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TRAVAUX de RECHERCHE (1994-2002)
A : Mécanismes d’action des médicaments anticancéreux
1. Induction de la différenciation érythroïde par les anthracyclines…
2. Induction de la différenciation érythroïde par l’acide butyrique
3. Inhibition de la différenciation érythroïde par le monoxyde d’azote (NO)
4. Induction de la différenciation des cellule HL-60 par l’ACLA et le butyrate
5. Les radicaux oxygénés : messager de l’effet différenciant…
6. Mise en évidence de la production de radicaux libres dans les cellules K562 et HL-60
7. Rôle des radicaux libres dans le processus de différenciation des cellules K562 et HL-
60
8. Stimulation du facteur de transcription AP-1 dans les cellules HL-60
9. Modulation du fer intracellulaire par l’ACLA dans les cellules leucémiques
10. Conclusions
A- MECANISMES D’ACTION DES MEDICAMENTS ANTICANCEREUX : rôle des facteurs de
transcription et des radicaux oxygénés dans la différenciation des cellules leucémiques.
Les cellules leucémiques sont généralement arrêtées dans leur maturation à un stade précoce et
prolifèrent rapidement. Toutefois l’acquisition d’une autonomie de croissance ne fait pas perdre à la
cellule tumorale tout son potentiel de différenciation, et la chimiothérapie différenciante, dont le principe
est de favoriser la différenciation des cellules au détriment de leur prolifération, peut apporter une aide à
la chimiothérapie conventionnelle cytotoxique (Beere and Hickman,1993, Anticancer Drug Design 8:299-322.
Fenaux et al., 1994, Lancet 343:1033. Reiss et al., 1986, Cancer Treat. Rep. 70:201-18). Cette approche
thérapeutique est déjà utilisée avec succès dans le cadre du traitement de patients atteints de leucémie
aiguë promyélocytaire de type 3 par l’acide rétinoïque tout trans (ATRA) (Degos et al., 1995, Blood 85:2643-
53). Néanmoins d’autres agents pharmacologiques, comme l’acide butyrique (Chen and Breitman, 1994,
Cancer Res. 54:3494-9. Newmark and Young, 1995, J. Cell. Biochem. Supp. 22:247-53) ou les anthracyclines
(Casazza, 1988, In: Lown, J.W. ed. Bioactive Molecules. Amsterdam: Elsevier, pp 715-734), sont capables de
provoquer la différenciation, ou re-normalisation, de cellules tumorales. Notre but était de mieux
comprendre les mécanismes moléculaires à l’origine de l’effet différenciant des anthracyclines et de
l’acide butyrique afin de pouvoir éventuellement les proposer en clinique, en association avec d’autres
traitements, cytotoxiques ou différenciants.
La lignée humaine K562, dérivée d’un patient atteint d’une leucémie myéloïde chronique, nous a permis
d’étudier les mécanismes de la différenciation érythroïde induite par les anthracyclines et l’acide
butyrique. Nous avons également utilisé la lignée HL-60 dont il est possible d’induire la différenciation
vers la voie granulocytaire avec les mêmes agents.
sommaire
A-1 Induction de la différenciation érythroïde par les anthracyclines : rôle des facteurs de
transcription GATA-1 et NF-E2.
Les antibiotiques de la classe des anthracyclines, aclarubicine (ACLA) et surtout doxorubicine (DOX),
sont largement utilisés dans la chimiothérapie conventionnelle de leucémies ou de tumeurs solides. En
plus de ces effets cytotoxiques, des études, in vitro et in vivo, ont montré que le traitement de cellules

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leucémiques ou de tumeurs solides par des anthracyclines, à des doses subtoxiques, provoque la
différenciation des cellules cancéreuses et l’arrêt de leur prolifération (Leukemia Lymphoma 1997).
Il a été montré au laboratoire que le traitement des cellules K562 par la DOX et l’ACLA induit de façon
irréversible la différentiation érythroïde des cellules. Celle ci est caractérisée par l’expression de la
glycophorine-A, une protéine membranaire spécifique des érythrocytes, une augmentation de la synthèse
d’hémoglobine, et l’apparition de nouveaux types d’hémoglobines embryonnaires (Gower-2, X, Portland)
et fœtale (F) absentes des cellules non traitées (Leukemia Lymphoma 1997). L’ACLA et la DOX
entraînent une augmentation du taux d’ARNm codant pour les chaînes g et e de globines ainsi que pour
la porphobilinogène déaminase (PBGD), un enzyme clef de la synthèse de l’hème (Leukemia Lymphoma
1997). Cependant, les résultats ont rapidement mis en évidence des différences entre DOX et ACLA qui
sont pourtant des molécules très proches chimiquement. Ces différences, qui s’observent à plusieurs
niveaux, sont résumées dans le tableau ci-dessous :
Traitement des cellules
DOX ACLA
Taux de différenciation
maximal corrélé à une…
inhibition de
croissance totale inhibition de croissance partielle
Hémoglobine majoritaire X Gower-I
Synthèse protéique (hors globines) inhibée stimulée (x 2)
Récepteur à l’érythropoïétine non modulé augmentation ARN
augmentation sites de liaison
GATA-1, NF-E2 non modulé augmentation ARN
augmentation liaison à l’ADN
Stabilisation des ARN oui non
Activation transcriptionnelle non oui
Pour notre part, nous avons montré, par des expériences de transcription à partir de noyaux isolés et de
stabilité d’ARN, que l’ACLA déclenche une activation de la transcription des gènes érythroïdes alors que
la DOX provoque une stabilisation des ARN de globine et de PBGD (Cell Growth Differ. 1996). De plus,
seule l’ACLA augmente l’expression des ARN codant pour les facteurs de transcription érythroïdes
GATA-1 et NF-E2, accroît leur liaison à l’ADN, et stimule l’activité de promoteurs dépendant de GATA
(Cell Growth Differ. 1996 ; Leukemia Lymphoma 1997).
En conclusion, les deux anthracyclines, ACLA et DOX, provoquent la différenciation érythroïde des
cellules K562 mais agissent par des mécanismes moléculaires différents.
sommaire
A-2 Induction de la différenciation érythoïde par l’acide butyrique.
L’acide butyrique est un acide gras naturel présent dans la nourriture et produit dans le tube digestif par
fermentation bactérienne. Il est connu depuis longtemps pour avoir de nombreux effets sur les cultures
cellulaires (arrêt de la prolifération en phase G1, stimulation de la synthèse des protéines, changement de
la morphologie cellulaire et du cytosquelette, différenciation…) et, en particulier, comme inducteur de la
synthèse d’hémoglobine et de la différenciation érythroïde (Kruh, 1982, Mol. Cell. Biol. 42 :65-82. Anderson
et al., 1979, Nature 278:364-5). Des essais cliniques ont montré la capacité de l’acide butyrique, ou de
dérivés tels que la tributyrine, à stimuler la synthèse d’hémoglobine, seul ou en association avec l’ATRA
(Perrine et al., 1993, N. Engl. J. Med. 328:81-6. Atweh et al., 1999, Blood 93:1790-7. Witt et al., 2000, Am. J.
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Hematol. 64:319-21). D’autres essais récents ont tenté d’évaluer l’intérêt du butyrate ou de la tributyrine
dans le traitement de tumeurs solides ou, en association avec l’interleukine-2, dans le cas de cancer
colorectal (Conley et al., 1998, Clin. Cancer Res. 4:629-34. Douillard et al., 2000, Cancer Immunol. Immunother.
49:56-61).
Il nous a donc semblé pertinent d’étudier le(s) mécanisme(s) moléculaire(s) de la différenciation
érythroïde des cellules K562 induite par l’acide butyrique, et d’en faire une comparaison avec ce que nous
connaissions concernant les anthracyclines. Nous avons obtenu, pour une dose optimale de 0,5 mM, une
différenciation de 50% des cellules et une inhibition de croissance de 70% après 3 jours dans nos
conditions de culture. De plus, nous avons montré le caractère irréversible de l’induction de différenciation
par l’acide butyrique (Leukemia 1997). L’analyse de l’expression des gènes érythroïdes en fonction du
temps à permis de mettre en évidence la surexpression des gènes de γ-globine, PBGD et des facteurs de
transcription GATA-1 et NF-E2 (Leukemia 1997). Par ailleurs, la liaison à l’ADN de GATA-1 et NF-E2 est
stimulée par l’acide butyrique dans les cellules K562 (Bridges et al., 1996, Eur. J. Haematol. 56:62-7).
L’implication des facteurs de transcription GATA-1 et NF-E2 dans le mécanisme d’action de l’acide
butyrique a été confirmée par l’utilisation d’oligonucléotides antisens. L’inhibition de la synthèse des
protéines GATA-1 et NF-E2 par les oligonucléotides antisens, visualisée par Western blot, empêche la
différenciation induite par l’acide butyrique (Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998). Ces résultats font
apparaître une certaine similitude entre l’acide butyrique et l’ACLA qui provoquent tous deux une
activation transcriptionnelle des gènes érythroïdes dépendante de GATA-1 et NF-E2. Néanmoins, le gène
du récepteur à l’érythropoïétine (R-EPO) qui est stimulé par l’ACLA ne l’est pas par l’acide butyrique
(Leukemia 1997).
Un des multiples effets de l’acide butyrique est d’augmenter l’acétylation des protéines histones, en
inhibant l’histone-déacétylase, et de favoriser ainsi l’accessibilité des sites d’initiation de transcription et
de liaison des facteurs-cis. Un tel mécanisme intervient probablement dans l’induction de différenciation
par l’acide butyrique. Mais peut-il en expliquer le caractère spécifique ? Par ailleurs, il a été montré
récemment que des protéines non-histones peuvent être substrat des histone-acétyltransférases, et en
particulier le facteur de transcription GATA-1 dont l’activité est alors réduite (Boyes et al., 1998, Nature
396:594-8). A l’inverse, des coactivateurs de transcription, tels que CBP, portent une activité histone-
acétyltransférase (Bannister and Kouzarides, 1996, Nature 384:641-3). L’utilisation de Trichostatine-A, un
inhibiteur d’histone-déacétylase, ainsi que l’étude de l’acétylation de GATA-1 pourraient apporter des
éléments de réponse.
sommaire
A-3 Inhibition de la différenciation érythroïde par le monoxyde d’azote (NO).
L’effet de NO sur l’expression des gènes érythroïdes a surtout été étudié dans le contexte de la régulation
du taux de fer intracellulaire. Néanmoins, NO peut influer sur la croissance et la différenciation cellulaire
comme cela a été montré pour certaines lignées cellulaires d’origine hématologique (Magrinat et al., 1992,
Blood 88:1880-4. Shami et al., 1995, Leukemia Res. 19:527-32. Dugas et al., 1996, Blood 88:3528-34. Yamazaki
and Birnboim, 1995, Leukemia Res. 19:325-35. Suhasini et al., 1995, Cell Growth Differ. 6:1559-66).
En utilisant des donneurs chimiques de NO tels que le nitroprussiate de sodium (SNP), la S-nitroso-N-
acétyl-penicillamine (SNAP), ou le 3-morpholinosydnonimine (SIN-1), nous avons montré que la
différenciation des cellules K562 induite par l’ACLA, la DOX ou l’acide butyrique est inhibée efficacement
par une faible dose de donneur de NO (100 µM) (Biochem. Pharmacol. 1999). A cette dose l’expression
des gènes érythroïdes n’est pas affectée par les donneurs de NO et il faut une concentration plus forte (1
mM de SNP) pour observer une diminution de l’expression des gènes de globine et PBGD. L’expression
des facteurs de transcription GATA-1 et NF-E2 reste inchangée (Biochem. Pharmacol. 1999). Par ailleurs,
la différenciation induite par l’hémine n’est sensible qu’au SIN-1, connu donner naissance au peroxynitrite
en générant non seulement NO mais aussi des ions superoxydes.
Plusieurs hypothèses peuvent être formulées pour expliquer l’effet inhibiteur de NO au niveau post-
traductionnel : 1) une augmentation de l’expression de l’hème oxygénase, 2) l’inactivation d’un enzyme de
la voie de synthèse de l’hème tel que la δ-aminolévulinate synthase érythroïde (eALAS), ou 3) une
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modification de la disponibilité intracellulaire du fer. De plus, un effet inhibiteur de NO sur la liaison à
l’ADN de GATA-1 et/ou NF-E2 permettrait d’expliquer la diminution d’expression des gènes érythroïdes.
sommaire
A-4 Induction de la différenciation granulocytaire des cellules HL-60 par l’ACLA et l’acide
butyrique : sécrétion de métalloprotéinases et pouvoir invasif.
Afin d’étendre notre étude des mécanismes de différenciation induite par les anthracyclines et l’acide
butyrique, nous avons choisi un autre modèle de différenciation de cellules leucémiques humaines : la
lignée promyélocytaire HL-60. Dans le cadre du stage de DEA de Mlle Doriane Richard (année 2000-
2001), nous avons montré la possibilité d’induire une différenciation granulocytaire des cellules HL-60 par
l’ACLA (25 nM) et l’acide butyrique (0,5 mM). Un taux de différenciation de 75% est obtenu au troisième
jour, accompagné d’une inhibition de croissance de 70% et nous avons confirmé la nature granulocytaire
des cellules différenciées par une observation morphologique après coloration des cellules.
La sécrétion de métalloprotéinases (MMP) et en particulier de gélatinase-A (ou MMP-9) a été caractérisée
récemment dans les cellules leucémiques et lignées dérivées (Janowska-Wieczorek et al., 1999, Br. J.
Haematol. 105:402-11. Matsuzaki and Janowska-Wieczorek, 1997, J. Cancer Res. Clin. Oncol. 123:100-6). Nous
avons montré par différentes techniques (zymographie, immuno-dosage et RT-PCR) que le traitement
des cellules HL-60 par l’ACLA s’accompagne d’une augmentation de la sécrétion de proMMP-9 liée a une
augmentation de l’expression de son ARN messager (Int. J. Oncol. 2002). En revanche, l’acide butyrique
stimule la sécrétion de pro-MMP-9 mais ne provoque pas d’augmentation du taux d’ARNm MMP-9 (FEBS
Let. 2002). Ce résultat est inattendu car l’acide butyrique est généralement connu pour stimuler la
transcription de nombreux gènes (globine par exemple). De plus, nous avons montré que la capacité de
migration et d’invasion des cellules HL-60 est augmentée en réponse au traitement par l’ACLA ou le
butyrate (Int. J. Oncol. 2002 ; FEBS Let. 2002).
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A-5 Les radicaux oxygénés : messagers de l’effet différenciant des anthracyclines et de l’acide
butyrique dans les cellules K562 et HL-60.
Parce que les anthracyclines (à forte dose) sont capables de générer des radicaux libres, responsables
en partie de leur toxicité cardiaque (Powis, 1989, Free Radic. Biol. Med. 6:63-101. Nowak and Drzewoski, 1996,
Cancer J. 9:296-303. Singal et al., 1997, FASEB J. 11:931-6), nous avons recherché l’implication d’un stress
oxydant dans le processus de différenciation des cellules K562 soumises aux doses différenciantes
d’ACLA et de DOX. L’acide butyrique peut lui aussi provoquer un stress oxydant, par exemple lors de la
différenciation de cellules de cancer du colon (Benard and Balasubramanian, 1997, Mol. Cell. Biochem.
170:109-14. Giardina and Inan, 1998, Biochem. Biophys. Acta 1401:277-88), et nous l’avons donc inclus dans
notre étude.
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a) Mise en évidence de la production de radicaux libres dans les cellules K562 et HL-60
Nous avons démontré que les très faibles doses d’anthracyclines que nous employons pour la
différenciation (25.10-9 mol/l) sont capables de générer des radicaux libres, et que ce stress oxydant est
un médiateur important, si ce n’est obligé, de l’effet différenciant des anthracyclines. La production de
radicaux libres a été évaluée par spectrofluorimétrie à l’aide de sondes fluorescentes (dihydroéthidine et
diacétate de dichlorofluorescéine) dans nos deux principaux modèles cellulaires : les lignées leucémiques
K562 (modèle de différenciation érythroïde) et HL-60 (modèle de différenciation granulocytaire) et elle est
maximale après 3h de traitement (Leukemia Res. 2002).
Une collaboration avec le Dr. Pascale Guiraud et Maud Andriollo à Grenoble nous a permis de mieux
caractériser ce stress oxydant dans le modèle K562. Nous avons ainsi montré que le traitement par
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l’ACLA et la doxorubicine (DOX) à dose différenciante provoque principalement une réduction du taux de
glutathion intracellulaire et de l’activité glutathion-peroxydase. D’autres marqueurs de stress oxydant
intracellulaire sont affectés et des différences sont perceptibles pour chaque anthracycline (Free Radic.
Biol. Med. 2000). Ces résultats ont donc confirmé l’existence d’un stress oxydant dans les cellules traitées
par les très faibles doses d’anthracyclines.
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b) Rôle des radicaux libres dans le processus de différenciation des cellules K562 et HL-60
Afin de démontrer le rôle des radicaux libres comme médiateurs de l’effet différenciant des antracyclines
et du butyrate, nous avons employé plusieurs molécules antioxydantes : N-acétylcystéine (NAC),
pyrrolidine-dithiocarbamate (PDTC), vitamine E, et un dérivé naturel, la quercétine. Par la mesure de la
production de radicaux libres par spectrofluorimétrie, nous avons vérifié que le PDTC ou la vitamine E
inhibent bien la production de radicaux induite par l’ACLA ou le butyrate (Int. J. Oncol. 2002 ; FEBS Let.
2002). Tous les antioxydants utilisés sont capables d’inhiber totalement la différenciation des cellules
K562 (Free Radic. Biol. Med. 2000 ; Leukemia Res. 2002). Dans ce cas, nous avons également montré
que les antioxydants empêchent l’augmentation de l’expression des ARN érythroïdes induite par l’ACLA
ou l’acide butyrique (Free Radic. Biol. Med. 2000).
Dans le modèle HL-60, NAC, PDTC et vitamine E inhibent la différenciation induite par l’ACLA ou le
butyrate ainsi que l’augmentation de la sécrétion de pro-MMP-9 (y compris au niveau ARN dans le cas de
l’ACLA) (Leukemia Res. 2002 ; Int. J. Oncol. 2002 ; FEBS Let. 2002). Dans les 2 types cellulaires, la
prolifération est fortement ralentie par le traitement par l’ACLA et la présence d’antioxydant tend à
renforcer ce phénomène. La migration des cellules (passage à travers un filtre de polycarbonate) est un
phénomène indépendant de la sécrétion d’enzymes de dégradation de la matrice (MMP ou autres). Elle
est augmentée par l’ACLA et le butyrate mais n’est pas affectée par la présence d’antioxydants. On peut
donc dire que la migration est indépendante de la production de radicaux libres. En revanche, l’invasion
(passage à travers un filtre de polycarbonate recouvert de Matrigel® qui mime une matrice extracellulaire)
dépend de la production de MMPs ou autres enzymes dégradant la matrice. Elle est augmentée par
l’ACLA et le butyrate et inhibée en présence de NAC ou vitamine E (Int. J. Oncol. 2002 ; FEBS Let. 2002).
Ces résultats indiquent que les radicaux libres générés par l’ACLA ou le butyrate sont les médiateurs de
la différenciation et de l’augmentation de la sécrétion de MMP-9, qui est probablement une conséquence
de la différenciation. Cependant la sur-expression de MMP-9 (liée au stress oxydant) n’explique pas à elle
seule l’augmentation du pouvoir invasif des cellules traitées par l’ACLA ou le butyrate.
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c) Stimulation du facteur de transcription AP-1 dans les cellules HL-60
Le promoteur du gène MMP-9 comporte plusieurs sites de liaison pour des facteurs de transcription dont
un site NF-κB et un site AP-1. Ces deux types de facteurs de transcription sont connus pour être
sensibles au stress oxydant. Nous avons observé que l’ACLA stimule la liaison du facteur de transcription
AP-1 avec une cinétique comparable avec celle de la production de radicaux libres, c’est a dire maximale
après 3 heures de traitement par l’ACLA. De plus, le PDTC inhibe la liaison à l’ADN du facteur AP-1 dans
les cellules HL-60 traitées par l’ACLA (résultats non publiés). La nature des constituants du complexe AP-
1 (famille des protéines jun/fos…) stimulés par l’ACLA reste à déterminer. Par ailleurs, les quelques
résultats obtenus semblaient indiquer que le facteur NF-κB n’est pas affecté par l’ACLA dans les cellules
HL-60.
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A-6 Modulation du fer intracellulaire par l’aclarubicine dans les cellules leucémiques.
Nous avons adapté la technique de mesure du fer libre intracellulaire par spectrofluorimétrie, initialement
décrite par Epzstejn et coll. en 1997 (Epsztejn et al., 1997, Anal. Biochem. 248:31-40), et utilisant la calcéine
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