
160, 161). Enfin, il a été montré que le niveau d’imprégnation œstrogénique n’influençait pas
l’expression des ER au niveau vésical (162).
Les œstrogènes ont également une action au niveau du système nerveux et par ce fait peuvent
agir sur le contrôle de la fonction vésicale. Des ER sont présents dans les neurones des
différents centres de l’encéphale, du tronc cérébral et de la moelle épinière liés à la miction.
Le principal ER exprimé au niveau cortical, du cervelet et de la protubérance est l’ERβ (158).
Toutefois, chez la chate, ont été mis en évidence des ERα au niveau des neurones
préganglionnaires parasympathiques innervant la vessie (163). Enfin, il a été rapporté la
présence d’ERα et β au niveau des cellules ganglionnaires des racines lombosacrées
postérieures innervant la vessie (164).
Œstrogènes et paroi vésicale
A partir d’études réalisées chez la femme et chez l’animal, il a été montré que les variations
de l’imprégnation œstrogénique avaient des conséquences sur la trophicité et la
vascularisation de la paroi vésicale et sur la densité en récepteurs α-adrénergiques et
muscariniques (165-169).
La déprivation œstrogénique est responsable, chez la femme, d’une altération de l’activité
collagénase (170, 171). Cette dernière est responsable chez la lapine d’une augmentation du
collagène au sein de la paroi vésicale après ovariectomie (172, 173). Parallèlement, il s’y
associe une atrophie musculaire lisse (165, 172, 173). Ces deux modifications sont
responsables, comme cela a été montré chez la rate et la lapine, d’une augmentation du ratio
collagène sur fibres musculaires lisses au sein de la paroi vésicale (165, 172). Chez l’animal,
ces modifications de structures étaient réversibles après œstrogénothérapie (165, 173, 174).
45
A l’inverse, après ovariectomie bilatérale ou à la naissance, lorsque la rate ou la lapine est
traitée d’emblée par œstrogènes, apparaissait une hypertrophie de la paroi vésicale en rapport
avec une augmentation des fibres musculaires lisses, une diminution de la teneur en collagène
et une augmentation de la vascularisation de la vessie (168, 169, 172-176). L’hypertrophie
intéressait la partie mobile de la vessie et s’accompagnait d’une augmentation du poids de la
vessie (166, 172, 173). Elle est probablement multifactorielle et est liée pour Lin à une action
des œstrogènes sur la paroi vésicale et sur le muscle lisse (172). Toutefois, nous ne pouvons
pas éliminer un effet indirect secondaire à une obstruction sous-vésicale par augmentation des
résistances uréthrales liée au traitement œstrogénique (177). L’augmentation de la
vascularisation de la vessie est liée, d’après les données expérimentales, à une induction de
l’angiogénèse par les œstrogènes (176), cette néovascularisation se faisant au sein de la
musculeuse.
Dès 1980, ont été rapportés des variations de la densité des récepteurs α-adrénergiques,
cholinergiques et purinergiques selon l’imprégnation hormonale (166, 175). Toutefois, les
résultats sont contradictoires. Levin a rapporté, chez la lapine, une augmentation de la réponse
aux agonistes α-adrénergiques, cholinergiques et purinergiques après traitement par
œstrogènes (175). Inversement, Shapiro et Batra ont rapporté, également chez la lapine, une
diminution de la densité des récepteurs muscariniques après castration et œstrogénothérapie
(148, 166). Dans ces deux études, aucune différence n’a été mise en évidence entre le groupe
témoin et le groupe ovariectomisé. Il est à noter que la différence de résultats entre l’étude de
Levin et celles de Shapiro et Batra peut s’expliquer par la dose d’œstrogènes utilisée et surtout
par la durée de traitement qui n’était que de 4 jours dans le premier cas. De plus, Levin avait
utilisé comme modèle des lapins immatures. Enfin, Liang, chez la rate, a rapporté l’absence
de variations de l’affinité des récepteurs muscariniques selon le degré d’imprégnation
œstrogénique (167).
46
Œstrogènes et fonction vésicale
A partir d’études réalisées chez la femme et chez l’animal, il a été montré que les variations
de l’imprégnation œstrogénique avaient des conséquences sur la contractilité vésicale et sur la
réponse inflammatoire au niveau vésical (162, 172, 173, 178-184). Les variations du cycle
menstruel influencent la survenue de symptômes urinaires et la mise en évidence d’une
hyperactivité détrusorienne à la cystomanométrie. Ces derniers sont ainsi plus fréquents au
cours de la phase folliculaire (178). De plus, chez la femme ménopausée, un mode de
fonctionnement vésical fréquent est le syndrome « DHIC » (detrusor hyperreflexia – impaired
contractility) caractérisé par l’association d’une hyperactivité vésicale et d’une réduction de la
contractilité mictionnelle (185). Les symptômes les plus fréquents sont la pollakiurie et
l’urgenturie. Ainsi la capacité cystomanométrique maximale est diminuée et la sensibilité
vésicale augmentée (186). Chez la lapine, après ovariectomie, l’étude du calendrier
mictionnel montrait une pollakiurie (165). Les études en bains d’organes isolés de vessies de
lapines et de rates révélaient une hypocontractilité vésicale indépendamment des formes de
stimulation (stimulation électrique, ATP, carbachol, KCl) (168, 172, 179, 187, 188),
hypocontractilité se corrigeant après traitement par œstrogènes. Cependant, ces effets
n’étaient totalement réversibles que chez les animaux matures lors de la réalisation de
l’ovariectomie (179).
Inversement, les lapines et rates traitées par œstrogènes après ovariectomie, avaient une
contractilité augmentée (168, 172, 179, 187, 188). Parallèlement, il a été rapporté que les
lapines traitées par œstrogènes avaient une augmentation de la relaxation médiée par les
récepteurs beta2- et beta3-adrénergiques, qui pourrait être liée à une augmentation de l’AMPc
dans les cellules musculaires lisses du détrusor (121, 189, 190).
Le mécanisme d’action des œstrogènes sur la contractilité vésicale est multifactoriel.
Interviennent l’effet trophique des œstrogènes et l’action sur la densité des récepteurs
muscariniques, purinergiques et α adrénergiques comme nous l’avons déjà vu. S’y ajoutent
47
des modifications des concentrations intracytoplasmiques en calcium. Ainsi, chez la lapine
ovariectomisée, le flux transmembranaire de calcium était diminué entraînant une baisse de la
contractilité (187, 188).
Nous avons vu que les œstrogènes avaient une action sur la réponse immunitaire (108). Au
niveau vésical, chez la rate, la réponse inflammatoire à une agression diffèrent en fonction de
la période du cycle menstruel ou en fonction du traitement ou non par des œstrogènes après
ovariectomie (181, 182). Intervient également le taux d’ER. Ainsi, les rates ayant un taux
élevé d’ERβ étaient moins sensibles à l’agression ou avaient un meilleur pronostic de
guérison (182).
Œstrogènes et urèthre
Les récepteurs aux œstrogènes au niveau uréthral
Iosif a rapporté le premier la présence de récepteurs aux œstrogènes au niveau de l’urèthre de
la femme (147). Initialement, les études rapportaient la présence de ces récepteurs uniquement
au niveau de la partie malpighienne de la muqueuse uréthrale (162). Plus récemment, avec la
découverte de l’ERβ, il est apparu que l’urothélium exprimait aussi ce type de récepteur
(191). A partir d’une étude menée sur des biopsies uréthrales réalisées chez des femmes
ménopausées et non ménopausées, il est apparu que les deux types de récepteur étaient
exprimés de manière similaire au sein des noyaux de l’ensemble des cellules de l’épithélium
uréthral et qu’ils n’étaient que très faiblement exprimés au niveau de la lamina propria.
D’autres auteurs se sont intéressés à l’expression des récepteurs aux œstrogènes au niveau des
tissus péri-uréthraux et en fonction de situations pathologiques. Söderberg a rapporté une
diminution, au niveau de la matrice extracellulaire du plancher pelvien, de l’expression des
ERβ chez les femmes préménopausées ayant une incontinence urinaire d’effort par rapport à
des femmes continentes (192). A l’inverse dans une population de femmes ayant un prolapsus
génito-urinaire, Skala ne rapportait pas de différence d’expression de l’ARNm des deux types
48
de récepteurs au niveau uréthral en fonction de la présence ou non d’une incontinence urinaire
(193).
Enfin l’expression des récepteurs ne semble pas affectée par le statut hormonal que ce soit au
niveau uréthral ou péri-uréthral (191, 194).
Chez la lapine, a été rapportée la présence d’ER au niveau de l’épithélium uréthral et au
niveau des fibres musculaires lisses (195) et que les traitements par œstrogènes étaient
associés à une diminution de 30 à 50 % de leur expression (196). A l’inverse, chez la rate,
seul l’ARNm ERβ est exprimé au niveau de l’épithélium de l’urèthre (160) et son expression
diminue après ovariectomie (197).
Comme pour le contrôle vésical, des récepteurs aux œstrogènes sont exprimés au niveau des
différents centres et relais de l’innervation uréthrale. Zoubina a rapporté que chez la rate au
niveau des ganglions paravertébraux, 90 % des neurones orthosympathiques se projetant au
niveau de l’urèthre proximal exprimaient ERβ et 30 % ERα et que cela n’était pas influencé
par le statut hormonal (198).
Œstrogènes et paroi uréthrale
Les variations de l’imprégnation œstrogénique ont des conséquences sur la vascularisation
uréthrale. Robinson chez la guenon ménopausée a montré que la supplémentation
œstrogénique n’entrainait pas de modifications au niveau de l’urothélium mais qu’elle
augmentait le nombre de composants vasculaires des couches conjonctives de l’urèthre (199).
Chez la rate, la castration induisait une diminution de la vascularisation uréthrale et cet effet
était lié à une diminution de l’expression locale du Vascular Endothelial Growth Factor
(VEGF) (200). En revanche, la supplémentation œstrogénique permettait d’augmenter le
nombre de vaisseaux et d’atteindre un niveau identique à celui d’avant castration (201, 202).
Des résultats identiques ont été rapportés chez la lapine (173). Cela a depuis été confirmé
dans l’espèce humaine par des études par échographie doppler évaluant le flux sanguin
49
périuréthral chez des femmes ménopausées avant et après traitement hormonal systémique ou
local et montrant lors du traitement une augmentation du flux sanguin (203-205).
L’effet sur le tissu conjonctif et en particulier sur la teneur et la typologie en collagène est en
revanche plus discuté. Augsburger, a rapporté chez la chienne que l’ovariectomie ne
s’accompagnait d’aucune modification à ce niveau (206). D’autres études réalisées chez la
rate ou la lapine ont abouti aux mêmes conclusions (207, 208). A l’inverse, d’autres auteurs
ont rapporté des résultats opposés indiquant une augmentation chez la rate du nombre de
fibres de collagène dans la paroi uréthrale au profit du collagène de type II et une diminution
du nombre de fibres musculaires (209). Néanmoins ces effets étaient réversibles sous
traitement œstrogénique (201). Dans le même sens, Rizk a rapporté également chez la rate
que la prise d’œstrogènes après ovariectomie diminuait l’expression cytoplasmique du peptide
de signalisation intracellulaire p27 (kip 1) et de l’isomyosine 1 (210).
Lin a également montré chez la rate que la quantité et la longueur des fibres d’élastine étaient
diminuées après castration et que la prise d’œstrogènes amplifiait cette situation en interférant
avec le TGFβ1, facteur favorisant l’augmentation de l’expression de l’élastine, ce qui d’après
les auteurs expliquerait au moins en partie l’échec de l’hormonothérapie substitutive dans le
traitement et la prévention de l’incontinence urinaire d’effort (211). Breyer a confirmé ces
résultats en montrant que la castration entrainait une fragmentation et une désorganisation des
fibres élastiques et que la prise d’œstrogènes n’avait aucun effet à ce niveau (212). De même
chez la femme, Edwall a montré qu’à dose physiologique l’œstrone et le 17β-œstradiol
augmentaient le renouvellement du collagène chez les femmes saines mais pas chez celles
ayant une incontinence urinaire d’effort en particulier après la ménopause et ils concluaient
que les femmes incontinentes avaient une sensibilité aux œstrogènes plus faible que les
femmes continentes (213). Dans une étude par mise en culture de fibroblastes provenant de
tissus péri-uréthraux de femmes continentes et non continentes, Chen a montré qu’alors que
50
les œstrogènes entrainaient une augmentation des inhibiteurs de la production de
métalloprotéinase, enzyme de dégradation du collagène, chez les premières, il n’y avait aucun
impact au niveau des cellules provenant de femmes ayant une incontinence urinaire d’effort
(214). Toutefois la cause de ces différences d’effet est inconnue.
Le rôle des œstrogènes au niveau de la muqueuse uréthrale reste mal élucidé. Chez la rate, il a
été rapporté que la prise d’œstrogènes s’accompagnait d’une augmentation d’épaisseur de
l’épithélium (201, 215). Cependant, cela n’a été que partiellement confirmé chez la femme où
cette augmentation se limiterait à l’épithélium malpighien (216). Enfin, De Deus a rapporté
une étude montrant que la castration chez la rate n’avait aucun impact sur la quantité et la
qualité des glycosaminoglycanes tant au niveau uréthral que vésical (217).
Œstrogènes et fonction uréthrale
Nous allons tout d’abord nous intéresser aux études réalisées chez l’animal puis à celles
réalisées chez la femme.
Les études urodynamiques réalisées chez la rate anesthésiée montraient une diminution des
pressions uréthrales après castration et que la prise d’œstrogènes permettait d’augmenter ces
dernières (218). Kitta a indiqué qu’en plus de ces effets, la castration s’accompagnait d’une
diminution de l’amplitude de la réponse uréthrale à l’éternuement et que cet effet n’était pas
corrigé par l’apport d’œstrogènes (219).
Nous avons montré que chez la souris le traitement au long cours avec des doses
gestationnelles d’œstradiol augmentait le tonus uréthral (220).
Les études réalisées sur organes isolés montraient une augmentation de l’activité contractile
musculaire de l’urèthre de lapines castrées traitées par œstrogènes au long cours, que la
stimulation soit électrique ou chimique par ajout de béthanéchol ou carbachol (173, 221), et
que cet effet était aboli par l’ajout d’antagonistes alpha adrénergiques et d’un atropinique, la
scopolamine (221). Des résultats comparables ont été rapportés chez le singe recevant des
phyto-œstrogènes (222). Cependant, l’effet de la castration sur l’activité contractile
51
musculaire de l’urèthre reste controversé et pourrait varier selon l’espèce. Alors que certains,
chez la lapine, ont rapporté qu’elle n’avait pas d’influence sur la contractilité par rapport aux
animaux non castrés (208, 221), d’autres chez la rate ont noté une diminution de la réponse
contractile à l’ATP, norépinéphrine et au KCl après castration (223). Enfin d’autres ont
montré chez la rate une augmentation de la sensibilité à l’effet contractile du carbachol et de
la noradrénaline (224).
Dans les années 1980, plusieurs équipes se sont intéressées aux variations de la pression
uréthrale de la femme en fonction de l’imprégnation œstrogénique. Ainsi, Van Geelen a
montré chez 27 femmes nullipares d’âge moyen 25,4 ans que certains paramètres
urodynamiques fluctuaient en fonction du cycle menstruel. Une profilométrie uréthrale et un
dosage de l’œstradiol, de la progestérone, de la prolactine, de la LH et de la FSH étaient
réalisés à quatre périodes du cycle : à la phase folliculaire, en milieu de cycle, en début et en
fin de la phase lutéale. Alors que la pression uréthrale maximale restait comparable, les
longueurs anatomique et fonctionnelle de l’urèthre étaient augmentées en milieu de cycle et
au début de la phase lutéale et ces variations étaient corrélées au taux d’œstradiol mais pas
avec les autres hormones étudiées (225).
Une étude s’est intéressée à l’effet de faibles doses d’œstro-progestatifs à visée contraceptive
sur la pression uréthrale et n’a pas montré de différence du profil de pression entre les femmes
traitées et les femmes non traitées. Cependant la cohorte était limitée avec seulement 12
femmes incluses (226).
Iosif a réalisé une profilométrie uréthrale chez 14 femmes primipares entre la douzième et la
seizième semaine de grossesse, à la 38ème semaine et 5 à 7 jours après l’accouchement et a
montré que la pression uréthrale, les longueurs fonctionnelle et anatomique de l’urèthre
augmentaient progressivement pendant la grossesse et revenaient une semaine après
l’accouchement à des valeurs comparables à celles du début de grossesse (227). Il a ensuite
52
comparé les résultats des femmes continentes à celles ayant eu une incontinence urinaire
d’effort pendant la grossesse et rapporté que les femmes incontinentes avaient une longueur
uréthrale plus courte, une pression de clôture uréthrale plus basse et pas d’augmentation des
pressions uréthrales suffisante lors de l’effort. Malheureusement, aucune évaluation
hormonale n’avait été réalisée (227). Van Geelen, dans une étude comparable, a rapporté des
résultats similaires et indiqué que l’engagement du fœtus vers la 36ème semaine n’avait pas
d’effet sur la pression uréthrale. En revanche, aucun lien entre les taux hormonaux circulants
et les résultats de l’étude profilométrique n’avait été mis en évidence (228).
La ménopause s’accompagne d’une diminution de la pression uréthrale maximale et de la
pression de clôture uréthrale (229). Cette dernière semble toutefois n’apparaitre que cinq ans
après la ménopause (186). Enfin, certaines patientes ont une descente du col vésical et il a été
rapporté que cette dernière était liée aux taux d’œstradiol circulants (230).
Œstrogènes et commande neurologique du bas appareil urinaire
D’une manière générale, les variations de l’imprégnation œstrogénique peuvent avoir un
impact sur la fonction neuronale (231). Au niveau des centres de la miction, leur effet est mal
connu. Il a toutefois été rapporté que traiter des macaques femelles par des œstrogènes
augmentait la production de 5-hydroxytryptamine, neuromédiateur ayant une action
inhibitrice sur le réflexe mictionnel, au niveau du système nerveux autonome (232). Au
niveau du système non adrénergique non cholinergique, Ehren a montré que les œstrogènes
augmentaient l’activité de la monoxyde d’azote synthase calcium-dépendante au niveau de la
vessie du cochon d’inde (233). Il n’était en revanche pas précisé dans cette étude si
l’augmentation d’activité était liée ou non à l’isoforme neuronal de la monoxyde d’azote
synthase.
Une étude réalisée chez des souris déficientes en ERα ou ERβ a montré, par la réalisation
d’études en bains d’organes isolés et de cystomanométries chez l’animal vigil, un impact
53
limité sur la contractilité vésicale de l’absence d’ER. En revanche, ces souris n’avaient plus
de réponse à l’instillation de capsaïcine. Cela suggère que les ER interviennent au niveau de
la voie afférente et en particulier sur la fonction des récepteurs vanilloïdes (234). Ces résultats
sont corroborés par la localisation des ER au niveau des cellules ganglionnaires des racines
postérieures lombosacrées innervant la vessie où ils ne sont exprimés qu’au sein des neurones
exprimant le TRPV1, marqueur des neurones sensibles à la capsaïcine (164).
Dans un modèle d’incontinence urinaire par écrasement du nerf pudendal chez la rate, il a été
montré que celles traitées par œstrogènes avaient des pressions vésicales au point de fuite
augmentées par rapport aux non traités mais restant inférieures à celles de ceux sans lésions
neurologiques et que cette effet était associé à une augmentation au sein du noyau d’Onuf de
l’expression de l’ARNm de βII tubuline qui est un marqueur de la régénération nerveuse
(235). Smith a rapporté des résultats comparables concernant l’innervation sympathique de
l’urèthre proximale. Après destruction chimique des axones terminaux sympathiques par de la
6-hydroxydopamine, les rates traitées par œstradiol avaient une innervation identique à celle
des témoins alors qu’aucune réinnervation n’était décelable chez les animaux castrés non
traités (236). Une des limites de cette étude était toutefois l’absence d’évaluation
fonctionnelle. Ces travaux permettent d’expliquer les mécanismes de réparation nerveuse des
lésions pouvant survenir lors de l’accouchement et indiquent qu’ils sont au moins en partie
œstrogéno-dépendant.
Les œstrogènes à des doses légèrement supraphysiologiques diminuaient chez la rate
l’expression du gène du NGF au niveau de l’urèthre mais pas au niveau de la vessie (184).
Zucchi a récemment précisé que la castration induisait une augmentation de l’expression du
NGF dans le muscle péri-uréthral et que l’administration d’œstrogènes chez ces rates
augmentait l’expression du NGF au niveau de l’urothélium et une diminution au niveau des
muscles péri-uréthraux (237) De manière intéressante, alors que la castration entrainait une
54
activité irrégulière et non coordonnée du détrusor et des sphincters, chez ces mêmes animaux,
la prise d’œstrogènes permettait de retrouver une activité régulière et coordonnée de l’urèthre
et de la vessie (184). Ces résultats ont récemment été confirmés par Cheng et De Groat
indiquant que la coordination vésico-sphinctérienne était modulée par les œstrogènes (238) et
que cet effet pourrait être lié à l’impact sur l’expression du NGF (184). Un autre mécanisme
pourrait être une modulation du réflexe entre la vessie et le sphincter externe de l’urèthre NMéthyl-D-Aspartate (NMDA) dépendant. En effet alors que la castration chez la rate le
diminuait de manière significative, la supplémentation en œstrogènes permettait de retrouver
une activité normale et que cet effet était lié à la concentration NMDA au niveau spinal (239).
Plus récemment, une équipe s’est intéressée à la place des œstrogènes dans les mécanismes de
sensibilisation croisée entre les organes pelviens (colon, utérus) et l’urèthre et a rapporté chez
la rate que les œstrogènes la favorisaient via les récepteurs ERα et β en augmentant le NMDA
intramédullaire (240) au travers de plusieurs voies que sont la voie des phosphatidylinositol3-kinase (241) et la voie de régulation extracellulaire (ERK1/2) (242).
Traitement hormonal après la ménopause et bas appareil urinaire
La ménopause est responsable de la survenue de troubles vésico-sphinctériens (243). Leur
prévalence est estimée entre 10 et 40 % et 25 % des femmes ménopausées sont en demande
d’une prise en charge médicale (2).
De nombreux auteurs se sont intéressés à l’impact des traitements œstrogéniques qu’ils soient
administrés par voie générale ou locale sur les symptômes du bas appareil urinaire après la
ménopause. Toutefois les résultats sont controversés et décevant en particulier pour la prise en
charge de l’incontinence urinaire d’effort.
Incontinence urinaire d’effort
Alors que certains ont rapporté une augmentation de la pression uréthrale maximale sous
traitement oral et une amélioration de la symptomatologie dans 65 à 70 % des cas (244, 245),
ces résultats n’ont pas été confirmés par les études récentes (203) et en particulier par deux
55
études multicentriques contrôlées contre placebo évaluant l’effet de la prise orale
d’œstrogènes sous la forme d’œstrogènes conjugués équins pour l’une et de valérate
d’œstradiol pour l’autre chez respectivement 83 et 67 femmes ayant une incontinence urinaire
d’effort (246, 247). Une revue portant sur 8 essais contrôlés et 14 essais prospectifs non
contrôlés a abouti à la même conclusion (248). Dans une étude multicentrique contrôlée en
double aveugle contre placebo réalisée auprès de 27 347 ménopausées (Etude WHI), la prise
d’œstrogènes conjugués équins en association ou non à des progestatifs augmentait le risque
de survenue d’une incontinence urinaire d’effort (249). L’ensemble de ces résultats a été
repris dans une analyse du groupe Cochrane concluant que l’administration systémique
d’œstrogènes qu’ils soient de synthèse ou équins résultait en une aggravation de
l’incontinence urinaire d’effort par rapport au placebo (250).
Concernant l’administration locale isolée, il n’a pas été démontré, à ce jour, de bénéfices dans
le traitement de ce type d’incontinence (251).
Hyperactivité vésicale
Alors que l’effet d’un traitement oral reste controversé, les études actuellement disponibles
s’accordent sur une efficacité du traitement local.
Ainsi alors qu’une étude contrôlée en cross-over en double aveugle évaluant la prise orale
d’œstriol par rapport au placebo chez 34 femmes ménopausées a montré une amélioration
subjective de la symptomatologie (252), une étude distincte portant sur 64 femmes
ménopausées ayant une urgenturie n’a pas montré d’effet de l’œstriol (253).
Concernant le traitement local par œstradiol, Eriksen rapporte, à partir d’une étude
randomisée contre placébo réalisée chez 164 patientes traitées pendant douze semaines, une
amélioration significative de l’ensemble des symptômes composant le syndrome clinique
d’hyperactivité vésicale (254).
Une méta-analyse incluant 10 essais contrôlés contre placebo a montré que la prise
d’œstrogènes par voie orale ou voie vaginale était supérieure au placebo pour l’incontinence
56
urinaire par urgenturie, la pollakiurie et la nycturie et que seule l’administration vaginale avait
un effet sur l’urgenturie (155). Cela a été confirmé par la revue réalisée par le groupe
Cochrane (250).
Infections urinaires récidivantes
Là encore, les résultats du traitement par voie orale sont controversés alors que ceux de la
voie vaginale montrent un bénéfice.
Dans une étude randomisée contrôlée contre placebo réalisée chez 40 femmes ménopausées,
Kirkengen rapporte une supériorité de l’œstriol (255). Malheureusement, ces résultats n’ont
pas été confirmés dans un essai en cross-over réalisé chez 12 femmes (156).
Une étude randomisée contre-placebo en double-aveugle menée chez 93 femmes
ménopausées a montré que l’œstriol administré par voie vaginale diminuait significativement
le nombre d’infections urinaires et que cela était associé à une diminution du pH vaginal et de
la colonisation vaginale par Entérobacter (256). Une méta-analyse portant sur trois essais et la
revue réalisée à partir de deux essais par le groupe Cochrane ont conclu que
l’œstrogénothérapie par voie vaginale diminuait le nombre d’infections urinaires chez la
femme ménopausée (155, 257).
Œstrogènes et monoxyde d’azote au niveau du bas appareil urinaire
Plusieurs auteurs ont rapportés un lien entre les œstrogènes et la production de monoxyde
d’azote au niveau du bas appareil urinaire. Toutefois les effets rapportés sont contradictoires.
Ainsi, Ehren a montré que les œstrogènes augmentaient l’activité de la monoxyde d’azote
synthase calcium-dépendante au niveau de la vessie du cochon d’inde (233). Il n’était en
revanche pas précisé dans cette étude si l’augmentation d’activité était liée ou non à
l’isoforme neuronal de la monoxyde d’azote synthase. Al-Hijji a rapporté une diminution de
l’activité de la monoxyde d’azote synthase cytosolique calcium-dépendante au niveau de la
vessie, du trigone et de l’urèthre. Cette différence de résultats peut s’expliquer par la dose
d’œstrogènes utilisée puisque dans ce deuxième cas, elle était 100 fois inférieure (258). Dans
57
une étude associant une évaluation de la contractilité en bains d’organes isolés et une mesure
d’activité enzymatique, Takahashi a montré que le traitement par œstrogènes de lapines non
castrées réduisait au niveau de l’urèthre l’activité de la NO synthase et inhibait la relaxation
induite par la stimulation des nerfs nitrergiques (259). Okuno comparant des lapines castrées à
des lapines castrées supplémentés en œstrogènes, a montré qu’un des mécanismes de cet effet
était lié à l’accumulation dans l’urèthre d’inhibiteurs endogènes de la monoxyde d’azote
synthase (L-NMMA et ADMA) lors de l’apport d’œstrogènes (260).
Nous avons montré chez la souris femelle que l’expression uréthrale de la nNOS était
modulée par l’œstradiol. Elle était diminuée en présence de taux gestationnels et augmentée
après ovariectomie (220).
Après la ménopause ont été rapportées des variations d’expression de la eNOS et de la iNOS.
Ainsi, chez la rate, la castration est associée à une diminution d’expression de la eNOS au
niveau de la paroi des vaisseaux de la paroi vésicale et la supplémentation en œstrogène
permet de retrouver un niveau identique (261). Chez la femme ménopausée, Pace a montré la
présence de iNOS au niveau des tissus péri-uréthraux et du vagin (262).
58
Voie du monoxyde d’azote
Le NO est un gaz incolore et inodore dans les conditions normales de pression et de
température. C’est un radical neutre dont la structure possède un électron non apparié. En
1986, Furchgott montrait pour la première fois que ce gaz était un acteur de la médiation
cellulaire. Il s’agit d’ailleurs toujours du seul médiateur gazeux connu à ce jour. En réalité,
dès 1980, il avait mis en évidence qu’une substance produite par les cellules endothéliales
avait un effet vasodilatateur et l’avait appelée EDRF (Endothelium-Derived Relaxing Factor)
(263). Ignarro a ensuite montré que l’effet vasodilatateur de cet EDRF était dû à une molécule
signale identifiée comme le monoxyde d’azote (264). Enfin, Murad a établi que la cible du
NO était, dans le système cardiovasculaire, la guanylate cyclase soluble (GCs). A la suite de
ces travaux, en 1992, la revue Science élisait le NO, molécule de l'année et ces trois auteurs
recevaient le prix Nobel de médecine en 1998.
Structure et propriétés physico-chimiques du NO
Dans les conditions normales de température et de pression, le monoxyde d'azote est un gaz
incolore à l'état pur. NO est un radical mesurant 115 pm constitué d'un atome d'azote et d'un
atome d'oxygène liés par une double liaison (figure 8).
Figure 8: Structure de Lewis du monoxyde d'azote
La concentration de NO dans une solution exposée à une pression partielle de 1 atm (101,3
kPa) de NO gaz est de 1,93 mM à 25°C et 1,63 mM à 37°C. Le radical NO• ne réagit pas avec
l’eau. Il est assez peu soluble et sa solubilité est diminuée par l’augmentation de la force
59
ionique de la solution avec laquelle il est en contact. Il est admis que, pour une pression
partielle de 1 atm, elle est de 1,55 mM dans des conditions physiologiques de force ionique et
de température. Le coefficient de partage dans le système 1-octanol/eau est de 6,5. Cela
suggère que la solubilité du radical NO est 6 à 7 fois plus élevée dans les membranes que dans
la phase aqueuse. Cette propriété hydrophobe lui permet d’être stocké dans les membranes
mais également de diffuser à travers celles-ci afin d’exercer ses fonctions physiologiques
(265). Son coefficient de diffusion en phase aqueuse est de 4,8.10-5 cm2.s-1 à 37°C.
La chimie du NO est caractérisée par sa nature radicalaire ce qui le rend très réactif. De ce
fait, il a une demi-vie courte de l’ordre de 1 à 5 secondes, voire 30 secondes au maximum en
milieu biologique. Ainsi, le NO réagit rapidement avec l’ion superoxyde O2- pour former l’ion
peroxynitrique ONOO- qui possède une toxicité reconnue impliquée en autre dans l’apoptose.
Le NO peut également réagir avec des métaux de transition. Il se lie sur des sites de
coordination libre dans des complexes métalliques comme le manganèse, le cuivre ou le fer,
pour former des complexes métalliques nitrosés, par oxydation ou réduction directe des
centres métalliques. Les cibles privilégiées du NO sont les métalloprotéines, qu’elles
renferment ou non un noyau héminique. Le NO présente ainsi une grande affinité avec le fer
ferreux avec lequel il se lie de façon réversible selon le schéma suivant : NO + Fe2+ ↔ Fe2+NO. Cette interaction peut conduire à l’activation ou à l’inhibition de l’activité enzymatique
de la métalloprotéine. Ainsi, le NO active spécifiquement la guanylate cyclase soluble (GCs)
en entraînant la formation d’un complexe de fer nitrosylé qui catalyse la formation de
Guanosine MonoPhosphate cyclique (GMPc) à partir de Guanosine TriPhosphate (GTP)
(266). Le NO se fixe de façon réversible sur l’hème de l’enzyme avec une constante
d’association de 7x108 M-1 s-1 et une constante de dissociation de 0.05 s-1. A l’inverse de
l’action sur la guanylate cyclase, l’interaction entre le NO et la partie héminique des protéines
60
appartenant à la famille des cytochromes P450, NO-synthases, lipooxygénases ou cytochrome
oxydases conduit à une inhibition de l’activité enzymatique (267).
Le radical NO peut aussi réagir avec des protéines non héminiques pour former des
complexes protéiques de fer dinitrosylés stables. Ces complexes pourraient contribuer à
l’action cytotoxique du NO à travers l’inhibition d’enzymes à cluster [Fe-S] mitochondriales
ou cytosoliques telles que les aconitases, la NADH-ubiquinone oxydoréductase et la succinate
ubiquinone oxydoréductase (268).
L’interaction du NO avec des centres métalliques peut se traduire par des réactions
d’oxydation, comme dans le cas de l’oxyhémoglobine (Hb-O2) (269). Le complexe Hb-O2
peut être représenté sous deux formes résonantes, Fe2+-O2 et Fe3+-O2-, cette dernière étant
prédominante. Le radical NO, en réagissant avec l’oxyhémoglobine, conduit à la formation de
methémoglobine (Fe3+-Hb) et de nitrates, selon la réaction : [Fe2+-O2 ↔ Fe3+-O2-] + NO• →
Fe3++NO3−.
La concentration élevée d’hémoglobine dans le sang et la diffusion rapide du radical NO font
que les nitrates sont les produits terminaux du métabolisme du radical NO in vivo.
Contrairement au monoxyde de carbone et à l’oxygène moléculaire, le NO est capable de se
lier de façon réversible au fer ferrique des protéines héminiques (avec une moindre affinité
que pour le fer ferreux) selon le schéma suivant : Fe3++NO• ↔ [Fe3+- NO ↔ Fe2+- NO+]. Le
complexe résultant est très instable car deux formes mésomères peuvent exister.
Le radical NO peut agir en tant que réducteur du fer ferrique et acquiert un caractère NO+. Le
complexe peut être attaqué par des agents nucléophiles (B-) selon le schéma suivant : [Fe3+NO → Fe2+-NO+] + B- → Fe2++ B-NO. Ces agents nucléophiles peuvent être des thiols (270).
Cependant, le NO ne réagit pas directement avec les thiols. La réaction nécessite un accepteur
d’électron qui est en général un métal de transition ou le radical NO2• : NO + RSH → RSNO
+ H++e-. Les nitrosothiols (RSNO) ainsi formés ont une demi-vie biologique plus longue (près
61
de 40 minutes) que le radical NO. Ils pourraient ainsi constituer des « réservoirs » de NO et
par conséquent augmenter la durée de son action.
En solution aqueuse aérobie, le NO est rapidement oxydé en nitrite. La vitesse de cette
oxydation n’étant pas linéaire en fonction de la concentration en NO, celui-ci peut, en faible
concentration, diffuser largement.
La voie du monoxyde d’azote
La voie du monoxyde d’azote comprend les aspects biochimiques de la synthèse du NO, sa
libération, son catabolisme et ses effets biologiques (figure 9).
Figure 9: Voie et mode d’action direct du monoxyde d’azote
NOS : monoxyde d’azote synthase, NADPH : β-nicotinamide adénine dinucléotide réduit, NO :
monoxyde d’azote, GCs : Guanylate cyclase soluble, GTP : Guanosine TriPhosphate, GMPc :
Guanosine MonoPhosphate cyclique, GMP : Guanosine MonoPhosphate, PDE5 : Phosphodiesterase
de type V, Ca2+ : calcium, fml : fibre musculaire lisse
La synthèse du NO
Le monoxyde d’azote est produit dans l’organisme à partir de la L-Arginine par
l’intermédiaire de monoxyde d’azote synthases (NOS) (271). Il n’est pas stocké et est donc
produit au moment et a une demi-vie de l’ordre de la seconde.
62
Le substrat : la L-arginine
La L-arginine est un acide aminé « semi-essentiel ». Elle a une origine exogène et endogène.
L’apport exogène est constitué par la dégradation des protéines absorbées dans l’alimentation,
cette dernière apportant environ 5 g d'arginine par jour. Environ 40% de l’arginine ingérée est
dégradée dans le tube digestif avant de pouvoir être absorbée (272).
Dans l’organisme, l’arginine est synthétisée à partir de la citrulline, (principalement au niveau
du tubule rénal proximal) ou provient de la dégradation de protéines endogènes. Pour la
synthèse à partir de la citrulline, deux enzymes du cycle de l’urée (arginosuccinate lyase et
arginosuccinate synthétase) sont impliquées. A l’échelle de l’organisme, la majorité de
l’arginine synthétisée de novo est le fruit d’une « collaboration métabolique » entre l’intestin
grêle et le rein. Cette synthèse de novo peut atteindre des niveaux tels que l’arginine n’est pas
considérée comme un acide aminé essentiel chez un adulte sain. En revanche, cette synthèse
peut s’avérer insuffisante chez des nourrissons, des enfants en période de croissance, des
adultes en phase de catabolisme important ou lorsqu’il existe une dysfonction des reins et/ou
de l’intestin grêle. Cela explique que l’arginine soit considérée comme un acide aminé semiessentiel.
En période de jeûne, environ 85% de l’arginine qui pénètre dans la circulation sanguine
provient de la dégradation de protéines endogènes, les 15% restant provenant de la synthèse
de novo. Cette dernière semble indépendante de son apport exogène et/ou de sa synthèse via
le catabolisme endogène (273). Cela signifie que l’homéostasie de l’arginine se fait par le
biais de sa dégradation, principalement via les arginases. Ainsi, après invalidation du gène de
l’arginase II chez la souris, la concentration circulante d’arginine augmente (274).
La synthèse de novo d’arginine peut également avoir lieu dans d’autres cellules que le rein.
C’est le cas dans le macrophage. Cette synthèse est alors majorée par diverses cytokines, en
général en même temps qu’est induite l’expression de NOS-2 (275). Dans ce cas, une partie
de la citrulline produite par la NOS est « recyclée » en arginine (figure 10) (272).
63
Figure 10: Synthèse endogène de l’arginine à partir de la Citrulline
D’après Wu et Morris (272)
Les NO-synthases
Il existe trois isoformes de NO synthases: l’isoforme neuronale ou nNOS ou NOS-1 ou NOS
neuronale, l’isoforme inductible ou iNOS ou NOS-2 et l’isoforme endothéliale ou eNOS ou
NOS-3 ou NOS endothéliale. Les NOS-1 et NOS-3 sont dites constitutives car elles sont
exprimées en permanence dans certaines cellules. Toutefois, elles ne sont actives que lorsque
la concentration cytoplasmique de calcium augmente. Elles sont donc calcium-dépendantes.
Contrairement aux premières descriptions qui ont dicté le nom des différentes isoformes
enzymatiques, la NOS-1 est présente ailleurs que dans les neurones et la NOS-3 ailleurs que
dans les cellules endothéliales. La NOS-2 est dite inductible car elle n’est pas exprimée en
permanence et son activité est indépendante du calcium. Elle est exprimée par le macrophage
mais aussi par de nombreuses autres cellules de l'organisme, en réponse à des toxines
bactériennes (endotoxine des bacilles gram négatifs, acide lipoteichoïque et peptidoglycane
des cocci gram positifs) et à des cytokines pro-inflammatoires (IL-1β, TNF-α, IFN-γ).
Les trois isoformes de NOS sont caractérisées par des régions de forte homologie (les
domaines oxygénase et réductase), un substrat commun (L-arginine), les mêmes cofacteurs
(β-nicotinamide adénine dinucléotide réduit (NADPH), tétrahydrobioptérine (BH4), flavine
64
adénine dinucléotide (FAD), flavine mononucléotide (FMN) et hème) et certains inhibiteurs
(dérivés de la L-arginine où la fonction amine NH2 concernée par la réaction enzymatique est
modifiée) (figure 11).
Figure 11: Fonctionnement général des NOS
Le β-nicotinamide adénine dinucléotide réduit (NADPH) est oxydé au niveau du domaine réductase.
Les 2 électrons libérés transitent par la flavine adénine dinucléotide (FAD), puis par la flavine
mononucléotide (FMN), avant d’aboutir dans le domaine oxygénase, qui possède les sites de fixation
de tétrahydrobioptérine (BH4) et de l’hème. Ce flux d’électrons n’est possible qu’en présence de
calmoduline (CAM).
Les différentes isoformes ont également des caractéristiques distinctes (tableau 2).
Type
Localisation cellulaire
Masse Moléculaire (kDa)
Localisation du gène
dans l’espèce humaine
Activation
NOS-I
Constitutive
NOS-II
Inductible
Cytosol
Cytosol
160
130
NOS-III
Constitutive
Cytosol
Membrane
Mitochondries
133
12q24
17q11.2
7q35-36
Augmentation
concentration de
calcium
Expression stimulée par
cytokines et/ou
endotoxines
Augmentation
concentration de
calcium
Tableau 2 : caractéristiques des trois isoformes de NO-synthases
Ainsi la NOS-1 est exprimée de manière constitutive dans certains neurones (276). Son
activité, mesurée dans la fraction cytosolique des neurones, dépend du calcium et de la
calmoduline (277). Elle fut d’abord caractérisée sous forme soluble mais peut aussi être liée
aux protéines membranaires telles que PSD-95, PSD-93 ou la syntrophine, par l’intermédiaire
d’un fragment PDZ N-terminal (278). La NOS-1 est très puissamment inhibée par la Protein
65
Inhibitor of NOS (PIN) qui est capable de déstabiliser les homodimères de NOS-1 et donc de
rendre l’enzyme inactive (279). Dans certaines régions du cerveau, de nombreux neurones
cholinergiques contiennent une activité NADPH-diaphorase caractéristique de l’activité des
NOS (280). Certaines données indiquent que la très grande quantité de NOS-1 présente dans
le pont pourrait être un élément de signalisation paracrine (281). La NOS-1 a également été
mise en évidence au niveau de multiples tissus dans l’organisme comme l’urèthre par
exemple. Enfin, elle peut être activée par des médiateurs comme l'acétylcholine, l'histamine,
la sérotonine, l'adénosine, la bradykinine et le glutamate.
La NOS-2 est exprimée dans les macrophages mais aussi dans les hépatocytes et les
chondrocytes (282). Elle est très largement distribuée dans les cellules et les tissus de
l’organisme. Son activité enzymatique est indépendante du calcium car la calmoduline est très
fortement liée à l’enzyme et ce quel que soit la concentration de calcium intracytosolique
(283). Son expression dépend de la fixation d’un facteur de transcription (NFκB) au niveau de
l’ADN. Le NFκB est activé après exposition à des composants bactériens (lipopolysaccharide,
acide lipotechoïque) ou des cytokines proinflammatoires (IL1, IL2, IL6, TNFα et INFγ) (284,
285). L’expression de la NOS-2 peut donc être induite par une réaction inflammatoire (286).
A l’inverse, le NFκB peut être inactivé par le NO (provenant des NOS constitutives dans les
conditions physiologiques ou par la NOS-2 elle-même) (287).
La NOS-3 est exprimée au niveau des cellules endothéliales. Son activité enzymatique est
modulée par les forces de cisaillement qui renforcent son activité (288-290) et par des
médiateurs circulants qui vont non seulement contrôler l’activité de cette enzyme mais
également son expression. En effet, la stimulation de récepteurs spécifiques d’agonistes variés
(bradykinine, sérotonine, adénosine, ADP/ATP, histamine, thrombine) peut augmenter
l’activité de la NOS-3 (291, 292). La phosphorylation des résidus sérine de la NOS-3 est
essentielle pour contrôler son activité. Les conséquences de cette phosphorylation sont soit
66
une augmentation soit une réduction de son activité en fonction du type de kinase (Protéine
kinase A, Protéine kinase B encore appelée sérine/thréonine kinase Akt, Protéine Kinase C) et
du résidu sérine impliqués (293-296). En outre, plusieurs facteurs peuvent augmenter
l’expression et/ou l’activité de la NOS-3, incluant le Vascular Endothelial Growth Factor
(297, 298), l’insuline (299), le TGF-β, l’Epidermal Growth Factor, ou encore de faibles
concentrations
de
LDL
oxydées
ou
de
son
facteur
athérogénique
majeur
le
lysophosphatidylcholine (lysoPC). D’autres facteurs sont connus pour réduire l’expression de
la NOS-3, en particulier le TNF-α, l’érythropoïétine, l’hypoxie et des concentrations fortes de
LDL oxydées (300, 301).
Synthèse du NO par les NO-synthases
Les NO-synthases catalysent la formation du radical NO à partir d’un atome d’azote du
groupement guanidium de l’acide aminé L-Arginine en consommant de l’oxygène
moléculaire et du NADPH (figure 12) (302).
Figure 12 : Cascade chimique conduisant à la production de monoxyde d’azote à partir de L-Arginine
Comme vu plus haut, l’activité des NOS nécessite, outre les substrats, de nombreux
cofacteurs (303). Leurs formes actives sont des homodimères (304), chaque monomère
comprenant un domaine réductase en C-terminal liant NADPH et flavines et un domaine
oxygénase en N-terminal comportant le site catalytique, le site de fixation pour la BH4 et
67
l’hème. Ce dernier joue un rôle important pour la dimérisation de l’enzyme, tandis que la
liaison du BH4 stabiliserait la forme dimère (305). Le complexe calcium/calmoduline (ou la
calmoduline seule dans le cas de la NOS-2) se fixe entre le domaine oxygénase et domaine
réductase et contrôle le transfert d’électrons du domaine réductase vers le domaine oxygénase
pour permettre la réaction enzymatique (306).
Il a été rapporté que la NOS inductible produisait de plus fortes concentrations de NO que les
NOS constitutives (307). En réalité, les 3 isoformes de NOS ont une activité spécifique très
voisine (308), et la différence de concentration de NO est en réalité liée à des phénomènes de
contrôle post-transcriptionnel (localisation subcellulaire, phosphorylation, …) (309).
Mécanismes d’action du NO
Une fois synthétisé le NO réagit avec des molécules intra-cellulaires et/ou sur les cellules
voisines selon un mode paracrine et du fait de sa grande instabilité intrinsèque, ne nécessite
pas de récepteur extracellulaire et de mécanisme spécifique de dégradation. Ses effets sont
extrêmement variés et dépendent essentiellement de la concentration du NO et du milieu
environnant son site de synthèse.
La voie du GMPc, produit par l’interaction du NO avec la GCs, est le mécanisme d’action
principal des effets physiologiques du NO. Cependant, il existe deux autres mécanismes
connus.
Les mécanismes du NO sont ainsi divisés en trois parties : des réactions avec des métaux
comme le fer, le cuivre ou le zinc de groupements prosthétiques d’enzymes ou de protéines,
permettant ainsi au NO de réguler l’activité de différentes enzymes (GMPc essentiellement);
la formation de S-nitrosothiols à partir de la cystéine par S-nitrosylation permettant de réguler
l’activité de nombreuses enzymes; et la réaction avec l’anion superoxyde (O2-) entrainant
ainsi la formation de peroxynitrite (ONOO-), qui du fait de son fort pouvoir oxydant est à
l’origine de modifications des protéines, lipides et acides nucléiques.
68
Le premier mécanisme est considéré comme un mécanisme direct et les deux autres sont
qualifiés d’indirects. De plus, à de faibles concentrations (<1μM), l’effet direct est
prédominant, alors qu’à des concentrations plus élevées (>1μM), les effets indirects
deviennent plus importants (310).
Les différents mécanismes sont résumés figure 13.
NO et voie du GMPc
Le NO, du fait de sa structure peut agir comme un donneur d’électron et peut ainsi réagir avec
des métaux de transition comme le fer, le cuivre et le zinc. Une des cibles principales du NO
est la GCs. Celle-ci contient une structure hème avec du fer (Fe2+) et peut convertir le GTP en
une molécule messager intracellulaire: le GMPc. A l’état de base, l’activité GCs est faible,
mais elle peut être très rapidement augmentée par de faibles concentrations de NO (10100nM). Le NO se lie directement à l’hème entrainant ainsi un changement de la structure
porphyrique permettant ainsi l’activation de la GCs. Cette activation entraine une
augmentation de la synthèse de GMPc (400 à 500 fois) (310, 311). Le principal médiateur de
la voie GMPc est la protéine kinase GMPc dépendante (PKG). La PKG est une
serine/thréonine kinase activée par la liaison avec le GMPc. Il existe deux types de PKG
différant par leur domaine régulateur. La PKG I est une enzyme cytosolique exprimée de
façon ubiquitaire. La PKG II est une protéine membranaire présente dans de nombreux tissus
ayant un rôle important dans l’activité sécrétrice de l’épithélium intestinal (312). Elles sont
responsables de la phosphorylation du phospholambane qui favorise la recapture du Ca2+ par
les SERCA (sarcoplasmic/endoplasmic-reticulum Ca2+-ATPase). Elles vont également
phosphoryler le récepteur à l’inositol triphosphate (IP3), les pompes calciques
transmembranaires et la myosin light chain kinase (272, 313). La phosphorylation du R-IP3
va diminuer la libération de Ca2+ du réticulum (314, 315), et la production d’IP3 pourrait être
inhibée (316). Les PKG sont également responsables d’une activation des canaux potassiques
sensibles au calcium provoquant une hyperpolarisation (317). Cette dernière inhibe l’entrée
69
des ions calcium via les canaux calciques voltage dépendants. Enfin, les PKG vont activer par
phosphorylation une protéine phosphatase A2 qui va aussi déphosphoryler les canaux
calciques voltage dépendants.
Le GMPc agit aussi via les canaux ioniques activés par les nucléotides cycliques (CNG, cyclic
nucleotide gated channels), la protéine kinase AMPc dépendante (PKA) et les
phosphodiestérases (PDE). Il existe de nombreuses analogies structurales entre la PKG et la
PKA. Cependant, l’affinité de la PKA pour le GMPc est 50 fois moindre que pour l’AMPc
(312).
Tous ces mécanismes participent à la baisse de Ca2+ intracellulaire et vont conduire à la
relaxation (318). Cependant, les PKG pourraient également agir par des voies indépendantes
du calcium intracellulaire. Elles agiraient alors par des voies de désensibilisation (318).
Différents travaux démontrent que la PKG est capable d’activer la phosphatase spécifique de
la chaîne légère de la myosine qui va, en aval de la cascade de transduction, déphosphoryler
cette dernière et ainsi inhiber les interactions myosine-actine. Cette phosphatase spécifique de
la chaîne légère de la myosine est indépendante du Ca2+ pour son fonctionnement.
Le GMPc peut aussi se lier aux PDE qui catalysent la conversion/inactivation de l’AMPc et
du GMPc en respectivement 5’AMP et 5’GMP. La PDE 5 est spécifique du GMPc (319).
Un mécanisme direct du NO sur la cytochrome c oxydase (CcO), enzyme terminale
permettant la synthèse d’ATP par la mitochondrie a été décrit. Le NO peut inhiber de manière
réversible la CcO, entravant ainsi la respiration mitochondriale (320). De plus, le NO peut
inhiber la catalase en réagissant avec le fer de l’hème de cette enzyme. La catalase est
responsable du métabolisme du peroxyde d’hydrogène. Son inhibition par le NO entraine une
augmentation de la concentration intracellulaire du peroxyde d’hydrogène pouvant contribuer
à la cytotoxicité du NO (321).
NO et S-nitrosylation
70
La S-nitrosylation des protéines est un mécanisme important de régulation de l’activité
protéique. En solution aqueuse, le NO réagit rapidement avec l’oxygène formant le trioxyde
d’azote (N2O3), rapidement décomposé en ion nitrosonium (NO+) et nitrite. NO+ est à
l’origine de la nitrosylation de thiols, amines secondaires et composés phénoliques (322).
L’importance de ces mécanismes d’autoxydation est dépendante de la concentration de NO et
d’oxygène, entrainant une formation importante de N2O3 au site de synthèse de NO. Ceci
permet de souligner l’importance de la distance entre le site de synthèse du NO dans la voie
de signalisation choisie. Le groupe de protéines cellulaires cibles de la régulation par Snitrosylation est extrêmement varié et important: facteurs de transcription, kinases impliquées
dans les voies de signalisation, caspases, canaux ioniques. En effet, le NO peut réagir avec des
protéines contenant des groupements thiols comme l’albumine et l’activateur du
plasminogène tissulaire, formant ainsi des groupements S-nitrosothiols pouvant jouer un rôle
de stockage ou de transport du NO. Les mécanismes directs de défense antimicrobienne du
NO sont en grande partie dus à la S-nitrosylation de la cystéine des protéases qui sont
importantes pour la réplication et la virulence des virus, bactéries et des parasites (323, 324).
NO et peroxynitrite
La réaction entre le NO et l’anion superoxide (O2-) forme ONOO-, molécule réactive pouvant
être à l’origine de nitration et d’oxydation des protéines, lipides et nucléotides. La réaction
entre le NO et l’anion superoxyde est extrêmement rapide, favorisée par la présence en
concentration suffisante et équivalente de NO et d’oxygène. Les sources de superoxyde sont
essentiellement la mitochondrie et les cellules immunitaires (macrophages et lignées
granuleuses) (310). Une formation accrue de peroxynitrite entraine une nitration des
protéines, une inhibition de la respiration mitochondriale, une altération de l’ADN, une
apoptose et une nécrose cellulaire, entraînant des lésions cellulaires et tissulaires (325). La
nitrotyrosine est utilisée comme un marqueur de formation de peroxynitrite, de lésions
tissulaires ainsi qu’un marqueur de survenue de modifications fonctionnelles des protéines.
71
En effet, la nitration des protéines et des enzymes entraine une modification de leur activité
catalytique, de leur capacité d’agir comme signal cellulaire ainsi qu’une modification
structurelle du cytosquelette (325, 326). Il faut souligner que l’activité de la NOS-2 est
médiée par une nitration induite par l’ONOO- (entrainant une diminution de l’activité
catalytique de la NOS-2) (327). Enfin, il faut noter que le NO peut être à l’origine de nitration
de protéines sans formation de ONOO-, comme les cyclooxygenases I et II (328, 329).
Figure 13: Représentation schématique des trois mécanismes d’action du NO
Modulation de la voie du monoxyde d’azote
La régulation de l’activité des NOS permet au NO d’exercer ses fonctions adéquatement et de
s’adapter en fonction des situations physiologiques ou physiopathologiques.
Comme vu plus haut, l’activité des NOS (eNOS et nNOS surtout) peut être modulée par des
modifications post-traductionnelles comme la phosphorylation et l’acylation. Elle peut
également être modulée par l’intermédiaire des molécules qui lui sont associées comme la
CAM, le BH4 et la HSP90, des modifications de la concentration intracellulaire du substrat, la
72
L-arginine, par des variations des apports exogènes, de production endogène, de son transport
transmembranaire et de l’activité des arginases.
Par ailleurs, les effets de la voie du monoxyde d’azote peuvent être augmentés par l’utilisation
de donneurs de NO tels que les dérivés nitrés (trinitrine ou trinitrate de glycéryle, le
tétranitrate d'érythrityle, le tétranitrate de pentaérythrityle ou dinitrate d'isosorbide), le
nitroprussiate de sodium, la molsidomine et la linsidomine.
Nous allons nous intéresser ici à d’autres mécanismes : les inhibiteurs des NOS et des PDE5.
Les inhibiteurs des NOS
Il existe plusieurs types d’inhibiteurs des NOS dont la plupart agissent au site actif de
l’enzyme : les inhibiteurs ne dérivant pas des acides aminés, les ligands de l’hème et les plus
utilisés, les analogues de la L-arginine. De plus, certains ne sont pas sélectifs alors que
d’autres sont plus sélectifs de telle ou telle isoforme (tableaux 3 et 4).
Les analogues « guanidino-substitutés » de la L-arginine inhibent la synthèse du NO en
entrant en compétition avec l’arginine. Ces inhibiteurs peuvent être endogènes tels que la NGmonomethyl-L-arginine (L-NMMA) et la diméthylarginine « asymétrique » (ADMA, pour «
asymmetric dimethylarginine ») (330) ou exogènes comme le L-NAME (N -nitro-L-arginine

méthylester) (331). Ce dernier est fréquemment utilisé comme inhibiteur non sélectif, même
si certains rapportent qu’il serait sélectif pour les formes constitutives, la nNOS et la eNOS
(332). L’iminoéthyl-L-lysine (L-NIL) est plus sélectifs de la iNOS (333).
D’autres inhibiteurs non acides aminés entrent en compétition avec la L-Arginine au niveau
de son site de fixation à la NOS. Il s’agit de l’aminoguanidine et du 1400W, tous deux
sélectifs de la iNOS (334, 335).
Le mode d’action des ligands de l’hème est la fixation du groupement hème de l’enzyme
empêchant ainsi l’oxydation de la L-arginine et ainsi la production de NO. C’est ainsi
73
qu’agissent les agents indazolés tels que le 7-nitroindazole (7-NI), inhibiteur sélectif de la
nNOS (336).
Composé
L-NMMA
(N-méthyl-L-arginine)
L-NNA (N-nitro-L-arginine)
et L-NAME
L-NIL (iminoéthyl-L-lysine)
AG (aminoguanidine)
Type
d’inhibiteur
Analogue
de la L-Arg
Analogue
de la L-Arg
Analogue
de la L-Arg
Non acide
aminé
IC50 pour
nNOS (µM)
IC50 pour
eNOS (µM)
IC50 pour
iNOS (µM)
4,9
3,5
6,6
0,29
0,35
3,1
37
49
1,6
170
330
31
1400W
N-3-aminométhyl-benzylacétamidine
Non acide
aminé
7,3
1000
0,23
7-NI (7-nitroindazole)
Ligand de
l’hème
8,3
11,8
9,7
Tableau 3: Affinité des inhibiteurs pour les différentes NOS
Composé
L-NMMA (N-méthyl-L-arginine)
L-NNA (N-nitro-L-arginine)
et L-NAME
L-NIL (iminoéthyl-L-lysine)
AG (aminoguanidine)
1400W
N-3-aminométhyl-benzyl-acétamidine
7-NI (7-nitroindazole)
Type
d’inhibiteur
Analogue
de la L-Arg
Analogue
de la L-Arg
Analogue
de la L-Arg
Non acide aminé
iNOS
vs nNOS
iNOS
vs eNOS
nNOS
vs eNOS
0,7
0,5
0,7
0,09
0,11
1,2
23
49
1,3
5,5
11
1,9
Non acide aminé
32
<4000
<130
Ligand de l’hème
0,9
1,2
1,4
Tableau 4: Sélectivité relative des NOS
Amplification des effets de la voie du monoxyde d’azote par diminution
du catabolisme du second messager : le GMPc
Le GMPc est catabolisé en GMP par la PDE5 en hydrolysant les liaisons phosphodiester.
Cette dernière fut purifiée en 1980 à partir de poumon de rat (337) et clonée en 1993 (338). Le
gène de PDE5 est localisé sur le locus chromosomique 4q26 (339). Il s’agit d’un homodimère
de poids moléculaire de 200 kDa. Chaque monomère contient un domaine C-terminal
catalytique ayant une très forte affinité avec le Zinc, deux sites de liaison allostériques pour le
74
GMPc et au niveau de la région N-terminale un site de phosphorylation de la sérine 92. La
phosphorylation par la protéine kinase A ou G résulte en une augmentation significative de
l’activité PDE5. Cette protéine est exprimée dans l’ensemble des cellules musculaires lisses
de l’organisme et dans les plaquettes. Trois différentes formes ont été décrites : PDE5A1PDE5A3 (339, 340). La distribution cellulaire des différents isoformes de la PDE5 est
présentée tableau 5.
Isoformes PDE5
Lignées cellulaires/tissus
A1
A2
A3
MCF-7 (cancer du sein)
-
+
-
T47-D (cancer du sein)
-
+
-
Ishikawa (caner de l’utérus)
-
+
-
HT1080 (fibrosarcome)
-
+
-
COS -7 (fibroblastes)
-
+
-
Muscle lisse aorte
-
+
+
Muscle lisse vessie
-
+
+
Muscle lisse urèthre
-
+
+
Muscle lisse pénis
-
+
+
Endothélium pénis
-
+
+
Endothélium Aorte
-
+
-
CEM (Leucémie)
-
+
-
Jurkat (Leucémie)
-
+
-
K562 (Leucémie)
-
+
-
Molt-4 (Leucémie)
-
+
-
Tableau 5: Distribution cellulaire des isoformes de la PDE5
D’après Lin (341)
75
Les inhibiteurs de la PDE5 rentrent en compétition avec la GMPc en se fixant sur la protéine
au niveau du site catalytique ce qui a pour conséquence une augmentation de la concentration
intracellulaire en GMPc. De multiples inhibiteurs sont actuellement disponibles : sildénafil,
vardénafil, tadalafil, zaprinast, udénafil, mirodénafil et avanafil. Les trois molécules les plus
utilisées en thérapie humaine sont le sildenafil, le vardénafil et le tadalafil. Toutefois leurs
propriétés pharmacologiques diffèrent. Elles sont résumées tableau 6.
Dosages disponibles (mg)
Classification biopharmaceutique
Absorption orale (%)
Biodisponibilité orale (%)
Délai atteinte pic plasmatique (heure)
Concentration plasmatique maximale (µg/l)
Impact alimentation riche en graisse
Aire sous la courbe (µg.h.l-1)
Linéarité de la dose
Fixation protéine de transport (%)
Volume de distribution après injection
intraveineuse (l)
Volume de distribution après ingestion orale (l)
Clairance (l/h)
Variabilité de la clairance orale (%)
Demi-vie plasmatique
Excrétion rénale (%)
Isoenzymes Cytochrome P450
Métabolite actif
IC50 pour IPDE5 (nm)
Sildénafil
25, 50, 100
Haute solubilité
Haute perméabilité
92
38-41
1 (0,5-2)
560
Augmentation délai
atteinte pic
plasmatique de 1
heure
1685
Légèrement non
linéaire
96
Vardénafil
5, 10, 20
Basse solubilité
Haute perméabilité
NA
15 (8-25)
0,7 (0,25-3)
20,9
Augmentation délai
atteinte pic
plasmatique de 1
heure
74,5
Tadalafil
2,5, 5, 10, 20
Basse solubilité
Haute perméabilité
36
NA
2 (0,5-6)
378
Linéaire
Linéaire
93-95
94
105
208
NA
>310
41
1785
56
Interindividuelle :
29
Inter et
intraindividuelle :
élevée
60-70
2,5
Inter et
intraindividuelle :
respectivement 45
et 28
17,5
<0,3
3-5
<1
3A4 (79%), 2C9
(20%), 2C9 et 2D6
(<2%)
N-desmethyl
sildenafil
3,9
4-5
1
3A4 (majeur), 3A5
(mineur), 2C9
(mineur)
Pas d’effet
significatif
8066
N-desethyl vardenafil
Aucun
0,1-0,7
0,94
Tableau 6 : Propriétés pharmocologiques des trois inhibiteurs des PDE5 disponibles en France
76
3A4
Expression des différentes isoformes de la monoxyde d’azote
synthase et des PDE5 au niveau du bas appareil urinaire féminin
Expression des différentes isoformes de la monoxyde d’azote synthase
au niveau du bas appareil urinaire féminin
Les trois types connus d’isoformes de NOS peuvent être exprimés au niveau du bas appareil
urinaire féminin. Physiologiquement, seules les nNOS et eNOS sont exprimées. Cependant la
iNOS est exprimée dans certaines situations pathologiques. Ces différentes isoformes sont
présentes dans l’espèce humaine mais aussi chez la lapine, la truie, la brebis, la chienne, la
souris et le cochon d’inde.
Dans l’espèce humaine, la nNOS est abondamment exprimée au niveau des fibres nerveuses
du col vésical et de l’urèthre et de manière clairsemée au niveau du dôme et des faces latérales
de la vessie (342). Chez la rate, la chate et la truie, elle est aussi exprimée au niveau du
trigone (343-345). Tous les auteurs s’accordent sur un gradient croissant d’expression de la
nNOS entre le détrusor, le col vésical et l’urèthre et ce quel que soit l’espèce étudiée. Elle est
exprimée au niveau des troncs nerveux situés au niveau de l’adventice et de la musculeuse et
au niveau des fines fibres nerveuses situées entre les faisceaux musculaires et dans la lamina
propria (346). Gillepsie a montré chez le cochon d’inde que la nNOS était également
exprimée au niveau de l’urothélium vésical à la fois par les cellules basales situées sur les
faces latérales de la vessie et les cellules superficielles situées sur la base et le dôme vésical
(347). Cependant au niveau des faces latérales, il n’y avait ni GMPc ni sous-unité β1 de la
GCs et l’adjonction de NO exogène n’avait aucun impact indiquant l’absence de fonction de
la nNOS à ce niveau.
Chez la lapine, Lyons a mis en évidence que les nerfs exprimant la nNOS au niveau des
faisceaux musculaires lisses uréthraux étaient également au contact des cellules interstitielles
(348).
77
La nNOS est également exprimée dans le sarcolème des fibres musculaires striées du
sphincter externe de l’urèthre de la femme et au sein des terminaisons nerveuses au niveau de
la plaque motrice chez la brebis (349, 350).
La eNOS est exprimée au niveau de la paroi des vaisseaux de la paroi vésicale et uréthrale.
Elle est également présente au sein de l’urothélium uréthral (3, 351).
L’expression des NOS peut être modifiée dans certaines situations pathologiques.
Comme indiqué plus haut, après la ménopause ont été rapportées des variations d’expression
de la eNOS et de la iNOS. Ainsi, chez la rate, la castration est associée à une diminution
d’expression de la eNOS au niveau de la paroi des vaisseaux de la paroi vésicale et la
supplémentation en œstrogène permet de retrouver un niveau identique (261). Chez la femme
ménopausée, Pace a montré la présence de iNOS au niveau des tissus péri-uréthraux et du
vagin (262).
Nous avons montré chez la souris femelle que l’expression uréthrale de la nNOS était aussi
modulée par l’œstradiol. Elle était diminuée en présence de taux gestationnels et augmentée
après ovariectomie (220).
En cas de cancer de vessie, les cellules tumorales expriment la iNOS alors que le tissu sain
péritumoral n’en exprime pas (352).
Lors d’une obstruction sous-vésicale, les études chez la rate ont montré une augmentation de
l’expression de la iNOS au niveau de l’urothélium vésical et des cellules inflammatoires et
une diminution de l’activité de la nNOS de la musculeuse (353). Kim a rapporté une
augmentation de l’expression de la eNOS et de la nNOS dans la paroi vésicale et que celle de
la nNOS se faisait au sein de cellules au contact des cellules interstitielles de Cajal situées
entre les fibres musculaires lisses du détrusor (354).
L’expression de la iNOS est également augmentée en cas d’infections urinaires et de
pathologies inflammatoires de la vessie. Johansson a ainsi montré lors de cultures de cellules
78
provenant de vessies de rates qu’après stimulation par des lipopolysaccharides et des
cytokines exprimés lors des infections urinaires, les cellules exprimaient l’ARNm de la iNOS
alors qu’il n’était pas présent dans les cellules non stimulées (355). Des résultats comparables
ont été rapportés après instillation intravésicale de lipopolysaccharides d’Escherichia coli
chez la rate (356). Cependant, après injection intrapéritonéale chez la souris, Kang n’observait
qu’une augmentation d’expression de la eNOS. Toutefois dans cette expérience, les vessies
étaient prélevées une heure après l’injection ce qui n’était probablement pas suffisant pour
que les éléments diffusent jusqu’en intra-vésical (357).
Dans l’espèce humaine, les patients ayant une cystite interstitielle ont une augmentation de
l’expression de l’ARNm de iNOS au niveau de l’urothélium et des macrophages situés dans la
muqueuse vésicale (358). Cela se traduit par une augmentation de 30 à 50 fois de la
concentration urinaire de NO par rapport à des sujets sains et ce quel que soit la cause de
l’inflammation vésicale (cystite interstitielle, radique, infectieuse, BCG) (359). En revanche,
cette augmentation n’est pas retrouvée en cas d’obstruction sous-vésicale, d’hyperactivité
idiopathique vésicale ou du détrusor (360).
Certaines thérapies peuvent également influencer l’expression vésicale des NOS. Minardi a
observé chez des rates traitées par neuromodulation sacrée pendant 21 jours une augmentation
de l’expression urothéliale et endothéliale de la iNOS et urothéliale de la nNOS (361).
Expression des phosphodiestérases V au niveau du bas appareil urinaire
féminin
Truss, le premier, a rapporté la présence de PDE5 dans la musculeuse vésicale de femmes et
de truies (362). Qiu a montré leur présence dans le détrusor de rates (363) et Nies a confirmé
leur présence dans le détrusor humain quel que soit le sexe (364).
Au niveau de l’urèthre, les PDE5 sont exprimées chez la femme et la truie au sein des fibres
musculaires lisses de la musculeuse, des artères de large calibre et de l’endothélium des
artères de large et de petit calibre (365).
79
Enfin, chez la femme ménopausée, Pace a montré la présence de iNOS au niveau des tissus
péri-uréthraux et du vagin (262).
Monoxyde d’azote, PDE5 et fonction vésicale
Nous allons ici nous intéresser uniquement à l’effet au niveau de la vessie en excluant le col
vésical qui sera traité avec l’urèthre.
Monoxyde d’azote et physiologie vésicale
Le muscle détrusor est peu sensible au NO. En effet, bien que l’exposition de vessies de rates,
de lapines ou de cochons d’Inde au NO ou à des donneurs de NO tel que le nitroprussiate de
sodium entraîne une relaxation du détrusor, celle-ci est de faible amplitude et
significativement plus limitée que celle induite au niveau uréthral. Toutefois, l’administration
chez l’animal d’inhibiteurs des NOS que ce soit par voie orale (L-NAME) ou intravésicale,
s’associe à une diminution de la capacité vésicale et à une augmentation de l’amplitude des
contractions (366). L’impact de ces inhibiteurs varie en fonction de l’isoforme de NOS
inhibée. Chez la chate, l’inhibition pharmacologique sélective de la e-NOS s’accompagne
d’une diminution du volume seuil de miction et d’une augmentation de la fréquence des
contractions de faibles amplitudes alors que l’inhibition pharmacologique sélective de la
nNOS a un effet contraire (367). Il a également été rapporté qu’exposer une vessie de cochon
d’Inde à du nitroprussiate de sodium n’était pas associé à une élévation de la GMPc au niveau
du détrusor indiquant que l’effet relaxant du NO sur le détrusor était indépendant de la voie
NO/GMPc (368). De même, Sutherland a montré que l’invalidation du gène de la nNOS chez
la souris n’avait aucun impact sur le fonctionnement vésical (369). Ces résultats étaient en
faveur d’une modulation par le NO de l’effet d’autres neurotransmetteurs ou d’une action sur
l’afférence (370).
Ces hypothèses ont été confirmées depuis y compris dans l’espèce humaine (371). Ainsi,
Fujiwara a mis en évidence une accumulation de GMPc dans les fibres nerveuses et les
80
cellules stromales de la paroi vésicale de souris traitées par nitroprussiate de sodium et dans le
même temps l’absence de GMPc au sein des fibres musculaires lisses (372). Miyamoto a
montré dans des études en bains d’organes isolés et de microdialyse à partir de vessies de
lapines que ce même donneur de NO inhibait la libération d’acétylcholine au niveau de la
jonction neuromusculaire et ainsi la réponse contractile à toute stimulation électrique (373).
Plus récemment, il est apparu que le NO était produit par l’urothélium vésical sous l’effet de
plusieurs
stimuli
comme
les
β
agonistes
(374),
la
norépinéphrine
(45),
le
DiMéthylSulfateOxyde (375), le carbachol (376) et modulait la dépolarisation des fibres
nerveuses afférentes (377) et en stimulant les cellules interstitielles de la couche musculaire
externe, l’activité phasique du détrusor (378). Cependant, la suppression de l’urothélium
n’annule pas l’effet de la substance P intravésicale ou des stimulations électriques sur la
libération de NO indiquant une autre source de production située au niveau de la couche
profonde du chorion ou de la musculeuse (376). Pour Birder, cette dernière provient des fibres
nerveuses de la paroi vésicale (45).
L’effet de modulation de l’afférence par le NO est situé uniquement au niveau de la paroi
vésicale et n’a pas d’origine centrale (médullaire ou cérébrale). Ainsi, l’instillation
intravésicale de capsaïcine induit une hyperactivité du détrusor qui est renforcée en présence
de L-NAME et diminuée en présence de donneurs de NO ou de sildénafil ou de vardénafil
chez
la
rate
(379,
380).
En
revanche,
administrés
par
voie
intrathécale
ou
intracérébroventriculaire, ils n’avaient aucun effet (380).
Récemment, a été montré chez la rate que le NO produit par l’urothélium avait un effet
inhibiteur sur les fibres C et Aδ (381, 382). En enregistrant directement l’activité de ces fibres
pendant le remplissage vésical, Aizawa a montré une augmentation progressive de leur
activité qui était majorée de 50 % après administration de L-NAME et était diminué voire
inhibé après traitement par L-arginine (382). Cet effet est GMPc dépendant. Cependant, il est
81
apparu que le NO avait aussi une action GMPc indépendante sur la contractilité du détrusor.
Ainsi par comparaison avec les souris ayant une invalidation du gène de la nNOS, les témoins
avaient une activité phasique du détrusor plus élevée et le blocage de la voie du GMPc par de
l’1-H-oxadiazolo-quinoxalin-1
n’avait
pas
d’impact
(383).
Toutefois,
des
études
complémentaires sont nécessaires pour évaluer le rôle physiologique du NO à ce niveau.
Le NO a également un effet sur la vascularisation vésicale. Toutefois, il a été montré chez la
chienne que cet effet se limitait à la muqueuse. En effet, l’administration intraartérielle de Ngnitro-L-arginine diminuait la vascularisation à ce niveau et l’apport de L-arginine
l’augmentait. Dans chaque cas, cela n’avait aucun effet sur la vascularisation de la
musculeuse (384). Plus récemment, Lieb a montré chez la lapine que le NO n’aurait un rôle
de régulateur de la vascularisation que pendant et juste après la miction, les traitements par LNAME n’ayant aucun effet sur la vascularisation à l’état basal (385).
PDE5 et physiologie vésicale
A l’état physiologique, l’effet des PDE5 au niveau vésical est limité. Ainsi sur des études en
bains isolés de vessie, il n’a été rapporté qu’un effet relaxant modéré sur des parois précontractées (363).
Nous avons montré chez la souris femelle qu’indépendamment du statut œstrogénique, le
sildénafil, inhibiteur spécifique de la PDE5, diminuait le tonus uréthral et que cet effet passait
par la voie de la nNOS (386).
NOS, PDE5 et pathologies vésicales
Inflammation vésicale
Comme nous l’avons vu plus haut, toutes les pathologies inflammatoires sont associées à une
expression de la iNOS au niveau de la paroi vésicale. Deux types de modèle d’inflammation
vésicale ont été étudiés chez l’animal : la cystite à cyclophosphamide et la cystite bactérienne.
Cystite interstitielle
82
Chez la rate, la iNOS joue un rôle primordial dans la genèse des lésions induites par le
cyclophosphamide. En effet, en cas de traitement par un inhibiteur sélectif de la iNOS, le Sméthylisothiourée, aucune lésion vésicale n’apparaissait (387). De même, en cas de coexpression TGF-β1 et iNOS, les effets tissulaires étaient diminués (388).
Des études sur des fibres musculaires lisses vésicales de rates en culture, ont montré que
l’expression de la iNOS était inversement corrélée à celle de la chaine lourde de la myosine ce
qui pourrait constituer l’un des mécanismes sous-jacents de la symptomatologie lors d’une
inflammation vésicale (389). Cependant, d’autres auteurs ont rapporté que l’apport de NO
était associé à une diminution de l’hyperactivité vésicale et détrusorienne chez le même type
de rates. Néanmoins, ils concluent que l’effet enregistré ici sur l’animal anesthésié serait lié à
un effet sur l’afférence et non directement sur le muscle (390).
De manière intéressante chez la femme, il a été rapporté que les patientes répondeuses aux
traitements de la cystite interstitielle avaient une diminution du NO urinaire par rapport à ceux
en échec de traitement, ce qui soulignait le rôle joué par le NO dans la genèse de la
symptomatologie (391).
Infections urinaires
En cas d’infections urinaires, la voie de la iNOS est impliquée dans les mécanismes de
modification de l’activité contractile du détrusor. Ainsi Johansson a montré que la iNOS
exprimée en présence de cytokines et de lipopolysaccharides était responsable d’une
perturbation de cette dernière et indiquait qu’elle était liée au caractère cytotoxique du NO
altérant les tissus vésicaux en formant du péroxynitrite qui allait réagir avec le cytosquelette et
les protéines contractiles (355, 392). Plus récemment, Li a rapporté un autre mécanisme :
l’augmentation de l’expression de la connexine Cx43 au niveau de la musculeuse par la iNOS
(393).
La eNOS jouerait un rôle dans les mécanismes de survenue d’infections urinaires récidivante.
Il a été rapporté qu’elle était nécessaire pour l’internalisation des Escherichia coli dans la
83
paroi vésicale. En effet, chez les souris traitées par des inhibiteurs spécifiques de eNOS ou
celles ayant une invalidation du gène pour la eNOS, l’internalisation était abrogée (394).
Vessie neurologique du blessé médullaire
L’ensemble des études réalisées chez la rate spinalisée montre une perte de l’inhibition de
l’afférence par le NO. Toutefois cette dernière était réversible soit par ajout d’inhibiteurs de
l’arginase, ce qui s’accompagnait d’une diminution de l’hyperactivité du détrusor chez la rate
(395), soit par la réalisation d’injections intradétrusoriennes de toxine botulique qui induisait
une diminution de la libération d’ATP et une augmentation de la production de NO (396) et
soit par traitement par IPDE5 (397). Ainsi Behr-Roussel a rapporté que le vardénafil atténuait
l’activité des afférences vésicales chez la rate ayant eu une section de la moelle au niveau T7T8 (397).
Dans l’espèce humaine, Gacci a montré qu’une prise unique de vardénafil à la dose de 20 mg
améliorait les paramètres urodynamiques (diminution de la pression détrusorienne maximale,
augmentation de la capacité cystomanométrique maximale et du volume de remplissage avant
la première contraction non inhibée du détrusor) chez les patients blessés médullaires alors
qu’aucun effet n’était noté dans le groupe contrôle (398).
Obstruction sous-vésicale
Il apparait que le NO joue un rôle dans la survenue de l’hypertrophie vésicale et de
l’hyperactivité du détrusor lors d’une obstruction sous-vésicale (353, 354). En effet,
l’obstruction chez des souris ayant une invalidation du gène de la iNOS n’induisait pas
d’hypertrophie du détrusor et de fibrose pariétale et était responsable d’une diminution de sa
contractilité après stimulation électrique alors que les contrôles avaient une augmentation de
la contractilité et développaient une hyperactivité du détrusor (25, 399). Des résultats
identiques ont été rapportés chez des rates traitées par des inhibiteurs pharmacologiques de la
iNOS tout le temps de l’obstruction (25).
84
En revanche, les NOS ne semblent pas avoir d’effet sur la lutte contre l’ischémie pariétale
vésicale secondaire à l’obstruction, Shabsigh ayant rapporté que chez la rate bien qu’après
obstruction sous-vésicale partielle était trouvé une augmentation du débit sanguin dans la
paroi vésicale, l’activité des NOS n’était pas modifiée (400).
Hyperactivité-Hypoactivité vésicale
Le NO semble jouer un rôle dans les mécanismes de survenue d’une hyper ou d’une
hypoactivité du détrusor. Munoz a rapporté que cela dépendrait de l’équilibre entre la
libération d’ATP et de NO. Dans deux modèles de rates diabétiques, il a montré une
augmentation d’ATP sans augmentation de NO chez les animaux ayant une hyperactivité du
détrusor et une augmentation des taux de NO sans variation de celui de l’ATP chez ceux
ayant une hypoactivité vésicale (376).
NO et fonction de l’urèthre
NO et physiologie uréthrale
Toutes les études rapportées montrent que le NO induit une relaxation du col vésical et de
l’urèthre, que cette dernière est plus marquée au niveau de l’urèthre proximal et que cet effet
passe par la voie du GMPc et est donc calcium dépendante. De plus, l’effet est identique quel
que soit l’espèce (lapine, rate, souris, brebis, truie, chienne, cochon d’inde, espèce humaine)
(401-406) Cela a été initialement démontré dans des études en bains d’organes isolés où
l’adjonction d’inhibiteurs des NOS ou de la guanylate cyclase tel que le bleu de méthylène ou
par invalidation du gène de la protéine kinase I GMPc-dépendante conduisait à un défaut de
relaxation cervico-uréthral alors que l’apport de L-arginine l’induisait (401-405, 407). Il a
ensuite été montré que le NO à ce niveau était produit par la nNOS située au niveau des
terminaisons nerveuses et pouvait être induite par stimulation électrique (401, 408). Ainsi
Burnett a montré que des souris ayant une invalidation du gène de la nNOS avaient un défaut
de relaxation du col vésical et de l’urèthre après stimulation électrique et qu’elles avaient une
vessie hypertrophiée et dilatée secondaire à l’obstruction sous-vésicale (3). Garcia-Pascual a
85
mis en évidence chez la brebis et la rate que la stimulation des nerfs nitrergiques était
responsable d’une augmentation de GMPc non seulement au niveau des fibres musculaires
lisses mais aussi au sein des cellules interstitielles de Cajal (409). A l’inverse, la dénervation
de l’urèthre s’accompagnait d’une perte de production locale de NO mais l’ajout de
nitroprussiate de sodium permettait d’obtenir une relaxation (410). Kontani a rapporté chez la
rate que le NO avait non seulement un effet sur les fibres musculaires lisses mais qu’il
inhibait également la libération de norépinéphrine au niveau de la jonction neuromusculaire
(411). Pour Yoshida, cet effet pré-jonctionnel serait dû au radical libre NO- (412). Un lien
entre innervation adrénergique et NO a été souligné. Cependant, alors que chez la lapine, il a
été montré que la libération de NO était augmentée par les agonistes α2 adrénergiques et
diminuée par les agonistes α1, d’autres ont indiqué que chez la truie les agonistes α2
diminuaient la libération de NO (413, 414).
Récemment, Hernandez a montré qu’au niveau du col vésical de la truie, le polypeptide
d'activation de l'adénylate cyclase pituitaire 38 conduisait à une augmentation de la libération
de NO via le récepteur neuronal PAC1 (415).
Bien que la nNOS soit exprimée au niveau du sphincter strié de l’urèthre, l’apport
d’inhibiteurs de NOS ou de donneurs de NO n’a pas d’effet sur les contractions
isovolumétriques (350). Le NO aurait ici un rôle de modulateur des récepteurs nicotiniques
(416).
PDE5 et physiologie uréthrale
Dans l’espèce humaine et chez l’animal, les inhibiteurs de la PDE5 (Zaprinast, vardenafil,
sildenafil et tadalafil) induisent une relaxation uréthrale (365, 417, 418).
NOS, PDE5 et physiopathologie uréthrale
Deux études se sont intéressées à l’impact de certaines situations pathologiques sur la voie du
NO au niveau uréthral. Masuda a montré chez le lapin qu’en cas d’ischémie s’accumulaient
86
localement des inhibiteurs endogènes de NOS (L-NMMA et ADMA) induisant ainsi un
défaut de production de NO et donc une altération de la relaxation neurogène (419). Yang
s’est intéressé aux dysfonctions uréthrales induites par le diabète chez la rate et a rapporté un
défaut de réponse aux donneurs de NO et ainsi un défaut de relaxation musculaire (420).
NOS et commande neurologique du bas appareil urinaire
L’isoforme neuronal de la nNOs est exprimé au niveau du système nerveux périphérique et
central.
Au niveau périphérique, il a été montré qu’elle était exprimée chez la rate et la chatte dans les
fibres nerveuses situées au niveau de la sous-muqueuse uréthrale (345, 421) et pour la chatte
aussi au niveau de l’urothélium. En revanche au niveau vésical, le nombre de fibres nerveuses
exprimant la nNOS était plus limité et elles siégeaient principalement au niveau de la
musculeuse lisse et dans la majorité des neurones des ganglions intrapariétaux (345).
En injectant un marqueur neuronal fluorescent de type Fast Blue® dans la paroi vésicale, il a
été rapporté chez la truie que 9 % des neurones à point de départ vésical exprimaient la nNOS
au niveau des ganglions rachidiens lombaires et 1,5 % des sacro-coccygiens (422). Des
résultats comparables avaient été précédemment rapportés chez la rate (423) et Zhou a précisé
qu’il s’agissait des ganglions s’étendant de L6 à S1 (424). Il a également montré qu’à ce
niveau des neurones exprimant la nNOS étaient présents dans la moelle et ce aussi bien dans
les cornes antérieures, postérieures qu’autour du canal épendymaire et au sein du noyau
d’Onuf, en particulier chez la guenon, la chatte et la femme (424).
Les centres supra-spinaux du contrôle de l’appareil vésico-sphinctérien expriment également
de la nNOS. Ainsi, Morrison a montré que le NO, au niveau du tronc cérébral chez la rate,
était le neuromédiateur du réflexe somato-vésical parasympathique inhibiteur (425). Les
centres supra-spinaux sont également capables de moduler l’effet des nNOS spinales, l’effet
87
de la nNOS étant augmenté chez la rate anesthésiée par rapport à celle éveillée soulignant une
modulation inhibitrice de l’effet de la nNOS spinale par l’encéphale (380).
Au niveau de la voie efférente, Persson a montré chez la rate que les neurones responsables de
la relaxation nNOS dépendante de l’urèthre provenaient du ganglion pelvien majeur (426).
Plusieurs réflexes sont médiés par le NO. Ainsi, chez la rate, les contractions vésicales
induisaient une relaxation uréthrale qui était abolie lors de l’administration de N-nitro-Larginine (427). A l’inverse, la perfusion de donneurs de NO (nitroprussiate de sodium, Snitroso-N-acétylamine) dans l’urèthre après occlusion du col vésical induisait une diminution
de la fréquence des contractions vésicales et cet effet était comparable à celui obtenu lors de
l’instillation de lidocaïne au même niveau (27).
La distribution et le nombre de fibres nerveuses exprimant la nNOS changent dans certaines
situations pathologiques et sont modulées par certains traitements.
Chez la rate spinalisée, les études par marquage rétrograde des nerfs à point de départ vésical
montraient une augmentation de l’expression de la nNOS au niveau de la moelle lombosacrée et au niveau des ganglions rachidiens s’étendant de L6 à S1 (428, 429). Pour Zhang,
l’augmentation de l’expression de la nNOS pourrait faciliter l’émergence d’un réflexe
mictionnel médullaire (428). Dans le même sens, Kakizaki a rapporté que de la stimulation
périnéale de la rate spinalisée induisait une relaxation des fibres musculaires lisses uréthrales
et que cette dernière était abolie en présence de L-NAME démontrant l’existence d’un réflexe
somato-uréthral médié par la voie efférente lombo-sacrée (430).
Les études réalisées sur des modèles d’irritation vésicale en aiguë (acide acétique, capsaïcine)
ou en chronique (cyclophosphamide) chez la rate ont montré une augmentation de l’activité et
de l’expression des nNOS au niveau des ganglions rachidiens et de la moelle s’étendant de L6
à S2 (431, 432). Le NO à ce niveau serait impliqué dans la transmission de la douleur car
l’administration intrathécale de L-NAME diminuait le comportement douloureux de l’animal
88
(433) et dans la survenue d’une hyperactivité détrusorienne elle-même inhibée par
l’administration intrathécale de L-NAME (434).
En cas d’obstruction sous-vésicale pendant 6 semaines, chez la rate, l’expression de la nNOS
était augmentée de 1,9 fois au sein des neurones d’origine vésicale situés dans les ganglions
rachidiens L6 et de 5,3 fois en S1 (435).
Enfin alors que l’administration intraventriculaire de L-NAME ou d’un donneur de NO (FK409) chez la rate n’avait aucun effet sur le fonctionnement vésical, après infarcissement
cérébral, le L-NAME était responsable d’une augmentation de la capacité vésicale et le même
donneur de NO d’une diminution de la capacité vésicale signant l’implication du NO dans la
survenue d’une hyperactivité vésicale après infarctus cérébral (436).
Dernièrement a été montré que plusieurs drogues pouvaient moduler l’expression de la nNOS
dans les neurones d’origine vésicaux des ganglions rachidiens de la truie. Ainsi, après
injections intradétrusoriennes de toxine botulique A Botox® ou de conantokine G ou
instillation de résinifératoxine, elle était diminuée (437-440) et à l’inverse, augmentée lors
d’instillation de tétrodotoxine (440, 441).
89
Matériel et méthodes
90
Expérimentation animale
Des souris femelles C57/BL6 (Charles Rivers, Les Oncins, France) étaient hébergées dans des
cages en acier inoxydable placées dans une enceinte avec contrôle thermique, un cycle
jour/nuit 12/12 heures et étaient alimentées avec le régime habituel des souris de laboratoire.
Toutes les expériences ont été conduites conformément au Guide for the Care and Use of
Laboratory Animals (Institute for Laboratory Animal Research, National Research Council,
Washington, DC: National Academy Press, 1996).
Produits utilisés
L’anesthésie des souris était obtenue par injection intra-péritonéale à la dose de 0,2ml/20g
d’un mélange de 2,5 ml de kétamine 50mg/5ml (Panpharma, Luitré-Fougères, France) et de
0,5 ml de xylasine 2% (Bayer Pharma, Leverkusen, Allemagne) dans 7 ml de sérum
physiologique.
Le 7-Nitroindazole (Acros Organics, Morris Plains, NJ), inhibiteur compétitif sélectif puissant
de la nNOS sans effet significatif sur la eNOS de la souris (336) était administré par voie
intra-péritonéale à la dose de 50 mg.kg-1 après sonication (Duty cycle = 70 %, Output control
= 4-5 UA, 2 minutes) dans de l’huile d’arachide (Laboratoire Cooper, Melun, France) à la
dose de 0,2 ml/20g. Pour chaque expérimentation, le 7-Nitroindazole ou l’huile d’arachide
étaient injectés 30 minutes avant le début de l’étude.
Le sildenafil (Pfizer, Sandwich, UK), puissant inhibiteur sélectif de la phosphodiestérase de
type V était administré par voie intrapéritonéale à la dose de 50 mg.kg-1 après dilution dans du
NaCl à 0.9 % (Baxter, Maurepas, France) (442). Pour chaque expérimentation, le sildénafil ou
le NaCl étaient injectés 60 minutes avant le début de l’étude.
L’œstradiol était administré en continu à la dose de 80 µg.kg-1.j-1 à partir d’implants souscutanés de 17 -œstradiol (0,1 mg/implant, 60-day release, Innovative Research of America,
Sarasota, FL, USA). Il a été précédemment rapporté que cette dose induisait des taux
91
plasmatiques de 0.3 nM (80 pg.ml-1), une concentration rencontrée pendant la grossesse et
environ 10 fois supérieure à celle trouvée pendant le cycle œstral (443).
Une
antibioprophylaxie
par
voie
orale
a
été
réalisée
par
l’association
sulfaméthoxazole/triméthoprime (400 mg + 80 mg par 5 ml) (laboratoires Roche, Neuilly sur
Seine, France) dans l’eau de boisson à la dose d’une ampoule de 5 ml dans 571,5 ml d’eau et
remplacée chaque semaine.
Manipulations hormonales
La température corporelle était maintenue à 37° à l’aide d’une sonde rectale reliée à une
plaque chauffante.
Les souris étaient ovariectomisées sous anesthésie générale au travers de deux incisions
distinctes du flanc ou avaient une simulation d’ovariectomie à l’âge de 4 semaines. Deux
semaines plus tard, les animaux ovariectomisés étaient implantés avec un placebo ou avec les
implants diffusant pendant 60 jours de l’œstradiol. Ils étaient placés sous anesthésie générale
dans le plan cellulo-graisseux sous-cutané en arrière de l’oreille droite.
92
Explorations fonctionnelles physiologiques
L’ensemble des explorations fonctionnelles physiologiques a été mené six semaines plus tard
soit à l’âge de 12 semaines.
Calendrier mictionnel
Les souris étaient placées dans des cages métaboliques
(Marty Technologie, Marcilly-sur-Eure, France), une
souris par cage, 14 heures avant le début de l’étude afin
qu’elles s’acclimatent (nourriture et eau ad libitum). Les
cages étaient placées sur un papier buvard préalablement
pesé (figure 14). Toutes les cinq minutes, le papier buvard
était repesé et changé (3). Les paramètres étudiés étaient,
sur huit heures, le nombre de mictions, le volume total
uriné et le volume moyen uriné par miction. Au bout de
huit heures, une pression manuelle était exercée au niveau
hypogastrique chez la souris vigile placée au dessus d’un
Figure 14: Calendrier mictionnel
Souris placée dans une cage
métabolique posée sur un papier
buvard.
papier buvard et le volume uriné, appelé volume de
réplétion vésicale, était déterminé par pesée du papier
buvard.
Cystomanométrie
Chez le même animal, quarante-huit heures après, les caractéristiques pariétales de la vessie
étaient étudiées par cystomanométrie. Quinze minutes après induction de l’anesthésie
générale, les souris étaient placées en décubitus dorsal sur une table chauffante asservie à une
sonde thermique rectale afin de maintenir la température corporelle à 37 °C. Un cathéter 22
Gauge (Braun, Melsungen, Allemagne) était mis en place dans l’urèthre. L’extrémité
93
proximale du cathéter était reliée latéralement à un pousse
seringue électrique (Harvard Apparatus, Southnatick,
USA) afin de distendre la vessie par du sérum
physiologique à température ambiante avec un débit
constant de 1,2 ml.h-1. Dans l’axe, le cathéter était relié à
un capteur de pression (Statham P10 EZ) et à un
enregistreur TA 4000 (Gould Electronics, Ballainvilliers,
Figure 15: Cystomanométrie.
Souris sondée, placée sur une
plaque chauffante. Distension
de la vessie par du sérum
physiologique à l’aide d’un
pousse seringue électrique et
enregistrement continu de la
pression intravésicale.
France) (figure 15). Les paramètres étudiés étaient la
pression intravésicale pour une distension de 50 µl, 100
µl, 150 µl et 200 µl.
Pression vésicale au point de fuite
Quinze minutes après induction, les souris étaient placées
en décubitus dorsal sur une table chauffante afin de
maintenir la température corporelle à 37 °C. Une courte
laparotomie était pratiquée. Le dôme vésical était
cathétérisé par un cathlon 22 Gauge mis en place à l’aide
de son mandrin. Le cathlon était fixé et l’étanchéité du
système assurée par la mise en place de cyanoacrylate
autour du point d’entrée dans la vessie. La laparotomie
Figure 16: Pression vésicale au
point de fuite.
Cathéter vésical sus-pubien
permettant une distension à
débit constant de la vessie par
un
mélange
de
sérum
physiologique et d’encre bleue,
et étant relié à un capteur de
pression. Souris placée sur un
papier buvard blanc. Fuite bleue
au niveau du méat uréthral.
était refermée par un surjet au fil tressé 4/0 (Ethicon
Vicryl, USA). L’extrémité proximale du cathlon était
reliée de la même manière que pour la cystomanométrie.
La vessie était distendue, à un débit constant de 1,2 ml.h-1,
par un mélange de sérum physiologique et d’encre bleue
94
puis les souris étaient placées sur un papier buvard blanc (figure 16).
Le paramètre étudié était la pression intravésicale au moment de l’apparition d’une fuite bleue
au niveau du méat uréthral appelée pression vésicale au point de fuite traduisant les
résistances uréthrales.
Stimulation cervico-vaginale et mesure de la lubrification vaginale
Sous anesthésie générale, les animaux étaient placés en
décubitus dorsal et la vessie vidée par pression digitale
hypogastrique. Une stimulation douce du vagin et du col
utérin était obtenue par cinq coups rapides en cinq secondes
Figure 17: Stimulation cervicovaginale
Stimulation douce du vagin et
du col utérin à l’aide d’une
sonde permettant d’induire une
lubrification vaginale.
à l’aide d’une sonde recouverte de téflon charrière 3
introduite dans la lumière vaginale (Sonde d’occlusion
urétérale, Coloplast, Rosny-sous-Bois, France) (figure 17).
Une minute après la fin de la stimulation, un papier buvard
préalablement pesé était inséré dans le vagin et laissé en place pendant 10 secondes. Le
volume de lubrification vaginale correspondait à la différence entre le poids du buvard avant
et après introduction vaginale (Mettler AC 100 analytical balance, Mettler Toledo, France).
Etude anatomo-pathologique
Prélèvement de l’appareil urinaire
Les souris utilisées pour l’étude du calendrier mictionnel et de la cystomanométrie ont été
sacrifiées à l’âge de 4 mois, soit au moins 2 mois après acquisition de la maturité sexuelle.
Sous anesthésie générale, afin d’éviter des images artéfactuelles secondaires aux spasmes
vésicaux préagoniques, une injection intra-péritonéale de 0,5 ml d’atropine sulfate à 0,025 %
(Laboratoire Renaudin, Itxassou, France) était pratiquée. Cinq minutes après, un cathéter 22
Gauge (Braun, Melsungen, Allemagne) était mis en place au niveau uréthral. La vessie était
vidée puis progressivement distendue, au débit de 1,2 ml.h-1, par 50 µl de sérum
95
physiologique. Le cathéter était ensuite clampé. Les souris étaient sacrifiées par injection
intra-péritonéale de 0,5 ml de lidocaïne à 1 % (Astra-Zeneca, Rueil-Malmaison, France).
L’appareil génito-urinaire était prélevé en monobloc. Les différents organes étaient séparés et
pesés. Les uretères étaient placés au sein d’un lobe hépatique puis fixés. L’ensemble des
organes prélevés était fixé dans du liquide de Dubosc-Frazil.
Etude histologique
Après fixation, les pièces histologiques étaient incluses en paraffine. Des sections de quatre
micromètres, colorées par Trichrome bleu de Masson, ont été étudiées au microscope optique
sous l’autorité de Mesdames les Docteurs Ghislaine Escourrou et Catherine Mazerolles,
Service d’Anatomo-pathologie, CHU Rangueil, Toulouse. Les lames (uretère, vessie, urèthre,
vagin) ont été numérisées pour analyse histomorphométrique à l’aide d’un appareil photo
numérique (Nikon Coolpix 995) au grossissement X 400 pour les uretères, X 160 pour les
vessies, X 100 pour les urèthres et X 40 pour les vagins.
Etude histomorphométrique
Les images numérisées des vessies, des uretères, des urèthres et des vagins ont été analysées
avec le logiciel NIH Image (http://rsb.info.nih.gov/nih-image). Les paramètres étudiés
étaient pour l’uretère et l’urèthre, la surface globale, la surface de la musculeuse, du chorion,
de l’épithélium et de la lumière (figures 18 et 19). La section urétérale étudiée était située en
regard du pôle inférieur du rein (tiers supérieur de l’uretère). La section uréthrale étudiée
correspondait au tiers moyen de l’urèthre.
Pour la vessie et le vagin, les paramètres étudiés étaient l’épaisseur moyenne de la
musculeuse, obtenue en faisant le rapport de la surface de la musculeuse sur la longueur de
l’épithélium correspondant, et l’épaisseur moyenne du chorion, obtenue en faisant le rapport
de la surface du chorion sur la longueur de l’épithélium correspondant (figures 20 et 21). La
96
zone étudiée correspondait pour la vessie au dôme vésical, dans l’axe d’implantation de
l’urèthre et pour le vagin à son tiers moyen. Les résultats étaient exprimés en µm et en µm2.
Figure 18: A : Coupe d'uretère au microscope optique X 400. Coloration trichrome bleu de Masson
B : Schématisation des différents paramètres étudiés de la section urétérale.
Figure 19: A : Coupe d'urèthre au microscope optique X 100. Coloration trichrome bleu de Masson
B : Schématisation des différents paramètres étudiés de la section uréthrale.
Figure 20: A : Coupe de la paroi vésicale au microscope optique X 160. Coloration trichrome bleu de
Masson.
B : Schématisation des surfaces de la musculeuse, du chorion et de la longueur de l’épithélium
correspondant.
Figure 21: A: Coupe de la paroi vaginale au microscope optique X40. Coloration trichrome bleu de
Masson.
B : Schématisation des surfaces de la musculeuse, du chorion et de la longueur de l’épithélium
correspondant.
97
Extraction et immunoempreinte protéique
Les urèthres ont été prélevés en bloc, rincés et congelés par immersion dans de l'azote liquide
et stocké à -80°C jusqu'à l’analyse au bout de trois semaines. Les tissus congelés ont été
dégelés et homogénéisés dans environ 10 volumes d’un tampon contenant du glycérol à 10 %,
20 mM de Tris, 140 mM de NaCl, 10 mM de pyrophosphate de sodium, 10 mM de fluor, 2
mM orthovanadate de sodium, 3 mM d’EDTA, 10 µg.ml-1 d’inhibiteur de la trypsine, 10
µg.ml-1 de leupeptine et 2 µg.ml-1 d’aprotinine à l’aide d’un Homogénéisateur Polytron®
(Kinematica, Lonay, Suisse) pendant quatre périodes de une minute avec des pauses
intermittentes de rafraîchissement de 4 minutes. L’homogénat a été centrifugé à 40 000 G
pendant 45 minutes et le culot éliminé. Le surnageant a été récupéré. Des aliquots de 60 µL de
surnageant ont été diluées 1:2 dans un tampon d’électrophorèse (1,8 M Tris HCl, pH 6,8,
glycérol à 10 %, SDS à 10 %, bleu de bromophénol à 0,01 % bleu et mercapto-éthanol à 5%)
pour déposer 60 µg de protéine par voie. Les échantillons ont été réduits en les bouillant
pendant 5 min. Le cortex de cervelet de souris a été utilisé comme contrôle positif.
L’électrophorèse de gel de SDS-PAGE a été effectuée sur un gel constitué de 10 % de
polyacrylamide à 125 V pendant 30 min. Après transfert électrophorétique à une membrane
de polyvinylidène Difluoride à 10-15 V pendant 30 minutes, les empreintes étaient bloquées
la nuit avec du lait en poudre dilué dans du TBS-TWEEN 20 à 4°C. Les empreintes ont été
alors incubées avec des anticorps polyclonaux primaires (nNOS N31030; laboratoires de
Transduction, Lexington, KY) dilués dans un mélange de lait en poudre et de TBS-TWEEN
20 (nNOS 1:1000) pendant une heure à température ambiante. Les empreintes étaient alors
rincées dans du TBS-TWEEN 20 pendant 1-15 minute suivie de 3-5 minutes et incubées avec
des anticorps secondaires anti-lapin IgG-peroxidase (SC2030; Santa Cruz Biotechnologie,
Heidelberg, Allemagne) dilué dans du TBS-TWEEN 20 (1:10 000) pendant une heure à
température ambiante. Les empreintes étaient alors rincées comme ci-dessus et soumises au
système de chemiluminescence augmenté. Le film autoradiographique a été appliqué aux
98
empreintes jusqu'à ce qu’une exposition satisfaisante ait été obtenue. Après numérisation, les
films ont été analysés par le logiciel d'analyse d’image du NIH pour quantifier l'expression de
la nNOS.
99
Résultats expérimentaux
100
Les résultats expérimentaux sont présentés sous la forme de deux articles publiés et un article
accepté pour publication dans The Journal of Sexual Medicine.
101
Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 294: R851–R857, 2008.
First published January 9, 2008; doi:10.1152/ajpregu.00467.2007.
Estradiol increases urethral tone through the local inhibition of neuronal nitric
oxide synthase expression
Xavier Gamé,1 Julien Allard,2 Ghislaine Escourrou,3 Pierre Gourdy,2 Ivan Tack,2 Pascal Rischmann,1
Jean-François Arnal,2 and Bernard Malavaud1
1
Service d’Urologie, Transplantation Rénale et Andrologie, 2Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale U858
et Laboratoire de Physiologie, and 3Laboratoire D’Anatomie Pathologique, Centre Hospitalier Universitaire Rangueil,
Toulouse, France
Submitted 29 June 2007; accepted in final form 2 January 2008
The intricate relationship between urine storage and micturition involves a reciprocal balance in the muscle tone of bladder
and urethra, which are under spinal and supraspinal controls.
Autonomic regulation of the lower urinary tract physiology is
driven by all three components of the autonomic nervous
system. Nitric oxide (NO), the key neurotransmitter of the
nonadrenergic, noncholinergic nerves of the peripheral nervous
system, is produced by the neuronal isoform of NO synthase
(nNOS). In the lower urinary tract, nNOS is mainly expressed
in nerves located in the muscular and inner lamina propria
layers of the urethral wall and only sparsely present in the
detrusor muscle (5, 14). In line with the ubiquitous relaxing
effect of NO (20), variations in local NO production are
suspected to play a physiological role in urethral sphincter
relaxation during micturition (18).
Because estrogens are known to modulate the expression
of nNOS in several target organs, such as the hypothalamus
(33) and genital tract (30), we explored the effects of
supraestrus levels of E2 on lower urinary tract function and
morphology and urethral nNOS expression, as well as the
consequences of acute inhibition of nNOS activity by 7-nitroindazole.
estrogen; neurourology; urethra
to suffer from urinary
incontinence or overactive bladder (22). Lower urinary tract
function is intimately interrelated to physiological estradiol
(E2) variations, as illustrated by the transitory increase in
urethral pressure at the peak of E2 secretion at midcycle (32),
its gradual increase during pregnancy (15), and the prevalence
of urinary bothers after menopause (6).
In woman, estrogen therapy has been shown to prevent
postmenopausal cystitis (8) and urinary atrophy and overactive
bladder (6). Moreover, clinical data suggest that estrogens
partly improve lower urinary tract functioning by improving
local trophicity (13). However, regarding urinary incontinence,
estrogens either failed to show any effect on stress urinary
incontinence (24) or actually increased (in a large multicentric
study) the incidence and severity of all types of urinary
incontinence (12).
Animal experiments. Female C57/Bl6 mice (Charles Rivers, Les
Oncins, France) were housed in stainless steel cages in a temperaturecontrolled facility on a 12:12-h light-dark cycle and fed normal
laboratory mouse chow diet. All experiments were conducted in
conformity with Guide for the Care and Use of Laboratory Animals
(Institute for Laboratory Animal Research, National Research Council, Washington, DC: National Academy Press, 1996). All animal
studies were approved by the local Animal Care and Use Committee.
For all surgical procedures, mice were anesthetized by intraperitoneal injection of a mixture of 150 mg/kg ketamine (PanPharma,
Luitré-Fougères, France) and xylazine (Bayer, Leverkusen, Germany). Body temperature was maintained at 37°C by means of a rectal
probe connected to a homeothermic blanket.
Hormonal manipulations. In mice, E2 levels vary threefold with the
estrus cycle within a range of 0.1 (proestrus) to 0.3 (estrus) nM, with
intermediate values (0.2 nM) observed in noncycling animals (26).
After ovariectomy, attempts to restore with exogen depots the physiology of endogenous E2 have shown some limitations. For instance,
Modder et al. (19) reported that physiological E2 serum levels were
reached with 5 and 10 ␮g 䡠 kg⫺1 䡠 day⫺1 pellets but that higher dosages
(20 – 40 ␮g 䡠 kg⫺1 䡠 day⫺1) and supraphysiological serum levels were
Address for reprint requests and other correspondence: X. Gamé, Service
d’Urologie, Andrologie et Transplantation Rénale, CHU Rangueil, TSA
50032, 31059 Toulouse, France (e-mail: [email protected]).
The costs of publication of this article were defrayed in part by the payment
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in accordance with 18 U.S.C. Section 1734 solely to indicate this fact.
UP TO 50% OF WOMEN ARE REPORTED
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R851
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Gamé X, Allard J, Escourrou G, Gourdy P, Tack I, Rischmann
P, Arnal J-F, Malavaud B. Estradiol increases urethral tone through
the local inhibition of neuronal nitric oxide synthase expression. Am J
Physiol Regul Integr Comp Physiol 294: R851–R857, 2008. First
published January 9, 2008; doi:10.1152/ajpregu.00467.2007.—Estrogens are known to modulate lower urinary tract (LUT) trophicity and
neuronal nitric oxide synthase (nNOS) expression in several organs.
The aim of this study was to explore the effects of endogenous and
supraestrus levels of 17␤-estradiol (E2) on LUT and urethral nNOS
expression and function. LUT function and histology and urethral
nNOS expression were studied in adult female mice subjected either
to sham surgery, surgical castration, or castration plus chronic E2
supplementation (80 ␮g 䡠 kg⫺1 䡠 day⫺1, i.e., pregnancy level). The
micturition pattern was profoundly altered by long-term supraestrus
levels of E2 with decreased frequency paralleled by increased residual
volumes higher than those of ovariectomized mice. Urethral resistance
was increased twofold in E2-treated mice, with no structural changes
in urethra, supporting a pure tonic mechanism. Acute nNOS inhibition
by 7-nitroindazole decreased frequency and increased residual volumes in ovariectomized mice but had no additive effect on the
micturition pattern of long-term supraestrus mice, showing that longterm supraestrus E2 levels and acute inhibition of nNOS activity had
similar functional effects. Finally, E2 decreased urethral nNOS expression in ovariectomized mice. Long-term supraestrus levels of E2
increased urethral tone through inhibition of nNOS expression,
whereas physiological levels of E2 had no effect.
R852
EFFECT OF E2 ON URETHRAL nNOS EXPRESSION AND FUNCTION
AJP-Regul Integr Comp Physiol • VOL
mean thickness of the muscularis layer of a bladder section was
assessed as the ratio of the muscularis surface to the urothelium
segment length.
Protein extraction and Western blot. Urethral specimens were
removed en bloc, rinsed with ice-cold saline buffer, frozen by immersion in liquid nitrogen, and stored at ⫺80°C until used for the
experiment (within 3 wk).
The frozen tissues were thawed and then homogenized in ⬃10 vol
buffer containing 10% glycerol, 20 mM Tris, 140 mM NaCl, 10 mM
sodium pyrophosphate, 10 mM fluoride, 2 mM sodium orthovanadate,
3 mM EDTA, 10 ␮g/ml trypsin inhibitor, 10 ␮g/ml leupeptin, and 2
␮g/ml aprotinin with a Polytron homogenizer for four periods of 1
min with intermittent cooling pauses of 4 min. The homogenate was
centrifuged at 40,000 g for 45 min, and the pellet was discarded. The
supernatant was saved.
Aliquots of 60 ␮l of supernatant were diluted 1:2 in electrophoresis
sample buffer (1.8 M Tris 䡠 HCl, pH 6.8, 10% glycerol, 10% SDS,
0.01% bromphenol blue, and 5% ␤-mercaptoethanol) to yield 60 ␮g
of protein per lane. The samples were reduced by boiling for 5 min.
Mouse cerebellum cortex was used as a positive control. SDS-PAGE
was carried out on a 10% polyacrylamide gel at 125 V for 30 min.
After electrophoretic transfer to a polyvinylidene difluoride membrane at 10 –15 V for 30 min, the blots were blocked overnight with
dry milk diluted in TBS-Tween 20 at 4°C. The blots were then
incubated with primary polyclonal antibodies (nNOS N31030; Transduction Laboratories, Lexington, KY) diluted in TBS-Tween 20-dry
milk (nNOS 1:1000) for 1 h at room temperature. Blots were then
rinsed in TBS-Tween 20 for 1–15 min followed by 3–5 min and
incubated with secondary anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase
(SC2030; Santa Cruz Biotechnology) diluted in TBS-Tween 20 (1:10
000) for 1 h at room temperature. Blots were then rinsed as above and
subjected to the enhanced chemiluminescence system. Autoradiographic film was applied to the blot until satisfactory exposure was
obtained. After scanning, films were analyzed by NIH Image software
to quantitate nNOS expression.
Statistical analysis. Data were analyzed by two-way ANOVA,
followed by Student’s t-test when appropriate. Data are presented as
means ⫾ SD. P ⬍ 0.05 was considered significant.
RESULTS
Uterus and body weight. Mean body weights were similar in
all groups (E2-treated mice ⫽ 23.3 ⫾ 1.0 g, ovariectomized
mice ⫽ 22.9 ⫾ 0.9 g, sham-operated mice ⫽ 23.1 ⫾ 1.1 g,
respectively; not significant).
Compared with sham-operated mice (102 ⫾ 12 mg), mean
uterus weights were similar in E2-treated mice (117 ⫾ 22 mg;
not significant) and drastically decreased in ovariectomized
mice (23 ⫾ 3 mg, P ⫽ 0.002).
At the time of death (16 wk of age), E2 serum levels were
undetectable in ovariectomized animals, whereas a fourfold
increase was observed in E2-treated animals compared with
Table 1. Characteristics of 4-mo-old female mice in different
experimental groups with corresponding estradiol
serum levels
Group
n
Body
Weight, g
Sham-operated
Ovariectomized
Supraestrus
6
6
6
23.1⫾1.1
22.9⫾0.9
23.3⫾1.0
Bladder
Weight,
mg
Uterus
Weight,
mg
E2 Serum
Level,
pg/ml
21.0⫾1.8
22.1⫾2.2
31.2⫾7.8
102⫾12
23⫾3
117⫾22
19⫾3
ND
80⫾9
Values are means ⫾ SD; n ⫽ no. of animals. E2, 17␤-estradiol; ND, not
detectable.
294 • MARCH 2008 •
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needed to restore the weight of such a select target organ as the uterus
in laboratory animals. We therefore opted for classical sham-operated
animals as physiological controls to study the influence of E2 on the
lower urinary tract.
Mice were sham operated or ovariectomized at 4 wk of age. Two
weeks later, the ovariectomized animals were subcutaneously implanted with either a placebo or a 60-day time release E2 pellet (0.1
mg E2 releasing 80 ␮g 䡠 kg⫺1 䡠 day⫺1; Innovative Research of America,
Sarasota, FL). This dose was previously reported to induce plasma
levels of 0.3 nM (80 pg/ml), a concentration encountered during
pregnancy and ⬃10 times higher than that found during the estrus
cycle (10). Six weeks later, the mice received either an intraperitoneal
injection of 7-nitroindazole (Acros Organics, Morris Plains, NJ), a
potent selective competitive inhibitor of nNOS with no significant
effect on endothelial NO synthase (eNOS) in mice (21), sonicated in
peanut oil at a dose of 50 mg/kg or the vehicle alone.
Micturition behavior was then recorded in the animals (6 per
group), and 2 days later leak point pressures were measured. A
separate set of animals (6 per group) was followed after hormonal
manipulation [ovariectomy, sham surgery, ovariectomy plus E2 pellets every 2 mo (hereafter reported as E2-treated mice)] until 4 mo of
age when they were euthanized for histology and Western blot
analysis. In all conditions, the hormonal status was verified by the
combination of uterus weights and serum E2 levels.
Plasma E2. In all animals, serum samples were taken before death
at 12 wk (micturition behavior) or 16 wk (histology) of age. E2 was
first extracted under diethyl ether. Plasma E2 was measured with a
commercially available double-antibody RIA immulite-kit (Coat-ACount Estradiol-6; Diagnostic Products, Los Angeles, CA). The interassay and intra-assay coefficients of variation for this kit are
reported to be 4.1–15.3% and 3.5–7.6%, respectively. Assay sensitivity was 7.4 pg/ml, and the cross-reactivity with other estrogenic
compounds was negligible.
Micturition behavior. Micturition behavior was assessed as described by Burnett et al. (5). Briefly, animals were housed individually
in hanging stainless cages for 14 h before the experiment and provided
with food and water ad libitum. Preweighed absorbent cage paper was
placed underneath each cage and weighed at 5-min intervals for 8 h.
Urine output was calculated as the sum of the volume urinated and
the residual volume per 8 h.
Leak point pressure study. The bladder dome was exposed under
operative microscopy through a lower midline abdominal incision. A
22-gauge angiocatheter was inserted and fixed to the bladder wall with
cyanoacrylate glue. The bladder was then distended with room temperature saline at a filling rate of 20 ␮l/min. The intravesical pressures
were recorded with a TA400 pressure transducer (Gould Electronics,
Ballainvilliers, France), and the leak point pressure was defined as the
pressure recorded when the first drop was observed at the meatus.
Histological analysis and histomorphometry. Mice were euthanized at 16 wk of age for histology analysis. The animals were put
under general anesthesia as previously described and injected intraperitoneally with 12.5 mg/kg atropine sulfate (Laboratoires Renaudin,
Itxassou, France) to prevent premortem bladder contractions. The
bladder was catheterized, emptied, and distended to 50 ␮l of volume
as described for the leak point pressure study. Animals were euthanized by intraperitoneal injection of 250 mg/kg lidocaine (AstraZeneca, Rueil-Malmaison, France).
The upper and lower urinary tracts were removed en bloc, and the
kidneys, bladder, and uterus were weighed separately. Bladder dome,
midureter, and midurethra specimens were fixed in Dubosc-BrazilBouin mixture and routinely processed for Masson trichrome stain.
Digital microscopic pictures of 4-␮m-thick slides (ureter ⫽ ⫻400,
bladder ⫽ ⫻160, urethra ⫽ ⫻100) were analyzed with the freeware
National Institutes of Health (NIH) Image software (http:/rsb.info.nih.
gov/nih-image). For the ureter and urethra specimens, the areas of the
epithelial layer, submucosa, and muscularis layer were measured, as
well as the overall area of the section. For the bladder specimens, the
R853
EFFECT OF E2 ON URETHRAL nNOS EXPRESSION AND FUNCTION
Table 2. Micturition behavior in vigil animals and leak point pressure in anesthetized animals according to hormonal status
and nNOS inhibition by 7-nitroindazole intraperitoneal injection
Ovariectomized
Number of micturitions/8 h
Volume urinated/8 h, ␮l
Residual volume, ␮l
Urine output/8 h, ␮l
Leak point pressure, cmH2O
Sham-operated
E2 Treated
Without 7NI
7NI
P
Without 7NI
7NI
P
Without 7NI
7NI
P
4.0⫾1.7
332⫾62
15⫾13
347⫾7
4.3⫾0.7
1.2⫾0.8
86⫾69
104⫾76
190⫾12
9.9⫾5.13
0.0079
0.0079
0.016
0.016
0.03
3.6⫾1.5
371⫾118
18⫾17
389⫾12
4.9⫾0.9
1.3⫾0.8
260⫾151
92⫾28
352⫾12
7.60⫾1.55
0.0041
0.16
0.0079
0.45
0.03
1.2⫾0.8
156⫾128
318⫾111
474⫾14
8.8⫾2.3
0.4⫾0.6
58⫾119
203⫾36
261⫾18
10.7⫾6.12
0.15
0.22
0.11
0.11
0.70
Values are means ⫾ SD. Urine output was defined as the sum of the volume urinated and the residual volume. Within each condition (ovariectomized,
sham-operated, and E2 treated), P values (ANOVA) refer to the effect of nNOS inhibition by 7-nitroindazole (7NI).
7-nitroindazole did not significantly influence the micturition
pattern of E2 animals (Table 2). nNOS inhibition significantly
reduced urine output in ovariectomized animals (190 vs. 347
␮l; P ⫽ 0.016) but not in sham-operated (352 vs. 389 ␮l; P ⫽
0.45) and in E2-treated animals (261 vs. 474 ␮l; P ⫽ 0.11).
Leak point pressure. E2-treated mice exhibited a twofold
increase in leak point pressure, compared with ovariectomized
and sham-operated animals (8.8 ⫾ 2.3 vs. 4.3 ⫾ 0.7 and 4.9 ⫾
0.9 cmH2O, respectively; P ⬍ 0.01; Table 2).
In addition, acute nNOS inhibition significantly increased
urethral resistances in sham-operated (7.60 ⫾ 1.55 vs. 4.90 ⫾
0.89 cmH2O; P ⫽ 0.03) and ovariectomized animals (9.90 ⫾
5.13 vs. 4.25 ⫾ 0.66 cmH2O; P ⫽ 0.03) but not in E2-treated
animals (10.67 ⫾ 6.12 vs. 8.75 ⫾ 2.29 cmH2O, not significant,
P ⫽ 0.70), highlighting both the relaxing role of nNOS in
sham-operated and ovariectomized animals and its impairment
by supraestrus levels of E2 (Table 2).
Histology and histomorphometry. Figures 1 and 2 show
histology and histomorphometry. As expected in mice, urethral
Fig. 1. Representative histologies of ureter, bladder, and urethra in relation to hormonal status (with
Masson trichrome stain).
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sham operated animals (80 ⫾ 9 vs. 19 ⫾ 3 pg/ml, P ⬍ 0.001;
Table 1). Similar results were observed at 12 wk of age (data
not shown).
Micturition behavior. E2-treated mice exhibited a lower
frequency of micturition than ovariectomized and sham-operated animals (1.2 ⫾ 0.8 vs. 4.0 ⫾ 1.7 and 3.6 ⫾ 1.5 micturition/8 h, respectively; P ⫽ 0.008). At the end of the experiment, the residual urine volume was determined by bladder
catheterization. E2-treated mice exhibited a 30-fold increase in
residual volume compared with ovariectomized or sham-operated
animals, which were almost devoid of residual (0.32 ⫾ 0.11 ml
vs. 0.01 ⫾ 0.01 ml and 0.01 ⫾ 0.01 ml, respectively; P ⫽ 0.008).
The role of nNOS-derived NO was evaluated by subjecting
the animals to pharmacological inhibition by 7-nitroindazole.
Acute inhibition of nNOS resulted in a significant decrease in
the frequency of micturition in ovariectomized and shamoperated animals, which was paralleled by a significant increase in residual volume (Table 2), giving evidence of the
tonic inhibitory effect of nNOS in micturition. In contrast,
R854
EFFECT OF E2 ON URETHRAL nNOS EXPRESSION AND FUNCTION
sections were devoid of striated muscle. E2-induced increase in
urethral resistances was associated with thicker muscularis
layers in ureter and bladder and by a parallel increase in
bladder weight (31.2 ⫾ 7.8 vs. 21.0 ⫾ 1.8 vs. 22.1 ⫾ 2.2 mg
in E2-treated mice vs. sham-operated and ovariectomized mice,
respectively; P ⬍ 0.01). No differences were observed in
various urethral layers, whatever the hormonal status.
nNOS urethral expression. E2 strongly affected nNOS urethral expression, as supraestrus E2 resulted in a significant 62%
decrease, whereas ovariectomy led to a 69% increase in expression, compared with sham-operated controls (Fig. 3).
DISCUSSION
In the present work, we confirmed the influence of E2 on
urethral tone and asserted whether it was mediated through
local nNOS activity and expression, as reported in other target
organs (summarized in Fig. 4). Contrary to sham-operated and
ovariectomized animals in which acute nNOS inhibition increased urethral resistances, nNOS inhibition had no effect on
the chronically elevated resistances observed in E2-treated
animals.
As shown by increased residual volume and fewer micturitions in E2-treated animals, E2 status profoundly influenced the
micturition pattern, which raises the concern that supraestrus
AJP-Regul Integr Comp Physiol • VOL
levels of E2 could lead to overflow incontinence by urinary
retention.
However, the NIH consensus definition of overflow incontinence is that of frequent micturitions of low volumes (http://
kidney.niddk.nih.gov/kudiseases/pubs/uiwomen/index.htm).
We observed in supraestrus animals a reduction in frequency
associated with an increase in volume, contrary to this definition.
One limitation of the present study is that it did not address
any direct effect on bladder contractility. Although nNOS was
shown to be the major NOS isoform in the lower urinary tract
(5), its gene invalidation did not affect bladder strip contractility or relaxation after chemical and electrical stimulations
(28), suggesting that the reported effects on urodynamics and
micturition were secondary to alterations of urethral resistances
(5, 18, 28). We therefore focused on the dynamic control of
urethral resistances by E2 through the nNOS pathway.
Because urethral resistances may reflect any combination of
dynamic obstructions resulting from smooth muscle tonus and
static tissue resistances, we investigated their respective contributions depending on E2 status and nNOS activity by measuring the bladder pressure at urine leakage, similar to the leak
point pressure in humans, and searched for structural urethral
alterations. In contrast to results in sham-operated and ovari294 • MARCH 2008 •
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Fig. 2. Box and whiskers distribution of
urothelium and muscularis areas of ureter,
bladder, and urethra (6 mice per group). The
box part covers the interquartile range (25–
75% of all observations), and the whiskers
represent minimum and maximum values.
No differences are observed in urothelium
areas in all segments, whereas statistically
significant increases (**P ⬍ 0.01) are shown
in ureter and bladder muscularis of 17␤estradiol (E2)-treated ovariectomized animals (O⫹E2), compared with sham-operated
(S) and ovariectomized (O) animals.
EFFECT OF E2 ON URETHRAL nNOS EXPRESSION AND FUNCTION
R855
segments of the lower urinary tract. Both experiments studied
the influence of short-term stimulation (2 and 1 wk, respectively) with high doses of E2 (5 and 1 mg䡠kg⫺1䡠wk⫺1, respectively) on NOS activity and did not assess selective implication
of specific NOS subtypes. To our knowledge, the present report
is the first evidence of long-term hormonal modulation of
nNOS expression in the female lower urinary tract by su-
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Fig. 3. Neuronal nitric oxide synthase (nNOS) expression in female mice
urethra according to hormonal status. A: representative Western blot. Standard
refers to 0.5, 1, and 1.5 ␮g of cerebellum proteic extract (positive control).
B: mean and SD of 6 separate experiments, showing results compared with
sham-operated animals (S). There was a significant 62% decrease in nNOS
expression in E2-treated ovariectomized animals (P ⬍ 0.01) and a 69%
increase in ovariectomized animals (P ⬍ 0.05). *P ⬍ 0.05; **P ⬍ 0.01;
***P ⬍ 0.001.
ectomized controls, E2-treated mice exhibited a twofold increase in urethral resistances that was not further modified by
nNOS inhibition. In addition, the structure of the bladder, as
assessed by image analysis and weight, was significantly altered. Of note, no differences between groups were observed in
the urethral layers, suggesting that the E2-induced urethral
resistances were not related to structural changes of the outlet.
In ovariectomized and sham-operated control animals, acute
inhibition of nNOS increased the bladder pressure at urine
leakage, confirming in the female urinary tract the relaxing
effect of NO on urethral tone (28). However, such inhibition
had no influences on the increased urethral resistances observed in E2-treated mice.
We therefore assessed nNOS expression and for the first
time in urethra highlighted the significant decrease of nNOS
expression in E2-treated animals mirrored by its sharp increase
in ovariectomized animals.
Ten years ago, Takahashi et al. (29) first reported that
short-term high-dose estrogen treatment reduced NOS activity
and inhibited the nitrergic nerve stimulation-induced relaxation
of rabbit urethral smooth muscle. Al-Hijji and Batra (3)
showed that such E2-reduced NOS activity was observed in all
AJP-Regul Integr Comp Physiol • VOL
Fig. 4. Representation of interactions between estrogens (E2) and nitric oxide
production and functional effects on lower urinary tract. A: results from
1) Warembourg et al. (33), 2) Traish et al. (30), 3) Al-Hijji and Batra (3),
4) Takahashi et al. (29), 5) Burnett et al. (5), and 6) Sutherland et al. (28).
eNOS, endothelial nitric oxide synthase. B: present experiments. 7-NI, 7-nitroindazole.
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R856
EFFECT OF E2 ON URETHRAL nNOS EXPRESSION AND FUNCTION
AJP-Regul Integr Comp Physiol • VOL
increased urine volume by decreasing osmolality. In addition,
this was exquisitely influenced by nNOS inhibition, confirming
the observation of Alexander et al. (2) in the pregnant rat,
which showed that renal hemodynamic changes were related to
renal expression of inducible NOS and nNOS isoforms.
With regard to ovariectomized animals, urine output was
sharply reduced by nNOS inhibition (347 vs. 190 ␮l; P ⫽
0.016), whereas no significant effects were observed in shamoperated animals, suggesting that the role of nNOS is more
prominent after castration. Recently, Yamaleyeva et al. (34)
observed in the cortex and medulla of hypertensive rats that
ovariectomy enhanced nNOS mRNA but decreased eNOS
mRNA, suggesting that increased renal nNOS expression constituted a compensatory mechanism to castration-induced reduction in renal eNOS. This report is consistent with the
present observation of a more profound effect of nNOS acute
inhibition in ovariectomized animals than in sham-operated
animals.
Therefore, one important finding is that, to be of any clinical
relevance in terms of urethral tone, E2 supplementation would
have to reach selectively supraestrus levels in the urethra. Such
a limitation could be addressed by transvaginal administration,
which was shown in a Cochrane review of 16 trials encompassing 2,129 women to have a positive effect on vaginal
dryness and atrophy, without side effects (27). Another way
would be to resort to selective estrogen receptor modulators
(SERMs), selected to reproduce some but not all the effects of
E2. The identification of numerous coactivators and corepressors that modulate receptor function and the generation of two
estrogen receptor subtypes attest to the potential complexity
through which SERMs produce diverse tissue-specific responses (17). Contrary to their effects on bone metabolism,
SERMs do not appear to have a class effect on the lower
urinary tract (1), and the present animal models could prove of
value in the preclinical development of “uroSERM,” designed
to take advantage of the modulation of urethral tone by estrogens.
Perspectives and Significance
We show here that long-term treatment with high doses of
E2 increases the urethral tone and reduces nNOS expression in
the urethra. This mechanism potentially accounts for the physiological increase in urethral tone during pregnancy. It suggests
a beneficial effect of local delivery of estrogens or uroSERM in
postmenopausal urinary incontinence.
In conclusion, we here show that supraestrus E2 decreases
urethral nNOS expression, resulting in outlet obstruction. No
static urethral modifications were observed, in line with a
dynamic effect on the urethral smooth muscle tone.
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praestrus levels of E2, a key finding in view of the function of
NO as a major mediator of smooth muscle relaxation in the
lower urinary tract.
Sutherland et al. (28) and Burnett et al. (5) previously
emphasized the key role of the nNOS subtype on lower urinary
function. Sutherland et al. showed that gene inactivation of
nNOS in female mice resulted in a profound decrease of
overall NOS activity in bladder and urethra, indicating that it
accounts for most of the NOS activity in the lower urinary
tract. Increased bladder weight and maximal bladder pressure
at leakage suggested that nNOS disruption resulted in increased uretral resistances, which did not however translate
into measurable alterations of the voiding patterns (28). In
male animals, however, targeted disruption of the nNOS gene
resulted in dysfunctional bladder outlet (5). Interestingly,
eNOS immunoreactivity was observed in endothelium of submucosa blood vessels and in urothelium of the urethra, whereas
nNOS expression was restricted to nerve fibers throughout the
inner lamina propria and muscular layer, thereby supporting an
exclusive control of urethral muscle relaxation by nNOS (5).
Our present findings in female sham-operated animals in which
7-nitroindazole-selective nNOS inhibition increased urethral
tone are consistent with these two studies.
We show here that supraestrus E2 decreased urethral nNOS
expression, resulting in profound modifications of bladder
function and structure. In addition to direct regulation of nNOS
expression, E2 can also indirectly impair NOS activity by
generating urethral production of endogenous NOS inhibitors
such as NG-monomethyl-L-arginine and asymmetrical NG,NGdimethyl-L-arginine through decreases in dimethylarginine
dimethylaminohydrolase activity (23). In human studies, endogenous NOS inhibitors have proven to be of pathophysiological relevance in pathological conditions such as peripheral
and coronary arterial diseases (4, 31). In addition to modulation
of the urethral outlet function or as its consequence, E2 has a
strong effect on the bladder reservoir. Indeed, it can induce
detrusor hypertrophy (16) or reduce the density of muscarinic
receptors (25) in keeping with the significant improvement of
overactive bladder symptoms in postmenopausal women (7).
As a whole, by decreasing the expression and the activity of
nNOS and by enhancing the local concentration of NOS
inhibitors, supraestrus E2 can locally disrupt NO regulation,
leading to an increase in the urethral tone. This could account
for the reported gradual increase in urethral tone and relative
lack of stress urinary incontinence during pregnancy (15) and
suggests a beneficial effect of estrogens in postmenopausal
incontinence.
This effect was not observed with physiological E2 serum
levels, in line with the reported lack of efficacy of estrogen
supplementation within the estrus range on urinary incontinence (12, 24). This apparent discrepancy between physiological and supraestrus levels of E2 was previously reported by our
group in other extrareproductive effects, such as atherosclerosis prevention (10) and modulation of invariant natural killer T
cells (11).
The present study also confirmed the profound effect of high
doses of E2 on kidney function and nNOS renal expression.
Indeed, in E2-treated animals, urine output (as represented by
the sum of the volume urinated and the residual volume)
increased, reminiscent of the report by Carlberg et al. (9),
which showed that high-dose supplementation with estrogens
EFFECT OF E2 ON URETHRAL nNOS EXPRESSION AND FUNCTION
5.
6.
7.
8.
10.
11.
12.
13.
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466..471
Xavier Gamé, MD,*†‡ Ourdia Bouali, MD,‡ Julien Allard, MD,† Pierre Gourdy, MD, PhD,†
Ghislaine Escourrou, MD,§ Ivan Tack, MD, PhD,† Pascal Rischmann, MD,*
Jean-François Arnal, MD, PhD,† and Bernard Malavaud, MD, PhD*
*Service d’Urologie, Transplantation Rénale et Andrologie, Centre Hospitalier Universitaire Rangueil, Toulouse, France;
†
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale U858 et Laboratoire de Physiologie, Toulouse, France;
‡
Institut Fédératif de Recherche 31, Centre Hospitalier Universitaire Rangueil, Toulouse, France; §Laboratoire D’Anatomie
Pathologique, Centre Hospitalier Universitaire Rangueil, Toulouse, France
DOI: 10.1111/j.1743-6109.2011.02559.x
ABSTRACT
Introduction. Nitric oxide synthases (NOSs) and estrogen receptors are expressed in the female urethra.
Aim. We aimed to assess the impact of sildenafil on micturition behavior, urethral tone according to the hormonal
status and to determine the implications of the neuronal isoform of NOS (nNOS).
Methods. Four-week-old C57/BL6 female mice were sham-operated or ovariectomized. Six weeks later, they were
injected intraperitoneally by any combination of sildenafil, 7-nitroindazole (7-NI)—a potent selective nNOS
inhibitor—or the corresponding vehicles. The mice were then subjected to micturition behavior and leak point
pressure studies. Urethral histomorphometry was performed.
Main Outcome Measures. The main outcome measures were micturition behavior, leak point pressure, and
histomorphometry.
Results. In sham-operated and ovariectomized animals, sildenafil did not impact micturition, although it decreased
urethral resistance 10-fold. nNOS inhibition by 7-NI reduced the number of micturitions and increased residual
volume and leak point pressure. It abrogated sildenafil-induced drop in urethral resistances. Hormonal status did not
influence the structure of the urethral layers.
Conclusions. Irrespective of the hormonal status, sildenafil decreased leak point pressure by a nNOS-mediated
mechanism. Gamé X, Bouali O, Allard J, Gourdy P, Escourrou G, Tack I, Rischmann P, Arnal J-F, and
Malavaud B. Influence of sildenafil on micturition and urethral tone in ovariectomized and nonovariectomized mice. J Sex Med 2012;9:466–471.
Key Words. Sildenafil; Urethra, Physiology; Nitric Oxide; Neuronal Nitric Oxide Synthase; Micturition; Leak Point
Pressure; Urethral Tone
Introduction
A
utonomic regulation of the lower urinary
tract is driven by all three components of the
autonomic nervous system. Produced by the three
isoforms of nitric oxide synthase (NOS) that is the
neuronal isoform of NOS (nNOS), the endothelial
isoform (eNOS), and the inducible isoform
(iNOS); nitric oxide (NO) is the key neurotrans-
J Sex Med 2012;9:466–471
mitter of the nonadrenergic, noncholinergic
nerves of the peripheral nervous system [1].
The main isoform of the lower urinary tract is
nNOS, located in the nerves supplying the
smooth muscle layers of the urethral wall. It
is only sparsely present in the detrusor muscle
[2]. NOS isoforms regulation by estrogens is
organ-dependent. Castration decreases nNOS
and eNOS expression in the vagina while
© 2011 International Society for Sexual Medicine
Sildenafil on Micturition and Urethral Tone
it increases nNOS expression in the urethra
nNOS [3,4].
The relaxing effects of NO on smooth muscle
fiber are mediated by cyclic guanosine monophosphate (cGMP) production from guanosine
triphosphate by soluble guanylate cyclase. cGMP
in turn activates cGMP-dependent protein kinase
G, which acts upon large-conductance, calciumactivated potassium channels to promote smooth
muscle relaxation. Phosphodiesterase-5 (PDE-5)
acts to break down cGMP and to decrease activation of protein kinase G. Conversely, PDE-5
inhibitors promote protein kinase G activation and
smooth muscle relaxation [1].
PDE-5 is expressed in the female human, pig, and
rat urethra. In the urethra, PDE-5 is expressed not
only within the urethral and vascular smooth muscle
cells, but also in the vascular endothelial cells [5,6].
The aim of this study was to assess the impact of
sildenafil, a PDE-5 inhibitor, on the female urethral
tone taking the hormonal status into account.
Materials and Methods
Animal Experiments
All experiments were conducted in conformity
with the guiding principles in the care and use of
laboratory animals published by the U.S. National
Institute of Health (NIH Publication no. 8,523,
revised 1985).
Female C57-Bl6 mice (Charles Rivers, Les
Oncins, France) were housed in stainless steel cages
in a temperature-controlled facility on a 12-hour
light–dark cycle and fed normal laboratory mouse
chow. To prevent estrus, the mice were housed separately from males and not exposed to male mouse
urine-soaked bedding (“Whitten effect”). For surgical procedures, mice were anesthetized by intraperitoneal injection of a mixture of 150 mg/kg ketamine
(PanPharma, Luitré-Fougères, France) and xylazine
(Bayer, Leverkusen, Germany). Body temperature
was maintained at 37°C by means of a rectal probe
connected to a homeothermic blanket.
Mice were sham-operated or ovariectomized at
4 weeks of age. Six weeks later, they received an
intraperitoneal injection of either 7-nitroindazole
(7-NI; 50 mg/kg; ACROS Organics, Morris
Plains, NJ, USA), a potent selective competitive
inhibitor of nNOS without significant effect on
eNOS in mice, or the vehicle alone (peanut oil).
At the same time, they received an intraperitoneal injection of sildenafil (50 mg/kg; Pfizer, Sandwich, UK), a potent selective inhibitor of PDE-5,
or the vehicle alone (saline).
467
As a whole, four experimental groups of six mice
each (sildenafil + peanut oil, sildenafil + 7-NI,
saline + peanut oil, saline + 7-NI) were assessed in
both hormonal conditions (castrated, shamoperated, total number 48 animals).
Micturition Behavior
Micturition behavior (six animals per condition)
was assessed 1 hour after intraperitoneal injection of
7-NI, sildenafil, or vehicle as previously described
[2,3]. The animals were housed individually in
hanging stainless steel cages for 14 hours prior to
the experiment with food and water ad libitum. At
the time of experiment, the animals remained on
solid and liquid diet. Preweighed absorbent cage
paper was placed underneath each cage and
weighed at 5-minute intervals for 8 hours (Mettler
AC 100 analytical balance, Mettler-Toledo,
Viroflay, France) giving an exact representation of
the micturition pattern in a noninvasive manner.
Leak Point Pressure (LPP) Study
One hour after intraperitoneal injections, LPP was
assessed as previously described [3]. Under anesthesia, the bladder dome was exposed under the
operative microscope through a lower midline
abdominal incision. A 22-gauge angiocatheter was
inserted and fixed to the bladder wall with
cyanoacrylate glue. The bladder was then distended with room temperature saline at a filling
rate of 20 ml/minute. The intravesical pressures
were recorded with a TA400 pressure transducer
(Gould Electronics, Ballainvilliers, France), and
the LPP was defined as the pressure recorded
when the first drop was observed at the meatus.
Plasma Estradiol
In all animals, serum samples were obtained at the
time of LPP studies (10 weeks). Plasma estradiol
was first extracted under diethyl ether and measured
with a commercially available double-antibody
radioimmunoassay (RIA) immulite-kit (Coat-ACount Estradiol-6; Diagnostic Products, Los
Angeles, CA, USA). The interassay and intraassay
coefficients of variation for this kit are reported to
be 4.1–15.3% and 3.5–7.6%, respectively. Assay
sensitivity was 7.4 pg/mL, and cross-reactivity with
other estrogenic compounds was negligible.
Histological Analysis and Histomorphometry
Mice were euthanized at 12 weeks of age for histology analysis. As previously described [3], the animals
(N = 48) were put under general anesthesia and
injected intraperitoneally with 12.5 mg/kg atropine
J Sex Med 2012;9:466–471
468
Table 1
levels
Gamé et al.
Characteristics of 3-month-old female mice in different experimental groups with corresponding estradiol serum
Body weight (g)
Uterus wet weight (mg)
Urethra wet weight (mg)
E2 serum level (pg/mL)
Sham-operated
Ovariectomized
P value
21.8 ⫾ 0.3
136 ⫾ 18
22.5 ⫾ 7.9
20 ⫾ 4
21.2 ⫾ 0.2
11 ⫾ 0.6
21.7 ⫾ 3.5
ND
NS
P < 0.0001
NS
Not applicable
Values are means ⫾ SD
NS = not significant; E2 = 17b-estradiol; ND = not detectable
sulphate (Laboratoires Renaudin, Itxassou, France)
to prevent premortem bladder contractions. The
bladder was catheterized, emptied, and distended to
50 ml of volume. Animals were then euthanized by
intraperitoneal injection of 250 mg/kg lidocaine
(Astra-Zeneca, Rueil-Malmaison, France).
Lower urinary tract and vagina were removed
en bloc. The urethra and uterus were weighed separately. Mid-urethra specimens were fixed in
Dubosc–Brasil–Bouin fixative and routinely processed for Masson’s trichrome stain.
Digital microscopic pictures of 4-mm-thick
slides (urethra = ¥100) were analyzed with the
freeware NIH ImageJ software (http://
rsbweb.nih.gov/ij/) (Bethesda, MD, USA). For
urethral specimens, the surface areas of the epithelial and muscularis layers of the mid-urethra
transverse section were measured.
Statistical Analysis
Data were analyzed by Mann–Whitney’s nonparametric U-test. Data were presented as the
mean ⫾ standard deviation. P < 0.05 was considered significant.
Results
While mean body weights were similar in all groups
(ovariectomized 21.2 ⫾ 0.2 g vs. sham-operated
21.8 ⫾ 0.3 g, respectively, not significant [N.S.]),
mean uterus wet weights were, as expected, lower in
ovariectomized mice as compared with sham-
operated mice (uterus 11 ⫾ 0.6 mg vs. 136 ⫾ 18 mg,
respectively, P < 0.0001). 17b-estradiol (E2) serum
levels confirmed proestrus E2 impregnation in
sham-operated animals and undetectable levels in
ovariectomized animals (Table 1). Ovariectomized
mice urethra wet weights were similar to shamoperated animals (21.7 ⫾ 3.5 mg vs. 22.5 ⫾ 7.9 mg,
respectively, N.S.).
Impact of nNOS Inhibition and PDE-5 Inhibition on
Micturition in Sham-Operated Female Mice
7-NI significantly altered the micturition pattern
with reduced number of micturitions (3.7 ⫾ 0.6 vs.
1.2 ⫾ 0.3, in vehicle and 7-NI-treated animals,
respectively, [P = 0.0051]) and increased residual
urine volume (15 ⫾ 7 mL vs. 102 ⫾ 14 mL,
P = 0.0079) and LPP (4.8 ⫾ 0.3 vs. 7.2 ⫾ 0.7 cm
H2O, P = 0.0317) (Table 2).
By contrast, PDE-5 inhibition did not alter the
micturition pattern but reduced urethral resistances 10-fold (LPP 4.8 ⫾ 0.3 cm H2O vs.
0.52 ⫾ 0.14 cm H2O in vehicle and sildenafiltreated animals, respectively, P = 0.0079).
The effect of nNOS inhibition on micturition,
residual volume, and LPP were not altered by
PDE-5 inhibition.
Effects of nNOS and PDE-5 Inhibitions on
Micturition in Ovariectomized Mice
nNOS inactivation by 7-NI altered the micturition pattern (reduced number of micturitions,
reduced urinated volume, increased residual urine)
(Table 3) and increased LPP. On the other hand,
Table 2 Impact of sildenafil, a potent inhibitor of phosphodiesterase-5, and of 7-nitroindazole, a potent inhibitor of the
neuronal isoform of nitric oxide synthase, on micturition behavior, leak point pressure in sham-operated female mice
Number of micturitions/8 hours (N)
Volume urinated/8 hours (ml)
Residual urine volume (ml)
Leak point pressure (cm H2O)
Control*
Sildenafil
Sildenafil
vs. control
(P value)
3.7 ⫾ 0.6
379 ⫾ 98
15 ⫾ 7
4.8 ⫾ 0.3
4.8 ⫾ 1.3
384 ⫾ 99
11 ⫾ 10
0.52 ⫾ 0.14
0.32
0.90
0.69
0.008
*Mice receiving the two vehicles (saline and peanut oil)
J Sex Med 2012;9:466–471
7-NI
7-NI vs.
control
(P value)
7-NI +
sildenafil
7-NI vs. 7-NI +
sildenafil
(P value)
1.2 ⫾ 0.3
255 ⫾ 161
102 ⫾ 14
7.2 ⫾ 0.7
0.005
0.17
0.008
0.03
1.3 ⫾ 0.6
286.7 ⫾ 32.15
96.7 ⫾ 35.12
9.1 ⫾ 2.0
0.57
0.73
0.79
0.40
469
Sildenafil on Micturition and Urethral Tone
Table 3 Impact of sildenafil, a potent inhibitor of phosphodiesterase-5, and of 7-nitroindazole, a potent inhibitor of the
neuronal isoform of nitric oxide synthase, on micturition behavior, leak point pressure in ovariectomized female mice
Number of micturitions/8 hours (N)
Volume urinated/8 hours (ml)
Residual urine volume (ml)
Leak point pressure (cm H2O)
Control*
Sildenafil
Sildenafil
vs. control
(P value)
4.2 ⫾ 1.6
352 ⫾ 23
11.7 ⫾ 11.6
4.3 ⫾ 0.6
5.2 ⫾ 0.8
357 ⫾ 43
10 ⫾ 7
0.33 ⫾ 0.06
0.15
0.62
0.90
0.0079
7-NI
7-NI vs.
control
(P value)
7-NI +
sildenafil
7-NI vs. 7-NI +
sildenafil
(P value)
1.4 ⫾ 0.5
92 ⫾ 58
122 ⫾ 70
8.9 ⫾ 3.6
0.008
0.008
0.005
0.032
1.4 ⫾ 0.55
102.6 ⫾ 28.7
112 ⫾ 58.05
7.6 ⫾ 1.52
0.84
0.55
0.55
0.69
*Mice receiving the two vehicles (saline and peanut oil)
PDE-5 inhibition exerted no impact on micturition but decreased LPP (Table 3).
Histology and Histomorphometry
No differences were observed between shamoperated and ovariectomized animals with regard
to the mucosal and muscularis layers of the urethra
(Figures 1 and 2).
Discussion
We researched the influence of PDE-5 inhibition
on the micturition behavior and urethral tone of
female mice and showed that PDE-5 inhibition
under nNOS control induced a potent reduction
(10-fold) of urethral resistances, irrespective of the
hormonal status.
Figure 1 Masson’s trichome stain showing no difference in
the urethra according to the hormonal status.
PDE-5 promotes the degradation of cGMP
that is produced in the target cells by guanylate
cyclase upon NO activation. Three NOS isoforms
were demonstrated in the urethra, nNOS in the
neuromuscular junction [7] and eNOS or iNOS in
submucosa endothelium and in urothelium [2]. By
showing a 10-fold reduction in LPP after sildenafil
injection, the present report highlighted the key
role of PDE-5 in the control of urinary tract
smooth muscle cell tone. It confirms a previous
report on its role in the male and female lower
urinary tracts where it is a promising target in the
management of lower urinary tract symptoms [8].
7-NI was first described by Moore and colleagues as a potent inhibitor of mouse cerebellar
NOS, which contrary to L-nitro-arginine methyl
ester was devoid of impact on arterial pressure [9].
Although some inhibitory effects on eNOS were
reported in vitro [10], it shows in vivo relative
selectivity for nNOS [3] at the dose used in the
present experiment (50 mg/kg) and is therefore
extensively used in animal models.
Increased urethral tone and, for the first time,
complete abrogation of sildenafil-induced relaxation by the potent and selective nNOS inhibitor
7-NI showed that the main isoform involved in the
regulation of female urethral tone is nNOS.
In line with the report by Burnett in targeted
disruption of nNOS animals [2] and further investigated by our group [2,3], nNOS inhibition was
shown here to have a dramatic impact on the
Figure 2 Box and whisker distribution
of epithelium and muscularis areas of
urethra (six mice per group). The box
part covers the interquartile range (25–
75% of all observations), and the whiskers represent the minimum and
maximum values. No differences are
observed in urethral areas (n.s.).
J Sex Med 2012;9:466–471
470
female micturition pattern (increased LPP,
reduced number of micturitions). Interestingly,
this was observed irrespective of the hormonal
status. This would render nNOS inhibition of
clinical relevance in the treatment of stress urinary
incontinence through incompetent urethral
closure as defined by the International Continence
Society (ICS) as the leakage of urine in the absence
of a detrusor contraction [11]. However, no inhibitors suitable for clinical use have been developed,
most likely because their safety profiles would be
hampered by the ubiquitous distribution of nNOS
[12].
Alternatively, it is possible to enhance the effect
of nNOS activation by inhibiting the degradation
of NO by PDE-5. Reduction of smooth muscle
resistances with PDE-5 inhibitors is now considered a promising avenue in the treatment of male
and female lower urinary tract symptoms [8].
The present animal model complemented our
observations on the hormonal control of female
urethral tone through the nNOS pathway [3] by
showing that PDE-5 inhibition dramatically
reduced urethral resistances irrespective of the
hormonal status. It further supports PDE-5 inhibition in the treatment of female lower urinary
tract dysfunction in keeping with the strong
expression of PDE-5 reported by Werkstrom in
the smooth muscle cells of the human female
urethra [5]. This group showed on isolated urethral strips that urethral relaxation associated two
separate mechanisms, direct relaxation of smooth
muscle cells at high concentrations of PDE-5
inhibitors and prolongation of nerve-induced
relaxation at low concentrations. Of note, sildenafil was shown to be superior to vardenafil and tadalafil in inducing the relaxation of nonstimulated
and noradrenaline-contracted strips, suggesting
that it might indeed be the drug of choice to target
urinary tract smooth muscle cells [5].
The present study, in which high concentrations of sildenafil (100 mm/kg) were used, was
designed to investigate the direct effect of PDE-5
inhibitors on smooth muscle and, in intact
animals, to confirm the validity of observations
obtained ex vivo in urethral strips. Alternately, urethral resistances can be lowered by oral administration of NO donors as shown in healthy
volunteers [13] and in patients with detrusorsphincter dyssynergia [14]. As clarified by the ICS,
abnormal urethral function may be due to either a
urethra that cannot open because of anatomic
abnormality or obstruction secondary to urethral
overactivity as encountered in dysfunctional
J Sex Med 2012;9:466–471
Gamé et al.
voiding, detrusor-sphincter dyssynergia, or nonrelaxing urethral sphincter obstruction [11]. In a
recent survey of 247 women referred for complete
and partial retention, Kavia showed that primary
disorder of sphincter relaxation accounted for
more than half (57.5%) of the patients, while in a
significant minority (32%) no diagnosis was possible despite extensive investigations that comprised urethral pressure profilometry, transvaginal
ultrasound estimation of sphincter volume, and
sphincter electromyography (EMG) [15]. The
same group investigated, in a double-blind
placebo-controlled crossover study, the relevance
of sildenafil citrate in the primary disorder of
sphincter relaxation (Fowler’s syndrome) patients.
Interestingly, Fowler’s syndrome was defined as a
primary disorder of sphincter relaxation with no
neurological or urological explanation but with
striated sphincter overactivity and hormonal
imbalance such as that brought on by polycystic
ovaries [16]. The working hypothesis was that
relaxation of urethral resistances by augmentation
of the NO relaxation pathway by PDE-5 inhibitors might provide effective relief [17] in line with
the physiological role of NO in urethral sphincter
relaxation during micturition [18] and the evidence of nNOS overexpression in ovariectomized
mice [3]. While significant improvements in
maximum flow rate and International Prostate
Symptom Score were observed between baseline
and sildenafil citrate phases, the placebo and
sildenafil results were comparable that led to the
conclusion that this drug was not effective in that
select group of female patients [17].
Uninhibited striated muscle contractions found
on typical EMG by decelerating bursts and
complex repetitive discharges are considered the
primum movens of this disease. PDE-5 inhibitors
are not similarly potent on all three isoforms,
sildenafil being less potent than vardenafil,
notably on PDE-5A1 (threefold) and PDE-5A2
(12-fold), which are the two isoforms observed in
the striated muscle [19,20], so optimal activity on
uninhibited striated muscle contractions could
theoretically be better addressed by vardenafil
than by sildenafil.
Of note, the murine female urethra is devoid of
striated muscle [3], while intramural striated
muscle is present in the middle and the distal third
of the human female urethra [21] where it contributes to a third of urethral closure pressure [22]. In
that respect, the present murine model is hardly
relevant to evaluate the role of striated muscle or
the relevance of potential modulators.
Sildenafil on Micturition and Urethral Tone
Conclusion
Irrespective of the hormonal status, sildenafil
decreases LPP by a nNOS-mediated mechanism.
Similar to its use in male lower urinary tract symptoms, PDE-5 inhibitors might prove of value in
female bladder outlet obstruction related to dysfunctional voiding, detrusor-sphincter dyssynergia, or nonrelaxing urethral sphincter obstruction.
Corresponding Author: Xavier Gamé, MD, Service
d’Urologie, Transplantation Rénale et Andrologie,
Centre Hospitalier Universitaire Rangueil, TSA 50032,
31059 Toulouse, France. Tel: +33 561323301; Fax: +33
561323230; E-mail: [email protected]
Conflict of Interest: None.
Statement of Authorship
Category 1
(a) Conception and Design
Xavier Gamé; Jean-François Arnal; Bernard Malavaud
(b) Acquisition of Data
Xavier Gamé; Ourdia Bouali; Julien Allard; Pierre
Gourdy; Ghislaine Escourrou
(c) Analysis and Interpretation of Data
Xavier Gamé; Ourdia Bouali; Julien Allard; Ghislaine Escourrou; Ivan Tack; Jean-François Arnal;
Bernard Malavaud
Category 2
(a) Drafting the Article
Xavier Gamé; Bernard Malavaud
(b) Revising It for Intellectual Content
Xavier Gamé; Pascal Rischmann; Jean-François
Arnal; Bernard Malavaud
Category 3
(a) Final Approval of the Completed Article
Xavier Gamé; Ourdia Bouali; Julien Allard; Pierre
Gourdy; Ghislaine Escourrou; Ivan Tack; Pascal
Rischmann; Jean-François Arnal; Bernard Malavaud
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Vaginal lubrication after cervicovaginal stimulation is
facilitated
by
Phosphodiesterase-V
inhibition
in
ovariectomised mice.
Xavier Gamé
1, 2, 3
, Mathieu Roumiguié1, Ourdia Bouali3, Julien Allard2, Pierre Gourdy2,
Catherine Mazerolles4, Pascal Rischmann1, Jean-François Arnal2, Bernard Malavaud1
1: Département d’Urologie, Centre Hospitalier Universitaire Rangueil, Toulouse, France
2: Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale U1048 et Laboratoire de
Physiologie
3: Institut Fédératif de Recherche 31, CHU Rangueil, Toulouse, France
4: Laboratoire D’Anatomie Pathologique, Centre Hospitalier Universitaire Rangueil,
Toulouse, France
Address for correspondence: Docteur Xavier Gamé, Département d’Urologie, Centre
Hospitalier Universitaire Rangueil, TSA 50032, 31059 Toulouse, France
Phone: + 33 5 61 32 33 01
Fax: + 33 5 61 32 32 30
E-mail: [email protected]
Key-words: Vagina, lubrication, nitric oxide, nitric oxide synthase, phosphodiesterase V,
estrogens.
115
ABSTRACT
Introduction: Nitric oxide synthases (NOS) and estrogen receptors are expressed in the
vagina.
Aim: We aimed to assess the impact of sildenafil on vaginal lubrication according to the
hormonal status and to determine the role of the neuronal isoform of nitric oxide synthase
(nNOS).
Methods: Four-week-old C57/BL6 female mice were sham-operated or ovariectomized. At
ten weeks of age they were injected intraperitoneally by any combination of sildenafil, 7nitro-indazole (7NI) – a potent selective nNOS inhibitor – or the corresponding vehicles.
Vaginal lubrication was induced in a physiological manner by cervical vaginal probing and
quantified depending on the hormonal and pharmacological conditions. The animals were
then sacrificed for vaginal histomorphometry.
Main outcome measures: Quantification of vaginal transudate after cervico-vaginal
stimulation and vaginal histomorphometry.
Results: Sildenafil increased cervico-vaginal probing induced vaginal lubrication in
ovariectomized and sham-operated animals. Ovariectomized mice exhibited decreased vaginal
lubrication as compared to sham-operated mice. When taking into account the presence of
severe vaginal atrophy, a 3-fold increase in transudate per gram of vagina wet-weight was
revealed in ovariectomized animals. Castration markedly reduced the thickness of the vaginal
wall. nNOS inhibition by 7NI had no impact on vaginal lubrication.
Conclusions: Irrespective of the hormonal status, sildenafil increased vaginal lubrication. The
vaginal effect of sildenafil was independent of the nNOS pathway and more pronounced in
ovariectomized animals.
116
INTRODUCTION
After menopause up to one woman out of three experiences vaginal discomfort and dryness
which can impact on general well-being and sexual quality of life [1, 2].
Full sexual arousal in the female is characterized by increased blood flow in the genitalia and
vaginal lubrication [1]. The latter results from passive transfer of proteins and fluids across
the capillary network, befitting the definition of a transudate [3]. Mayhan first evidenced the
role of Nitric Oxide Synthase (NOS) in macromolecular permeability induced by histamine,
which was decreased by non-selective NOS inhibition but increased by perfusion of Larginine, the substrate of NOS [4]. In isolated coronary venules, the synthesis of NO in
endothelial cells controlled histamine-induced permeability, suggesting a major role in
permeability for the endothelial isoform of NOS [5]. More recently, Hatakeyama showed in
animals gene-invalidated for the endothelial and inducible isoforms of NOS (eNOS and
iNOS, respectively) that while neither played a part in baseline permeability, eNOS controlled
the permeability induced by local infusion of low concentrations of Platelet Activating Factor
[6].
NO is also a key mediator in smooth muscle relaxation and vasodilation [7]. In the lower
urinary tract, we have shown its role in driving the urethral tone [8, 9]. Therefore, the
NOS/NO cascade might impact the two major mechanisms driving vaginal lubrication that is
vascular permeability and vasodilation making it a valid target for improving female sexual
disorders.
As largely evidenced in sexual medicine, NO signalling modulation is readily achieved by
inhibition of its degradation by Phosphodiesterase-5 (PDE5) inhibitors. The three NOS
isoforms and PDE5 are expressed in the female human, pig and rat urethra and vagina further
supporting the potential relevance of this cascade in the female sexual response [10].
However, conflicting results have been reported on the impact of PDE5 inhibitors in
improving the female sexual response [11].
The aim of this study was therefore to assess the impact of sildenafil, a PDE-5 inhibitor, on
the vaginal lubrication taking the hormonal status into account and to determine the role of the
neuronal isoform of nitric oxide synthase (nNOS).
117
Material and Methods
Animal experiments
All experiments were conducted in conformity with the guiding principles in the care and use
of laboratory animals published by the US National Institute of Health (NIH Publication
n°8523, revised 1985).
Female C57-Bl6 mice (Charles Rivers, Les Oncins, France) were housed in stainless steel
cages in a temperature-controlled facility on a 12-hour light-dark cycle and fed normal
laboratory mouse chow. To prevent estrus, the mice were housed separately from males and
not exposed to male mouse urine soaked bedding (“Whitten effect”). For surgical procedures,
mice were anesthetized by isoflurane inhalation (1.5 % at 2 l.min-1 oxygen flow). Body
temperature was maintained at 37°C by means of a rectal probe connected to a homeothermic
blanket.
Mice were sham-operated or ovariectomized at 4 weeks of age and used for the following
experiments at the age of ten weeks.
To confirm the implication of NO production in vaginal lubrication, sham-operated animals
received an intraperitoneal injection of NG-Methyl-L-Arginine acetate, a non-selective NOS
inhibitor (1mg.kg-1, L-NMMA, Sigma Aldrich, Saint Quentin, France, n=6), or of the vehicle
(saline, n=6) and of sildenafil (50 mg.kg-1 Pfizer, Sandwich, UK) a potent selective inhibitor
of PDE-5, before assessing vaginal lubrication.
To further analyze the role of nNOS, separate groups of animals (n=6 per group) received an
intraperitoneal injection of either 7-nitro-indazole (50 mg.kg-1 7-NI, ACROS Organics, NJ,
USA), a potent selective competitive inhibitor of nNOS without significant effect on eNOS
and iNOS in mice, or the vehicle alone (peanut oil). At the same time they were given an
intraperitoneal injection of sildenafil (50 mg.kg-1 Pfizer, Sandwich, UK) or the vehicle alone
(saline).
Vaginal lubrication studies - with and without cervicovaginal stimulation as hereafter
described - were performed 90 minutes after intraperitoneal injections in each group of
animals.
Cervical vaginal stimulation (CVS)
Under isoflurane inhalation, the animals were placed in the supine position and their bladder
emptied by digital pressure. Gentle stimulation of the vagina and the cervix was then achieved
by five rapid strokes within 5 seconds against the cervix of a 3Fr (1.0mm wide) Teflon-coated
118
probe inserted into the vaginal lumen (3Fr occlusion balloon catheter, Coloplast; Rosny-sousBois, France). One minute after stimulation, a pre-weighed absorbent paper strip was inserted
into the vagina for 10 seconds. Vaginal lubricate volume was estimated from the difference in
weights after and before insertion (Mettler AC 100 analytical balance, Mettler Toledo,
France).
For standardization purposes, after sacrifice the transudate (mg) was expressed per gram of
vagina-wet-weight (mg).
Plasma Estradiol
In all animals, serum samples were obtained under isoflurane inhalation before any
manipulation at the time of lubrication studies (10 weeks of age). Plasma estradiol was first
extracted under diethyl ether and measured with a commercially available double-antibody
RIA immulite-kit (Coat-ACount Estradiol-6; Diagnostic Products, Los Angeles, CA). The
interassay and intra-assay coefficients of variation for this kit are reported to be 4.1–15.3%
and 3.5–7.6%, respectively. Assay sensitivity was 7.4 pg.ml-1, and cross-reactivity with other
estrogenic compounds was negligible.
Histological analysis and histomorphometry
Mice were euthanized at 10 weeks of age for histology analysis. Animals were euthanized by
intraperitoneal injection of 250 mg.kg-1 lidocaine (Astra-Zeneca, Rueil-Malmaison, France).
Uterus and vagina were removed en bloc. The uterus and vagina were weighed separately.
Midvagina specimens were immersed in Dubosc-Brazil-Bouin fixative and routinely processed
for Masson trichrome stain. Paraffin-embedded sections were then routinely processed for
Masson trichrome stain.
Digital microscopic pictures of 4-µm-thick slides were analysed with the freeware National
Institute of Health (NIH) ImageJ® software (http://rsbweb.nih.gov/ij/). As previously
described to quantify the muscularis layer of the bladder [8], the mean thickness of the
muscularis layer was assessed on longitudinal sections of the vaginal wall as the ratio of the
muscularis surface to the mucosa segment length [8].
Statistical analysis
Data were analyzed by two-way ANOVA, followed by Student’s t-test when appropriate.
Results are presented as the mean ± standard deviation. P < 0.05 was considered significant.
119
Results
Body weight, histology and histomorphometry
While mean body weights were similar in all groups (ovariectomized 21.3 ± 0.2 g vs. shamoperated 21.7 ± 0.2 g, respectively, N.S.), mean uterus and vagina wet-weights were, as
expected, lower in ovariectomized mice as compared to sham-operated mice (uterus: 11.2 ±
0.6 mg vs. 133.2 ± 15 mg, respectively, P < 0.0001; vagina: 15.2 ± 12.4 mg vs. 73.5 ± 18.7
mg, respectively, P < 0.001). 17ß-estradiol serum levels confirmed proestrus E2 impregnation
in sham-operated animals and undetectable levels in ovariectomized animals (Table I).
Histomorphometry confirmed the atrophy of the epithelial (2.5 ± 1.9 vs. 8.3 ± 3.2 mm in
ovariectomized mice and in sham-operated mice, respectively, P<0.01) and muscularis (1.1 ±
0.5 vs. 2.7 ± 0.6 mm in ovariectomized mice and in sham-operated mice, respectively,
P<0.01) layers (Figure 1).
As illustrated in Fig 2, castration induced profound changes of the vagina, with atrophy of the
fibromuscular layer and vaginal mucosa, including the receding of the cervical mucinous
glands.
Vaginal lubrication after CVS
In the absence of CVS vaginal secretions were undetectable (<0.01mg) both in sham-operated
and ovariectomized animals while stimulation induced a readily detectable response in both
groups (0.66±0.39 vs. 0.33±0.14 mg, in sham-operated and ovariectomized animals,
respectively p=0.0148). When expressed per gram of vagina wet-weight, the lubrication
response was three-fold higher in ovariectomized animals than in sham-operated controls
(0.018±0.006 vs. 0.058±0.037, in sham and ovariectomized animals, respectively p=0.015).
Impact of L-NMMA on vaginal lubrication in sham-operated animals
In sham-operated animals, the indiscriminate inhibition of all NOS isoforms by L-NMMA
abrogated the vaginal response to CVS (0.38 ± 0.12 vs 0.66 ± 0.39 mg, p<0.01 in L-NMMA
and control groups, respectively) and sildenafil+CVS (0.45±0.02 vs.2.53±0.20mg, p<0.0001,
in L-NMMA and control groups, respectively).
This confirmed the implication of NO production in the vaginal response and prompted us to
analyze the role of nNOS through selective inhibition (7NI).
nNOS and PDE-5 inhibitions of lubrication in sham-operated mice (Fig3A)
nNOS inactivation by 7-NI had no impact on vaginal lubrication (Table II).
120
By contrast, PDE-5 inhibition increased vaginal lubrication 4-fold (0.66 ± 0.39 vs. 2.65 ± 1.38
mg, respectively, P = 0.0087). It was not altered by nNOS inhibition.
nNOS and PDE-5 inhibitions of lubrication in ovariectomized mice (Fig3B)
nNOS inactivation by 7-NI had no influence on vaginal lubrication.
Vaginal lubrication was profoundly reduced in ovariectomized animals (0.33 ± 0.14 vs. 0.66 ±
0.39 mg, in ovariectomized and sham-operated animals, respectively (p = 0.04)) but remained
responsive to PDE-5 inhibition (10-fold increase, Table III).
nNOS inhibition failed to prevent PDE5 vaginal lubrication (3.2 ± 0.8 vs. 3.8 ± 0.3 mg in
sildenafil and sildenafil plus 7-NI ovariectomized animals, respectively (ns)).
121
Discussion
Dyspareunia is a prevalent complaint in premenopausal women as illustrated by a 13%
prevalence in women aged 20-29 in a large population-based study [12]. A recent report
emphasized the frequent use of lubricant in premenopausal women to facilitate penetration
and alleviate pain for women with dyspareunia and to enhance sexual experience in others
[13]. As estrogens are key elements in the maintenance of vaginal mucosal epithelium and
genital blood flow postmenopausal women also often report painful intercourse and
diminished sexual responsiveness [1], vaginal itching and dryness [2]. Independent of
achieving sexual satisfaction from intercourse, the sheer facilitation of vaginal lubrication
would therefore be a valid objective to improve the sexual quality of life in pre and
postmenopausal women.
We here showed that in sham-operated mice, PDE5 inhibition was a strong facilitator of
lubrication response to vaginal stimulation as it increased 4-fold the volume of the vaginal
transudate. Trials on PDE5 inhibitors in female sexual dysfunction consistently evidenced the
discordance between subjective measure of the sexual response and objective vaginal
vasocongestion, the first being inconsistently achieved, while the second was readily observed
in most studies [14]. In view of its prevalence and negative impact on the overall and sexual
quality of life, the simple relief of vaginal discomfort by facilitation of vaginal transudate
would therefore constitute a valid rationale for PDE5 use in premenopausal women.
We also showed in ovariectomized animals that preserved genital hemodynamics and thinned
vaginal mucosa exerted with PDE5 inhibition a cumulative effect promoting the lubrication
response to cervical vaginal stimulation.
The origin of vaginal secretions is not fully clarified. Initial studies showed a continuous
secretion (0.2-0.4ml/h) of acidic fluid mainly composed of electrolytes[15] with the presence
of low concentrations (100-150mg/ml, as compared to 70,000 g/ml in the serum) of low
molecular weight proteins (10-70kDa) with antimicrobial properties[3, 16, 17]. IgGs actively
transferred from the serum were also demonstrated [18, 19].
On the other hand, little is known on its composition during sexual stimulation. Most of it is
formed by a passive translocation of plasma proteins and fluids across the epithelial barrier
(transudate)[3], that originates from the subepithelial microvascular bed, engorged at the time
of sexual arousal, although proteins from the uterine cervix glands may also contribute [1, 20].
122
In the present experiments, PDE5 inhibition enhanced vaginal lubrication after vaginal
cervical stimulation irrespective of the hormonal status. Ovariectomized mice exhibited
decreased vaginal lubrication as compared to sham-operated mice. However, when taking into
account the presence of severe vaginal atrophy a 3-fold increase in transudate per gram of
vagina wet-weight was revealed in ovariectomized animals (0.018 vs. 0.058, in sham and
ovariectomized animals, respectively p=0.015). Similar results were reported after pelvic
nerve stimulation in rabbits where vaginal lubricates volumes were reduced by ovariectomy to
a lesser extent than vaginal weights, as compared to sham-operated animals [21]. Of note,
genital hemodynamics was not impacted by ovariectomy suggesting that regarding vaginal
lubrication, preserved vasculature can balance atrophy of the vaginal wall [21]. As evidenced
by histomorphometry, vaginal atrophy involved both the epithelial and submucosal layers
(Fig 2). We hypothesize that following vasodilation, the observed two-fold reduction in
epithelium thickness further enhanced lubrication by reducing the resistance to passive
translocation of plasma proteins and electrolytes. Of note, the uterine cervix glands present in
sham-animals were no longer observed after castration (Fig 2). Although no definitive answer
can be given about the respective involvements of gland secretion and transudate in shamoperated animals, gland secretion is not involved after castration.
The translation in menopause management remains debatable. While estrogen deficiency of
menopausal women does not impair blood engorgement in genitalia after visual stimulation
[22], Basson reported no subjective improvement in sexual response after sildenafil treatment
in two randomized double-blind studies in estrogen-deficient women with sexual dysfunction
[11]. On the other hand, others reported increased vaginal lubrication and improved sexual
quality of life in postmenopausal women [23] and women with multiple sclerosis [24] under
PDE5 inhibitors treatment. Trials focusing on vaginal lubrication and relief from vulvar
vaginal atrophy, instead of the broader objective of sexual response, should be designed to
provide the definitive answer on the relevance of PDE-5 inhibition in the treatment of
menopausal vaginal symptoms. Direct delivery of NO through NO-releasing microparticles
[25] and gels [26] could also be considered.
While confirming the central role of NO in vaginal lubrication [27], enhanced vaginal
lubrication by PDE5 inhibition and abrogation of that response by L-NMMA could not
123
indicate the NOS isoforms involved in that response. Although nNOS is expressed in the
human vagina arteries nerve fibres [28] and the stromal component of the human labia
minora[29] and controlled by Estrogens [30], its selective inhibition by 7-NI did not alter
vaginal lubrication suggesting that it that its lubricating role is at best marginal.
eNOS was highlighted in the endothelial lining [28] and the smooth muscle compartments
[31] of vagina arteries. In the rat, eNOS vaginal expression in the vascular endothelium and
smooth muscle fibres were abrogated by ovariectomy and fully restored by exogenous
estrogens [32]. In addition to controlling protein expression[33], estradiol also positively
modulates eNOS enzymatic activity by enhancing eNOS Akt-dependent phosphorylation [34,
35] and by facilitating its binding to its positive regulator heat shock protein 90 [36]. The
relevance of this complex network of action was recently illustrated by Musicki who
compared the expressions in the rat vagina of eNOS and its active phosphorylated form ((PeNOS(Ser-1177)) in various hormonal conditions: diestrus, ovariectomy and ovariectomy
plus estradiol [37].
iNOS should also be considered although there is limited evidence of its role in the genital
response. While iNOS appears to be absent in the human clitoris [38], iNOS mRNA was
consistently evidenced in the human menopausal vagina [37] and co-expressed with PDE5.
As eNOS and iNOS are under estrogen control [39, 40], the most logical answer to
postmenopausal vaginal discomfort would be hormone replacement therapy. However, the
ongoing controversies with respect to stroke and cardiovascular disease [41] might limit the
applicability of this concept. A third-generation Selective Estrogen Receptor Modulator
(SERM), lasofoxifene, was shown to have high affinity for ER [42]. It was recently EMEAapproved in the prevention of menopausal osteoporosis [43] and reported to improve vulvar
vaginal atrophy symptoms [44].
Alternately, the new pharmacological of class of enhancers of eNOS transcription was
capable to restore eNOS down-regulation in a spontaneously hypertensive rat model [45] and
could also be relevant in the present setting.
Finally, most studies of the genital response have used invasive methods such as pelvic nerve
stimulation in rabbits or rats. However, the physiology of the genital response in the rodent
involves direct vaginal stimulation often referred to as cervical probing or vaginal cervical
124
stimulation [46, 47]. We here show that direct vaginal probing – shown to activate the
hypogastric and pelvic nerves [48], - induced lubrication (0.66±0.39 vs. 0.33±0.14 mg, in
sham-operated and ovariectomized animals, respectively).
The development in small animals such as transgenic mice of non-invasive methods of genital
stimulation would allow longitudinal evaluations of different pharmacological modulators
providing a powerful leverage in our understanding of the molecular mechanisms involved in
the female genital response.
Conclusion
Irrespective of the hormonal status, Sildenafil increased vaginal lubrication. This vaginal
effect was independent of the nNOS pathway and more pronounced in ovariectomized
animals.
125
Table I: Characteristics of 10-week-old female mice in different experimental groups with
corresponding estradiol serum levels. Values are means ± SD. E2: 17β-estradiol, ND: not
detectable.
Group
Body
Vagina
Uterus
E2 Serum level
(g)
(mg)
(mg)
(pg/ml)
Sham-operated (n=6)
21.7±0.2
73.5 ± 18.7
133.2 ± 15.0
21±5
Ovariectomized (n=6)
21.3±0.2
15.2 ± 12.4
11.2 ± 0.6
ND
P
ns (0.87)
<0.001
<0.0001
-
Table II. Impact of sildenafil and of 7-nitroindazole, a potent inhibitor of the neuronal isoform
of nitric oxide synthase, on vaginal lubrication in sham-operated mice.
*
: Received the two vehicles (saline and peanut oil)
Control*
Sildenafil
7NI
7NI + sildenafil
(n=6)
(n=6)
(n=6)
(n=6)
Vaginal lubrication (mg)
0.66 ± 0.39
2.65 ± 1.38
0.40 ± 0.29
2.4 ± 1.6
Condition vs. control, p
-
0.009
ns (0.18)
0.004
Table III. Impact of sildenafil and of 7-nitroindazole, a potent inhibitor of the neuronal
isoform of nitric oxide synthase, on vaginal lubrication in ovariectomized mice.
*
: Received the two vehicles (saline and peanut oil)
Control*
sildenafil
7NI
7NI + sildenafil
Vaginal lubrication (mg)
0.33 ± 0.14
3.21 ± 0.85
0.31 ± 0.33
3.8  0.3
Condition vs. control, p
-
0.0022
ns (0.18)
0.002
126
Figure 1: A: Masson’s trichome stain showing an atrophy of the different layer wall of the
vagina in ovariectomized mice as compared to sham-operated animals.
B: Box-and-whisker distribution of epithelium and muscularis thickness of vagina wall (6
mice per group). The box part covers the interquartile range (25–75% of all observations), and
the whiskers represent minimum and maximum values.
Statistically significant decreases (**: P < 0.01) are shown in muscularis and epithelium of
ovariectomized compared to sham-operated animals.
127
Figure 2: A: H&E sagittal section of the genitourinary tract in a 12-week old sham-operated
mouse (Magnification X 4). Open circle indicates the vaginal cul-de-sac. B: Representative
sections of the vaginal cul-de-sac in sham-operated (a&c) and ovariectomized (b&d) animals
(Magnification X 100). Adjacent sections were stained with standard H&E (a&b) or Masson
Trichrome (c&d). As shown by purple stain, mucine secretion was observed only in shamoperated animals.
Figure 3: Lubrication effect per vagina wet weight in relation to hormonal status, nNOS
inhibition (+7-NI) and PDE-5 inhibition (+sildenafil). Note the use for Yaxis of semilogarithmic scale. A: Sham-operated animals, B: Ovariectomized animals.
128
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131
Discussion et perspectives
132
Effets des taux gestationnels d’œstradiol sur la fonction et
la morphologie du bas appareil urinaire et sur l’expression
uréthrale de la nNOS.
Dans ce travail, nous avons confirmé l'influence de l’œstradiol sur le tonus uréthral et
avons montré pour la première fois que cette dernière était liée à des variations de l'activité et
de l'expression locale de la nNOS, comme cela a déjà été rapporté dans d'autres organes cibles
(4). Contrairement aux souris ayant eu une simulation d’ovariectomie et aux souris
ovariectomisées chez lesquelles l'inhibition aiguë de la nNOS était responsable d’une
augmentation des résistances uréthrales, l'inhibition de la nNOS n'avait aucun effet sur les
résistances chroniquement élevées observées chez les souris traitées par œstradiol. De plus, la
structure de la vessie appréciée par l’analyse d'image et son poids, était chez ces animaux
significativement modifiée. En revanche, aucune différence entre les différents groupes n'a été
observée au niveau de la paroi uréthrale, suggérant que l’augmentation des résistances
uréthrales induites par l’œstradiol n’était pas secondaire à des changements structurels. En
évaluant l'expression de la nNOS en fonction de l’ambiance œstrogénique, nous avons mis en
évidence la diminution significative dans l'urèthre de l'expression de la nNOS chez des
animaux traités par œstradiol et, à l’inverse, son importante augmentation chez les animaux
ovariectomisés.
Ce mécanisme explique l’augmentation physiologique du tonus uréthral et l’absence
relative
d’incontinence urinaire d’effort pendant la grossesse (227) et suggère un effet
bénéfique des œstrogènes dans l’incontinence postménopausique. Cependant, il apparait que
pour avoir un effet clinique sur le tonus uréthral, la supplémentation en œstradiol doit
permettre d’obtenir des taux gestationnels au niveau de l’urèthre. De tels taux pourraient être
obtenus par une administration transvaginale, qui comme l’a montré une revue de la Cochrane
Library ayant inclus 16 essais comprenant 2,129 femmes a un effet positif, sans effets
secondaires, sur la sécheresse et l’atrophie vaginale (444). Une autre voie serait de recourir à
133
des SERMs, développés pour reproduire certains mais pas tous les effets de l’œstradiol.
L'identification de nombreux coactivateurs et corépresseurs modulant la fonction des
récepteurs et la production de deux sous-types de récepteurs aux œstrogènes attestent de la
complexité potentielle avec laquelle les SERMs peuvent produire des réponses spécifiques
dans divers tissus (445). Contrairement à leurs effets sur le métabolisme osseux, les SERMs
ne semblent pas avoir un effet de classe sur le bas appareil urinaire (446) et les modèles
animaux que nous rapportons pourraient être d’une grande utilité dans le développement
préclinique d’"uroSERM", conçus pour profiter de la modulation du tonus urétral par les
œstrogènes.
Impact du sildénafil, inhibiteur spécifique de la
phosphodiestérase de type V, sur le tonus uréthral en
fonction du statut œstrogénique
Dans la deuxième partie de notre travail, nous montrons qu’indépendamment du statut
œstrogénique, l’inhibition de la phosphodiestérase de type V par le sildénafil induit une
profonde diminution (10 fois) des résistances uréthrales, sans modification du comportement
mictionnel, et pour la première fois que cet effet passe par la voie de l’isoforme neuronale de
la NOS. Ces résultats confirment le rôle clé des PDE-5 dans le contrôle du tonus musculaire
lisse de l’urèthre féminin. De plus, l’augmentation du tonus uréthral et la complète abolition
de la relaxation induite par le sildenafil par un puissant inhibiteur sélectif de la nNOS (7-NI)
confirme que le principal isoforme impliqué dans la régulation du tonus uréthral féminin est la
nNOS.
La possibilité de renforcer l’effet relaxant uréthral du NO produit par la nNOS en inhibant sa
dégradation par la PDE5 indique, qu’à l’instar de chez l’homme (447), les IPDE-5 constituent
une cible prometteuse dans le traitement de certains troubles du bas appareil urinaire de la
femme tels que l’obstruction sous-vésicale fonctionnelle et ce quel que soit le statut hormonal.
134
Aujourd’hui, un seul essai contrôlé a été réalisé et montrait un effet comparable du sildénafil
par rapport au placebo. Cependant, il s’agissait d’un modèle particulier de pathologie du
sphincter externe de l’urèthre avec retentissement sur l’afférence vésicale: le désordre
primaire de la relaxation sphinctérienne ou syndrome de Fowler (448). Nos résultats plaident
pour la mise en place d’essais évaluant le sildénafil dans le traitement des autres causes
d’obstruction sous-vésicale de la femme.
Impact du sildénafil, sur la lubrification vaginale en
fonction du statut œstrogénique
Dans la troisième partie de notre travail, nous montrons qu’indépendamment du statut
œstrogénique, l’inhibition de la PDE-5 par le sildénafil augmente la lubrification vaginale et
pour la première fois que cet effet est indépendant de la voie de l’isoforme neuronale de la
NOS et est plus prononcé chez l’animal ovariectomisé.
L’abolition de toute lubrification vaginale après stimulation cervico-vaginale en présence
d’un puissant inhibiteur non spécifique des NOS (L-MMA) confirme le rôle central du NO.
En revanche, la persistance de lubrification en présence d’un puissant inhibiteur sélectif de la
nNOS (7-NI) montre que cet effet passe soit par la eNOS soit par la iNOS.
Les souris ovariectomisées ont une diminution de la lubrification vaginale par comparaison
aux souris ayant eu une simulation d’ovariectomie. Cependant, en prenant en compte la
présence d’une atrophie marquée comme mis en évidence par histomorphométrie,
l’augmentation de la lubrification par gramme de vagin est trois fois supérieure après
ovariectomie par rapport aux souris ayant eu une simulation d’ovariectomie.
Alors que la plupart des études rapportées à ce jour évaluant la fonction sexuelle utilisent des
méthodes invasives telles que la stimulation des nerfs pelviens, nous avons développé ici un
modèle de stimulation cervico-vaginale. Ce dernier permettra de réaliser des études
135
longitudinales évaluant différents modulateurs pharmacologiques chez de petits animaux tels
que des souris transgéniques par exemple.
La facilitation de la lubrification vaginale par les IPDE-5 indépendamment du statut
œstrogénique indique qu’ils pourraient constituer un traitement des dysfonctions sexuelles
féminines à type de sécheresse vaginale ou de dyspareunie et ce quel que soit la période de la
vie génitale féminine. Des essais évaluant l’effet des IPDE-5 sur la lubrification vaginale et
sur le traitement des conséquences de l’atrophie vulvo-vaginale après la ménopause devront
être mis en place. De même, l’administration locale de NO pourrait être envisagé au travers de
microparticules ou de gels libérant du NO (449) (450).
Enfin comme les eNOS et iNOS sont sous contrôle des œstrogènes (451, 452), la réponse la
plus logique dans le traitement de l’inconfort vaginal post-ménopausique serait le traitement
hormonal substitutif. Cependant les controverses actuelles concernant ce dernier en limitent
aujourd’hui l’utilisation. Une nouvelle voie serait l’emploi soit de SERM tels qu’un SERM de
troisième génération comme le lasoxifène soit de l’œstrogène fœtal naturel, l’estetrol. Une
évaluation préclinique sur le modèle de stimulation cervico-vaginale développé permettra de
déterminer leur impact sur la lubrification vaginale.
136
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Auteur : Xavier GAME
Titre : Régulation par les œstrogènes du contrôle nitrergique du bas appareil urinaire
RESUME
Chez la femme, la prévalence des symptômes du bas appareil urinaire varie en fonction de la
vie hormonale. Ils sont ainsi plus fréquents pendant la grossesse et après la ménopause. Le
monoxyde d’azote est un médiateur endogène ubiquitaire produit par la monoxyde d’azote
synthase (NOS) dont l’expression est modulée par l’œstradiol au niveau du système nerveux.
Nous montrons que l’œstradiol module également l’expression de l’isoforme neuronale de la
NOS au niveau uréthral. Alors qu’après castration, elle est augmentée, le traitement au long
cours avec des doses gestationnelles d’œstradiol augmente le tonus uréthral et diminue
l'expression de l’isoforme neuronale de la NOS (nNOS) à ce niveau. Nous montrons
également que le sildénafil diminue les résistances uréthrales et ce quel que soit le statut
hormonal et que cet effet passe par la voie de la nNOS. Enfin, nous montrons
qu’indépendamment du statut hormonal, le sildénafil augmente la lubrification vaginale et
que cet effet est nNOS indépendant.
Ces travaux expliquent l’augmentation physiologique du tonus uréthral pendant la grossesse,
suggèrent un effet bénéfique de la délivrance locale d'œstrogènes à doses gestationnelles ou
d’uroSERM dans le traitement de l’incontinence urinaire postménopausique et que, quel que
soit le statut hormonal, le sildénafil pourrait être envisagé comme traitement chez la femme
d’une obstruction sous-vésicale fonctionnelle et comme traitement des troubles de la
lubrification vaginale.
ABSTRACT
In women, the prevalence of lower urinary tract symptoms changes with hormonal life.
Therefore, they are more common during pregnancy and after menopause. Nitric oxide is a
ubiquitous transmitter produced by nitric oxide synthase (NOS) whose expression in the
central nervous system is modulated by estradiol. We show that estradiol modulates NOS
neuronal isoform (nNOS) expression in the urethra. While it is increased after castration,
supraestrus levels of estradiol increase urethral tone and decrease nNOS expression in the
urethra. We also show that sildenafil decreases urethral resistances irrespective of hormonal
status and that this effect depends on the nNOS pathway. Finally, we show that, irrespective
of the hormonal status, sildenafil increases vaginal lubrication in a nNOS independent
manner.
These works explain the physiological increase of urethral tone during pregnancy, suggest a
positive effect of supraestrus doses of estradiol or UroSERM as post-menopausal urinary
incontinence treatments and that sildenafil may be considered as a treatment for functional
bladder outlet obstruction in women and vaginal lubrication disorders, irrespective of
hormonal status.
Mots clés: Œstrogène, Monoxyde d’azote, Phosphodiestérase de type V, urèthre, vagin