3. Cinétique enzymatique

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3. Cinétique enzymatique
3.1 Introduction aux enzymes
Une enzyme est un catalyseur biologique qui augmente la vitesse d’une
réaction par plusieurs ordres de grandeur en diminuant son énergie libre
d’activation, sans être elle-même affectée.
Certains enzymes sont extrêmement spécifiques et ne fonctionneront
que sur un seul et unique réactif (substrat); d'autres ont un large spectre
et fonctionnent sur une structure partagée par de nombreuses molécules
qui peuvent toutes lui servir de substrat.
Une enzyme agit comme catalyseur en se liant au substrat et facilite sa
réaction en stabilisant son état de transition vers un produit spécifique:
La majorité des enzymes sont des protéines ou des glycoprotéines.
Les sites actifs des enzymes contiennent souvent des composantes
chimiques (organiques ou inorganiques), autres que des acides aminés
(ex. Fe2+, Mn2+, Zn2+ ou Mg2+, biotine, vitamines B), qui sont essentielles
pour l’activité catalytique.
Substrat(s) enzyme
⎯ → ⎯ ⎯ ⎯ Produit(s)
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La partie protéique d’une enzyme est l’apoenzyme et la partie non protéique
est le cofacteur ou la coenzyme:
Haloenzyme = apoenzyme + cofacteur
Les cofacteurs ou coenzymes se lient de façon transitoire à l’apoenzyme. Un
groupement prosthétique - cofacteur lié de façon covalente à l’enzyme.
Par exemple, l’oxydase d’acide D-aminé catalyse la réaction suivante:
Cette enzyme monomère est constituée d’un apoenzyme polypeptidique
et d’une coenzyme rédox, le dinucléotide d’adénine flavine (FAD),
qui est lié de manière non-covalente à l’apoenzyme
(constante d’association de 3.6 x 10-6 M):
Enzyme(FAD) + Substrat Enzyme(FADH2) + Produit
Enzyme(FADH2) + O2Enzyme(FAD) + H2O2
Réaction nette: Substrat + O2 Produit
+ H2O2
+H3N-CH(R)-COO- + O2 + H2O
ox
y
dase d
'
a
c
i
de
D-aminé R-CO-COO- + H2O2 + NH4+
N
N
N
HN CH3
O
O
CH3
HH
HO H
HO H
HO H
OH2C
PO
O-
OP
O
O-
H2CO
N
NN
N
NH2
O
OH OH
HH
HH

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Selon les réactions catalysées, les enzymes peuvent être classées dans
six grandes catégories:
1. Oxydoréductases- qui catalysent des transferts d'électrons et de
protons d’un donneur à un accepteur
2. Transférases- qui catalysent les transferts de groupements
3. Hydrolases- qui catalysent des réactions d'hydrolyse (coupure des
liens C-C, C-O, C-N et autres par de l’eau)
4. Lyases- qui catalysent l'addition de groupes à des liens
doubles ou l'inverse
5. Isomérases- qui catalysent le transfert de groupes dans
une même molécule pour produire des formes isomères
(ex. conversion d'un acide aminé L en acide aminé D)
6. Ligases- qui forment des liens C-C, C-S, C-O et C-N lors de
réactions de condensation couplées à l'utilisation d'ATP
Classification des enzymes
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Nomenclature
Chaque enzyme est assignée un code à quatre chiffres par
la Commission des Enzymes (EC) de l’union International de
Biochimie de Biochimie Moléculaire:
Nom de l’enzyme (EC W.X.Y.Z)
EC- système numérique de la commission des enzymes
W- indique la réaction catalysée (1-6)
X- indique le substrat général (ou groupe de substrats) impliqué
Y- indique le substrat spécifique ou la coenzyme
Z- le numéro de série de l’enzyme
Ex. oxydase de glucose EC 1.1.3.4

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Il est difficile de mesurer la quantité d’enzyme en unités de masse
ou de concentration molaire; l’activité enzymatique est défini en
terme de vitesse de réaction.
L’unité international (I.U.) est le montant d’enzyme requis
pour convertir 1-µmol de substrat en produit dans 1 min à
une température et pH spécifiés (ex. pH 7.0 et 25°C) et sous
des conditions de saturation du substrat:
I.U. = 1-µmol substrat consommé/min
L’activité spécifique d’une enzyme est l’activité catalytique par
unité de masse de protéine (I.U./mg d’enzyme solide)
Le taux de roulement (« turnover number » en anglais) exprime
l’activité catalytique en terme d’unités par mol d’enzyme pure (au
lieu de mg de protéine).
Définition de l’activité enzymatique
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Détection et quantification des enzymes:
- Des taux anormaux d’enzymes dans le plasma sanguin
indiquent des problèmes métaboliques.
- Les essais enzymatiques sont des méthodes efficaces pour
évaluer la qualité des aliments et pour vérifier l’efficacité des
processus de stérilisation et de pasteurisation.
Applications analytiques:
- essais immuno-enzymatiques, électrodes à enzymes, enzymes
immobilisées
- Les enzymes constituent des outils analytiques importants; elles
offrent des méthodes sensibles et sélectives pour l’identification et
quantification des biomolécules (substrats, activateurs, inhibiteurs),
ainsi qu’une amplification catalytique de l’analyte.
3.2 Les enzymes en chimie bioanalytique

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3.3 Nature du site actif
Le «site actif» d’une enzyme est la région tridimensionnelle qui se lie
au substrat.
Les sites actifs sont des cavités de caractère non polaire et dans
lesquelles les substrats s’insèrent. L’eau est normalement exclut du
site actif lorsque le substrat est lié, sauf si elle est un réactif.
Le site actif consiste d'au moins deux parties fonctionnelles, qui
peuvent ou non être voisines sur la chaîne polypeptidique
(si non, la structure tertiaire les amène près l'une de l'autre):
-le site de reconnaissance du substrat est constitué de certains
acides aminés qui sont associés avec l’orientation du substrat, et
donc, avec la spécificité de l’enzyme
-le site catalytique est constitué des résidus qui sont directement
impliqués dans la formation et rupture des liens chimiques. Ces
résidus sont souvent localisés dans le fond de la cavité, et dans la
majorité des cas, possèdent des chaînes latérales ioniques ou
réactives (ex. His, Lys, Cys, Ser, Asp, Glu).
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Deux modèles pour expliquer la spécificité des enzymes:
Clé-serrure: la forme du site actif est complémentaire à celle du
substrat
Forme induite: l’enzyme change sa conformation lors de la
liaison du substrat.
Substrat
+
Enzyme
abcComplexe
enzyme-substrat
Enzyme
abc
Substrat
+
Complexe
enzyme-substrat

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3.4 Nature des interactions substrat-enzyme
Les substrats sont liés aux enzymes par des interactions faibles:
constantes d’association de 10-2 à10
-8 M et ∆Gd’interaction
entre -3 et -12 kcal/mol (vs. -50 à -110 kcal/mol pour des liens
covalents).
La liaison du substrat au site actif implique souvent de nombreuses
liaisons non-covalentes de types
-van der Waals
-électrostatiques
-ponts hydrogènes
Ces 3 types de liaisons non-covalentes diffèrent dans leurs
contraintes géométrique, force et spécificité. De plus, elles sont
profondément affectées (de manière différente) par la présence
d’eau.
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Interactions électrostatiques
La force d’une interaction électro-
statique est donnée par la loi de
Coulomb: F= q1q2/r2D. Une interaction
électrostatique est plus forte dans le
vide (où D=1) et plus faible dans l’eau
(où D=80).
Un substrat chargé négativement peut
former un lien électrostatique avec la
chaîne latérale des résidus Lys, Arg et
His, ainsi qu’avec l’amine terminale
d’une chaîne polypeptidique si, dûs à
leurs pKa’s, ces groupements sont
chargés positivement au pH du milieu.
Un substrat chargé positivement peut
interagir avec les résidus Asp et Glu,
ainsi qu’avec un carboxylate terminal.
+
-
+O
H
H
O
H
H
OHH
-
OHH
O
H
H
OH
H
environnement
non-polaire
milieu
aqueux