Les protéines

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Molécules de la vie
Les protéines
En moyenne, dans les cellules eucaryotes, les protéines occupent 58% du poids sec.
Rôle :
•
•
Structural (matériaux intelligent)
Fonctionnel (nanomachine)
Les acides aminés
Ionisation
Si le pH est à 2,5, on aura 50% de chaque forme :
H 3 N −CH −COOH / H 3 N −CHR−COO−
A pH très acide, acide aminé chargé positivement.
A pH neutre, acide aminé neutre
Si le pH est basique, on aura la forme basique majoritaire du couple :
H 3 N −CHR−COO− / H 2 N −CHR−COO−
La liaison peptidique
C terminal
N Terminal
N terminal
La lecture se fait toujours dans le sens N terminal/C terminal.
Géométrie de la liaison peptidique
Possibilité de résonance, ce qui changer la « mobilité » de la molécule. L'électron libre du N de la liaison peptidique
peut se délocaliser, mettant une charge + sur le N et une charge – sur le O.
+
Hybride de résonance
Chaîne principale/chaîne latérale : structure primaire
Chaines Latérales
Chaine Principale
Seule la chaîne latérale est variable d'une protéine à un autre. La chaîne principale reste invariable.
Les différents acides aminés
On peut les ranger dans des sous catégories :
• Hydrophobes
• Chargés (à pH physiologique)
• Polaires
Hydrophobes :
Alanine
Valine
Leucine
Isoleucine
Augmentation de l'encombrement Stérique
Proline
Phenylalanine
Triptophane
Méthionine
(bloque la libre rotation
de la protéine du fait de
sa conformation)
Chargés Positivement
Lysine
Arginine
Histidine
Chargés Négativements
Acide Aspartique
(pKa = 4,5)
Acide Glutamique (pKa = 5
Autres Acides aminés
Glycine (seul acide aminé à ne
pas avoir un carbone asymétrique)
Pont Disulfure (intrachaîne pour
Cystéine (très présent dans les protéine
stabiliser la protéine ou interchaînes,
pour lier deux protéines)
pour sa capacité à créer des ponts disulfures)
Acides aminés polaires avec fonction alcool
Thréonine
Sérine
Asparagine
Glutamine
Tyrosine
La structure des protéines
I] Les différents niveaux de structure des protéine
Structure primaire : Ordre ou séquence des acides aminés
Structure secondaire : conformations régulièrement répétées de la chaine polypeptidique, soit en hélice α, ou en
feuillets plissés β (dues aux interaction de Van der Waals, et liaison hydrogène)
Structure tertiaire : Conformation tridimensionnelle de la protéine comprenant souvent des domaines
indépendamment repliés.
Structure quaternaire : assemblage de chaines synthétisées séparément en protéines oligomériques
Structure primaire :
Polypeptide très simple, qui n'a ni ne structure secondaire, ni tertiaire.
Pareil pour le glutathion (tripeptide antioxydant).
Structure secondaire :
Le repliement des protéines est essentiellement due aux interactions électrostatiques, ici
des liaisons hydrogènes (possible également avec des liaisons Van der Waals).
Hélice α :
Les chaînes latérales sont toujours pointées vers l'extérieur
Il n'y a pas de nombre fixe d'acide aminés présent dans un tour
d'hélice (3,6 environ par tour)
Un acide aminé tous les 100°, et environ 0,15nm
Les hélice α droite sont plus stables (et donc plus fréquentes) que
les hélices α gauche (moyen mnémotechnique : main fermée,
pouce orienté vers C-terminal. Si la main droite enroule bien,
hélice α droite, sinon α gauche)
Les hélices peuvent être distordue (courbé) à cause du solvant
Il existe des acides aminés 310 : 3 résidus par tour d'hélice, et
10 atomes autour d'un anneau formé par un pont hydrogène.
α-kératine (dans les phanères) : les hélices s'associent en
superhélice, protofibrille, microfibrille, macrofibrille... La
richesse en pont disulfure donne sa rigidité.
•
•
•
•
•
•
•
Structure β :
•
•
•
Feuillet stabilisé par des liaisons hydrogènes
Les chaines latérales pointent au dessus, ou en dessous du
feuillet
Les feuillets anti-parallèles sont plus stables que les feuillets
parallèles.
•
•
Les feuillet peuvent être distordus aussi (twisted)
Dans le cas d'un feuillet β anti-parallèle, on regarde les
endroits de boucle
•
On peut trouver ces feuillets dans la soie des vers, ou dans
la toile d'araignée (qui est largement plus résistante que
l'acier!)
Structure tertiaire :
Elle conditionne l'activité d'une protéine (exemple de l'interleukine et de son récepteur, sont complémentaires grâce à
leur structure tertiaires)
Structure quaternaire :
•
Mécanisme du repliement
Assemblage de plusieurs sous-unités pour former une supermolécule
Toute l'information pour le repliement de la protéine est contenue dans sa structure. Pour le montrer, le prix Nobel
Afinsen a montré qu'après avoir dénaturé une protéine, celle-ci se remet en forme seule.
Pour dénaturer une protéine on peut :
• Modifier le pH
• Chauffer la protéine
• Utiliser des dénaturants :
▪ Sels : se dissocient en paires d'ions, ce qui déstabilise les liaisons ioniques
▪ Les détergents : molécules amphiphiles, dont les chaînes hydrophobes recouvrent la chaîne latérale, et
sa partie chargé se tourne vers l'eau. La protéine est stabilisé sous forme dénaturée (et s'il y en a, les
sous unités sont dissociées
•
•
Les compétiteurs de liaisons hydrogènes : empêchera la protéine de se stabiliser avec des liaisons hydrogènes
Les oxydants et réducteurs : un
agent réducteur pourra réduire les
ponts disulfures
Chaque acide aminé peut prendre plusieurs
conformations. Ainsi 300 acides aminés qui
pourraient
prendre
3
conformation
143
donneraient 10
possibilités.
Actuellement, les données sont en faveur d'un processus de repliement contrôlé thermodynamiquement : la bonne
conformation est celle de plus basses énergie : elle ne va pas tester toutes les conformation, mais se diriger vers l'état de
plus grande stabilité.
Méthode d'études des protéines
Techniques de purification
Echantillon
Biologique
Homogénat
Homogénéisation
Protéine
Purification
Homogénéisation : il faut briser les cellules et en extraire le contenu
• Un tampon de lyse bien choisi (pour ne pas dénaturer l'homogénat). Il faut faire attention à :
◦ L'isotonicité du tampon (concentration en sels identique à celle de la cellule), pour ne pas perturber les
liaisons ioniques
◦ pH (pour ne pas modifier les charges des acides aminés, et si le pH est trop bas, les protéases deviendront
actives, et détruiront la protéine d'intérêt,
◦ Oxydation, qui favorise la formation de pont disulfures. On utilise donc des agents réducteurs.
◦ Protéases présents, on utilise donc des Anti-protéases pour empêcher le contenu des lysosomes de
dégrader les protéines, on fait attention au pH, et on garde l'échantillon au frais [facteur cinétique].
•
On mixe l'échantillon pour séparer les cellules les unes des autres
•
On brise les cellules
◦ Manière douce :
▪ Choc osmotique : en mettant autour de la cellule soit une eau pure sans sel, ou une solution saline très
concentré. Par osmose, la cellule explose. Marche seulement sur des cellules faibles (pas bactéries), et
il y a problème pour conserver l'isotonicité donc ne marche pas pour les protéines cytosoliques.
▪
▪
▪
◦
Les détergents : Il rentre dans la membrane lipidique, la détruisent, et ils en
font des micelles
Le dounce et le potter : Le cylindre fait la taille du dounce ou du potter. Du
coup, on met les cellules dedans, et en se coinçant entre le cylindre et les
dounce ou potter, les membranes sont arrachées.
Les Enzymes lytiques : avec certaines cellules (bactéries, ou plantes), les
cellules sont protégées par des couches glucidiques, qu'il faut casser avec de
enzymes lytiques avant de pouvoir arriver à la membrane.
La manière forte
▪ French press : sorte de pompe, qui comprime une chambre (jusqu'à 1000 atmosphère). D'un coup, on
ouvre un robinet, créant un gros dépressurisation, qui fait exploser les bactéries.
▪ Bombe à disruption : l'échantillon est traité avec de l'azote à haute pression qui se liquéfie. On
modifie la pression, l'azote s'expand, faisant exploser les bactéries.
▪ Bead beater : Une mixer fait tourner des billes, qui se percutent, et percutent les parois. Les cellules
entre explosent
▪ Sonication : On met des ultrasons dans la solution, ce qui créent des bulles, qui font des ondes de
choc, et brisent les cellules.
Purification :
•
Séparation par la taille (en fonction des organistes où se trouvent la protéines d'intérêt) :
◦ Centrifugation : qui par la force centrifuge qui sépare en fonction de la taille (plus le
compartiment est gros, plus il descendra dans le tube)
◦
Dialyse : Boudin percé de trous de taille définis.
◦
Gel filtration : Les billes dans le gel possèdent des
trous de tailles croissante au fur et à mesure qu'on
descend. Ainsi, les petites protéines ressortent en
dernier parce qu'elles rentrent dans toutes les billes, et
donc perdent du temps. Plus les molécules sont
grosses, plus elles ressortent vite. Cette technique
permet de séparer toutes les protéines en fonction de
leur taille. On parle en volume (ex : volume
d'exclusion : volume qui ne prend pas en compte les
billes. Volume total, qui comprend en plus le volume
de toutes les billes). On peut identifier la taille d'une
protéine en fonction d'une droite étalon.
•
Séparation par la charge
◦ Colonnes échangeuses d'ions : Une colonne avec des billes chargés, qui retiennent les protéines chargés
opposément. Si elle est chargé positivement, elle capte les anions : C'est une échangeuse d'anion. Pour
décrocher ensuite la protéine chargé, on utilise un contre-ion (sel par exemple), qui prend la place de la
protéine. En utilisant une courbe étalon aussi, on peut identifier la protéine : si elle est échangé par le sel
facilement, elle est peu chargé, donc elle redescend en premier.
•
Chromatographie d'affinité : On accroche des ligands sur les billes (glucose par exemple). Les seuls
protéines qui s'accrochent sont spécifiques au glucose. Pour le séparer, on insère du glucose libre, qui va faire
compétition au glucose greffé.
Le but de ces méthodes analytique permet d'avoir une idée de la quantité et la qualité
des protéines purifiées.
• On peut les quantifier précisément avec la spectrophotométrie (les acides
aminés qui absorbent possèdent un noyau benzénique : trp tyr, phe), car
l'absorbance est proportionnelle à la concentration.
• On vérifié la pureté du mélange par électrophorèse sur gel (en condition
dénaturantes : on dénature les protéines pour les rendre chargées), faisant migrer
les protéines en fonction de leur charge, puis en les colorant. On les compare
avec une courbe étalon (en fonction de la distance de migration).
•
On peut aussi séquencer les protéines : on supprime les pont disulfures, on détermine la composition globale
de la protéine, on identifie les acides aminés en N et C terminaux. On utilise un séquenceur qui séquence
depuis n terminal (environ 10 aa), on clive la chaine avec des enzymes qui lysent sélectivement au niveau d'un
aa, une fois les acides aminés séparés, on peut les marquer et en fonction de l'absorbance (le marqueur permet
de l'utiliser), on peut déduire le nombre de chaque acide aminé dans la protéine.
•
Spectroscopie de masse :
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