ANPGM_080-v2

ASSOCIATION DES PRATICIENS DE GENETIQUE MOLECULAIRE (ANPGM)
Stratégies d’études des gènes F8 et F9 impliqués dans les
Hémophilie A et Hémophilie B
Référence : ANPGM_080 Numéro de version : 2
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Pour les versions révisées :
- Date de 1ère mise en application : février 2016
- Numéro de l’ancienne version du document : ANPGM_080
- Date de révision : 2 décembre 2015
Nom
Hôpital
Date
Rédacteur(s)
Catherine Costa
Mathilde Fretigny
Pierre Boisseau
Christophe Zawadski
CHU Cochin
CHU Lyon
CHU Nantes
CHU Lille
02/12/2015
Vérificateur(s)
Filière
Christine Vinciguerra
MHEMO
CHU Lyon
02/12/2015
17/12/2015
Approbateur(s)
Pour le CA de l’ANPGM :
Benoit ARVEILER
Cécile ACQUAVIVA
Anne-Sophie LEBRE
Pascale SAUGIER-VEBER
CHU Bordeaux
CHU Lyon
CHU Reims
CHU Rouen
04/10/2016

ASSOCIATION DES PRATICIENS DE GENETIQUE MOLECULAIRE (ANPGM)
Stratégies d’études des gènes F8 et F9 impliqués dans les
Hémophilie A et Hémophilie B
Référence : ANPGM_080 Numéro de version : 2
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I-Introduction
Description et mode de transmission
Les hémophilies sont des affections hémorragiques héréditaires, transmises selon un mode récessif lié au
chromosome X et dues à un déficit en facteur VIII (hémophilie A) ou en facteur IX de la coagulation
(hémophilie B). L’hémophilie A, concerne environ une naissance masculine sur 5 000, est plus fréquente
que l’hémophilie B (environ une naissance masculine sur 30 000). La sévérité clinique dépend de
l’importance du déficit en activité coagulante. On distingue classiquement les hémophilies sévères, où le
taux résiduel de l’activité coagulante du facteur VIII (FVIII:C) ou du facteur IX (FIX:C) est inférieur ou égal à
1%, les hémophilies modérées où le taux résiduel est entre 1 et <5%, et les formes mineures où le taux
résiduel se situe entre 5 et 40% (définition ISTH).
Aujourd’hui il est recommandé de génotyper tous les patients hémophiles A et B, et ce quel que soit le degré
de sévérité de la maladie. Ces recommandations sont publiées depuis 2006 par le « United Kingdom
Haemophilia Centre Doctors Organization » (1), et concernent tous les patients hémophiles. Le génotypage
n’apporte aucun élément pour le diagnostic d’hémophilie chez un sujet atteint, les dosages des facteurs VIII
et IX de la coagulation donnant des éléments indiscutables pour un tel diagnostic, mais il est indispensable
pour la détection des conductrices d’hémophilie et le diagnostic prénatal. De plus, il donne des informations
pour la prise en charge d’un patient hémophile.
L’anomalie génétique est l’un des facteurs de risque de développement d’inhibiteur (environ 30% HA 5%
HB) qui survient le plus souvent dans les formes sévères mais également dans les formes modérées et
mineures (2,3). Il existe une corrélation entre anomalie génétique et inhibiteur avec une
incidence/prévalence fonction du type de mutation. La présence d’une mutation à haut risque d’inhibiteur
(délétion de grande taille par exemple) chez les patients hémophiles ayant développé un inhibiteur est
associée à une moindre efficacité d’une induction de tolérance immune.
D’autre part, il existe une corrélation entre le type d’anomalie génétique et la réponse au traitement par la
desmopressine.
Pathologie moléculaire
Hémophilie A : Le gène du facteur VIII de la coagulation (F8) est un très grand gène constitué de 26 exons
répartis sur 186kb (1). Des microinversions interrompant le gène F8 au niveau des introns 1 ou 22 résultant
de la recombinaison intrachromosomique entre deux séquences homologues sont respectivement
responsables de 3% et 45% des cas d’hémophilie A sévère (2, 3). De très nombreuses mutations
ponctuelles rendent compte d’environ 40% des cas d’hémophilie A sévère et de la presque totalité des cas
d’hémophilie modérée ou mineure. Des délétions/insertions de quelques paires de bases sont également la
cause d’hémophilies de sévérité variable.
Les 5% d’hémophilies sévères restant sont dus à de grands réarrangements tels des délétions de grande
taille ou autres mécanismes plus rares tels des duplications d’exons.
Dans environ 3% des formes sévères et environ 10% des formes modérée/mineures, aucune anomalie
moléculaire n’est identifiée par les techniques actuelles. (4)
Hémophilie B : Le gène du facteur IX de la coagulation (F9) est plus petit, contient 8 exons et est réparti
sur 34kb (1). La majorité des mutations sont des mutations ponctuelles non-sens, faux-sens, ou des
insertions/délétions de quelques paires de bases. Plusieurs centaines de mutations sont répertoriées et sont
réparties sur l’ensemble du gène. Environ 5% des cas d’hémophilie B sévère sont dus à des délétions de
plus grande taille.
Noms et références des gènes
Hémophilie A, N° OMIM : 300841, N° ORPHANET : 121677, gène F8, NM_000132.3, NP_000123.1
Hémophilie B, N° OMIM : 300746, N° ORPHANET : 121683, gène F9, NM_000133.3, NP_000124.1

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II-Organisation de la prise en charge des études génétiques au sein des réseaux
de laboratoires
Les laboratoires sont organisés en réseau depuis 2006 afin d’offrir une couverture nationale homogène
selon un rationnel simple. Ce réseau national des laboratoires réalisant les caractéristiques génétiques des
maladies constitutionnelles de la coagulation et de la fibrinolyse est intitulé GENOSTASE.
Les laboratoires ne réalisant pas l’étude du gène demandé ou n‘explorant qu’une partie du gène doivent
adresser le prélèvement d’ADN pour étude complémentaire à un laboratoire de niveau 2 ou un laboratoire
expert de niveau 2 selon le schéma ci-dessous.
En 2015 les laboratoires réalisant les études génétiques des gènes F8 et F9 sont répartis selon le
tableau ci-après.

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Analyses réalisées
Type de laboratoire
Niveau 1 avec
recherche
évènements
récurrents
Niveau 1
Niveau 2
Niveau 2
expert
Hémophilie A
Recherche inversions du gène F8 intron 22 /
intron 1
X
X
X
X
Etude des régions codantes et sites
d’épissage des 26 exons du gène F8
X
X
X
Etudes complémentaires : promoteur, région
3’NTR, grands ré-arrangements
X
X
Etudes fonctionnelles : ex vivo ARNm F8,
minigène F8, expression cellulaire de variants
FVIII
X
Hémophilie B
Etude des régions codantes et sites
d’épissage des 8 exons du gène F9 + Etudes
complémentaires : promoteur, région 3’NTR,
grands ré-arrangements
X
X
Etudes fonctionnelles : ex vivo minigène F9,
expression cellulaire de variants FIX
X
III-Arbres décisionnels des études des gènes F8 et F9
Ces arbres s’appuient sur les guidelines publiées en hémophilie A et B (1).
1-The molecular analysis of haemophilia B: a guideline from the UK haemophilia centre doctors' organization
haemophilia genetics laboratory network. Mitchell M1, Keeney S, Goodeve A; UK Haemophilia Centre
Doctors' Organization Haemophilia Genetics Laboratory Network. Haemophilia. 2005 Jul;11(4):398-404.
Ces arbres décisionnels sont validés au sein du réseau des laboratoires GENOSTASE après une mise à
jour incluant le séquençage à haut débit (NGS).
Dans le contexte d’étude d’un gène unique, il n’y a pas de recommandation à privilégier l’utilisation du
NGS par rapport au séquençage Sanger.
Le choix entre séquençage Sanger et NGS dans un laboratoire relève de contraintes techniques,
organisationnelles et économiques. La transition au NGS doit avoir fait l’objet d’une validation qui garantit
une sensibilité analytique de détection des mutations au moins équivalente à celle du séquençage
Sanger. Si besoin, les régions mal couvertes en NGS doivent faire l’objet d’une analyse complémentaire
(par exemple la séquence de l’exon 14 riche en régions d’homopolymères (A)6 à (A)9.
Les indications d’étude sont à adapter en fonction des différentes situations telles que présentées ci-après.
Les indications d’étude se présentent sous 2 aspects selon qu’il s’agisse d’une étude utilisant le séquençage
à haut débit NGS ou le séquençage Sanger.
A- Stratégie d’étude des Hémophilies intégrant le NGS selon les Indications
Le NGS permet le séquençage simultané des gènes F8 et F9

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1- Patients Hémophiles
2- Femmes à taux bas FVIII :C ou FIX :C
3- Femmes à taux normaux mais notion d’antécédents d’hémophilie A ou B dans la famille
4- Diagnostic de conductrices chez des apparentées avec mutation identifiée
5- Cas particulier des néomutations
6- Diagnostic de conductrices chez des apparentées avec mutation non identifiée
7- Conduite à tenir lors de l’identification d’une mutation
Dans les cas d’identification d’une anomalie du gène celle-ci devra être vérifiée de préférence et si possible
par une autre méthode. Exemple anomalie d’un nombre de copie du gène MLPA et qPCR.
Les zones d’homopolymères étant des régions difficiles à étudier selon la technique de séquençage haut
débit utilisée, il sera parfois nécessaire de faire un complément d’étude de ces régions par la technique de
Sanger.
Dans les formes non familiales d’hémophilie A modérée et mineure il est généralement demandé d’avoir
éliminé une maladie de Willebrand et un déficit combiné FV+VIII.
Chez certains patients il peut co-exister une hémophilie A modérée/mineure et certaines formes de maladie
de Willebrand homozygote ou hétérozygote, pour lesquels une étude du gène vWF sera une aide au
diagnostic. (Ex : taux discordants au sein des différents membres d’une même famille). Ceci sera à discuter
avec le clinicien pour une prise en charge par le Centre de référence de la maladie de Willebrand.
Dans certaines situations un second prélèvement de contrôle peut-être demandé. Cette situation est
discutée au cas par cas. Exemple, en cas d’étude négative un contrôle d’identité par étude de marqueurs
polymorphes sur un 2nd prélèvement peut être proposé.