BIO14 L3 A01 TP Génét Poly1

Travaux Pratiques de Génétique 2014-2015 - 1 -
École Normale Supérieure – Département de Biologie - 46 rue d'Ulm 75005 PARIS
Travaux Pratiques de la Licence de Biologie
TRAVAUX PRATIQUES DE GÉNÉTIQUE
Le but de l'expérience proposée est l'obtention et la localisation de mutations affectant les
gènes impliqués dans le métabolisme du maltose chez Escherichia coli, une bactérie à gram négatif.
• Le système utilisé sera celui d'une mutagenèse par insertion d'un transposon bactérien.
• Les mutants seront sélectionnés : soit par leur phénotype [mal-] sur un milieu contenant un
indicateur coloré, soit par leur résistance au bactériophage lambda (λ).
À titre de référence, vous pouvez lire la revue consacrée au régulon Maltose parue dans
Microbioloby and Molecular Biology Reviews en 1998 (volume 62, pages 204 à 229) et ‘network
regulation of the Escherichia coli maltose system’ dans J Mol Microbiol Biotechnol en 2002.
I) LE RÉGULON MALTOSE D'ESCHERICHIA COLI
Le régulon maltose d'E. coli comprend huit principaux gènes (mal Q, P, T, G, F, E, K et
lamB) dont les produits interviennent dans le métabolisme du maltose et des maltodextrines et un
gène qui régule l'expression de ceux-ci (voir figures 1 et 2).
Figure 1. Le régulon maltose. Les positions des régions malA, malB et malS sur le chromosome d'E. coli sont données
entre parenthèses. En présence de maltose, le produit du gène malT stimule l'expression de tous les gènes du régulon à
l'exception de malT.
Le transport du maltose et des maltodextrines met en jeu un système complexe qui
comprend cinq protéines : les produits des gènes malE, malF, malG, malK et lamB. En plus de son
rôle dans le transport, la protéine lamB est nécessaire à l'adsorption du bactériophage λ. Le
métabolisme du maltose et des maltodextrines nécessite deux enzymes spécifiques : l'amylomaltase
et la maltodextrine phosphorylase qui sont les produits des gènes malQ et malP respectivement
(voir figures 1 et 2).
Maltodextrine glucosidase
E. coli (9 min.)
malZ

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Ces gènes sont regroupés en trois opérons. L'un de ceux-ci : malPQ est localisé dans une
région qui a été appelée malA et qui est située à 76,5 minutes sur la carte d'E. coli. Les deux autres
opérons malEFG et malK sont localisés dans une autre région : malB située à 91,4 minutes sur la
carte d'E. coli (figure 6). La transcription de ces trois opérons est induite par le maltose et les
maltodextrines et cette induction est sous la dépendance du gène régulateur malT localisé dans la
région malA.
Figure 2. Métabolisme de l'amidon et de ces dérivés chez E. coli. Les protéines impliquées sont représentées d'après le
nom de leur gène (figure 1). TM : nombre d’hélices transmembranaires
II) LA MÉTHODE DE MUTAGENÈSE
Il existe chez les procaryotes comme chez les eucaryotes des séquences capables de se
déplacer d'un site à un autre dans le génome. Ces séquences sont appelées éléments mobiles. Les
transposons font partie de cette classe d'éléments. Chacun d'eux porte les gènes requis pour sa
propre transposition, celle-ci étant éventuellement modulée par les fonctions de l'hôte. La
transposition a pour conséquence l'insertion covalente dans l'ADN de l'hôte d'une séquence qui lui
est étrangère, ce qui peut évidemment conduire à l'inactivation du ou des gènes ayant subi une telle
insertion.

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Les éléments mobiles possèdent des tailles très variables, par exemple, chez les bactéries, de
768 pb pour IS1 à 37000 pb pour le bactériophage Mu. Le système utilisé en Travaux Pratiques fait
appel aux propriétés cumulées d'un transposon bactérien dérivé de Tn10 et du bactériophage λ.
1- Les transposons bactériens
La structure de Tn10 (9,3 kb) est représentée sur la figure 3. Ce transposon porte aux deux
extrémités des séquences d'environ 1400 pb qui diffèrent l'une de l'autre par trois mutations
ponctuelles. Ces séquences sont appelées IS10-gauche et IS10-droite. Les séquences IS (Insertion
Sequence) sont elles-mêmes des éléments mobiles. Cette mobilité requiert la présence de deux
séquences répétées inversées IR (Inverted Sequence) de 70 pb aux deux extrémités de l'IS. Elle
nécessite en outre l'activité d'une protéine codée par IS-droite appelée transposase. La transposition
peut permettre le déplacement de l'une ou l'autre IS, ou des deux IS, avec la séquence qu'elles
encadrent. Seul ce dernier déplacement est aisément repérable grâce aux gènes de résistance
(tétracycline). On peut remplacer ce gène de résistance par tout autre gène.
Figure 3. Le transposon Tn10. Les extrémités IS10-Gauche et IS10-Droite encadrent les gènes tetR (répresseur de tetA),
tetA (protéine membranaire nécessaire à la résistance), tetC et tetD (fonctions inconnues). Les demi-flèches à l'extrémité
des éléments IS10 représentent les séquences répétées inversées. Les flèches grises dans les gènes tet indiquent le sens
de transcription. La flèche pleine dans la région IS10-Droite indique le sens de la transcription du gène de la transposase
et la flèche dégradée de la région IS10-Gauche celui de la transposase défective de cet élément.
Dans le cadre des Travaux Pratiques (figure 4), le dérivé de Tn10 utilisé porte un gène de
résistance à la kanamycine (Kanr).
Figure 4. Transposon utilisé au cours des Travaux Pratiques.
Le déplacement de tous les éléments mobiles bactériens est indépendant du système de
recombinaison homologue. En outre, dans le cas de Tn10 et d'IS10, la transposition ne nécessite pas
la réplication de l'élément mobile.
A partir du Tn10 sauvage, décrit dans la figure 3, des mini-transposons ont été construits et
intégrés dans les dérivés du bactériophage λ. Nous utiliserons, pendant les Travaux Pratiques, le
bactériophage λ1105 (figure 5).
2- λ 1105
Le bactériophage λ est un bactériophage tempéré capable de lysogéniser Escherichia coli.
Lors de ce processus, il intègre son ADN en un site unique du génome bactérien par l'intermédiaire

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de séquences appelées attB et attP. La séquence attB est présente sur l'ADN bactérien et attP sur
l'ADN du phage. Le maintien de l'état lysogène nécessite la synthèse continue d'une protéine
phagique codée par le gène cI. Le bactériophage λ peut également lyser la bactérie en se
multipliant. Ce processus dépend de l'expression de gènes phagiques dont le gène P.
Le bactériophage λ1105 porte une délétion du site attP (notée sur la figure 5 : b522) et une
mutation ambre (non-sens) dans le gène P (P80am). En conséquence, ce phage ne peut lysogéniser,
ni se multiplier dans une souche dépourvue de suppresseur de non-sens. Un tel virus ne pourra donc
que se multiplier (sans pouvoir lysogéniser) dans une bactérie portant un suppresseur de non-sens.
Dans λ1105, une partie de l'ADN phagique a été délétée et remplacée par de l'ADN dérivé
des transposons Tn10 et Tn903. Dans ce fragment rapporté, on trouve :
• le gène de la transposase de IS10-droite sous le contrôle d'un promoteur chimèrique appelé
pTac. Ce promoteur est un promoteur hybride inductible par l'IPTG.
• un mini-transposon (1,7 kb) portant à ses extrémités les séquences répétées inversées (IR)
de
IS903. Ces séquences encadrent le gène de résistance à la kanamycine, Kanr.
Figure 5. Le bactériophage λ1105.
3- Utilisation de ce système
La bactérie dont on veut effectuer la mutagenèse sera infectée par λ1105. Elle est dépourvue
de suppresseur de non sens ambre. Le bactériophage λ1105 est défectif pour son site d'attachement
attP (délétion b522) et muté dans un gène nécessaire à sa réplication (P80am), l'infection ne conduira
donc ni à la lyse de la bactérie, ni à la multiplication du phage. Cependant, le phage λ1105 est

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toujours capable, dans certaines conditions de tuer la bactérie qu'il a infecté (gène kill). Cette
bactérie ayant, d'autre part, été cultivée en présence de l'inducteur du promoteur de la transposase
(IPTG), celle-ci sera pleinement exprimée.
Dans ces conditions, la transposition sur le chromosome bactérien, de la séquence de 1,7 kb
encadrée par les deux IR, sera possible et l'on pourra obtenir des bactéries [Kanr]. À la suite de cette
manipulation, ne sera conservé du phage λ, que le mini-transposon qui sera intégré dans le
chromosome bactérien.
On peut considérer que ce type d'intégration se fait de façon aléatoire dans le chromosome.
III) LES MILIEUX, LES SOLUTIONS
LB : Luria Bertani, milieu complet permettant la croissance de tous les auxotrophes connus.
MK1 : milieu Mac Conkey N °1, le mileu Mac Conkey est un milieu permettant de déterminer si
une souche d'E. coli est capable ou non d'utiliser un sucre donné. Dans notre cas de figure,
ce sucre est le maltose. Sur ce milieu des bactéries utilisant le sucre donnent des colonies
rouges et les bactéries ne l'utilisant pas, des colonies blanches. L'origine de ces changements
de couleur est due à des variations locales du pH. Le MK1 des Travaux Pratiques contient
du maltose 1%, du citrate 2.10-2 M et de la kanamycine (25 µg/ml). Le citrate complexe les
ions Mg2+ et Ca2+ nécessaires à l'adsorption du phage. Sur ce milieu, les réadsorptions
parasites du phage sont donc inhibées.
MK2 : milieu Mac Conkey N °2, milieu Mac Conkey maltose contenant de la tétracycline à
10 µg/ml et de l'acide nalidixique à 20 µg/ml. Ce milieu sera utilisé lors de la conjugaison.
MK3 : milieu Mac Conkey N °3, milieu Mac Conkey maltose contenant de l'ampicilline à
50 µg/ml. Ce milieu sera utilisé pour le test de complémentation fonctionnelle.
La kanamycine et la tétracycline sont deux inhibiteurs de la synthèse protéique. Le premier
se fixe sur le ribosome alors que le second bloque la translocation du ribosome. L’acide nalidixique
est un inhibiteur de la réplication de la bactérie en agissant sur la topoisomérase IV et l’ADN
gyrase.
Maltose : 20% (20g/100mL) ; Glucose : 1M ; IPTG : 1M ; Citrate : 1M ; kanamycine : 25mg/mL
IV) GÉNOTYPES ET PHÉNOTYPES DES SOUCHES UTILISÉES
HFR P4X
HFR P4X : met-, srl::Tn10
[mal+, TetR, nalS]
TP1
F- : malPQ::Tn9, Δ malT, gyrA, thi-, thyA-
[mal-, tetS, NalR]
TP2
F- : ΔmalB, gyrA, thi-
[mal-, tetS, NalR]
V) PLASMIDES UTILISÉS
Plasmides auto réplicatifs
Gènes
Taille
Résistance apportée
pMalFG
malF, malG
11318 pb
Ampicilline
pMalG
malG
9669 pb
Ampicilline
pMalQ
malQ
10633 pb
Ampicilline