Cours 6

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Partie 3
11 et 12.3.09
Rappels cours 2: régulation de la dorsalisation au
stade blastula et gastrula par des facteurs de
croissance
famille FGF
Facteur de croissance
Facteur de transcription
Facteurs cytoplasmiques
famille TGFβ
Vg1: +
Activine A: +/Nodal: +
Wnt: + Dsh – GSK3 – β-caténine – siamois
Noggin - chordin
BMP: + smad
Effet antagoniste de facteurs dorsalisants (chordin, noggin)
et de facteurs ventralisants (BMP4)
fécondation
1
2
segmentation
3
gastrulation
4
neurulation
et
organogenèse
6 - Organogenèse
6.1. L’ectoderme produit l’épiderme et
le système nerveux
Rappel: au cours de la neurulation se différencient
l’épiderme et le tube neural à partir de l’ectoderme
En fin de neurulation: épiderme constitué d’une
couche de cellules = épithélium unistratifié
périderme
Épithélium unistratifié
couche germinative
Plus tard au cours du développement se forment les
glandes cutanées (invaginations de l’épiderme)
¾ Glandes acineuses (produisent en surface un
mucus protecteur)
Formation des placodes: les principales sont
¾Adénohypophysaire
¾Olfactives
¾Cristalliniennes
¾Otiques
Le système nerveux dérive d’un tube creux
Organogenèse selon l’axe antéro-postérieur:
Région antérieure
tube neural > vésicules cérébrales
Région intermédiaire et postérieure
tube neural > moelle épinière
6.2. Organogenèse du mésoderme
Le feuillet moyen, le mésoderme, se trouve
entre l’ectoderme et l’endoderme au cours de
la gastrulation
L’organogenèse du mésoderme s’amorce
pendant la neurulation
Mésoderme
Région antérieure:
Mésenchyme céphalique
> tissu conjonctif et muscles de la face
Sur l’axe dorsal antérieur – postérieur:
mésoderme somitique
> tissu conjonctif, os, cartilage, derme, muscles
Mésoderme des pièces intermédiaires
> Système urinaire et conduits génitaux
Mésoderme des lames latérales
> Système vasculaire, cœur, cellules sanguines, parois des
cavités coelomiques, composants des membres (sauf
muscles)
Stage bourgeon caudal
Axe dorso-ventral
Coupe transversale
La chorde forme l’axe A-P de l’embryon et
« dirige » l’organogenèse
Chorde: axe antéro-postérieur (AP)
C’est autour de la chorde, qui disparaîtra,
que vont s’assembler les vertèbres
Les somites contribuent à la formation du squelette,
des muscles et du derme
Mésoderme paraxial sur toute la
longueur de l’embryon
Formation des somites?
Où l’on retrouve des facteurs connus…!
Chordin et noggin
Expérience
Incubation de noggin ou (chordin + FGF) avec calottes
animales > marqueurs de différenciation neurale
Antagonisme d’action par BMP4
Mésoderme somitique
> > > Migration
¾ cellules du tissu conjonctif
¾ cellules germinales
Sécrétion d’une protéine, sonic hedgehog, dont l’expression
augmente au cours de la neurulation
¾ Maintien de la polarité dorso-ventrale
Action antagoniste des BMP
Formation des somites A > P
Chaque somite est une entité structurale autonome
Dermatome > derme
Myotome > cellules musculaires
Sclérotome > cellules à l’origine des vertèbres
6.3. Le développement des muscles squelettiques
Principes généraux
Pour tous les tissus, c’est toujours la même séquence: phase
de prolifération suivie d’une phase de différenciation
cellules des myotomes
Prolifération
myoblastes
myocytes
Différenciation
fusion cellulaire
myotubes
myofibrilles
contractiles
association de myotubes
et connexions nerveuses
myotube
myocytes
Cellule satellite
myoblastes
prolifération
différenciation
Après fusion cellulaire, plusieurs noyaux par cellule (myotube)
Absence de centrioles dans les myotubes, réorganisation du
matériel péricentriolaire autour du noyau
Myoblastes en culture
DAPI
TUBULINE
ALP (α-Actinin associated Lim Protein)
myotubes
myoblastes
Myofibrille
La jonction neuromusculaire
En cas d’altérations, renouvellement par prolifération et
différenciation des cellules satellites
A la périphérie des muscles, cellules non différenciées, capables de
prolifération et de différenciation, les cellules satellites
Quels sont les signaux proliférateurs ?
Le FGF stimule la prolifération des myoblastes
FGF > transduction de signaux > réplication ADN
Entrée des myoblastes en différenciation:
disparition des récepteurs FGF
Stratégie: montrer que le facteur de croissance est
capable de favoriser la croissance de cellules
musculaires.
Exemple: FGF6 (Fibroblast Growth Factor 6)
Expérience
Etudier l’effet de FGF6 sur la lignée cellulaire musculaire
C2C12 (qui ne l’exprime par normalement)
Comment ? on fait s’exprimer FGF6 dans la lignée C2C12
en transfectant (en introduisant dans les cellules) le gène
codant pour FGF6
Résultat: nouvelle lignée cellulaire, C2CF6
On vérifie que les cellules de la lignée C2CF6 produisent
bien du FGF6: mesure de FGF6 dans le milieu de
culture des cellules (Western blot)
Analyse morphologique des cellules
J3
J3
C2C12
C2CF6
Interprétation: Quand FGF6 est synthétisé, la prolifération se poursuit.
Pas de différenciation.
J7
J7
C2C12
C2CF6
FGF6 stimule la synthèse de
MDR1 (MultiDrug Resistance Protein 1)
MDR1 est un transporteur de la famille
ABC (ATP-Binding Cassette)
Protéine membranaire de 1280 aa
Hydrolyse l’ATP et régule l’entrée de molécules dans la cellule
Le rôle physiologique de MDR1 n’est pas clairement
identifié !
Hypothèse: la protéine membranaire pourrait protéger les
cellules de l’apoptose (mort cellulaire programmée)
Conséquence: maintien de la prolifération des cellules
Les marqueurs de différenciation musculaire
Rôle de la matrice extra-cellulaire
Sécrétion de fibronectine par les myoblastes
en différenciation
Fibronectine > Récepteur α5β1 > myoblaste
Cette liaison est indispensable à la différenciation
des myoblastes
Expression de facteurs de transcription spécifiques
myotube
myocytes
Cellule satellite
myoblastes
pax7
pax3
myf5
myoD
myogenin
MRF4
Conclusion: expression séquentielle de facteurs
de transcription
pax7 semble être le premier exprimé
puis pax3, myf5 et myoD (pax7 toujours exprimé)
puis myogenin et MRF4
Pax7 est exprimé très précocement au cours de la régénération chez
l’amphibien
PCNA
DAPI
pax7
Revenons aux expériences sur lignées cellulaires…
Expérience 1
C2C12: lignée musculaire
C2CF6: transfection de FGF6 dans la lignée C2C12
Question: expression comparée de myoD et myf5 ?
Expression de…
Marqueurs de différenciation: les ARNm de MyoD et Myf5 sont faiblement
exprimés dans les cellules C2CF6 comparativement aux cellules C2C12
Expérience 2
Incubation des cellules C2CF6 avec un inhibiteur de FGF6 (SU5402)
Western blot: comparer l’expression
de trois marqueurs de différenciation
dans la lignée C2C12, C2CF6 et
C2CF6 + SU5402
Interprétation:
En présence de SU5402, les cellules
expriment MyoD et Myogénine
De plus, l’observation des cellules de la lignée
C2CF6 + SU5402 montre la présence de myotubes
Conclusion: corrélation « in vitro » entre expression
de MyoD et myogenin et la différenciation musculaire
pax7
Chez les souris mutantes pax7 -/-
Le nombre de cellules satellites décroît rapidement après
la naissance
La régénération du muscle est déficiente chez les souris
adultes
Expérience
Expression de 2 marqueurs de différenciation, myogénine
et myf5, dans des souris transgéniques
L’expression de myogénine et de myf5 dépend d’une
signalisation noggin
Souris sauvages: +
Souris mutante noggin -/Souris mutante noggin -/- et possédant une seule copie
du gène bmp4 (bmp4+/-)
Conclusion
Localisation précoce, au niveau des somites, de
myf5 et myogénine
En absence de noggin, pas d’expression de facteurs de
transcription spécifiques de la différenciation musculaire
Dans les « double mutants » (absence de noggin
et présence partielle de BMP4): expression de
myf5 et expression faible de myogénine
Expression de gènes spécifiques des cellules musculaires
Protéines de structure:
- actine musculaire
- autres protéines contractiles
exemple: myosine, tropomyosine
- protéines de filaments intermédiaires:
desmine, vimentine
Enzymes:
- exemple: créatine phosphokinases spécifiques
Expression de marqueurs de différenciation musculaire
tropomyosine
Plusieurs gènes codant pour des actines de fonction spécifique
Expression d’une protéine cytoplasmique spécifique
La tropomyosine, un marqueur
de différenciation musculaire
(coupes de bourgeon caudal,
stade 54)
Hybridation in situ
(localisation de l’ARNm)
6.4. Application
Réparation de muscles déficients chez l’adulte
(thérapie cellulaire régénérative)
Biopsie
Extraction
Réparation
Sélection & amplification
Injection
Décongélation
Congélation
Contrôle qualité
CELOGOS
Vers le développement d’une médecine cellulaire?
- Spécificité
- Absence de toxicité (effets secondaires)
- Cellules souches adultes?
(exemple des cellules musculaires)
- Cellules souches embryonnaires?
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