La protéomique : une nouvelle approche analytique de l étude des

La protéomique : une nouvelle approche analytique
de l’étude des protéines
N. de Roux*
L
e séquençage du génome
humain a soulevé de nom-
breux espoirs grâce à l’énorme
effort consenti par plusieurs labo-
ratoires de recherche à travers le
monde. Un formidable outil est main-
tenant disponible directement par
l’intermédiaire d’Internet et en libre
accès. Cet effort continue d’ailleurs
pour d’autres espèces de mammi-
fères comme la souris. Plusieurs
conséquences découlent directement
de ce travail dont l’accélération de
la découverte de nouveaux gènes
responsables de pathologies rares
est un exemple. On n’a plus besoin
de rassembler un nombre important
de familles informatives pour carac-
tériser un gène par génétique inverse,
la marche sur le chromosome qui
prenait plusieurs mois, voire des
années, n’est plus nécessaire puisque
les gènes et les marqueurs sont
ordonnés sur chaque chromosome.
Le clonage in silico de nouveaux
gènes est devenu possible. Plusieurs
exemples ont récemment démontré
la puissance de ces approches en
endocrinologie. De plus, le séquen-
çage du génome humain a montré
que le nombre de gènes maintenant
évalué à 30 000 environ est plus
faible que les prévisions générale-
ment admises autour de 100 000.
L’homologie de structure entre les
génomes, notamment les séquences
codantes entre les différentes espèces
de mammifères, est très importante.
La diversité observée entre les
espèces ne dépend donc pas uni-
quement de la structure du génome.
Afin de mieux comprendre les méca-
nismes de cette diversité, plusieurs
approches sont utilisées (figure 1).
L’étude du transcriptome consiste à
étudier l’expression des gènes, à un
instant donné, au sein d’un tissu ou de
cellules. L’idée étant que le profil de
l’expression de plusieurs dizaines de
gènes est la signature physiologique
de la cellule à cet instant précis.
Néanmoins, il est rapidement apparu
que l’analyse du transcriptome n’était
pas suffisamment informative et qu’il
fallait également étudier l’expression
des protéines, leurs modifications
post-traductionnelles, ainsi que les
interactions protéine-protéine. Il deve-
nait alors indispensable de définir
une nouvelle approche méthodo-
logique centrée sur la biochimie des
protéines : la protéomique.
La protéomique cherche à répondre
à trois questions fondamentales :
quelles sont les protéines exprimées
dans une cellule ou un tissu (pro-
* INSERM U584, faculté de médecine Necker-
enfants malades, Paris.
▲
▲Le protéome définit la population protéique dans un tissu ou une
cellule à un moment donné. La protéomique regroupe l’ensemble des
technologies permettant l’étude qualitative et quantitative de cette
population protéique.
▲
▲Les protéines sont des chaînes polypeptidiques dont l’ordre est défini
par les séquences codantes de l’ADN. La diversité du protéome est
bien supérieure à la diversité prévue par le génome. L’étude de l’ADN
et du transcriptome ne suffit donc pas à la compréhension des méca-
nismes moléculaires physiologiques ou physiopathologiques.
▲
▲La spectrométrie de masse est une méthodologie analytique connue
depuis longtemps par les chimistes, et récemment adaptée à l’analyse
des protéines. Cette approche est très puissante car elle détermine avec
précision la masse moléculaire d’un peptide, ce qui permet son identi-
fication.
▲
▲La complexité protéique des échantillons biologiques bruts est le pro-
blème majeur de l’analyse par spectrométrie de masse. Plusieurs tech-
niques de fragmentation ont été proposées. L’électrophorèse 2D et la
chromatographie liquide sont les deux techniques les plus utilisées
actuellement.
▲
▲La spectrométrie de masse permet également l’étude des modifications
post-traductionnelles des protéines. Ce point est crucial car les inter-
actions protéiques ou les activités enzymatiques dépendent fréquem-
ment de ces modification qualitatives.
▲
▲L’apport de l’analyse du protéome en cancérologie et de la spectro-
métrie de masse pour le diagnostic des erreurs du métabolisme est déjà
évident. On devrait assister dans un avenir proche au développement
de la protéomique dans d’autres spécialités telle que l’endocrinologie.
points FORTS
Génome
Dossier
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Métabolismes Hormones Diabètes et Nutrition (VII), no2, mars/avril 2003

Métabolismes Hormones Diabètes et Nutrition (VII), no2, mars/avril 2003
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téome) ? Quelles sont les modifica-
tions post-traductionnelles portées
pas les protéines ? Quelles sont les
interactions physiques ou fonction-
nelles survenant entre ces protéines?
Pour répondre à ces questions, un
effort très important a été réalisé ces
dernières années dans le développe-
ment de technologies innovantes et
complémentaires, dont la spectro-
métrie de masse est certainement
l’exemple le plus frappant.
Un bref rappel sur la synthèse des
protéines est présenté dans la pre-
mière partie de cet article. Les prin-
cipales approches méthodologiques
actuellement disponibles dans l’étude
du protéome sont décrites dans la
deuxième partie. Finalement, un bref
aperçu des répercussions déjà per-
ceptibles en biologie clinique est
abordé dans la dernière partie.
La synthèse des protéines
Les différentes étapes de la synthèse
des protéines sont maintenant bien
connues (figure 2). Le point de départ
est le gène et le produit final est une
chaîne polypeptidique composée
d’acides aminés dont la séquence
protéique dépend directement de la
séquence nucléotidique. Les gènes
sont organisés en exons comprenant
l’information indispensable à la syn-
thèse du polypeptide et en séquences
non traduites en acides aminés.
Deux types de séquences non tra-
duites sont décrites. Les séquences
d’ADN transcrites en ARN, mais
non traduites forment les introns.
Elles participent notamment à la
maturation des ARN. Les séquences
non transcrites en ARN servent à la
régulation de l’expression des gènes.
Elles sont situées majoritairement
en amont du premier exon. Elles font
partie du gène, bien qu’il soit sou-
vent difficile de les délimiter préci-
sément. Les exons et les introns sont
transcrits en ARN dans le noyau,
puis cet ARN subit une maturation,
également dans le noyau, consistant
à conserver uniquement les exons et
à éliminer les introns. Le produit est
appelé ARN messager (ARNm).
L’ARNm est exporté dans le cyto-
plasme où la polymérisation des
acides aminés en chaîne polypepti-
dique a lieu au niveau des ribosomes
qui sont composés d’ARN et de pro-
téines. À partir de cette étape, deux
voies de synthèse sont possibles
selon la destinée des protéines. Les
protéines secrétées ou destinées à la
membrane plasmique, aux lysosomes
ou aux structures cellulaires compo-
sant cette voie de synthèse, pénè-
trent dans le recticulum endoplas-
mique (REG). Le signal dirigeant la
protéine vers cette voie de sécrétion
est une séquence peptidique connue
sous le nom de signal peptide. Dans
le REG, les protéines subissent une
Figure 1. Les différentes étapes de l’étude du gène à la fonction biologique.
Figure 2. Biosynthèse des protéines.
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ADN
ADN
Exon 1
Intron 1 Intron 2
Exon 2 Exon 3
ARN
ARNm
Complexe de transcription
Reticulum endoplasmique
Appareil de Golgi
Membrane associée
Transmembrane
Protéines
sécrétées
Génomique
ADN
– Séquences
nucléotidiques
– Modifications
épigénétiques
Protéines
– Expression
des protéines
– Modifications
post-traductionnelles
– Interactions
protéine-protéine
– Complexes
multiprotéiques
– Complexes
multienzymatiques
ARNm
– Quantification
– RNA editing
Transcriptome Protéome Réseau
protéique
Fonction
biologique

Métabolismes Hormones Diabètes et Nutrition (VII), no2, mars/avril 2003
première glycosylation et la struc-
ture tridimentionnelle est organisée
grâce à la formation de ponts disul-
fures entre cystéines. Puis les pro-
téines sont transférées dans l’appareil
de Golgi. Trois compartiments diffé-
rents composent l’appareil de Golgi,
dont la fonction principale est la
glycosylation des glycoprotéines
mais, également, l’ajout de lipides
permettant l’ancrage des protéines
dans la membrane plasmique. La
maturation protéolytique de certaines
protéines par les proconvertases
(furin) a aussi lieu dans l’appareil de
Golgi. Finalement, les protéines sont
dirigées dans des vésicules de sécré-
tion d’où elles sont expulsées grâce
à la fusion des vésicules de sécré-
tion avec la membrane plasmique.
Les protéines destinées à la cellule
ne contiennent pas de signal peptide
et ne pénètrent pas dans le REG.
Après synthèse dans des ribosomes
libres, ces protéines peuvent éga-
lement subir des maturations post-
traductionnelles, mais elles ne sont
pas glycosylées. Différents signaux
protéiques dirigent ces protéines vers
un compartiment cellulaire spécifique
tel que le cytoplasme, le noyau, les
mitochondries, etc. Toutes les étapes
de la synthèse des protéines sont
régulées par des mécanismes bio-
chimiques complexes.
La diversité protéique est due à la
diversité génétique mais aussi à
différents mécanismes moléculaires
qui permettent d’obtenir plusieurs
chaînes polypeptides à partir d’un
même gène. L’utilisation de promo-
teurs alternatifs ou l’épissage alter-
natif des ARNm sont des exemples
de mécanismes responsables de cette
diversité. Le vieil adage affirmant
qu’il suffit de déterminer la séquence
exonique (ADN) pour connaître la
séquence protéique vient d’être remis
en cause avec la description d’un
processus complexe de maturation
des ARNs appelée RNA editing
concernant notamment certains
récepteurs de la sérotonine. Le RNA
editing modifie la séquence nucléo-
tique de l’ARN, ce qui une entraîne
une modification de l’enchaînement
des acides aminés. Ce mécanisme
reste exceptionnel, mais il devait
néanmoins être cité comme source
de diversité protéique.
L’analyse des processus biologiques
ne peut donc pas se limiter à l’ana-
lyse de la structure de l’ADN et de
l’expression des gènes, mais elle
doit également prendre en compte
l’expression des protéines.
Analyse qualitative
des protéines exprimées
dans un tissu
ou des cellules
Il s’agit d’une des questions les plus
complexes mais certainement d’une
des plus pertinentes en recherche
fondamentale ainsi qu’en biologie
clinique. Pendant de nombreuses
années, l’étude du protéome dans
une cellule ou un tissu était essen-
tiellement réalisée par l’électro-
phorèse en deux dimensions (2D-
PAGE). Cette méthode ancienne
était difficile à maîtriser, peu repro-
ductible, et elle ne déterminait pas la
nature exacte des protéines étudiées.
Le développement de spectromètres
de masse adaptés à l’analyse de pep-
tides a levé cet inconvénient. En
quelques années, la spectrométrie
de masse (SM) est devenue le point
central de l’analyse du protéome
autour duquel plusieurs techniques,
anciennes ou nouvelles, ont été déve-
loppées (figure 3). L’électrophorèse
en deux dimensions fait partie de
ces techniques anciennes qui ont été
améliorées depuis l’utilisation de la
SM dans l’étude du protéome.
L’électrophorèse
en deux dimensions
Cette technique utilise deux carac-
téristiques dépendant directement
de la séquence en acides aminés
des protéines : le point isoélectrique
(PI) défini par le pH, auquel la pro-
téine n’est plus chargée car toutes
les charges négatives sont annulées
par des charges positives, et la masse
moléculaire de la protéine étudiée.
Cette technique consiste en une
Dossier
Génome
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Figure 3. La spectrométrie de masse : le cœur de la protéomique.
Approche génétique :
– double hybride
– protéines recombinantes
Purification
Crosslink chimique
Spectrométrie
de Masse
Chromatographie
liquide
Interaction
protéine-protéine
Gel 2D

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séparation des protéines, dans un
premier temps, par électrophorèse,
dans un gradient de pH. Lorsque les
protéines arrivent au pH correspon-
dant à leur PI, la migration s’arrête.
Au niveau d’un même pH, il existe
donc plusieurs protéines dont les
masses moléculaires diffèrent. Une
deuxième électrophorèse est réalisée
dans un second temps, mais dans un
sens perpendiculaire à la précédente
migration, en présence de SDS, ce
qui permet d’uniformiser la charge
des protéines présentes dans le gel
(charge négative) et donc de les
séparer selon leur masse molécu-
laire. Un nombre impressionnant
de “spots” est ainsi visible sur ces
gels, par coloration des protéines
avec du bleu de coomassie et des
colorants fluorescents. Chaque spot
correspond à une ou plusieurs pro-
téines.
Cette technique est une méthode
comparative d’analyse du protéome.
Les résultats obtenus sont fortement
informatifs. Néanmoins, l’identifi-
cation précise des protéines à partir
d’un tissu unique n’est pas possible.
Cette étape d’identification est l’étape
clé de la protéomique. Elle est actuel-
lement réalisée par la spectrométrie
de masse (SM) (figure 4).
La spectrométrie de masse
La SM a d’abord été développée par
les chimistes pour des molécules de
petites masses moléculaires. L’amé-
lioration technologique a permis
d’appliquer récemment cette méthode
à l’analyse des peptides. La SM com-
prend trois étapes essentielles. La
première étape consiste en une ioni-
sation de la molécule étudiée. Dans
la deuxième étape, un analyseur de
masse sépare les particules chargées
en fonction de leur masse et de leur
charge. Un détecteur d’ions réalise la
troisième étape. Plusieurs techniques
d’ionisations ont été proposées, dont
une méthode par laser pour des pep-
tides déposés sur des supports solides
(matrix-assisted laser desorption/
ionization MALDI) ou une autre par
electrospray pour des peptides en
solution (electrospray ionization).
Plusieurs principes d’analyseur de
masse ont été développés : les ana-
lyseurs magnétique, quadripolaire, à
piégeage d’ions ou à temps de vol
(TOF). Le choix de la technologie
dépend de plusieurs paramètres
comme la complexité de l’échantillon
à analyser et la précision désirée de
la détermination de la masse molé-
culaire.
L’identification des protéines obte-
nues par gel 2D-PAGE nécessite
souvent une protéolyse de la pro-
téine d’intérêt prélevée à partir d’un
spot du gel 2D afin d’augmenter la
précision de la détermination de la
masse moléculaire. La trypsine est
l’une des protéases le plus souvent
utilisée. Elle agit sur la membrane
ou bien directement dans le gel.
Lorsque la séquence en acides aminés
est connue, il est relativement aisé
de prévoir le profil de protéolyse de
la protéine d’intérêt. En revanche, si
la protéine étudiée est inconnue,
l’identification devient possible en
comparant les profils de protéolyse
des protéines connues dans les bases
de données avec celui observé pour
la protéine d’intérêt. Le couplage de
l’ionisation par MALDI, avec un
analyseur de type TOF, est généra-
lement la méthode utilisée pour cette
approche appelée “identification pro-
téique par cartographie peptidique”.
Cette approche très performante pos-
sède certains inconvénients malgré
les nombreux progrès réalisés ces der-
nières années. Les gels 2D manquent
de sensibilité, notamment pour les
protéines faiblement exprimées et
non vues par les colorations utilisées.
De plus, il est fréquent qu’un spot
contienne plusieurs protéines, ce qui
gêne la précision de l’analyse par
SM.
Une alternative à l’utilisation des gels
2D-PAGE consistant à fragmenter
l’échantillon par une chromatographie
en phase liquide (LC) a donc été
développée. Cette approche, séparant
notamment les peptides selon leur
propriétés hyrophobes, peut être réa-
lisée par une chromatographie en
haute pression en phase liquide
(HPLC). Cela permet une séparation
très fine des peptides les uns par
rapport aux autres. Ce système a été
miniaturisé et il est directement cou-
plé au spectromètre de masse, car les
solvants utilisés pour l’élution des
peptides sont compatibles avec l’ioni-
sation par electrospray (ESI). Cette
approche est particulièrement per-
formante car son couplage avec un
Figure 4. Les différentes étapes de l’analyse par spectrométrie de masse.
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Conditions A
Extraction
des protéines
cellulaires
Migration en fonction
de la masse moléculaire
Migration dans
un gradient de pH
Prélèvement des
spots d’intérêt –
Protéolyse
des échantillons
Conditions A
Spectromètre
de masse
Spectres obtenus par spectrométrie de masse
Protéine 1
Protéine 2
Protéine 3

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analyseur de masse en tandem (MS/
MS) permet de déterminer la séquence
exacte des peptides analysés. L’ana-
lyse d’échantillons protéiques très
complexes, comprenant plusieurs
dizaines de milliers de peptides, est
alors possible. L’information obtenue
par le séquençage du génome humain
devient alors très pertinente puisqu’il
est possible de définir avec précision
les protéines d’intérêt en comparant la
séquence protéique obtenue par SM
aux séquences protéiques déduites
des séquences nucléotidiques codantes
ou des EST répertoriées dans les bases
de données internationales. L’analyse
d’échantillons très complexes permet
d’envisager l’étude du protéome par
SM dans un très proche avenir comme
un examen de routine.
La fragmentation des échantillons
protéiques par protéine-array (voir
ci-après) a également été proposée.
Cela favorise une sélection des pro-
téines sur des critères fonctionnels et
non plus sur leurs propriétés physico-
chimiques.
Analyse qualitative
des modifications
post-traductionnelles
Le couplage du gel 2D ou de la chro-
matographie liquide à la SM permet
de répertorier les protéines présentes
dans un échantillon biologique à un
instant donné. Néanmoins, cette ana-
lyse ne reflète que partiellement les
variations qualitatives des protéines.
En effet, les protéines peuvent subir
des modifications post-traduction-
nelles dont certaines surviennent
durant leur synthèse (glycosylation,
sulfatation, hydroxylation, protéo-
lyse), alors que d’autres participent
aux mécanismes de régulation de
l’activité biologique, comme la phos-
phorylation de certains acides aminés.
Pendant de nombreuses années, les
méthodes disponibles étaient compli-
quées, dépendant de la radioactivité,
et peu spécifiques. La SM a fortement
simplifié ces analyses puisqu’elle
permet d’identifier précisément les
modifications post-traductionnelles
d’une protéine donnée. La phospho-
rylation en est un exemple. Cette
modification qualitative des protéines
participe aux mécanismes de régu-
lation de leur activité biologique.
Pour les enzymes, l’effet peut être
une inhibition ou bien une activation
de la fonction enzymatique. Il est bien
connu que le niveau de phosphory-
lation des récepteurs régule leur inter-
action avec d’autres protéines. Cet
état est modulé très finement par des
kinases ou des phosphatases parfois,
elles-mêmes régulées par phosphory-
lation. La SM a fortement simplifié
l’étude de ces mécanismes de régu-
lation en permettant une étude directe
de la phosphorylation des protéines.
Analyse quantitative
du protéome
L’analyse quantitative est un point très
important de l’analyse de l’expression
des protéines. Malheureusement, la
spectrométrie de masse ne permet pas
une analyse quantitative du protéome.
Les variantes proposées sont plutôt
des méthodes semi-quantitatives.
Analyse des interactions
protéiques
Le protéome est défini par la popu-
lation protéique présente dans un
échantillon au moment du prélève-
ment. La destinée d’une protéine est
d’interagir avec une autre protéine
jusqu’à former un réseau protéique
fonctionnel. Le déterminisme du pro-
téome dans une cellule dépend du
génome, identique dans toutes les
cellules, mais aussi de l’état de diffé-
rentiation de la cellule. Mais en même
temps, cette différentiation cellu-
laire dépend des réseaux protéiques.
Comme nous l’avons vu précédem-
ment, la spectrométrie de masse per-
met de faire un état des lieux des pro-
téines présentes à un moment donné
mais elle ne renseigne pas sur l’as-
pect fonctionnel, et notamment sur
les interactions protéine-protéine.
Plusieurs méthodologies cherchent
à résoudre ce point fondamental,
indispensable à la compréhension
des mécanismes moléculaires et
à l’émergence de thérapeutiques
innovantes. Leur diffusion est pour
l’instant limitée aux laboratoires de
recherche. Deux grandes voies sont
suivies : une approche génétique et
une approche plus directement liée
à la biochimie des protéines.
L’approche génétique
Les méthodes génétiques sont fondées
sur les techniques d’ADN recombi-
nant. Contrairement aux approches
décrites précédemment, les protéines
sont modifiées. L’approche ayant
retenu le plus d’attention ces dernières
années est la méthode dite en double-
hybride. Cette technique consiste à
rechercher les protéines interagissant
avec la ou les protéines d’intérêt
(protéine appât) grâce à un système
ingénieux développé dans la levure.
Ce système est fondé sur la complé-
mentarité existant entre un domaine
de liaison à l’ADN et un domaine de
transactivation de facteurs de trans-
cription. Si ces deux domaines sont
fusionnés à des protéines qui inter-
agissent, il y aura expression d’un
gène rapporteur contenant l’élément
de réponse reconnu par le domaine
de liaison à l’ADN. Cette méthode a
permis la caractérisation de nombreux
cofacteurs des récepteurs nucléaires.
Une autre approche utilisant les
protéines recombinantes consiste à
rajouter une étiquette à des protéines
appâts en modifiant l’ADN codant
pour ces protéines. Cet ADN est
ensuite introduit dans des cellules
eucaryotes afin que les protéines
recombinantes interagissent avec
leurs partenaires. Les complexes pro-
téiques sont ensuite purifiés en utili-
sant une colonne d’affinité spécifique
de l’étiquette rajoutée. Les protéines
associées sont alors caractérisées
par spectrométrie de masse. Cette
méthodologie renseigne sur l’aspect
fonctionnel.
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