Cours Prepa agreg 2012

publicité
Métabolisme cellulaire - 1
LA CATALYSE ENZYMATIQUE
Introduction
La cellule peut être considérée comme un système thermodynamique ouvert. Elle est le siège de très nombreuses
réactions, soumises elles aussi aux lois thermodynamiques (réactions spontanées si ΔrG<0). Mais une réaction
peut aussi être envisagée sous l’angle de la cinétique : quelle est la vitesse de la réaction ? A quelle vitesse est
atteint l’équilibre de réaction ?
La totalité des réactions du métabolisme cellulaire sont catalysées, par des enzymes. Les enzymes toutes des
protéines. Qu’est-ce qu’un catalyseur ? Quelles sont les propriétés propres aux catalyseurs biologiques que sont
les enzymes ? En quoi leur nature de protéines leur permet de réaliser cette fonction de catalyseur ?
I. LES ENZYMES, DES CATALYSEURS BIOLOGIQUES
A. Action du suc pancréatique sur l’amidon
Une expérience simple, dans un bain marie thermostaté à 37°. On place 2 récipients :
Expérience 1
Tube 1 : solution d’empois d’amidon
Tube 2 : solution d’empois d’amidon + suc pancréatique
On prélève une partie du contenu à intervalles réguliers puis on réalise un test à l’eau iodée et un test à la liqueur
de Fehling.
Résultats
Temps en min
tube 2 eau iodée
tube 2 liqueur Fehling
tube 1 eau iodée
tube 1 liqueur Fehling
0
+
+
-
5
+/+
-
10
+/+
-
15
+
+
-
Interprétation
En présence de suc pancréatique, l’amidon est hydrolysé en un sucre réducteur
Amidon  n maltose
La vitesse de la réaction est nulle dans les conditions expérimentales du tube 1.
Conclusion : les enzymes présentes dans le suc pancréatique catalysent la réaction d’hydrolyse de l’amidon. C’està-dire de rupture des liaisons covalentes O glycosidiques.
3ème conditions expérimentales : bain marie à 100° + HCl concentré + amidon
On observe alors une disparition de l’amidon et une apparition de sucre réducteur (maltose)
Donc dans ces conditions l’hydrolyse a lieu, on parle de catalyse acide.
La catalyse correspond à une augmentation de la vitesse de réaction, ici les enzymes pancréatiques (amylase) et
le HCl jouent le rôle de catalyseur mais dans des conditions bien différentes.
amylase
Catalyse l’hydrolyse de l’amidon cuit
uniquement
Substrat = amidon seulement
Action à faible concentration
T=37°
HCl
Idem,
mais aussi d’autres réactions
Action sur d’autres polyosides : cellulose…
Action à forte concentration
T=100°
Quelles sont les propriétés des enzymes communes à tous les catalyseurs ?
B. Les enzymes accélèrent les réactions sans modifier l’équilibre final
Soit une réaction A + B   C + D
Comme toute réaction, on peut calculer un rG. Dans le cas de la réaction considérée, rG<0 dans le sens A + B
 C + D, cette réaction est exergonique. En abscisse, on suit l’avancement de la réaction. Deux paliers sont
représentés : état initial et état d’équilibre de la réaction.
Métabolisme cellulaire - 2
On voit que la réaction (comme toute réaction) nécessite le passe par un état de transition, de niveau
énergétique plus élevée. On peut considérer que c’est le passage par des intermédiaires de réactions plus
instables.
Il existe donc une sorte de barrière énergétique : il faut un apport d’énergie pour passer cette barrière, c’est
l’énergie d’activation. Même si le bilan global de la réaction est une libération d’énergie (rG<0). L’apport
d’énergie peut être réalisée par une augmentation de la température par exemple.
Les enzymes (et les catalyseurs en général) agissent en diminuant l’énergie d’activation, la conséquence est une
accélération de la réaction (augmentation de la vitesse). On verra plus tard que la formation du complexe enzyme
substrat permet de stabiliser l’état de transition et par conséquent d’abaisser l’énergie d’activation.
Par contre, on remarque que le rG reste inchangé. L’état d’équilibre n’est pas modifié, la constante d’équilibre
reste identique. Ke
C . D Les concentrations à l’équilibre restent inchangées.
A. B
En d’autres termes, une enzyme ne peut rendre spontanée une réaction endergonique. Un même état d’équilibre
est simplement atteint plus rapidement. Les constantes de vitesse des réactions opposées sont augmentées dans
les mêmes proportions.
Autres propriétés de catalyseurs :
- l’enzyme se retrouve intact à la fin de la réaction et en même quantité : il n’est pas consommé ou produit
par la réaction
- Par conséquent, une enzyme peut catalyser la réaction n fois selon un cycle d’action. Ce qui explique
qu’elles agissent à faible concentration.
Vocabulaire : A et B substrats de l’enzymes, C et D produits de la réaction.
C. Les conditions physico-chimiques influencent les propriétés catalytiques des enzymes
1) Effet de la température
Courbe de la vitesse en fonction de la température.
Résultats : a) entre 0 et 40 la vitesse de la réaction augmente lorsque la température augmente.
b) au-delà d’une certaine température seuil (entre 40-45°), la vitesse de la réaction diminue rapidement avec la
température
Interprétation
a) Il s’agit d’un phénomène purement physique : toute augmentation de température provoque une
augmentation de la vitesse des réactions chimiques. L’augmentation de température provoque une augmentation
de l’agitation moléculaire et par conséquent une augmentation de la probabilité de rencontre des réactifs. Dit
autrement, l’énergie d’activation est plus basse lorsque la température est plus élevée. C’est la loi d’Arrhenius,
qui peut s’exprimer sous la relation empirique suivante qui lie k (constante de vitesse d’une réaction) et T la
température :
k  Ae
 E
RT
R constante des gaz parfaits, T température absolue en Kelvins
E énergie d’activation, supposée constante sur un grand intervalle de température
A constante propre à la réaction.
b) Au-delà de 45° environ (valeur variable selon les enzymes), les enzymes (comme toutes les protéines) subissent
une dénaturation. Les liaisons faibles qui maintiennent la structure III (liaisons H, liaisons ioniques, forces de Van
der Walls) se détruisent. L’enzyme perd sa conformation spatiale, elle devient par conséquent inactive : la
réaction est très ralentie. Cette dénaturation est irréversible.
On remarque qu’il résulte une température optimale pour la catalyse.
Les propriétés des enzymes sont très liées à leur nature protéique.
Remarque : certains microorganismes dits thermophiles vivent à haute température, dans de l’eau proche de 80100°. Leurs enzymes sont adaptées avec une température optimale plus haute, une résistance très importante à
la dénaturation par la chaleur. Citons la bactérie Thermophilus aquaticus. Elle possède une polymérase de l’ADN
très utilisée en génie génétique, la Taq polymérase utilisée pour réaliser la PCR.
Métabolisme cellulaire - 3
2) Effet du pH
Exemple de l’ARNase, enzyme catalysant l’hydrolyse de l’ARN. 3 acides aminés sont importants pour la réalisation
de la réaction :
- l’histidine 12, qui doit être à l’état déprotoné
- l’histidine 119 qui doit être à l’état protoné
- la lysine 41
En effet, le mécanisme réactionnel (sans entrer dans les détails) implique que l’His 119 donne un proton, puis que
l’His 12 accepte ultérieurement un proton.
On peut construire une courbe sur lauel apparaît le % d’His 119 protonée et le % d’His 12 déprotonée.
Résultat : on voit que la coexistence His protonée et d’His 12 déprotonée n’existe que pour un intervalle de pH
étroit légèrement supérieur à 7. Intervalle qui correspond au maximum d’activité de l’enzyme.
Interprétation : il existe un pH optimal pour l’activité enzymatique.
En effet, le pH modifie :
- au niveau de l’enzyme, l’état d’ionisation des radicaux des acides aminés (au niveau du site actif) ce qui
modifie les possibilités d’interaction avec le substrat. Le pH peut perturber la structure tridimensionnelle
(par rupture de liaison faible, hydrogène, ionique)
- au niveau du substrat, l’état d’ionisation. Ce qui modifie les possibilités d’interaction avec l’enzyme.
Pour chaque enzyme, il existe alors un pH optimal :
- souvent proche de 7,4 ; pH cellulaire comme pour l’ARNase, l’amylase salivaire.
- Mais aussi pH 2 pour la pepsine dans l’estomac ou les hydrolases lysosomiales.
Ou encore pH 8/9 pour la trypsine agissant dans l’intestin.
D. Les enzymes sont caractérisés par une spécificité de substrat et de réaction : mise en
évidence
On a observé que l’amylase contenue dans le suc pancréatique catalyse l’hydrolyse de l’amidon, mais n’agit pas
sur la cellulose.
La ribonucléase vue dans la partie précédente catalyse l’hydrolyse de l’ARN (et pas de l’ADN).
Considérons un 3ème exemple : la glucokinase, catalyse la phosphorylation du glucose dans le cytosol.
Glucose + ATP  glucose6P + ADP
On a construit la courbe d’apparition du produit (glucose 6P) en fonction du temps, pour une concentration
d’enzyme et une concentration de substrat donné.
On voit que la vitesse de réaction est nulle ou presque pour tout autre substrat que le D glucose.
Les enzymes sont caractérisées par une spécificité de substrat. Elles ne peuvent agir que sur un substrat. Il s’agit
même d’une stéréospécificité (exple la glucokinase agit sur le D glucose et pas le L glucose) : il existe en fait une
complémentarité de la forme entre enzyme et substrat, à l’origine de la spécificité. Modèle clé serrure.
La spécificité vis-à-vis du substrat est plus ou moins stricte :
La glucokinase catalyse la phosphorylation du D glucose uniquement, l’hexokinase catalyse la phosphorylation des
hexoses.
Métabolisme cellulaire - 4
Les protéases, lipases, ribonucléases par exemple catalysent l’hydrolyse respectivement de protéines, de lipides,
d’ARN…
Mais il existe aussi une spécificité de réaction : les protéases catalysent l’hydrolyse de protéines, (i.e. de liaison
peptidique), les kinases catalysent des phosphorylations (ajout d’une groupement phosphate)…
La nomenclature des enzymes repose sur cette double spécificité puisque en générale le nom d’un enzyme
indique son substrat et le type de réaction catalysée : glucokinase, ribonucléase… ou non (trypsine…)
Toutefois, nous n’avons guère été précis sur l’origine de cette double spécificité, précisons maintenant quel est le
support moléculaire de cette propriété. Voyons comment encore une fois la structure protéique explique les
propriétés des enzymes. Nous répondrons alors à la questions qu’est-ce qu’un site actif.
II. LES ENZYMES, MECANISMES D’ACTION
A. Les enzymes sont caractérisées par une double spécificité : le site actif des enzymes
Les enzymes sont des protéines importance de la structure III voire IV de la protéine
1) Mutagenèse dirigée et vitesse de la réaction
Principe très général : La mutagenèse dirigée consiste à modifier la séquence du gène d’une enzyme sur un
nucléotide bien précis. On peut ensuite produire grâce à ce gène modifié, une enzyme dont un acide aminé bien
précis a été modifié. On effectue ensuite des tests d’activité de l’enzyme en mesurant la vitesse de la réaction.
Exemple ARNase déjà vue précédemment
acide aminé modifé
His 12
His 119
Lys 41
Lys 61
conséquence
V nulle
V nulle
V nulle
V peu modifiée
On observe donc que tous les acides aminés n’ont pas la même importance fonctionnelle : certains acides aminés
se regroupent dans la structure III, alors qu’ils sont éventuellement éloignés dans la structure I. Ils forment le site
actif de l’enzyme : lieu de fixation du substrat et lieu de la catalyse.
Il est possible de réaliser aussi des études cinétiques, en mesurant la vitesse initiale de la réaction en fonction de
la concentration en substrat. Voir TP pour les modalités d’obtention de la courbe.
On remarque qu’au-delà d’une certaine concentration en Substrat, la vitesse initiale reste constante (elle tend
vers Vmax). Il y a un effet de saturation. Toutes les enzymes présentes dans le milieu sont liées à une molécule de
substrat. Il existe un site de fixation du substrat, si ceux-ci sont trop nombreux, l’enzyme est saturée. Dis
autrement, il y a formation d’un complexe enzyme - substrat. La cristallographie aux rayons X confirme la
formation d’un complexe enzyme substrat au niveau d’un site spécifique de l’enzyme.
2) Notion de site actif
Le site actif de l’enzyme est le site où se fixe le substrat et où a lieu la catalyse. On distingue de façon un peu
artificielle : un site de fixation (1), un site de catalyse (2).
1
2
Le site actif correspond à un volume très restreint de l’enzyme. C’est-à-dire qu’il est constitué par un nombre
limité d’acides aminés. (cf. mutagenèse)
Le site actif est délimité par la structure 3D (structure III) de l’enzyme, c’est-à-dire le rapprochement d’acides
aminés éloignés dans la séquence de la protéine. On peut utiliser encore une fois l’exemple de la ribonucléase. On
a vu que le site actif correspond à 3 acides aminés cruciaux : His12, His119 et Lys 41, sur un total de 124 acides
aminés. Dans cet exemple, l’acide aminé nécessaire à la fixation du substrat est la lysine 41, dont le NH3+ établit
Métabolisme cellulaire - 5
une liaison ionique avec le groupement phosphate (chargé -) d’un nucléotide. Les deux histidines sont elles à la
base du mécanisme de catalyse (cf. effet du pH).
Le substrat se lie à l’enzyme au niveau du site actif par des liaisons faibles. Un autre exemple caractéristique est la
chymotrypsine. Il s’agit d’une peptidase : elle catalyse l’hydrolyse de la liaison peptidique, mais au niveau d’acides
aminés aromatiques (tyrosine, tryptophane). Le site de fixation de l’enzyme correspond à une poche hydrophobe
(constituée par des acides aminés hydrophobes de l’enzyme) qui interagit avec la partie apolaire du substrat
(interactions hydrophobes). Les acides aminés 193 et 214 établissent des liaisons hydrogène, par leur groupement
peptidique Le site catalytique est constitué de 3 acides aminés Sérine 195, Histidine 57, aspartate 102 (non
représentée). La formation du complexe enzyme substrat repose donc sur des liaisons faibles (toute la panoplie
habituelle) ce qui permet des propriétés de réversibilités, de dynamisme.
De plus, n’oublions pas la stéréospécificité : l’enzyme et le substrat ont des formes complémentaires, ce qui
facilite la mise en place des liaisons faibles. D’où l’analogie très utilisée de la clé et de la serrure. Toutefois cette
analogie néglige un aspect important de la formation du complexe : les modifications induites par le substrat. Par
exemple, l’hexokinase (déjà vue).
Elle catalyse la réaction :
Glucose + ATP  ADP + glucose 6P
Les études de diffraction aux rayons X ont permis d’étudier la structure de l’enzyme et du complexe enzyme
substrat. La fixation du glucose induit un changement de la conformation spatiale de l’enzyme. Les 2 lobes
entourant le site actif pivotent et enferment le glucose dans une poche. Cette rotation permet par ailleurs
l’exclusion des molécules d’eau du site actif. Il y a deux formes ouverte et fermée. Ce changement a d’ailleurs des
conséquences fonctionnelles importantes : l’ATP n’est pas hydrolysé puisqu’il n’y a pas d’eau dans
l’environnement réactionnel. Le phosphate est bien transféré sur le glucose. Ce qui n’est pas évident a priori
puisque l’hydrolyse de l’ATP est plus favorable (rG=-30,5kJ/mol) que le transfert du phosphate sur un ose (rG=13,8kJ/mol).
D’où la dernière caractéristique importante d’un site actif : c’est un site qui le plus souvent exclut les molécules
d’eau. Ainsi le site actif crée des conditions particulières, une sorte de microenvironnement hydrophobe, qui
favorise la réaction (cf. exemple de l’hexokinase)
B. Mécanisme catalytique : exemple de l’oxydation du glycéraldéhyde 3P
La réaction faut partie de la glycolyse qu’on reverra dans la partie suivante.
Glycéraldéhyde3P + Pi + NAD+  1,3biphosphoglycérate + NADH,H+
Il s’agit d’une phosphorylation, on passe du glycéraldéhyde avec 1 phosphate au biphosphoglycérate (2
phosphates). Mais c’est aussi une réaction d’oxydoréduction : le glycéraldéhyde cède 2e- (et 2 H+) au NAD+.
L’enzyme qui catalyse la réaction est une Glycéraldéhyde3P déshydrogénase. Elle fonctionne avec un coenzyme
qui est le couple NAD+/NADH,H+. (Interaction avec l’enzyme par liaisons faibles)
La réaction globale est exergonique (les potentiels redox sont favorables)
1- Le glycéraldéhyde se lie avec une cystéine de l’enzyme, au niveau du groupement thiol (SH). Le résultat
est un groupement de type hémithioacétal. On remarque qu’on est dans un cas particulier : ici le
complexe enzyme substrat passe par la formation d’une liaison covalente.
2- L’étape suivante correspond à la réduction d’une molécule de NAD+. Cela consiste en un transfert d’ion
hybride H-, c’est-à-dire H avec 2 électrons. Ainsi qu’un H+. L’oxydoréduction correspond bien ici au
transfert de deux électrons. La ½ équation pour le coenzyme est :
NAD+ + H- + H (i.e. 2e-)  NADH,H+
Le substrat passe alors à l’état thioester.
3- Le coenzyme réduit est libéré, il est remplacé par un nouveau. Le thioester comprend une liaison « riche
en énergie »
4- La liaison thioester est rompue, ce qui libère de l’énergie (réaction très exergonique). Cette énergie est
utilisée pour la phosphorylation : le 1,3BPG est libéré.
En principe, l’oxydation d’un aldéhyde nécessite le passage d’une barrière importante. On a vu qu’il faut retirer
un ion H-, à l’aldéhyde. Ce qui induirait l’apparition d’une charge + sur le carbonyle. Or, le carbone porte déjà une
charge partielle positive (puisque O est plus électronégatif). La réaction est exergonique (avec NAD) mais il y a
passage par un intermédiaire peu favorable (Ea élevée). La formation du complexe enzyme substrat, par liaison
covalente en l’occurrence, fait apparaître l’hémithioacétal. Lui cède plus facilement l’ion hybride (d’où
l’abaissement de l’énergie d’activation CQFD)
Métabolisme cellulaire - 6
A noter : la phosphorylation d’un glycérate est une réaction endergonique, mais elle est couplée avec la réaction
d’oxydoréduction (oxydation de l’aldéhyde, réduction du coenzyme)
Ici l’enzyme fonctionne avec un coenzyme, c’est un groupement prosthétique (partie non protéique de l’enzyme).
La part protéique est appelée apoenzyme.
C. Aspects cinétiques de la catalyse. Cas des enzymes michaeliennes
On a vu que la courbe Vi=f([S]) est une hyperbole, avec une phase linéaire puis une phase de saturation.
Michaelis et Menten ont établit le modèle cinétique représentant cette Vi.
k1
k3
E + S  ES  E + P
K2
L’équation établissant Vi en fonction de la concentration en substrat :
S 
ViV max
S  Km
Des mesures expérimentales permettent de construire une courbe Vi=f([S]). Une fois que la courbe est construite
on peut estimer les paramètres Km et Vmax.
 Km est une mesure de l’affinité de l’enzyme pour son substrat
Km c’est la concentration en substrat telle que Vi=Vmax/2. Km est une mesure de l’affinité de l’enzyme vis-à-vis
du substrat : plus le Km est faible, plus l’affinité est élevée. Km a une valeur située entre 10-1 et 10-7 mol/l. Mais
Km varie selon la température et d’autres facteurs.
Une autre façon d’écrire le Km, montre que c’est un estimateur de l’affinité. Une approximation de l’état
stationnaire montre que pour une valeur de [E] et de [S], alors la concentration de ES est constante :
Km
E . S  si la concentration du complexe augmente, par rapport aux enzymes et substrat isolés, le Km est
ES 
plus faible, l’affinité est élevé. Km est une mesure de la stabilité du complexe ES.
 Turn over et efficacité enzymatique
La vitesse apparente d’une réaction est V=V3 (c’est celle qu’on mesure)
V=V3=k3[ES]
La valeur de k3 est aussi appelée turnover, c’est le nombre de molécules de substrats transformées en produit par
unité de temps par une seule molécule d’enzyme totalement saturée par le substrat. Cette valeur se situe entre 1
et 104 molécules/s.
enzyme
acétylcholinestérase
anhydrase
carbonique
chymotrypsine
uréase
Substrat
acétylcholine
CO2
Km (mol/l)
9,5.10-5
1,2.10-2
k3=kcat (s-1)
1,4.104
1.10-6
peptide
urée
6,6.10-4
2,5.10-2
1,9.102
1.104
On utilise aussi la représentation de Lineweaver et Burk, dite en double inverse.
1  KmS  Km  1
V i V max .S  V max .S  V max
c’est une droite de pente Km/Vmax.
On peut tracer la courbe avec des points expérimentaux et on extrapole.
L’intersection avec l’axe des ordonnées 1/Vi=1/Vmax
L’intersection avec l’axe des abscisses
KmS 
0 1  1
S  Km
V maxS 
D. Les enzymes allostériques, une cinétique particulière
1) Cinétique de la réaction catalysée par l’aspartate transcarbamylase
L’ATCase est une enzyme d’E. coli qui catalyse la réaction :
Carbamyl phosphate + L-asparate  Carbamyl aspartate
Métabolisme cellulaire - 7
C’est une réaction correspondant à la première étape de biosynthèse des nucléotides pyrimidiques.
On observe que la courbe Vi=f([S]) est une courbe sigmoïde et pas une hyperbole. Tiens ça rappelle la courbe de
saturation de l’hémoglobine. Il y a 3 parties dans une telle courbe :
- A faible [S], la vitesse est assez faible, augmentant peu
- A moyennes [S], la pente est élevée, la vitesse de la réaction augmente rapidement avec la concentration
en substrat.
- A fortes [S], la vitesse atteint aussi un plateau de saturation. L’enzyme est saturée, tous les sites de
fixation de S sont occupés.
On observe ici une cinétique qui s’explique par un effet coopératif : la fixation de la première molécule de
substrat favorise la fixation des molécules suivantes.
Cet effet coopératif repose sur une transition allostérique : la fixation d’un substrat entraîne un changement de
conformation (structure spatiale) de la protéine. Comment ces phénomènes ont-ils lieu dans la structure
moléculaire ?
2) Aspects moléculaires de la transition allostérique
L’aspartate transcarbamylase est une enzyme oligomérique. Elle possède 6 sous unités (chaînes peptidiques)
catalytiques et 6 sous unités régulatrices.
Chaque polypeptide C possède un site de fixation pour l’aspartate, un site de fixation pour le carbamyl phosphate
(les 2 substrats). L’enzyme existe sous 2 états : l’un relâché de forte affinité, l’un tendu de faible affinité.
- Sans substrat fixé, des liaisons H se maintiennent entre sous unités C, au niveau d’acides glutamiques. le site
actif est très ouvert, dans cette état l’affinité est faible pour les substrats. C’est l’état T.
- Lorsque l’aspartate et le carbamylP se fixent sur leur site, ils provoquent une modification induite de la
structure du protomère. L’acide glutamique établit une liaison H avec l’aspartate. Le site de fixation de
l’aspartate se rapproche du site du carbamyl phosphate : le site actif se referme. En même temps, la liaison H
entre protomère est rompu, l’ensemble de l’enzyme est passé à l’état R. La fixation du 1 er couple de substrats a
favorisé la fixation de 5 autres. (effet coopératif). Ceci est passé par le réarrangement des structures III et IV des
protomères : transition allostérique.
D’une façon générale, les enzymes à cinétique sigmoïde ont une structure quaternaire oligomérique. Les
différents protomères sont liés entre eux par des liaisons faibles. Les liaisons faibles de la structure III de chaque
chaîne permettent une déformation des protomères. De même, les protomères peuvent bouger les uns par
rapport aux autres.
On distingue habituellement deux états dans une enzyme allostérique :
- la forme T (tendue) à faible affinité pour le substrat
- La forma R (relâchée) à forte affinité pour le substrat
Ainsi la fixation du premier substrat modifie la structure III du protomère concerné. Cette déformation se propage
aux autres protomères, la structure IV de l’enzyme est modifiée. L’enzyme est passée à l’état R (transition
allostérique), ce qui facilite la fixation des molécules de substrats suivantes (effet coopératif).
Comme dans le cas de l’Hb, la transition allostérique repose sur un effet homotrope.
III. LES ENZYMES, DES CATALYSEURS REGULES
A. Inhibiteurs du fonctionnement enzymatique
Les inhibiteurs sont des molécules entraînant une inactivation partielle ou totale de l’enzyme.
1) Inhibiteurs compétitifs
Les inhibiteurs compétitifs modifient la cinétique de la réaction de façon typique. Sur les deux représentations, on
remarque que Vmax reste inchangée et que le Km augmente.
Ou -1/Km’>-1/Km => -Km’<Km => Km’>Km
Ce qui veut dire que l’affinité de l’enzyme pour le substrat diminue. Interprétation moléculaire : l’inhibiteur
compétitif est une molécule dont la structure moléculaire est proche de celle du substrat. Il est donc capable de
se fixer à la place du substrat au niveau du site actif. Il forme donc un complexe enzyme – inhibiteur. La formation
de ce complexe est réversible. Mais l’inhibiteur compétitif empêche le substrat de se fixer, par un effet de
compétition vis-à-vis du site actif.
Métabolisme cellulaire - 8
On peut remarquer que l’inhibition compétitive est contrée lorsque la concentration en substrat augmente. En
effet, lorsque le substrat est en excès, il parvient à se fixer sur l’enzyme, par un effet de probabilité.
On peut aussi définir un Ki, affinité de l’enzyme pour son inhibiteur.
Ki
E I  voir TD pour plus de précision
EI 
Par exemple, la réaction suivante est une réaction de la glycolyse :
1,3biphosphoglycérate   2,3 biphosphoglycérate
biphosphoglycérate mutase
Le produit de la réaction est un inhibiteur compétitif de l’enzyme.
Glucose + ATP  Glucose 6P + ADP
Hexokinase
Le glucose 6P est un inhibiteur compétitif de l’enzyme. Il y a aussi inhibition par le produit de la réaction. Cette
réaction est la première de la glycolyse. Le glucose 6P s’accumule si la glycolyse est freinée ou n’arrive pas à
suivre la production de G6P. En s’accumulant, le G6P forme un complexe avec l’enzyme et inhibe la réaction de
phosphorylation. Evite donc une accumulation trop importante de G6P, ajuste à la consommation par le reste de
la glycolyse.
Le rétrocontrôle négatif qu’on vient de voir est un phénomène courant de régulation des enzymes. La
ressemblance entre un Substrat et le produit facilite la mise en place de l’inhibition compétitive.
Remarque : il existe des inhibiteurs compétitifs qui réalisent une inhibition irréversible. La pénicilline est un
antibiotique découvert par Fleming en 1928. C’est une molécule fabriquée par un champignon, moisissure. Mais
le mécanisme d’action n’a été découvert que dans les années 1950/60. Les bactéries sont entourées d’une paroi
de peptidoglycanes. Une enzyme catalyse la formation de liaisons peptidiques présentes dans les
peptidoglycanes. La pénicilline est un analogue du substrat, elle se fixe à sa place. Mais alors, la pénicilline forme
une liaison covalente avec l’enzyme. Ce qui bloque définitivement son activité catalytique.
2) Inhibiteurs non compétitifs
La cinétique nous renseigne aussi sur les modalités d’action des inhibiteurs non compétitifs. On remarque que la
vitesse max diminue et que le Km reste inchangé. Sur la courbe en double inverse : 1/Vm augmente, Vmax
diminue.
Si l’affinité est inchangée, le substrat se fixe de façon inchangée, il n’est pas en compétition avec l’inhibiteur.
L’inhibiteur non compétitif se fixe sur un site particulier (avec une affinité propre). Donc le substrat et l’inhibiteur
peuvent se fixer en même temps. Il existe donc trois type de complexes :
- ES, il est actif, la catalyse est possible.
- EI et ESI (avec substrat et inhibiteur) est inactif, la catalyse est moins rapide.
L’inhibiteur modifie le turn over de l’enzyme mais pas le nombre de substrats fixés à l’enzyme. Ce mode de
compétition est plus rare.
On remarque aussi que l’augmentation de la concentration en substrat ne peut pas contrer l’inhibition non
compétitive.
Exemple : la glutamate déshydrogénase catalyse la réaction suivante :
NH3 +  cétoglutarate + NADPH,H+  L glutamate + NADP+ + H2O
C’est une réaction capitale car elle permet la fixation de l’azote minérale (ammoniac) et de synthétiser un acide
aminé (glutamate). C’est une réaction réalisée dans les chloroplastes des plantes (autotrophie pour le N). Une
substance extraite du saule, le salicylate exerce une inhibition non compétitive sur la glutamate DH.
Problème : je n’ai pas trouvé la signification biologique de cette inhibition…
B. Régulation des enzymes allostériques
On retrouve l’ATCase, qui catalyse la réaction préliminaire de la synthèse des bases pyrimidiques.
carbamylP + aspartate  Ncarbamyl aspartate  …  CTP (cytosine triphosphate)
ATCase
L’activité de l’ATCase dépend de la présence de CTP. On constate que le CTP est un effecteur négatif : il ne
modifie pas la vitesse maximale. Mais le Km est augmenté en présence de CTP.
On peut traiter l’enzyme pour la dénaturer, c’est-à-dire séparer ces sous unités, on remarque :
- qu’elle conserve son activité catalytique, mais Vi=f([S]) prend un aspect de courbe michaëlienne
- Le CTP n’a plus d’effet inhibiteur.
Métabolisme cellulaire - 9
Ces résultats suggèrent que le CTP se fixe sur des sites propres, au niveau des sous unités de régulation qui sont
distinctes des sous unités catalytiques.
En effet, 1 CTP peut se fixer sur chaque sous unité régulatrice. Cette fixation induit une modification légère de la
structure III des sous unités R. En cascade, les sous unités R pivotent l’une par rapport à l’autre, 2 à 2. Puis le
mouvement des sous unités R se propage aux sous unités C, les liaisons H entre sous unités C se forment, i.e.
l’enzyme passe à l’état T. On a bien une transition allostérique, provoquée par un effecteur allostérique (le CTP)
différent du ligand (substrat) : c’est un effet hétérotrope négatif.
Si le CTP s’accumule, il inhibe l’ATCase : il inhibe donc sa formation (évitant donc une accumulation), en agissant
sur la 1ère étape de synthèse. C’est encore un cas de rétrocontrôle négatif.
A l’inverse l’ATP est un effecteur positif (activateur allostérique). En sa présence, le Km est plus faible (l’affinité
augmente). La Vmax reste inchangée. L’ATP se fixe aussi sur les sous unités de régulation, il favorise au contraire
l’état R. Une concentration élevée d’ATP signifie de l’énergie utilisable pour les synthèses, en particulier de
nucléotides.
C. Clivage et régulation par liaison covalente
1) Régulation par clivage protéolytique
Les cellules des acini pancréatiques synthétisent des enzymes à rôle digestif libérées dans le duodénum. Les
enzymes sont sécrétées au pôle apical de la cellule sous forme de proenzymes : des précurseurs inactifs. En effet,
ce sont des hydrolases qui peuvent dégrader des constituants cellulaires. Le stockage sous forme inactive
empêche tout problème de ce genre. Rappelons par exemple, deux peptidases :
La trypsine, libérée à l’état de trypsinogène.
La chymotrypsine, libérée à l’état de chymotrypsinogène.
Le passage trypsine à trypsinogène est catalysé par une entéropeptidase et par la trypsine elle-même. Le
trypsinogène de bœuf contient 229 acides aminés. Il subit un clivage entre la lysine 6 et l’isoleucine 7. Les 6 acides
aminés de l’extrémité Nterminal sont libérés. La trypsine est alors active. On remarque dans ce cas, un
rétrocontrôle positif de la trypsine sur son activation. Il y a un effet d’amplification.
Le chymotrypsinogène est activé en plusieurs étapes, catalysées par la trypsine. Des clivages se font entre les aa
13 et 16. De même que entre les aa 146 et 149. Les 3 morceaux obtenus restent attachés par deux ponts
disulfures. Des changements de conformations (repliements, spontanés) amènent à l’état chymotrypsine ,
active.
2) Régulation par liaisons covalentes : phosphorylation
Certaines enzymes ont une activité différente selon qu’elles sont phosphorylées ou non. La phosphorylation est
l’ajout d’un groupement phosphate, catalysée par une kinase. La phosphorylation se fait sur le groupement OH
des acides comme la sérine ou la thréonine. Une phosphorylation est réversible, le groupement phosphate peut
être retirée grâce à une phosphatase.
Un phosphate porte 2 charges négatives, qui peuvent interagir avec les charges de l’enzyme régulée (par
répulsion ou par attraction) et provoquer par conséquent un changement de conformation de l’enzyme.
Prenons l’exemple de la pyruvate kinase comme enzyme régulée, c’est une enzyme agissant en fin de glycolyse.
PEP + ADP + H+  Pyruvate + ATP
ATP
Déphosphorylée = active
Pyruvate kinase
Pi
kinase
phosphatase
H2O
ADP
Pyruvate kinase
phosphorylée = inactive
P
La situation décrite correspond à la L pyruvate kinase présente dans le foie. N’oublions pas que le foie est un
organe important de la régulation de la glycémie. La pyruvate kinase est une enzyme de la glycolyse, voie de
dégradation du glucose servant à produire de l’ATP, pour le fonctionnement des cellules (ici les cellules
hépatiques).
Métabolisme cellulaire - 10
Une cellule hépatique peut utiliser son glucose de différentes façons : glycolyse, stockage sous forme de
glycogène ou libération du glucose dans le sang pour approvisionner les autres organes.
Si il y a un besoin urgent de glucose dans l’organisme alors la glycolyse des cellules hépatiques est inhibée au
profit de la libération du glucose dans le sang. L’inhibition de la glycolyse passe par différentes voies dont celles
de la phosphorylation inactivation de la pyruvate kinase.
Conclusion :
Les enzymes sont donc indispensables au métabolisme cellulaire (toutes les réactions sont catalysées).
Les enzymes sont toutes des protéines, leur activité est étroitement liée à leur structure III (site actif…) voire à
leur structure IV (enzymes allostériques).
Elles ont un fonctionnement qui est étroitement régulé par des inhibiteurs, des effecteurs allostériques…
Chaque enzyme possède un optimum physico-chimique (de pH, de température notamment). Or, comment
concilier des optimums différents dans une même cellule ? Grâce à la compartimentation. Par exemple, les
enzymes d’un lysosome fonctionnent à pH 1-2 et le reste de la cellule est à pH neutre.
On va retrouver l’importance de ces enzymes dans le fonctionnement du métabolisme énergétique et les voies de
production de l’ATP.
Les antibiotiques sont souvent des molécules inhibitrices d’enzymes vitales pour les bactéries, comme la
pénicilline. Leur connaissance est donc très utile.
Métabolisme cellulaire
PARTIE 2.
LA CATALYSE ENZYMATIQUE
I. Les enzymes, des catalyseurs biologiques
A.
B.
C.
Action du suc pancréatique sur l’amidon
Les enzymes accélèrent les réactions sans modifier l’équilibre final
Les conditions physico-chimiques influencent les propriétés catalytiques des enzymes
1) Effet de la température
2) Effet du pH
D. Les enzymes sont caractérisés par une spécificité de substrat et de réaction : mise en évidence
II. Les enzymes, mécanismes d’action
A.
Les enzymes sont caractérisées par une double spécificité : le site actif des enzymes
1) Mutagenèse dirigée et vitesse de la réaction
2) Notion de site actif
B. Mécanisme catalytique : exemple de l’oxydation du glycéraldéhyde 3P
C. Aspects cinétiques de la catalyse. Cas des enzymes michaeliennes
D. Les enzymes allostériques, une cinétique particulière
1) Cinétique de la réaction catalysée par l’aspartate transcarbamylase
2) Aspects moléculaires de la transition allostérique
III. Les enzymes, des catalyseurs régulés
A.
Inhibiteurs du fonctionnement enzymatique
Inhibiteurs compétitifs
Inhibiteurs non compétitifs
B. Régulation des enzymes allostériques
C. Clivage et régulation par liaison covalente
1) Régulation par clivage protéolytique
2) Régulation par liaisons covalentes : phosphorylation
1)
2)
Téléchargement
Explore flashcards