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N° d’Ordre ...................../LABIOGENE UNIVERSITE DE OUAGADOUGOU --------------UNITE DE FORMATION ET DE RECHERCHE LABORATOIRE DE BIOLOGIE MOLÉCULAIRE ET DE GÉNÉTIQUE MOLÉCULAIRE SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE (LABIOGENE) (UFR/SVT) Mémoire Présenté Par : SAWADOGO Salfo Pour l’obtention du Master II de Biologie Moléculaire et de Génétique Moléculaire Appliquées de l’Université de Ouagadougou SUR LE THÈME: Diagnostic moléculaire de Campylobacter, Salmonella et Shigella dans les échantillons de coproculture à Ouagadougou. Soutenu le 27 Décembre 2013 devant le jury composé de : Président : Pr Aboubakar S. OUATTARA, Professeur Titulaire, Université de Ouagadougou Membres : Pr Jacques SIMPORE, Professeur Titulaire, Université de Ouagadougou Dr Djeneba OUERMI, Maître Assistant, Université de Ouagadougou Préface du Coordonnateur du Master BIOGEMA De nos jours, les connaissances avancées en génétique et biologie moléculaires sont incontournables pour conduire des études de hautes valeurs ajoutées en sciences biologiques. Les outils de la Biologie moléculaire ont permis d’accomplir de grands progrès dans le domaine du diagnostic, de la pharmacie, de la thérapeutique, de l’agriculture et même dans l’aide à la justice par l’identification humaine. Les Universités et les laboratoires de recherche des Pays membres de l’UEMOA dans leur grande majorité, restent arrimés aux pays et laboratoires de recherche du Nord pour leurs besoins en recherches et activités en génétique et biologie moléculaires. Cet état de fait est lié au déficit en personnel qualifié et le manque de ressources financières et matériel pour conduire les recherches en local in situ. Cela a pour conséquence, une non maîtrise de la finalité ainsi que de l’utilisation des résultats et produits des recherches que nous conduisons, une surenchère du coût des examens et des études en biologie et génétique moléculaires. Un autre corollaire et non des moindres de cet état de fait est la fuite de capitaux mais également la fuite des cerveaux car les étudiants les plus compétents envoyés dans les pays du Nord ont tendance à y rester. Le master en Biologie Moléculaire et en génétique moléculaires appliquées (BioGeMA) a pour but de combler le vide constaté dans l’expertise en génétique et biologie moléculaires par la mise à disposition des pays de l’espace UEMOA, de personnels qualifiés, de haut niveau de compétences pour conduire des études et recherches en génétique et biologie moléculaires. Le master BioGeMA est : Un Master à dimension sous-régionale Géré par un réseau de chercheurs et praticiens en génétique et biologie moléculaires Soutenu par une plateforme technologique sous-régionale à LABIOGENE (Laboratoire de Biologie et de Génétique Moléculaires) Ce Master a pour objectif de former des biologistes, des pharmaciens, des vétérinaires et des médecins biologistes capables d’effectuer des diagnostics biomoléculaires dans des centres hospitaliers et d’élaborer des études d’investigations dans des structures de recherches. En outre, il ouvrira la porte d’études doctorales aux meilleurs étudiants pour permettre la formation de chercheurs et d’enseignantschercheurs afin d’assurer la relève du corps enseignants, la constitution d’une masse critique d’experts africains et la mise en place d’un véritable réseau africain de recherche dans le domaine ci-dessus cité. Professeur Jacques SIMPORE Professeur Titulaire de Biologie Moléculaire et de Génétique Moléculaire UFR/SVT - École Doctorale Sciences et Technologies Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page I DÉDICACES Je dédie ce travail : A feu mon Père SAWADOGO Mahamoudou , A ma Mère SAWADOGO Kadidiata, A mon épouse Assiénata, A mes enfants Neïla, Dallel et Ayman A mes frères et sœurs, A tous mes proches qui m’ont d’une manière ou d’une autre soutenu. Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page II REMERCIEMENTS Ce travail a été réalisé dans le laboratoire de biologie moléculaire du Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro ANNIGONI /Laboratoire de Biologie Moléculaire et de Génétique (CERBA/LABIOGENE). Nous exprimons notre profonde gratitude : A notre Directeur de mémoire, Pr Jacques SIMPORE, Professeur titulaire de Génétique et de Biologie moléculaires, Coordonnateur du Master BioGeMA, Directeur du laboratoire du Centre Médical Saint Camille (CMSC) à Ouagadougou, Directeur du Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro ANNIGONI /Laboratoire de Biologie Moléculaire et de Génétique (CERBA/LABIOGENE), Recteur de l’Université Saint Thomas d’Aquin , pour avoir accepté la direction de ce Master, pour le choix pertinent de ce thème, pour le support économique de cette étude et pour son encadrement exceptionnel. Au Pr Aboubakar S. OUATTARA, Professeur titulaire de Microbiologie et au Dr Djénéba OUERMI, Maître assistant, pour avoir accepté de faire partie du jury chargé d’apprécier ce travail, afin de l’améliorer non seulement dans sa forme mais aussi et surtout dans le fond. Au Dr Cyrille BISSEYE, pour son encadrement technique au laboratoire et son expertise dans la rédaction de ce mémoire. Au Dr Florencia DJIGMA et au Père Albert YONLI pour leurs appuis multiformes. A tout le personnel du CERBA/LABIOGENE et du laboratoire du Centre Médical Saint Camille de OUAGADOUGOU pour l’accueil et l’accompagnement durant ce travail Au corps professoral de l’UFR/SVT en général et celui du Master II de BioGeMA en particulier pour avoir contribué à notre formation. Au Directeur de la Clinique El Fateh SUKA, à mes collègues de service, à PORGO Lassane, à tous les amis pour les multiples soutiens. A Birama DIARRA, pour son soutien lors des manipulations et pendant la rédaction de ce mémoire. A toute la première promotion du Master II de BioGeMA, pour cette ambiance familiale et cette solidarité. A l’Union Economique et Monétaire Ouest Africaine (UEMOA) et à la Conférence Episcopale Italienne (CEI) pour leur soutien financier. Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page III RÉSUMÉ Introduction : A l’instar des autres pays en développement, les gastroentérites infectieuses demeurent un problème de santé publique au Burkina Faso. Salmonella spp., Shigella spp. et Campylobacter spp. font partie des causes majeures de ces pathologies. La coproculture, méthode de diagnostic habituelle utilisée telle qu’elle est pratiquée par les laboratoires de bactériologie du pays ne prend pas en compte la recherche de Campylobacter spp. La présente étude a pour objectif de déterminer concomitamment les fréquences de ces 3 bactéries entéropathogènes grâce à l’utilisation des méthodes modernes de diagnostic. Méthodes : L’étude a porté sur les échantillons de coproculture reçus en routine dans les deux laboratoires de la clinique El Fateh SUKA et du Centre Médical Saint Camille (CMSC) à Ouagadougou du 05 février au 09 mars 2013. L’examen bactériologique des selles a consisté en la recherche systématique de Salmonella et Shigella dans tous les échantillons, d’E. coli entéropathogène (ECEP) dans les échantillons des enfants d’âge inférieur ou égal à 2 ans. Après conservation des matières fécales à -80 °C pendant 4 à 5 mois, une PCR en temps réel ciblant les gènes 23SrRNA (Campylobacter), TtrB (Salmonella) et IpaH (gène commun à Shigella et à E. coli entéroinvasif (ECEI)) a été réalisée pour le diagnostic moléculaire. Résultats : Sur l’ensemble des 200 échantillons étudiés, la culture a été positive chez 12 (6,00%) patients. Shigella spp. et Salmonella spp. qui ont été recherchés dans tous les échantillons ont été isolés respectivement dans 5 cas (2,50%) et dans 3 cas (1,50%). E. coli entéropathogène, recherché uniquement dans 37 échantillons (âge des patients ≤ 2 ans) a été isolé 4 fois (10,81%). Le diagnostic moléculaire a été positif pour 20 échantillons (10,00%) dont Shigella spp./ECEI: 17 cas, Salmonella spp.: 1 cas et Campylobacter spp.: 2 cas. Conclusion : La présente étude a utilisé les méthodes de biologie moléculaire pour évaluer la fréquence de Salmonella spp., Shigella spp. et Campylobacter spp. dans les échantillons de selles reçus en routine pour examen bactériologique. Si dans l’ensemble, une faible fréquence de ces 3 genres bactériens a été constatée (10, 00%), ces résultats posent la problématique de la recherche de Campylobacter dans les échantillons de coproculture. Une caractéristique principale de cette étude est la faible sensibilité de la culture par rapport à la PCR dans le diagnostic de Shigella. Mots clés : Coproculture, PCR en temps réel, Shigella spp., Salmonella spp., Campylobacter spp., Burkina Faso. Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page IV ABSTRACT Introduction: Like other developing countries, the infectious gastroenteritis remain a public health problem in Burkina Faso. Salmonella spp., Shigella spp. and Campylobacter spp. are a member of major causes of these gastroenteritis. The stool culture, the usual method of diagnosis used such as it is practiced by the bacteriology laboratories of the country does not take into account the research for Campylobacter spp. The present study has for objective to determine concomitantly the frequencies of these 3 enteropathogenic bacteria thanks to the use of diagnosis modern methods. Methods: The study concerned the samples of stool culture received in routine to both laboratories of Clinique El Fateh SUKA and Centre Medical Saint Camille (CMSC) in Ouagadougou from February 05th till March 09th, 2013. The bacteriological examination of stool specimen consisted of the systematic research for Salmonella and Shigella in all the samples and for EPEC in the samples of the children with an age below or equal to 2 years. After samples preservation at -80 °C during 4 to 5 months, a real-time PCR targeting genes 23SrRNA (Campylobacter), TtrB (Salmonella) and IpaH (a multicopy gene exclusively found in all Shigella and Enteroinvasive E. coli (EIEC)) is performed for the molecular diagnosis. Results: On all the 200 studied samples, the culture was positive in 12 (6.00 %). Shigella and Salmonella that were searched in all samples were isolated respectively in 5 cases (2.50%) and in 3 cases (1.50%). Enteropathogenic E. coli (EPEC) that was studied in only 37 samples (patient age ≤ 2 years) was isolated four times (10.81%). The molecular diagnosis was positive in 20 samples (10.00 %) of which Shigella spp/EIEC.: 17 cases, Salmonella spp.: 1 case, Campylobacter spp.: 2 cases. Conclusion: The present study used the methods of molecular biology to estimate the frequency of Salmonella spp., Shigella spp. and Campylobacter spp. in the stool samples received in routine for bacteriological examination. If on the whole, a low frequency of 3 popular bacteria was noticed (10.00%), these results put up the problem of the research for Campylobacter in the samples of stool culture. The striking feature of this study is the low sensitivity of culture comparatively to PCR in Shigella diagnosis. Key words: Stool culture, Real- time PCR, Shigella spp., Salmonella spp., Campylobacter spp., Burkina Faso. Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page V Table des Matières Préface du Coordonnateur du Master BIOGEMA ....................................................................................... I DÉDICACES .............................................................................................................................................. II REMERCIEMENTS ................................................................................................................................. III RÉSUMÉ .................................................................................................................................................. IV ABSTRACT ................................................................................................................................................V Liste des tableaux .................................................................................................................................... IX Liste des figures ....................................................................................................................................... IX Liste des Abréviations ...............................................................................................................................X Introduction ............................................................................................................................................... 2 1. Objectifs de l’étude ............................................................................................................................ 5 Objectif général ...................................................................................................................................... 5 Objectifs spécifiques ............................................................................................................................... 5 2. Revue bibliographique ...................................................................................................................... 7 2.1. Vue d’ensemble des bactéries entéropathogènes.................................................................... 7 2.1.1. Définition.............................................................................................................................. 7 2.1.2. Les différentes bactéries entéropathogènes ...................................................................... 7 2.1.3. Aspects moléculaires de leur virulence : les îlots de pathogénicité................................. 8 2.1.4. Diagnostic dans les matières fécales .................................................................................. 9 2.2. Le genre Campylobacter .......................................................................................................... 11 2.2.1. Définition et historique ..................................................................................................... 11 2.2.2. Habitat, épidémiologie et pouvoir pathogène ................................................................. 12 2.2.3. Nomenclature et classification ......................................................................................... 13 2.2.4. Caractères culturaux et biochimiques............................................................................. 14 2.2.5. Caractères antigéniques ................................................................................................... 14 2.2.6. Caractères génétiques ....................................................................................................... 15 2.2.7. Diagnostic biologique ........................................................................................................ 15 2.2.8. Prévention .......................................................................................................................... 17 Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page VI 2.3. 2.3.1. Définition et Historique .................................................................................................... 17 2.3.2. Taxinomie et nomenclature .............................................................................................. 18 2.3.3. Habitat et épidémiologie ................................................................................................... 19 2.3.4. Caractères culturaux ........................................................................................................ 20 2.3.5. Caractères biochimiques .................................................................................................. 20 2.3.6. Caractères antigéniques ................................................................................................... 20 2.3.7. Caractères génétiques ....................................................................................................... 21 2.3.8. Pouvoir pathogène chez l’Homme ................................................................................... 22 2.3.9. Diagnostic biologique ........................................................................................................ 23 2.3.10. Sensibilité aux antimicrobiens...................................................................................... 26 2.3.11. Prévention ...................................................................................................................... 26 2.4. 3. Le genre Salmonella ................................................................................................................ 17 Le genre Shigella ..................................................................................................................... 26 2.4.1. Définition et Historique .................................................................................................... 26 2.4.2. Taxinomie et nomenclature .............................................................................................. 27 2.4.3. Habitat, épidémiologie et pouvoir pathogène ................................................................. 27 2.4.4. Caractères culturaux et biochimiques............................................................................. 28 2.4.5. Caractères antigéniques ................................................................................................... 28 2.4.6. Caractères génétiques ....................................................................................................... 29 2.4.7. Diagnostic biologique ........................................................................................................ 32 2.4.8. Sensibilité aux antimicrobiens et prophylaxie ................................................................ 33 Matériels et méthodes ...................................................................................................................... 35 3.1. Cadre de l’étude ...................................................................................................................... 35 3.2. Période et type détude............................................................................................................. 36 3.3. Échantillonnage ....................................................................................................................... 36 3.4. Matériels et Méthodes pour la coproculture. ....................................................................... 37 3.5. Matériels et Méthodes pour le diagnostic moléculaire ........................................................ 38 3.5.1. Matériels ............................................................................................................................ 38 Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page VII 3.5.2. Préparation des échantillons pour l’extraction de l’ADN ............................................. 39 3.5.3. Extraction de l’ADN ......................................................................................................... 39 3.5.4. PCR en temps réel ............................................................................................................ 39 3.6. 4. 5. Analyse des données ................................................................................................................ 41 Résultats............................................................................................................................................ 43 4.1. Caractéristiques des patients ................................................................................................. 43 4.2. Résultats de l’isolement / identification ................................................................................ 43 4.3. Résultats de la PCR................................................................................................................. 44 Discussion ......................................................................................................................................... 48 Conclusion et perspectives...................................................................................................................... 54 Références Bibliographiques.................................................................................................................. 56 Annexes .................................................................................................................................................... 66 Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page VIII Liste des tableaux Tableau I Classification des bactéries entéropathogènes………......................................... Tableau II Caractères biochimiques des principales espèces entéropathogènes de 7 Campylobacter ………………………………………………………………… 14 Tableau III Caractères biochimiques des espèces de Shigella……………………………… 28 Tableau IV Caractéristiques épidémio-cliniques des patients……………………………… 43 Tableau V Répartition des résultats de la culture en fonction des tranches d’âge………… 44 Tableau VI Répartition des 20 cas positifs à la PCR selon les critères « épidemio- Tableau VII cliniques » des patients …………………………………………………….. 45 Résumé des résultats de culture et de PCR………………………………….. 46 Liste des figures Figure 1 Démarche diagnostique d’une coproculture……………………………………. 10 Figure 2 Campylobacter jejuni au microscope électronique à balayage…………………. 12 Figure 3 Salmonella au microscope électronique ……………………………………….. 18 Figure 4 Schéma de la structure antigénique de Salmonella…………………………….. 20 Figure 5 Démarche diagnostique pour la mise en évidence des salmonelles et des shigelles 25 Figure 6 Microscopie électronique à balayage de Shigella dans une cellule épithéliale… 27 Figure 7 Représentation circulaire du grand plasmide de virulence pWR501de Shigella 31 Figure 8 Appareil SaCycler-96 Real Time PCR v.7.3 de “Sacace Biotechnologie”…….. 38 Liste des Annexes Annexe 1 Fiche de collecte des échantillons………………………………………………… 66 Annexe 2 Contenu du kit « Sacace, TB44-50RT …………………………………………. 67 Annexe 3 Protocole d’extraction de l’ADN avec le « DNA-Sorb-B, de Sacace Biotechnologies® …………………………………………………... Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo 67 Page IX Liste des Abréviations ADN Acide désoxyribonucléique AFSSA Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments ANAES Agence Nationale d'Accréditation et d'Evaluation en Santé ARN Acide ribonucléique ATB Antibiogramme BEP Bactérie entéropathogène BMR Bactéries multi résistantes C3G Céphalosporine de 3ième génération CA-SFM Comité de l’Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie CDC Centers for Disease Control and prevention CERBA Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni C+G Cytosine et Guanine CMSC Centre Médical Saint Camille ECAD E. coli à adhésion diffuse ou DAEC (diffusely adherent E. coli) ECDC European Centre for Disease Prevention and Control ECEAg E.coli entéroagrégatif ou EAggEC (enteroaggregative E. coli) ECEH E. coli entérohémorragique ou EHEC (enterohaemorrhagic E. coli) ECEI E. coli entéroinvasif ou EIEC (enteroinvasive E. coli) ECEP E. coli entéropathogène ou EPEC (enteropathogenic E. coli) ECET E. coli entérotoxinogène ou ETEC ( enterotoxinogen E. coli) EFSA European Food Safety Authority ELISA Enzyme linked immuno sorbent assay HPV Human papillomavirus IpaH invasion plasmid antigen H IS insertion sequence Kb Kilobases KCN Cyanure de potassium LPS Lipopolysaccharide Mpb méga-paires de base OMS Organisation Mondiale de la Santé ORF Open Reading Frame PAI pathogenicity-associated island Pb paires de bases Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page X PBS Phosphate buffer saline PCR Polymerase chain reaction PHAC Public Health Agency of Canada PTME Prévention de la Transmission Mère Enfant PvVIH Personne vivant avec le VHI REMIC Référentiel en microbiologie médicale SHI Shigella pathogenicity island SHU Syndrome hémolytique et urémique SPI Salmonella Pathogenicity Island T3SS Type Three Secretion System TCBS Thiosulfate-citrate-bile-saccharose TAB Antitypho-paratyphique A et B TIAC Toxi-infection alimentaire collective TtrB Tetrathionate reductase subunit B USA United states of america VHC Virus de l’hépatite C VIH Virus de l’immunodéficience humaine WHO World Health Organization Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page XI INTRODUCTION Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 1 Introduction Les maladies diarrhéiques occupent la troisième place des infections les plus meurtrières dans le monde en occasionnant le décès d’environ 2,5 millions de personnes par an dont près de 2 millions d’enfants de moins de 5 ans (BRYCE et al., 2005). Dans les pays les moins développés, elles constituent la deuxième cause de mortalité (AUBREY, 2013). Au nombre des agents impliqués dans ces affections, les bactéries entéropathogènes dont Campylobacter, Salmonella et Shigella occupent souvent une place de choix tant par leur fréquence que par la gravité des affections qu’ils provoquent. Ainsi, les campylobacters sont actuellement considérés comme la première cause d’infections intestinales d’origine bactérienne chez l’Homme dans le monde avec une incidence croissante dans les pays développés (WHO, 2000 ; AFSSA, 2004 ; BURUCOA, 2011). Selon plusieurs études, 40 à 80% des carcasses de poulet à la distribution sont contaminées (BURUCOA, 2011). Même si l’infection à Campylobater est généralement bénigne, l’augmentation des cas de campylobactériose, l’existence de complications rares mais graves telles que bactériémie, avortement, péritonite, méningite, surtout le syndrome de Guillain-Barré, particulièrement sévère et l’inquiétante augmentation des résistances de Campylobacter aux antibiotiques, expliquent le regain d’intérêt porté à ce genre bactérien (AFSSA, 2004). Concernant Salmonella, l’OMS estime à 17 millions le nombre de cas de fièvre typhoïde dans le monde avec plus de 500 000 décès et à 1,3 milliard le nombre de cas annuels de gastroentérites dus à Salmonella non typhique dont 3 millions de décès par an (CHIMALIZENI et al., 2010). Quant à Shigella, le nombre annuel d'épisodes de shigellose est évalué à 160 millions, avec 1,1 million de décès, principalement des enfants de moins de 5 ans dans les pays en développement (KOTLOFF et al., 1999). L’infection à Shigella est la première cause de malnutrition dans les régions les plus défavorisées où la shigellose demeure endémique (SANSONETTI, 2009). S’il est vrai que le diagnostic direct de ces 3 bactéries peut se faire par isolement dans les échantillons de selles, le diagnostic de Campylobacter en particulier n’est généralement pas effectué. Même dans les pays développés où plusieurs études ont montré que de tous les micro-organismes, Campylobacter a la plus grande fréquence dans les cas de diarrhée aigue (TOMKINS et al., 1999 ; DE WIT et al., 2001), celui-ci n’est pas recherché systématiquement en coproculture, d’où certaines recommandations (ANAES, 2003). Sa Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 2 culture est réputée difficile et au Burkina Faso, la quasi-totalité des laboratoires réalisant des examens bactériologiques des selles ne sont pas préparés pour sa recherche. Il en résulte que les données manquent sur cette bactérie entéropathogène. Aussi, aucune étude à ce jour n’y a été rapportée sur le diagnostic moléculaire de l’un ou l’autre de ces 3 genres bactériens directement sur les échantillons de selles chez l’Homme. Il nous a paru important de réaliser une recherche de Campylobacter dans les matières fécales humaines en même temps que Salmonella et Shigella qui sont les seules bactéries recherchées en routine dans la coproculture standard au Burkina. Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 3 OBJECTIFS DE L’ÉTUDE Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 4 1. Objectifs de l’étude Objectif général Réaliser le diagnostic moléculaire de Campylobacter, de Salmonella et de Shigella dans les échantillons de coproculture. Objectifs spécifiques - Identifier les caractéristiques épidémio-cliniques des patients chez qui une coproculture est prescrite en pratique courante à Ouagadougou, - Déterminer la prévalence de Campylobacter par PCR en temps réel dans les échantillons de coproculture, - Déterminer la prévalence de Salmonella et de Shigella par coproculture et par PCR en temps réel, - Comparer les différentes prévalences. Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 5 REVUE BIBLIOGRAPHIQUE Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 6 2. Revue bibliographique 2.1. 2.1.1. Vue d’ensemble des bactéries entéropathogènes Définition Le mot « entéropathogène » dérive du grec <entéron> : intestin, <pathos> : maladie et <gennân> : engendrer (GARNIER et DELAMARE, Dictionnaire illustré des termes de médecine, 2004). Les bactéries entéropathogènes sont les bactéries capables d’entraîner une entérite, c’est à dire une inflammation de la muqueuse intestinale. Cette entéropathie s’accompagne le plus souvent d’une atteinte de l’estomac (gastro-entérite) ou du côlon (entérocolite). 2.1.2. Les différentes bactéries entéropathogènes On distingue les bactéries toxinogènes et les bactéries invasives (Tableau I) (GALMICHE et al., 1998) . Les bactéries toxinogènes sont le plus souvent responsables de syndrome cholériforme : la toxine peut être ingérée avec un aliment ou le plus souvent sécrétée sur place au niveau de l’intestin grêle ; les selles sont abondantes, fréquentes, aqueuses sans polynucléaires ni mucus. Quant aux bactéries invasives, elles sont responsables de syndrome dysentériforme : après adhésion et envahissement de l’épithélium intestinal, la bactérie entraine des selles glaireuses, muco-sanglantes avec le plus souvent présence de polynucléaires dans les selles. Tableau I: Classification des bactéries entéropathogènes Bactéries entéro-toxinogènes Bactéries entéro-invasives Vibrio cholerae Campylobacter spp. Vibrio parahaemolyticus Salmonella spp. ECET,ECEP, ECEH, ECEA, ECAD Shigella spp. Aeromonas spp Yersinia enterocolitica Pleisiomonas shigellloides Yersinia pseudotuberculosis Clostridium perfringens ECEI Clostridium difficile Listeria monocytogenes Clostridium botulinum Staphylococcus aureus Bacillus fragilus Bacillus cereus Helicobacter pylori Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 7 2.1.3. Aspects moléculaires de leur virulence : les îlots de pathogénicité 2.1.3.1. Définition des îlots de pathogénicité Les bactéries pathogènes et non pathogènes diffèrent par l'expression de facteurs de virulence. Les gènes codant pour ces différents facteurs sont souvent regroupés en « blocs » appelés îlots de pathogénicité, en anglais : pathogenicity-associated islands (PAIs), localisés soit sur le chromosome, soit sur un plasmide (GROISMAN et OCHMANN, 1996). Les PAIs regroupent en général les gènes des facteurs qui suffisent à rendre la bactérie capable d'un comportement pathogène. Le concept d’îlot de pathogénicité a été introduit pour la première fois en 1980 par Jörg HACKER et ses collaborateurs en Allemagne ; ils avaient alors à l’époque décrit le premier PAI bactérien chez une souche d’E. coli isolée du tractus urinaire (souche 536) (SCHMIDT et HENSEL, 2004). 2.1.3.2. Caractéristiques des îlots de pathogénicité Près d’une dizaine de spécificités générales sont prises en compte pour attribuer le nom d’îlot de pathogénicité à une séquence génomique (SCHMIDT et HENSEL, 2004). De toute évidence, un PAI comporte un ou plusieurs gènes de virulence, dans le cas échéant il s’agit plutôt d’un îlot génomique ou métabolique (SCHMIDT et HENSEL, 2004). Aussi, un PAI se retrouve uniquement chez la souche pathogène et n’est pas retrouvé chez les autres membres non pathogènes de l’espèce (SCHMIDT et HENSEL, 2004). Toutefois, ces îlots sont parfois instables et peuvent être perdus in vitro ou lors de l’infection (SCHMIDT et HENSEL, 2004). La grandeur des PAIs peut varier entre 10 et 200 kb ; de plus, le pourcentage en guanine et cytosine (G+C) diffère significativement du reste du génome (SCHMIDT et HENSEL, 2004). La localisation des PAIs est également particulière, puisqu’ils se trouvent très souvent adjacents aux gènes d’ARNt et ils sont bordés par des éléments génétiques mobiles (SCHMIDT et HENSEL, 2004). Les PAIs sont en général des structures hétérogènes reflétant de nombreux événements d’acquisition d’ADN étranger ou réarrangements (HACKER et al., 1997). De nombreux logiciels et algorithmes sont maintenant utilisés afin d’identifier les PAIs que l’on retrouve chez plusieurs pathogènes tels que Campylobacter., Salmonella et Shigella (VERNIKOS et al., 2006) Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 8 2.1.4. Diagnostic dans les matières fécales 2.1.4.1. La coproculture Le diagnostic biologique par la coproculture se fait en fonction des différents contextes. La coproculture standard qui comprend la recherche de Salmonella spp., de Shigella spp. et de Campylobacter spp. (voire Yersinia enterocolitica si le sujet est diarrhéique) est appliquée à l’adulte et à l’enfant de plus de deux ans (REMIC, 2004). Chez l’enfant de moins de deux ans, en plus de la coproculture standard, il est effectué la recherche supplémentaire des E. coli entéropathogènes (REMIC, 2004). Dans le cas particulier du nouveau-né, la recherche dans le méconium de bactéries responsables d'infections néonatales telles que Listeria monocytogenes, E. coli K1 et Streptococcus agalactiae (groupe B) est recommandée (REMIC, 2004). La réalisation d’une coproculture dans un contexte épidémio-clinique particulier comme les situations d’épidémie de choléra, de TIAC, de recherche de germes particuliers (détection de BMR) chez certains sujets spécifiques (patients VIH+, patients ayant un SHU), de recherche de portage chez les cuisiniers, chez les patients sous traitement antibiotique fait appel à l’utilisation de milieux appropriés à chaque cas en fonction des germes spécifiques recherchés (REMIC, 2004). La démarche diagnostique quelque soit le contexte comprend les étapes d’examen macroscopique des selles qui peut orienter sur la physiopathologie d’une diarrhée ; d’examen microscopique direct des selles à l’état frais qui permet d’évaluer la présence de leucocytes et d’hématies, la densité et la mobilité de la flore bactérienne, la présence de parasites, d’éléments fongiques ; d’examen si nécessaire du frottis coloré au Gram permettant d’apprécier l’importance et l’équilibre de la flore. La mise en culture proprement dite consiste à ensemencer différents milieux en fonction des germes à rechercher, et donc du contexte dans lequel se fait l’examen. L’isolement sera suivi de l’identification et éventuellement d’un typage sérologique (Salmonella, Shigella, E. coli) et d’un antibiogramme. La figure 1 résume la démarche diagnostique générale d’une coproculture. Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 9 Selles Aspect macroscopique Diarrhées sanglantes Syndrome cholériforme Ensemencement standard + MacConkey sorbitol + Milieu Clostridium + Milieu Yersinia Aspect microscopique Etat frais Examen au Gram TCBS Eau peptonnée alkaline Ensemencement standard Milieu sélectif pour Salmonella, Shigella Milieu d’enrichissement pour Salmonella Milieu Campylobacter SabouraudChloramphénicol (si levures) Repiquage sur milieu sélectif pour Salmonella Figure 1 : Démarche diagnostique d’une coproculture (MARIANI et BINGEN, 2011) 2.1.4.2. Diagnostic moléculaire par PCR La PCR (Polymerase Chain Reaction), est une technique de réplication ciblée in vitro. Elle copie une séquence d’ADN spécifique par une série de réactions, et peut amplifier des séquences d’ADN cibles présentes en quantités infinitésimales au sein d’une population de molécules d’ADN. Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 10 Dans le cas spécifique de diagnostic des bactéries entéropathogènes (BEP), certains critères généraux doivent être pris en compte lors d’un travail sur les matières fécales : tout d’abord le stockage des prélèvements se fait en général à -20°C ou à -80°C si les extractions ne peuvent être réalisées peu de temps après la récolte d’échantillons (HUYBENS et al, 2009). Aussi, le choix d’une méthode d’extraction doit tenir compte du fait que les matières fécales contiennent énormément d’inhibiteurs de PCR que l’extraction doit éliminer au maximum (DUENNGAI et al., 2008). 2.1.4.3. Autres méthodes de diagnostic Le diagnostic antigénique Les antigènes recherchés sont soit des constituants de l'agent pathogène : flagelles, pili, capsules, protéines de surface ; soit des antigènes solubles ou diffusibles retrouvés au siège de l'infection ou à distance ; soit des toxines bactériennes. Plusieurs techniques permettant de rechercher des antigènes bactériens spécifiques directement sur les selles sont actuellement commercialisées (MARIANI et BIGEN, 2011). Parmi elles, l’immunocapture ou immunochromatographie sur membrane est devenue une technique de routine rapide pour le diagnostic de certains germes : toxines de Clostridium difficile, Helicobacter pylori, Campylobacter, toxine de V. cholerae (MARIANI et BIGEN, 2011). La Culture cellulaire Certaines bactéries entéropathogènes (BEP) peuvent être diagnostiquées par culture cellulaire : cellules HeLa pour rechercher E. coli entéroinvasif ; cellules véro pour rechercher E. coli entérohémorragique (MARIANI et BIGEN, 2011). 2.2. 2.2.1. Le genre Campylobacter Définition et historique Les campylobacters (du grec kampulos = spiralé et baktêria = bâtonnet ) correspondent à des bacilles à Gram négatif caractérisés par leur morphologie de bacilles fins non sporulés de 0,2 à 0,9 µm de diamètre sur 0,5 à 5,0 µm de longueur, incurvés en forme de virgule, en forme de S, ou en forme hélicoïdale pour les formes longues (figure 2 ) ; leur mobilité caractéristique en vrille classiquement décrite comme « un vol de moucheron » ; leur métabolisme respiratoire micro-aérophile (certaines peuvent cependant pousser en aérobiose ou en Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 11 anaérobiose) ; une réaction oxydase positive et un pourcentage G+C du DNA compris entre 30 et 38% (AVRIL et al, 1988; AFSSA, 2004; BURUCOA, 2011). a b these gastroenteritis Figure 2 : Campylobacter jejuni au microscope électronique à balayage a = grossissement X 10000 (http://scd-theses.u-strasbg.fr/958/02/These_Frederic_Poly.pdf). b = grossissement X 4000 (d’après une photo UMR-INRA SECALIM n°1014 (AFSSA, 2004)) La première description de cette bactérie dans des selles d’enfants diarrhéiques remonte à 1886 en Allemagne et a été faite par le pédiatre bactériologiste Theodor Escherich. Elle sera baptisée « Vibrio fetus » par Smith et Taylor (U.S.A) en 1919 (AVRIL et al., 1988 ; AFSSA, 2004). En 1963, le genre Campylobacter a été proposé par Sebald et Véron qui grâce à l’étude du pourcentage de G + C de l’ADN, ont montré que ce "Vibrio fetus" est différent des Vibrio (AVRIL et al., 1988. AFSSA, 2004). 2.2.2. Habitat, épidémiologie et pouvoir pathogène Les campylobacters sont des bactéries trouvées dans le tube digestif des animaux. Les principaux réservoirs sont les animaux domestiques (volailles, bovins, porcins, petits ruminants), les animaux de compagnie (chats, chiens) et les animaux sauvages (oiseaux, rongeurs) ; la contamination de l’Homme se fait par voie digestive (AVRIL et al., 1988). Les infections par Campylobacter surviennent partout dans le monde et sont courantes autant dans les pays développés que dans les pays en développement et la plupart des éclosions sont d’origine alimentaire ou hydrique (ALLOS, 2001; BURUCOA, 2011). Les campylobacters Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 12 sont la cause principale de gastro-entérites bactériennes dans les pays développés, et la majorité des cas sont attribuables à C. jejuni (GALANIS, 2007). La campylobactériose est actuellement une zoonose très fréquemment signalée dans certains pays : première dans l'Union Européenne (EFSA-ECDC, 2013) et au Canada (PHAC, 2010), deuxième aux États unis d’Amérique (CDC, 2011). Dans les pays en développement où les infections sont endémiques, la majorité des cas symptomatiques s’observent chez les jeunes enfants ; les infections asymptomatiques sont courantes chez les adultes et les enfants (ALLOS, 2001). Du point de vue pathologique, la maladie humaine la plus fréquemment observée est une entérite aiguë, pouvant se compliquer par une bactériémie, des localisations secondaires et des complications post-infectieuses (appendicite, péritonite, cholécystite). Les campylobacters thermotolérants en particulier Campylobacter jejuni sont associés à ce type d’infection. Le syndrome post-infectieux le plus important à considérer est le syndrome de Guillain-Barré (paralysie due à une inflammation et à une démyélinisation des nerfs périphériques, souvent consécutive à une infection respiratoire ou digestive dont des infections intestinales à Campylobacter jejuni). Ce syndrome réputé réversible est en fait très sévère avec une mortalité de 2 à 3 %, des séquelles neurologiques majeures dans 20 % des cas, et une récupération partielle ou totale après quelques semaines ou mois pour les autres cas (BRISCOE et al., 1987). 2.2.3. Nomenclature et classification Campylobacter fait partie avec les genres Arcobacter, Sulfurospirillum, Helicobacter et Wolinella de la branche ε des Protéobactéries aussi appelée superfamille VI de bacilles à Gram négatif ; avec les deux premiers genres, ils forment la famille des Campylobacteraceae (VANDAMME et al., 1991). En 1963, date de sa création, le genre Campylobacter comprenait seulement deux espèces : Campylobacter fetus et Campylobacter bubulus (maintenant Campylobacter sputorum) ; depuis cette date, le genre a largement évolué (ON, 2001). De nos jours, avec la caractérisation d’une nouvelle espèce en 2010 (Campylobacter volucris), le genre totalise 21 espèces et 8 sous-espèces (DEBRUYNE et al., 2010). Les principales espèces impliquées en pathologie sont C. jejuni, C. coli responsables d'entérites et C. fetus responsable de septicémies et de méningites chez l’immunodéprimé (BURUCOA, 2011). Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 13 2.2.4. Caractères culturaux et biochimiques Les campylobacters sont microaérophiles, chimio-organotrophes, utilisant les acides aminés et les acides organiques comme source de carbone mais jamais les sucres. Sur milieu gélosé, les colonies apparaissent en 2 à 4 jours, avec un diamètre de 1 à 2 mm. Tous les campylobacters réduisent les nitrates en nitrites et les espèces ayant un intérêt médical sont catalase positive. La catalase permet de diviser les campylobacters en 2 groupes (AVRIL et al., 1988) : les campylobacters catalase positive comprenant les espèces entéropathogènes (C. fetus, C. jejuni , C . coli) et les campylobacters catalase négative regroupant les espèces non pathogènes (C. sputorum). Les caractères qui permettent de distinguer les 3 principales espèces rencontrées en pathologie infectieuse sont indiqués dans le Tableau II. Tableau II: Caractères biochimiques des principales espèces entéropathogènes de Campylobacter (AVRIL et al., 1988) Espèce Croissance Croissance Sensibilité à Sensibilité à Hydrolyse à 25 °C à 42 °C l’acide la de nalidixique céphalotine l’hippurate C. fetus + - R S - C. jejuni - + S R + C. coli - + S R - 2.2.5. Caractères antigéniques On distingue chez Campylobacter deux types d’antigènes : un antigène thermolabile de nature protéique lié à la structure flagellaire, et un antigène thermostable de nature lipopolysaccharidique (membrane externe). Chez certains sérovars de Campylobacter jejuni notamment le PEN 19, la structure du core de la partie lipopolysaccharidique présente des analogies avec les gangliosides ; cette homologie structurale expliquerait que des anticorps produits contre le core puissent réagir avec les gangliosides de l'hôte et être à l'origine d'un phénomène auto-immun à l'origine du syndrome de Guillain-Barré causé par Campylobacter jejuni (YUKI et al., 1997). Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 14 2.2.6. Caractères génétiques 2.2.6.1. Le génome de Campylobacter Campylobacter jejuni NCTC 11168 a été la première souche du genre Campylobacter à être séquencée (PARKHILL et al., 2000). Le génome de cette souche est composé d’un chromosome circulaire de 1,64 Mpb présentant un nombre total de 1654 ORFs. 94% du génome code pour des protéines. Le pourcentage G+C de C. jejuni NCTC 11168 est de 30,6%. Deux régions chromosomiques étendues, présentent un pourcentage G+C relativement plus faible par rapport au reste du génome. Ces régions correspondent aux gènes codant pour des protéines impliquées dans la biosynthèse de structure extracellulaire de type lipooligosaccharide (25,4%) et de la capsule (26,5%). Une des particularités du génome de cette souche est la quasi-absence de répétitions d’ADN : seules 4 séquences répétées sont présentes sur l’ensemble du génome. Une autre particularité de ce génome est la faible proportion de gènes organisés en structure opéronique ou en clusters. Récemment, quatre nouvelles souches de Campylobacter ont été séquencées montrant une taille du chromosome allant de 1,50 à 1,78 Mbp (souches C. jejuni RM1221, C. coli RM2228, C. lari RM2100, C. upsaliensis RM3195) (FOUTS et al., 2005). 2.2.6.2. Les îlots de pathogénécité Chez Campylobacter jejuni, une vingtaine de gènes ont été identifiés comme étant des gènes impliqués dans la virulence ; parmi eux, il ya les gènes virB11 (gène de virulence), ciaB (Campylobacter invasion antigen B), pldA (phospholipase A) et iamA (invasion-associated marker A) qui sont impliqués dans le pouvoir invasif de la bactérie (BISWAS et al., 2011). 2.2.7. Diagnostic biologique 2.2.7.1. Diagnostic direct La culture La culture de Campylobacter spp. s’effectue essentiellement à partir de prélèvements de selles (coproculture), plus rarement de sang (hémoculture), puisqu’il est principalement responsable d’entérite. La recherche de Campylobacter doit faire partie intégrante des coprocultures Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 15 devant une diarrhée infectieuse aigue (BURUCOA, 2011). L’échantillon de selles doit être mis en culture sur des milieux contenant du sang (Skirrow, Butzler, Blaser, Preston) ou du charbon (Karmali) et rendus sélectifs par l’addition d’antibiotiques (BURUCOA, 2011). Des milieux prêts à l’emploi sont également commercialisés (Campylosel®) (BURUCOA, 2011). Des milieux non sélectifs peuvent être utilisés à condition de filtrer l’échantillon de selles sur une membrane de pores de 0,65 µm de diamètre qui retient les autres bactéries et laisse passer les Campylobacters en raison de leur petite taille et de leur mobilité. La combinaison de ces 2 techniques, filtration et sélection, augmenterait la sensibilité de l’isolement (BURUCOA, 2011). Les cultures sont incubées pendant 48 heures minimum, parfois pendant 5 à 8 jours, en micro-aérophilie et à 37°C. Les colonies ont un aspect plat, grisâtre et translucide avec l’oxydase et la catalase positives. Pour l’antibiogramme, on testera en priorité les fluoroquinolones, les macrolides, les aminosides, les aminopenicillines, la tétracycline et le chloramphénicol. La réalisation pratique et l’interprétation de l’antibiogramme suivent les recommandations du CA-SFM (CA-SFM, 2011). Recherche d’antigènes spécifiques La recherche d’Ag de Campylobacter dans les selles peut se faire par ELISA en plaque de 96 puits (Premier Campy®, Meridian®, Ridascreen Campylobacter®, R-Biopharm®) ou par test immunochromatographique (immunoCard Stat ! Campy®, Méridian®), (BURUCOA, 2011, BESSEDE et al., 2011 ). Diagnostic moléculaire Il utilise surtout les techniques de PCR dont certaines détectent Campylobacter au niveau espèce, d’autres détectent C. jejuni et C. coli sans différentiation et incluant C. lari. ; la plupart des techniques sont basées sur l'amplification des gènes de la flagelline ou des gènes ribosomaux (16S rRNA et 23S rRNA) (WASSENAAR, 2000). Aucune technique ne permet de distinguer jusqu’à maintenant les trois espèces les plus fréquentes (C. jejuni, C. coli, C. fetus) en une seule étape (BURUCOA, 2011). 2.2.7.2. Diagnostic indirect. Le diagnostic sérologique présente un intérêt dans les complications post-infectieuses telles que les arthrites réactionnelles et le syndrome de Guillain-Barré. Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 16 Une technique ELISA existante a l’avantage de distinguer les IgG des IgM (BURUCOA, 2011). Elle est donc adaptée au diagnostic des infections aiguës. En effet, 95 % des malades à coproculture positive à C. jejuni présentent des anticorps détectables par cette technique (BURUCOA, 2011). 2.2.8. Prévention La perspective de développer un vaccin contre Campylobacter spp. chez l’Homme faisant pour l’instant partie du domaine de la recherche, la prévention de la propagation de la bactérie peut se faire par les mesures d’hygiène. 2.3. 2.3.1. Le genre Salmonella Définition et Historique Les salmonelles sont des bacilles aéro-anaérobies Gram-négatifs, hôtes facultatifs du tractus digestif et potentiellement pathogènes pour l’Homme et les animaux. Elles sont mobiles (ciliature péritriche), (le sérovar aviaire Salmonella. Gallinarum-pullorum est immobile), non sporulées, mesurant 0,7-1,5 µm de diamètre sur 2,0-5,0 µm de long (figure 3). C’est en 1880 que le premier bacille fut observé par Eberth dans des coupes de rate et de ganglions lymphatiques d’un malade mort de typhoïde (AVRIL et al., 1988). La culture in vitro de cette bactérie fut mise au point par Gaffky en 1884 (AVRIL et al., 1988). Widal fût le premier en 1896 à montrer que le sérum de malades atteints de fièvre typhoïde agglutinait des cultures du bacille d’Eberth (1er sérodiagnostic de l’histoire) (AVRIL et al., 1988). Le terme de Salmonella ne fut créé qu’en 1900 par Lignières, en l’honneur de Daniel Elmer Salmon, directeur des services vétérinaires des États-Unis à cette époque. Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 17 Figure 3 : Salmonella au microscope électronique Source : http://microbiology.free.fr/Presentations/salmonella.pdf 2.3.2. Taxinomie et nomenclature Le genre Salmonella appartient à la famille des Enterobacteriaceae. Depuis les années 1980, la nomenclature des salmonelles est empreinte d’une certaine confusion, à cause de diverses controverses et de nombreux changements sur le plan de la nomenclature, mais aussi de la taxinomie. Finalement en 2002, suite à la décision de la « Judicial Commission of the International Committee on the Systematics of Prokaryotes » à travers à l'Opinion Judiciaire N° 80, il sera reconnu que le genre Salmonella comporte deux espèces: Salmonella enterica (espèce type) et Salmonella bongori qui est exceptionnellement isolé chez l’Homme (TINDALL et al., 2005). L’espèce S. enterica est divisée en six sous-espèces : enterica (I), salamae (II), arizonae (IIIa), diarizonae (IIIb), houtenae (IV) et indica (VI). Chacune de ces sous-espèces se subdivise en sérovars définis par les Ag O (LPS), H (flagelle) et Vi (capsule). Le genre Salmonella comptait alors 2541 sérotypes (POPOFF et al., 2004). Depuis, un troisième nom d’espèce, Salmonella subterranea a été proposé pour une souche isolée de sédiments contaminés aux nitrates et à l’uranium (SHELOBOLINA et al., 2004). Le nom de cette espèce a été validé en 2005 (EUZEBY, 2005) mais finalement, cette espèce ne sera pas rattachée au genre Salmonella (GRIMONT & WEILL, 2007, EUZEBY, 2013). La liste exhaustive de tous les sérovars de Salmonella est résumée dans un document appelé « schéma de Kauffmann-White » qui indique la formule antigénique de tous les sérovars connus de Salmonella, et qui est régulièrement mis à jour par le Centre Collaborateur OMS de Référence et de Recherche sur les Salmonella (CCOMS-Salm) de l’Institut Pasteur de Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 18 Paris. Cette mise à jour est faite en accord avec deux autres laboratoires que sont le Institut für Hygiene und Umwelt de Hambourg et le Centers for Disease Control and Prevention (CDC) d’Atlanta (SU et CHIU, 2007; GRIMONT & WEILL, 2007). Ainsi, en 2007, le genre Salmonella totalisait 2579 sérovars dont 2557 pour S. enterica et 22 pous S. bongori (GRIMONT & WEILL, 2007). La sous-espèce I, S. enterica subspecies enterica, représente plus de 99,5 % des souches isolées en pathologie ; (BIDET et BINGEN, 2011). Quatre de ces sérovars correspondent aux salmonelles dites « majeures » strictement humaines (Typhi, Paratyphi A, Paratyphi B, Paratyphi C) responsables des fièvres typhoïdes et paratyphoïdes. La plupart des autres sérovars dits « mineurs » sont désignés le plus souvent par des noms géographiques (Wien, Dublin.) (LEADER et al., 2009). Afin de simplifier la dénomination des sérovars des salmonelles, il est admis de juxtaposer le nom du sérovar (en caractères pleins non italiques et avec une majuscule) à celui du genre Salmonella ; on dira donc Salmonella Typhi pour Salmonella enterica subsp. enterica sérovar Typhi (BRENNER et al., 2000). 2.3.3. Habitat et épidémiologie L’habitat commun de la sous-espèce enterica comprend les animaux à sang chaud tandis que celui des autres sous-espèces est constitué des animaux à sang froid et l’environnement (SU et CHIU, 2007). La persistance des salmonelles dans l’environnement apparaît comme un facteur épidémiologique important : Mc LAREN et WRAY (1991), en étudiant cinq élevages atteints d’une infection à Salmonella Typhimurium ont émis l’hypothèse que les souches pouvaient persister sur les lieux pendant des périodes s’étendant de 4 mois à 2 ans, la moyenne avoisinant 14 mois. Des cas d’infection à Salmonella enterica surviennent partout dans le monde. La salmonellose non typhique survient plus fréquemment dans les pays industrialisés, tandis que la fièvre entérique touche principalement les pays en développement (CONNOR et SCHWARTZ, 2005). Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 19 2.3.4. Caractères culturaux Après 24 heures d’incubation à 37°C sur un milieu ordinaire, les colonies obtenues ont un diamètre de 3 à 4 mm. Elles sont blanchâtres, circulaires, limitées par un bord régulier, légèrement bombées, translucides. A partir d’un milieu monomicrobien (tel que le sang ou le liquide céphalorachidien), une gélose ordinaire suffira à leur croissance. Par contre, dans le cas de prélèvements polymicrobiens (selles), l’utilisation de milieux sélectifs (géloses SS, XLD, DCL, ou Hektoen) est indispensable (BIDET et BINGEN, 2011). 2.3.5. Caractères biochimiques Les salmonelles présentent les caractères généraux de la famille des Enterobacteriaceae. Au sein de cette famille, les caractères permettant l’identification biochimique du genre Salmonella comprennent des caractères négatifs tels que l’uréase, le tryptophane désaminase, la production d’indole et d’acétoïne, la fermentation du lactose, du saccharose, de l’inositol, de l’amygdaline, de l’adonitol et du 2-cétogluconate ; ainsi que des caractères positifs comme la présence d’une thiosulfate réductase, la décarboxylation fréquente de la lysine et de l’ornithine et la capacité fréquente de croître sur milieu au citrate de Simmons. Les deux espèces du genre Salmonella peuvent être différenciées par leurs caractères biochimiques : Salmonella bongori ne fermente pas le sorbitol et pousse sur un milieu contenant du KCN, contrairement à Salmonella enterica. 2.3.6. Caractères antigéniques Les salmonelles possèdent plusieurs types d’antigènes utilisés pour leur classification et leur diagnostic : l’antigène O, l’antigène H et l’antigène Vi (figure 4). Figure 4 : Schéma de la structure antigénique de Salmonella Source : http://microbiology.free.fr/Presentations/salmonella.pdf Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 20 L’antigène O L’antigène O correspond à la partie externe du lipopolysaccharide. Dans le schéma de Kauffman-White, 67 antigènes O sont considérés. On en distingue deux types : les antigènes O majeurs qui permettent de classer les sérotypes en groupe O (par exemple dans le groupe D, sont retrouvés les sérotypes qui présentent l’antigène O:9 tels que Typhi et Enteritidis) et les antigènes O accessoires qui sont toujours liés à un antigène majeur : ils peuvent n’avoir aucun intérêt pour le diagnostic (AVRIL et al., 1988). L’antigène H Les flagelles sont constitués d’une molécule protéique, la flagelline dont la composition en acides aminés détermine le type antigénique H. Cette composition est codée par un gène de structure H1. Ces polymères de flagelline permettent l’agglutination rapide et l’immobilisation des bactéries via l’utilisation d’anticorps anti-H. Chez Salmonella, l’antigène H peut se présenter sous deux états : un état unique dit monophasique où la bactérie ne produit qu’un type de flagelle (cas retrouvé chez Salmonella Typhi ou encore chez Salmonella Enteritidis) et un état diphasique où la bactérie peut exprimer alternativement deux types de flagelles présentant des spécificités antigéniques différentes (cas de Salmonella Typhimurium qui peut présenter un antigène H soit de type 1, soit de type 2) (AVRIL et al., 1988). L’antigène Vi Le seul antigène capsulaire (Ag K) connu chez Salmonella est l’antigène Vi. Cet antigène, d’intérêt diagnostique, masque l’antigène O, rendant les bactéries « O-inagglutinables ». L’antigène Vi n’est rencontré que de façon inconstante chez 3 sérotypes : Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi C et Salmonella Dublin. Par chauffage de la suspension bactérienne à 100°C pendant 10 min, l’antigène Vi est solubilisé et l’antigène O devient accessible aux agglutinines (AVRIL et al., 1988). 2.3.7. Caractères génétiques 2.3.7.1. Le génome de Salmonella Le génome de la bactérie est composé d’un ADN chromosomique et d’un ou plusieurs plasmides. La taille du chromosome de Salmonella varie d’un sérotype à l’autre et elle est Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 21 comprise entre 4,5 et 4,9 Mbp (méga-paires de base). La membrane cytoplasmique de la bactérie est entourée par le peptydoglycane puis par la membrane externe qui porte les flagelles, pili, glycocalix et lipopolysaccharide. Ces structures ont des rôles importants pour la survie de la bactérie et comme facteurs de virulence. La souche CT18 de Salmonella Typhi est le premier représentant de Salmonella à avoir été séquencé (taille du chromosome = 4,81 Mpb) (PARKHILL et al., 2001). Une seconde souche, Ty2, a été séquencée deux ans plus tard (taille du chromosome = 4,79 Mpb) (DENG et al., 2003). 2.3.7.2. Les îlots de Pathogénicité Salmonella dispose d’un arsenal de facteurs de virulence jouant un rôle à différentes étapes du processus infectieux : attachement, pénétration, survie intracellulaire. Les gènes de virulence de Salmonella peuvent se situer sur un plasmide ou bien sur le chromosome et ce, de façon isolée, en opéron ou bien au sein de régions appelées îlots génomiques. Les îlots regroupant des gènes contribuant à la virulence de Salmonella sont appelés « SPI » pour Salmonella Pathogenicity Islands. Ces îlots de pathogénicité contiennent des gènes qui participent à un même phénotype de virulence. Chez Salmonella, plus de 20 îlots de pathogénicité ont été identifiés jusqu’à maintenant et leur taille varie de 10 à 100 kb (HENSEL, 2004; CHIU et al., 2005; VERNIKOS et PARKHILL, 2006). Parmi ceux-ci, les îlots SPI-1 et SPI-2 codent pour des systèmes de sécrétion de type III appelés T3SS-1 et T3SS-2 respectivement et ils jouent un rôle majeur durant l’infection (HENSEL, 2004). Tous les sérotypes de salmonelles ne présentent pas l’ensemble de ce répertoire de PAIs (HENSEL, 2004). 2.3.8. Pouvoir pathogène chez l’Homme Les salmonelloses sont à l’origine de deux types de pathologie : les salmonelloses dites « majeures » et celles appelées « mineures » (BIDET et BINGEN, 2011). 2.3.8.1. Les Salmonelloses majeures Il s’agit des fièvres typhoïdes et paratyphoïdes : elles sont dues à Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi A, B ou C, au cours desquelles deux mécanismes d’invasion se superposent : un processus entéro-invasif et l’action de l’endotoxine (LPS). Si le diagnostic et le traitement sont précoces, l’évolution est favorable. En l’absence de traitement, on note des Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 22 complications digestives (hémorragies, cholécystites), cardiovasculaires, neuroméningées et ostéoarticulaires (BIDET et BINGEN, 2011). 2.3.8.2. Les Salmonelloses mineures Elles sont dues aux autres sérovars. Elles se traduisent le plus souvent par des gastro-entérites d’origine alimentaire avec diarrhées et vomissements survenant dans les 8 à 10 jours après l’ingestion de l’aliment contaminant (BIDET et BINGEN, 2011). 2.3.9. Diagnostic biologique 2.3.9.1. Isolement en culture Les Coprocultures L’élimination des salmonelles pouvant être intermittente, il y a lieu de faire 2 coprocultures à une semaine d’intervalle (AVRIL et al., 1988). On utilise des milieux sélectifs (Hektoen, SS) pour l’ensemencement direct des selles sur l’un de ces milieux, des milieux d’enrichissement (bouillon de Muller-Kauffmann, bouillon au sélénite de sodium) que l’on inocule avec les selles, puis on repique ce bouillon sur milieu sélectif après 3 à 6 heures d’incubation (figure 5). Les autres cultures Les autres prélèvements les plus fréquemment utilisés sont le sang (hémoculture), les urines, la bile et le LCR. L’hémoculture est utile au cours des fièvres typhoïdes et paratyphoïdes où elle est positive dans 90 % des cas dans la 1ère semaine, 70 % des cas dans la 2ième semaine et 40 % des cas dans la troisième semaine (AVRIL et al., 1988 ). 2.3.9.2. La PCR Les gènes cibles les plus souvent utilisés pour la détection spécifique de Salmonella sont associées à la virulence : invA (gène chromosomique de virulence impliqué dans le mécanisme invasif de Salmonella), fimA (gène majeur de la fimbriae), spvA (gène plasmidique de virulence A), stn (gène de l'entérotoxine), fliC (gène de la flagelline) et hilA Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 23 (gène d'invasion A ) (CHEN JING et al., 2010) ; à la respiration tethrationate : les gènes codant les protéines de la tethrationate reductase (ttrA, ttrB, ttrC) (MALORNY et al., 2004). 2.3.9.3. Le Diagnostic sérologique Le sérodiagnostic de Widal et Félix (SDW) ne peut être appliqué qu’au dépistage d’un nombre limité de sérovars : Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi A, B et C, Salmonella. Enteritidis et Salmonella Typhimurium. Il permet la recherche des agglutinines anti-O et antiH par dilutions croissantes du sérum du malade en présence de suspensions préparées avec les sérovars Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi A, B et C. Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 24 5 colonies suspectes Uréase + Uréase - Absence de Salmonella et de Shigella KLIGLER HAJNA/LDC Ajouter réactif indole TDA + Glucose+ Lactose Gaz + Indole - Glucose + Lactose Gaz LDC – Mobilité – H2S - ONPG + Eliminer - Eliminer (Proteus) Possibilité de Yersinia Galerie20E +ATB LDC + LDC - Agglutinations Salmonelles* Possibilité de S. Paratyphi A A confirmer par agglutination* Agglutinations de Shigelles* Phage + ATB Galerie 20E Phage + ATB Galerie 20E Galerie 20E ATB Figure 5 : Démarche diagnostique pour la mise en évidence des salmonelles et des shigelles (MARIANI et BINGEN, 2011). * Classiquement, on ne procède à l’agglutination qu’après confirmation du diagnostic d’espèce par galerie ; toutefois, on peut être amené pour gagner du temps à pratiquer une agglutination à ce stade. Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 25 2.3.10. Sensibilité aux antimicrobiens Le phénotype sauvage des souches de Salmonella est caractérisé par une sensibilité à la totalité des antibiotiques actifs sur les entérobactéries. Vis-à-vis des β-lactamines, Salmonella fait partie du groupe 1 des entérobactéries, ne produisant pas naturellement une β-lactamase (CA-SFM, 2011). Cependant, plusieurs études ont montré l’émergence de souches de salmonelles résistantes aux quinolones, aussi bien Enteritidis (BROWN et al., 1996) que Typhimurium (MARTEL et al., 1995). Récemment, les systèmes nationaux de surveillance de Salmonella de France, d’Angleterre, du Pays de Galles, du Danemark et des États-Unis d’Amérique ont identifié l'apparition de souches multirésistantes de Salmonella enterica sérotype Kentucky montrant un haut niveau de résistance à la ciprofloxacine (LEHELLO et al., 2013). 2.3.11. Prévention Le vaccin TAB (Anti-typho-paratyphique A et B) est administré par injections d’une suspension de salmonelles tuées. La protection conférée serait médiocre (AVRIL et al., 1988). La lutte contre les salmonelloses passent également par l’hygiène collective (prévention du péril fécal, contrôle de la qualité bactériologique des denrées alimentaires) et individuelle (détection des porteurs sains, traitement des malades). 2.4. 2.4.1. Le genre Shigella Définition et Historique Les shigelles sont des bactéries pathogènes strictes, aéro-anaérobies facultatives, immobiles, non encapsulées, dépourvues de spores, de 2 à 3 µm de long sur 0,5 à 0,7 de large (figure 6), qui ne fermentent pas le lactose ou le fermentent lentement, appartenant à la famille des Enterobacteriaceae. Elles ont été nommées ainsi en l'honneur du bactériologiste japonais Kiyoshi Shiga qui isola le premier en 1896 l’agent de la dysentérie qui portera plus tard le nom de Shigella dysenteriae (HALE, 1991). Les autres espèces de shigelles ont été isolées ultérieurement et Shigella a été adopté comme un genre dans les années 1950 (HALE, 1991). Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 26 Figure 6 : Microscopie électronique à balayage de Shigella dans une cellule épithéliale (SANSONETTI, 2001) 2.4.2. Taxinomie et nomenclature Génétiquement, Shigella fait partie de l’espèce E. coli ; néanmoins le genre Shigella a été conservé dans la taxinomie pour des raisons médicales (LAN et REEVES, 2002 ; JIN et al., 2002 ; BIDET. et BINGEN, 2011). Le genre comprend 4 espèces ou groupes A, B, C, D pouvant comporter un ou plusieurs sérotypes : groupe A = S.dysenteriae avec 15 sérotypes ; groupe B = S. flexneri avec 6 sérotypes ; groupe C = S. boydii avec 20 sérotypes et groupe D = S. sonnei avec 1 sérotype (BIDET et BINGEN, 2011). 2.4.3. Habitat, épidémiologie et pouvoir pathogène Le seul réservoir de Shigella est le tube digestif de l’Homme et où il est pathogène spécifique. La shigellose est la plus transmissible des maladies bactériennes intestinales : dix germes vivants peuvent provoquer la maladie chez un adulte sain (AVRIL et al, 1988). S. dysenteriae type 1 ou bacille de shiga (toxine Shiga cytotoxique ou STX) est l’agent de la dysentérie bacillaire au sens stricto sensu caractérisée par une diarrhée avec des selles contenant du sang et du mucus; les autres shigelles provoquent des syndromes dysentériques (BIDET et BINGEN, 2011). Alors que S. flexneri est principalement endémique dans les pays en développement, S.sonnei est largement associé à des épisodes dans les pays industrialisés ; S.boydii est surtout Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 27 endémique du sous-continent indien et Shigella dysenteriae sérotype 1 provoque des épidémies meurtrières dans plusieurs des pays les plus pauvres (SANSONETTI, 2001). La mortalité avec S. dysenteriae 1 peut dépasser 10% des cas, malgré un traitement adapté (AVRIL, 1988). Il existe de rares localisations extra-digestives : infections urinaires, formes septicémiques, arthrites, méningites. 2.4.4. Caractères culturaux et biochimiques En 24 heures à 37°C, Shigella donne des colonies de taille moyenne (2 à 3mm), rondes et brillantes sur milieu ordinaire. Elles apparaissent bleues sur BCP, vertes sans centre noir sur Hektoen, incolores sans centre noir sur SS (Salmonella-Shigella) (BIDET et BINGEN, 2011) Sur le plan biochimique, les shigelles sont caractérisées par de nombreuses réactions négatives. Toutes les espèces sont immobiles, LDC, citrate de Christensen, Urée, TDA, H2S, VP, négatifs (BIDET et BINGEN, 2011). Quelques caractères permettent de les différencier (Tableau III). Tableau III: Caractères biochimiques des espèces de Shigella Test S. dysenteriaea S. flexneri S. boydii S. sonnei Fermentation du Mannitol - + + + Indole -b d D - ONPG D - D + ODC - - - + Sérogroupe A B C D a = le type 1 possède la particularité de ne pas avoir de catalase, ce qui est exceptionnel chez les Enterobateriaceae, b = caractère positif avec les types 2, 7, et 8 d = caractère variable 2.4.5. Caractères antigéniques On peut diviser les shigelles en 4 groupes sérologiques principaux (espèces), selon leurs antigènes somatiques O et leurs caractères biochimiques (AVRIL et al., 1988). Certains Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 28 antigènes O associés aux ECEI sont identiques à ceux trouvés dans les Shigella spp. (CHEASTY et ROWE, 1983). Les shigelles possèdent également l'antigène K de surface masquant l'antigène O qui peut se rencontrer dans tous les sous-groupes, sauf le D. Il est en général détruit par chauffage à 100°C (AVRIL et al., 1988). 2.4.6. Caractères génétiques 2.4.6.1. Le génome de Shigella Le génome de Shigella flexneri 2a, souche 245T a en premier été séquencé ; son génome comprend un grand plasmide de virulence et partage une grande partie des gènes chromosomiques avec E. coli K12 et O157:H7 (JIN et al., 2002). Ceci est en accord avec les études mettant Shigella dans les E. coli. Toutefois, dans le chromosome de S. flexneri, il ya des centaines de pseudogènes, des séquences d'insertion (IS) qui ont largement remodelé le génome sans doute au profit d'une expression plus complète de virulence (YANG et al., 2005). S. flexneri 245T présente une taille chromosomique de 4,6 Mb codant potentiellement 4084 gènes, avec 205 d’entre eux uniques à cette souche comparé à E. coli K12 (JIN et al., 2002). Comparé au génome d’E. coli O157:H7, la structure chromosomique de S. flexneri 245T est grossièrement similaire à celle de K12 avec des ponctuations d’îlots nucléotidiques, le nombre de ces îlots étant plus petit chez 245T par rapport à O157:H7 et majoritairement différents. Ces deux souches partagent uniquement 30 gènes en commun des gènes absents de K12 (JIN et al., 2002). Actuellement, des souches de toutes les 4 espèces de Shigella ont été séquencées (YANG et al., 2005). Chacune des souches séquencées montre que son organisation chromosomique et sa composition génétique sont très proches de celle de E. coli (YANG et al., 2005 2.4.6.2. Les îlots de Pathogénicité Le support génétique de l’invasion de Shigella est extrachromosomique : un grand plasmide d’environ 210- 220 kb porte la plupart des gènes nécessaires pour exprimer les étapes clés de l’invasion par Shigella (SANSONETTI, 2001 ; PARSOT, 2005 ; YANG et al., 2005). Les séquences codantes sont dispersées sur l'ensemble du plasmide de virulence, essentiellement séparées par de multiples séquences d’insertion souvent incomplètes. Cependant, un bloc de Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 29 30 ko montre un réseau dense de gènes appelé ipa/mxi-spa qui peut être considéré comme l’îlot de pathogénicité principal (PAI) de Shigella (SANSONETTI, 2001). Ce PAI plasmidique code pour l’appareil de sécrétion de type III, capable d’injecter dans la membrane cellulaire des protéines ipa dont IpaB et IpaC qui forment un translocateur capable d’injecter d’autres effecteurs moléculaires dans le cytoplasme cellulaire. Ce plasmide de virulence code également pour une protéine de surface appelée IcsA, responsable de la propagation intra-et inter-cellulaire des bactéries (YANG et al., 2005). La figure 7 ci-dessous est une représentation du grand plasmide pWR501 de S. flexneri 5a. Néanmoins, des gènes chromosomiques présents dans des «îlots de pathogénicité» participent habituellement au processus pathogène directement, ou contribuent à la survie de la bactérie au cours de l'infection et l'expression de la virulence dépendrait d'un mécanisme de régulation complexe qui implique un dialogue entre le chromosome et le plasmide de virulence (NIE et al., 2006). Ces îlots de pathogénicité chromosomiques mis en évidence et qui ne sont pas toujours à la fois présents chez une même souche sont SHI-0, SHI-1, SHI-2 et SHI-3 (NIE et al., 2006). Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 30 Figure 7 : Représentation circulaire du grand plasmide de virulence pWR501 (VENKATESAN et al., 2001) Légende : L’anneau extérieur représente les ORFs et leurs orientations ;un code couleur est donné selon la catégorie fonctionnelle : Rouge : identique ou essentiellement identique aux protéines associées à la virulence connues ; Rose : homologue aux protéines associées à la pathogenèse connues ; Bleu : hautement homologue aux éléments IS ou aux transposons ; Bleu-clair: faiblement homologue aux éléments IS ou aux transposons ; Jaune: homologue aux protéines impliquées dans la réplication, dans le maintien du plasmide ou dans d’autres fonctions métaboliques de l’ADN ; Brun: absence de similarité significative à une protéine ou aux ORF dans le “database” ; Orange: homologue ou identique aux ORF hypothétiques conservées, i.e., des protéines de fonction inconnue ; Vert: gènes d’insertion de Tn501. Le second anneau présente les éléments IS complets. Le troisième anneau montre le contenu en G+C calculé pour chaque ORF, avec chaque couleur codée pour l'ORF correspondant. L'échelle est en paires de bases. Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 31 2.4.7. Diagnostic biologique 2.4.7.1. Isolement en culture On utilise des milieux gélosés sélectifs non inhibiteurs : Hektoen, Drigalski, Mac Conkey. Il n’existe pas de bouillon d’enrichissement efficace pour Shigella (AVRIL et al.,1988 ; MARIANI et BINGEN, 2011). Le milieu SS qui ne permet pas la culture de certaines souches de Shigella n’est pas conseillé (AVRIL et al, 1988). L’incubation se fait en 24 heures à 37 °C. Les colonies lactose –, urée –, indole – et H2S + sont l’objet d’une caractérisation plus complète. Le sérotype de la souche est ensuite déterminé par agglutination sur lame avec des sérums anti-shigelles. La figure 5 décrit la technique de recherche à la fois des salmonelles et des shigelles en coproculture. Les autres examens utilisés sont l’hémoculture et l’uroculture où la bactérie est rarement isolée (AVRIL et al, 1988). 2.4.7.2. Le Diagnostic rapide Des tests de diagnostic rapide ont été mis au point et sont en évaluation sur le terrain pour S. dysenteriae (AUBREY, 2011). 2.4.7.3. La PCR Les méthodes de PCR ciblent principalement les gènes d’invasion «invasive plasmid antigen H : ipaH» seul (GAUDIO et al., 1997 ;DUTTA et al., 2001) ou ipaH et « invasive antigen locus : ial » (SETHABUTR et al., 1993). Les gènes ial et ipaH sont respectivement responsables de la pénétration directe de la bactérie dans les cellules épithéliales et de la modification de la réponse de l’hôte à l’infection (HALE, 1991). 2.4.7.4. Le Diagnostic sérologique Le sérodiagnostic peut se faire par séro-agglutination , mais est dépourvu d’intérêt dans les syndromes dysentériformes car il est trop tardif et sa spécificité est inégale selon les sousgroupes ; il est parfois utile pour rapporter certains syndromes rhumatismaux à S. flexneri (AVRIL et al.,1988). Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 32 2.4.8. Sensibilité aux antimicrobiens et prophylaxie De nombreuses souches de shigelles (en particulier Sd1) sont multirésistantes aux antibiotiques habituellement utilisés : tétracycline, ampicilline, cotrimoxazole, acide nalidixique (AUBREY, 2011). Les fluoroquinolones sont le traitement de première intention contre la shigellose (AUBREY, 2011) La prophylaxie est basée, outre sur une prise en charge des cas, sur l’hygiène collective et individuelle. Il n’existe actuellement aucun vaccin, cependant, des vaccins candidats sous-unitaires et vivants atténués administrés par voie parentérale font l’objet d’études ; d’autres études en cours portent aussi sur des vaccins vivants atténués, conjugués, à large spectre ou à base de protéosomes (AUBREY, 2011). Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 33 MATÉRIELS ET MÉTHODES Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 34 3. Matériels et méthodes 3.1. Cadre de l’étude Notre étude a été menée à Ouagadougou, capitale et ville la plus peuplée du Burkina Faso avec plus de deux millions d’habitants (Ministère de la Santé du Burkina Faso, 2010). Ouagadougou est situé au centre du pays et sur le plan sanitaire est découpé en 5 districts sanitaires (Baskuy, Bogodogo, Boulmiougou, Nongremassom et Signoghin). Il comprend 3 hôpitaux nationaux et de nombreux autres centres de santé publics et privés. Le climat y est de type soudano-sahélien, marqué par une saison pluvieuse qui s’étend sur environ 4 mois de Juin à Septembre et une saison sèche qui va d’Octobre à Mai. Ce climat reste principalement caractérisé par deux régimes : la saison hivernale est sous l’influence d’un vent humide, la mousson qui est la source des manifestations pluvieux- orageuses, alors qu’un régime de vent sec, l’harmattan, frappe la ville pendant la saison sèche. Le laboratoire de la Clinique El Fateh SUKA et celui du Centre Médical Saint Camille (CMSC) ont servi de cadres pour la collecte des échantillons ainsi que la réalisation des coprocultures ; le diagnostic moléculaire a été effectué au Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni (CERBA). La Clinique El Fateh SUKA est une structure sanitaire de la fondation SUKA, fondation intervenant dans le domaine social, sanitaire et éducatif au Burkina Faso. Elle est située au secteur 17 de la ville de Ouagadougou et relève du district sanitaire de Boulmiougou, Il s’agit d’une clinique médico-chirurgicale qui dispose d’une centaine de lits d’hospitalisation comprenant plusieurs services techniques (médecine générale, chirurgie, pédiatrie, gynécologie-obstétrique, bucco-dentaire, pharmacie, radiologie, laboratoire). La clinique offre également des prestations dans d’autres spécialités que sont la cardiologie, la dermatologie, la kinésithérapie, la diabétologie, la neurologie, la gastro-entérologie, la santé mentale. Son service de laboratoire qui fonctionne 7 jours / 7 et 24 heures / 24 assure des analyses de biochimie, bactériologie-virologie, parasitologie-mycologie, hématologie, immunologie et spermiologie. Il effectue également des prélèvements pour des tests d’ADN en collaboration avec des laboratoires du nord. Quant au Centre Médical Saint Camille (CMSC), c’est un centre de santé de la délégation camillienne au Burkina Faso. Il s’agit d’un établissement à caractère caritatif dont la gestion est assurée par les Camilliens. Situé au secteur 14 de la ville de Ouagadougou, il relève du Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 35 district sanitaire de Bogodogo. Il dispose des services de maternité, pédiatrie, santé maternelle et infantile (SMI), dispensaire pour adultes, dépôt pharmaceutique, cabinet dentaire, radiologie, laboratoire. Des consultations médicales spécialisées y sont également effectuées. Le service de laboratoire effectue des analyses de parasitologie, bactériologie, biochimie, hématologie, immunologie et de biologie moléculaire. Concernant le CERBA, il est situé au secteur 30 de Ouagadougou et relève du même district sanitaire que le CMSC ( Bogodogo). Créé également par la délégation camillienne, ce centre a pour missions premières la formation et la promotion de jeunes chercheurs en particulier dans le domaine biomoléculaire où il dispose d’un plateau technique moderne (appareils de PCR en temps réel, HPLC, séquenceur). Les activités de recherche s’articulent autour de plusieurs axes principaux. Le 1er axe qui concerne la recherche fondamentale et les sciences du génome se décompose en sous-axes sur les pathologies génétiques (hémoglobinopathies, ostéoporose, déficiences génétiques), les marqueurs de résistance génétique (résistance bactérienne aux antimicrobiens), le diagnostic moléculaire de diverses pathologies en particulier des pathologies émergentes (VIH, HPV, VHC, VHB) ainsi que sur la vaccinologie. Le 2ième axe fait intervenir des études de nature à valoriser la médecine traditionnelle (travaux sur des recettes traditionnelles fournies par des tradipraticiens). Les deux derniers axes comprennent la recherche clinique (suivi biologique et clinique des personnes vivant avec le VIH, activités portant sur la PTME, expérimentations pharmaco-cliniques) et la recherche en nutrition (réhabilitation nutritionnelle des enfants malnutris). 3.2. Période et type détude Il s’agit d’une étude prospective qui s’est déroulée du 05 Février au 18 Juillet 2013 3.3. Échantillonnage L’échantillonnage qui était aléatoire et systématique a concerné 200 prélèvements au total. 101 échantillons ont été réceptionnés au laboratoire de la clinique El Fateh SUKA entre le 05 février et le 09 mars 2013 et les 99 autres sont ceux que le laboratoire du CMSC a reçus entre le 05 février et le 06 mars 2013. Durant cette période, l’activité bactériologique totale des 2 laboratoires a concerné 804 échantillons traités et les 200 échantillons représentaient 25% de cet ensemble. Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 36 Sont inclus dans l’étude tout prélèvement de selles reçu au cours de la période indiquée et pour lequel il est formulé une demande d’examen bactériologique ou coproculture : il s’agissait des échantillons de toutes les coprocultures consécutives et non répétitives pour un même patient (la coproculture initiale seule a été retenue). Les échantillons de selles pour lesquels une telle demande n’est pas faite sont exclus. Les échantillons pour coproculture de contrôle étaient également exclus. Dans chacun des laboratoires, à la réception de l’échantillon, une fiche de collecte (Annexe 1) est remplie par un technicien du laboratoire. Dans les 30 mn qui suivent, une partie du prélèvement est transférée dans un tube stérile et conservée à – 80°C en vue du diagnostic moléculaire. La durée de conservation des échantillons avant ce diagnostic a été de trois à quatre mois. 3.4. Matériels et Méthodes pour la coproculture. Les bactéries entéropathogènes recherchées sont Salmonella, Shigella et E. coli entéropathogène (ECEP). Pour cela, la démarche diagnostique a été effectuée sur la base des référentiels existants (REMIC, 2004). Après l’examen microscopique d’une préparation des selles en eau physiologique (NaCl 0,9%) à l’état frais, une mise en culture est faite systématiquement pour la recherche de Salmonella et de Shigella pour tous les échantillons : la gélose Hektoen et un bouillon d’enrichissement pour salmonelles (bouillon sélénite) sont ensemencés et incubés à l’étuve à 37°C. Après 5 à 6 heures, le bouillon sélénite est repiqué sur une deuxième boîte de gélose Hektoen. Les deux boites de Hektoen sont gardées à l’étuve à 37°C pendant 18 à 24 heures. Les colonies suspectes (bleu-vertes ou vertes avec ou sans centre noir) ont été soumises à l’identification biochimique par galerie (API 20 E Biomérieux®, France) et repiquées également sur milieu de Kligler-Hajna. Les colonies identifiées Salmonella ou Shigella par la galerie sont agglutinées à partir de leur culture sur le milieu Kligler-Hajna respectivement avec les antisérums Salmonella et antisérums Shigella (BIO-RAD®, France) pour la confirmation, l’identification de l’espèce ou du sérotype. La recherche d’Escherichia coli s’est faite dans les échantillons des enfants d’âge inférieur ou égal à deux ans sur gélose Eosine Bleu de Méthylène (EMB). Les colonies caractéristiques (colonies violettes avec un reflet vert-métallique) ont été agglutinées avec des antisérums E. coli entéropathogène (BIO-RAD®, France). Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 37 3.5. Matériels et Méthodes pour le diagnostic moléculaire 3.5.1. Matériels 3.5.1.1. Réactifs - Solution de NaCl 0,9% et de PBS 10% - Kit d’extraction d’ADN : « DNA-Sorb-B » de Sacace Biotechnologies® (Réf K-1-1/B), (composition à l’annexe 2) - Kit d’amplification en temps réel « Shigella/Salmonella/Campylobacter Real-TM » de Sacace Biotechnologies® (Réf TB44-50FRT), (composition à l’annexe 2). 3.5.1.2. Appareil de PCR SaCycler-96 Real Time PCR v.7.3 de Sacace Biotechnologies®(figure 8) Figure 8: Appareil SaCycler-96 Real Time PCR v.7.3 de “Sacace Biotechnologie” Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 38 3.5.1.3. Autres matériels Plaques de lecture PCR, tubes à hémolyse de 5 mL, tubes eppendorf de 1.5 mL, pipettes pasteur plastique de 3 mL graduées, embouts à filtre, micropipettes, centrifugeuse, agitateur vortex, incubateur, bain marie, réfrigérateur, congélateur -80°C. 3.5.2. Préparation des échantillons pour l’extraction de l’ADN Avant l’étape de l’extraction, les échantillons ont été traités conformément aux recommandations du fabricant du réactif. Ils ont d’abord été décongelés. Une suspension de chaque échantillon est préparée en introduisant dans un tube à hémolyse stérile 4 mL de solution de NaCl à 0,9% et 1 mL d’échantillon pour les selles liquides ou 1g d’échantillon (taille d’un petit pois) pour les selles solides. Le tube est agité au vortex puis centrifugé à 12 000 g pendant 5 mn. Ensuite, 100 µL du surnageant sont transférés dans un tube eppendorf où on a ajouté 800 µL de tampon PBS à 10%. Après agitation au vortex et centrifugation pendant 5 mn à 12 000g, le surnageant est éliminé. On a ajouté au culot 300 µL de tampon PBS à 10% et l’on a agité au vortex. L’échantillon ainsi préparé est prêt pour l’étape de l’extraction et peut être conservé à 2-8°C pendant 24 heures ou à -20/-80°C au-delà de 24 heures. 3.5.3. Extraction de l’ADN Le protocole fourni par le fabricant du kit d’extraction (« DNA-Sorb-B, Sacace Biotechnologies® ») a été suivi (Annexe 3). 3.5.4. PCR en temps réel Principe du kit « Shigella / Salmonella / Campylobacter Real-TM » Le kit « Shigella / Salmonella / Campylobacter Real-TM » est un test PCR en temps réel pour la détection de Shigella spp. et E.coli entéroinvasif (ECEI) / Salmonella spp. / Campylobacter spp. dans l'eau et les fèces. L'ADN est extrait à partir des échantillons, puis amplifié en temps réel avec un reporteur fluorescent coloré à sondes spécifiques de Shigella spp. et E.Coli entéroinvasif (ECEI) / Salmonella spp. / Campylobacter spp. et un contrôle interne (IC). Le Contrôle Interne sert de contrôle d'amplification pour chaque échantillon traité et permet de détecter une inhibition de la réaction d’amplification. Les gènes cibles d’amplification sont IpaH pour Shigella, TtrB pour Salmonella, 23SrRNA pour Campylobacter. Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 39 Préparation des mélanges réactionnels pour l’amplification Le volume total de la réaction d’amplification pour chaque échantillon a été de 25µL (15 µL de PCR-mix et 10 µL d’ADN). Deux mélanges réactionnels ont été préparés (un pour Salmonella/Shigella et un pour Campylobacter). Lors de la détection de Salmonella / Shigella, pour N échantillons, on a introduit dans un tube :10 x (N +1) µL de RT-PCR-mix-1 Shigella spp. / Salmonella spp., 5.0 x (N +1) µL de PCR-mix-2 et 0,5 x (N +1) µL de TaqF Polymérase. Le tube a été agité au vortex puis centrifugé brièvement. Le mélange réactionnel pour Campylobacter a été préparé de la même manière en remplaçant la RT-PCR-mix-1 Shigella spp. / Salmonella spp par la PCR-mix-1 Campylobacter spp. / IC. Pour chaque échantillon, 2 puits de la plaque ont été utilisés (un contenant 15 µL du mélange réactionnel pour Salmonella/Shigella et l’autre contenant 15 µL du mélange réactionnel pour Campylobacter). On a ajouté à chaque puits 10 µL d’ADN de l’échantillon correspondant. Avant l’ajout de ces 10 µL, l’extrait d’ADN de chaque échantillon est centrifugé une nouvelle fois 2 mn à 12 000 g et c’est à partir du surnageant que sont prélevés ces 10µL (le culot étant susceptible d’inhiber la réaction). Un panel de 3 contrôles a été préparé en ajoutant 10 µl d'ADN-tampon dans le puits étiqueté contrôle négatif, 10 µl de Shigella sonnei / C + Salmonella dans le puits étiqueté C + Shigella / Salmonella et 10 µl de Campylobacter jejuni / IC C + au puits étiqueté C + Campylobacter. Programme d’amplification sur SaCycler-96 1- 95°C pendant 15 minutes X 1 cycle 2- 95°C pendant 10 secondes 3- 60°C pendant 30 secondes X 45 cycles 4- 72°C pendant 10 secondes Interprétation des résultats Les résultats ont été interprétés à l’aide du logiciel de l'appareil à travers le croisement de la courbe de fluorescence avec la ligne de seuil. Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 40 Campylobacter spp. est détecté par « FAM » (vert) et l’ADN IC par « JOE » (Jaune) grâce à la PCR-mix-1 Campylobacter spp./internal Control. Shigella spp. et E.coli entéroinvasif (ECEI) sont détectées par « FAM » (vert) et Salmonella spp. par « JOE » (jaune) grâce à la PCR-mix-1 Shigella spp. / Salmonella spp. 3.6. Analyse des données Pour des fins d’analyse, les patients ont été repartis en 4 groupes selon l’âge : nouveau-nés (âge ≤ 28 jours), nourrissons (âge > 28 jours et ≤ 2 ans), enfants (âge > 2ans et ≤ 15 ans), adultes (âge > 15 ans). La diarrhée, a été définie comme étant l’émission d’au moins 3 selles liquides ou molles par jour. L’état d’un patient ayant des antécédents de fièvre telle que rapportée par le patient ou mentionnée sur le bulletin de demande d’examen, a été considéré comme fébrile à des fins analytiques. L’analyse informatique et statistique a été faite sur micro-ordinateur à l’aide des logiciels Epi Info 3.5.1. et Microsoft office Excel 2007. Le test de Chi carré à été utilisé pour les comparaisons. La différence a été significative pour p <0,05. Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 41 RÉSULTATS Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 42 4. Résultats 4.1. Caractéristiques des patients L’étude a porté sur des échantillons de coproculture de 200 patients. L’âge des patients varie d’un jour (1 patient) à 80 ans (1 patient). La diarrhée, définie comme étant l’émission d’au moins 3 selles liquides ou molles par jour était présente chez 42 patients (21,00%) ; parmi ceux-ci les nourrissons (âge > 28 jours et ≤ 2 ans) au nombre de 24, représentaient 57,14% alors que 15,65% des adultes (18 parmi 115) présentaient cette symptomatologie. Les caractéristiques épidémio-cliniques des patients sont résumées dans le tableau IV. Tableau IV: Caractéristiques épidémio-cliniques des patients ≤ 28 jours 29 jours à 2 ans >2 ans et ≤ 15 ans >15 ans Masculin Sexe Féminin Hospitalisé Type de patient Externe Oui Diarrhée Non Oui Présence de fièvre Non Oui Vomissements Non Antibiothérapie en cours* Oui Non Liquide Consistance des selles Semi-liquide Solide Oui Selles sanguinolentes Non Oui Présence de leucocytes Non * : Nombre total de réponses = 184 Groupe d’âge 4.2. N % 2 35 48 115 79 121 11 189 42 158 89 111 26 174 29 155 12 23 165 5 195 10 190 1,0 17,5 24,0 57,5 39,5 60,5 5,5 94,5 21,0 79,0 44,5 55,5 13,0 87,0 14,5 85,5 6,0 11,5 82,5 2,5 97,5 5,0 95,0 Résultats de l’isolement / identification La recherche des 3 bactéries a été positive dans 12 échantillons (6,00%) (Tableau V). Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 43 Tableau V : Répartition des résultats de la culture en fonction des tranches d’âge ECEP* Répartition des cas selon l’âge Total des cas a (n=200 ) N % Nnés (n=02) Nssons (n=35) Enf(n=48) Ad (n=115) N % N % N % N % 4 10,81 0 0,00 4 11,42 Shigella spp. 5 Germes 2,50 0 0,00 1 2,85 1 2,10 3 2,60 Salmonella spp. 3 1,50 a : pour la recherche des ECEP, n = 37 ; 0 0,00 1 2,85 1 2,10 1 0,86 * : Recherché uniquement chez les Nnés et chez les Nssons Nnés (Nouveau-nés), Nssons (Nourrissons), Enf (Enfants), Ad (Adultes) La plus grande fréquence a été observée avec Escherichia coli entéro-pathogène rencontré 4 fois (10,81%) dans les 37 échantillons concernés (nouveau-nés + nourrissons). Pour Shigella et Salmonella, les résultats se repartissent en : Shigella (3 cas de S.flexneri, 1 cas de S. boydii, 1 cas de Shigella sp.), Salmonella (1cas de Salmonella Typhi, 1 cas de Salmonella Paratyphi B, 1 cas de Salmonella sp.). 4.3. Résultats de la PCR Parmi les 200 échantillons, 20 d’entre eux (10,00%) se sont révélés positifs à la PCR (Tableau VI) Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 44 Tableau VI : Répartition des 20 cas positifs à la PCR selon les critères « épidémiocliniques » des patients Nombre de bactéries diagnostiquées à la PCR Critère Groupe d’âge Sexe Hospitalisé ATBpie en cours * Diarrhée Fièvre Consistance des selles Selles sanguinolentes Leucocytes dans les selles Shigella Salmonella Campylobacter Nnés (n=2) 0 0 0 Nssons (n=35) 5 0 0 Enf. (n=48) 3 0 2 Ad. (n=115) 9 1 0 Masculin (n=79) 8 0 2 Féminin (n=121) 9 1 0 Non (n=189) 15 1 2 Oui (n=11) 2 0 0 Non (n=155) 13 1 2 Oui n= 29) 4 0 0 Non (n=158) 7 1 1 Oui (n=42) 10 0 1 Non (n=111) 8 1 1 Oui (n=89) 9 0 1 Liquide (n=12) 5 0 0 S-liquide (n=23) 5 0 2 Solide (n=165) 7 1 0 Non (n=196) 14 0 0 Oui (n= 4) 3 0 0 Non (n=190) 8 1 1 Oui (n=10) 9 0 1 * : nombre total de réponses obtenues = 184 S-liquide= semi-liquide ATBpie = Antibiothérapie Campylobacter spp. a été positif dans deux échantillons semi-liquides de 2 enfants: les selles d’un garçon diarrhéique de 5 ans chez qui la culture avait détecté Salmonella Paratyhi B, et dans celles d’un autre garçon de 7 ans pour qui la culture a été négative . Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 45 Concernant Salmonella spp., seul un échantillon s’est révélé positif. Il s’agit de celui d’une dame sans diarrhée avec des selles molles, absence de leucocytes chez qui la coproculture a indiqué Salmonella Typhi. Les 2 autres échantillons positifs à la coproculture ont donc donné des résultats négatifs à la PCR. Pour le diagnostic de Shigella spp., en rappel, le gène cible que détecte le kit utilisé est le gène IpaH, gène présent également chez E. coli entéro-invasif. Dix sept (17) échantillons ont été positifs pour ce gène (soit 8,50%). Par ailleurs, tous les 5 échantillons positifs à la culture étaient positifs à la PCR. Sur ces 17 échantillons, la recherche d’Escherichia coli par culture avait été faite chez 5 d’entre eux (âge des patients ≤ 2 ans) et deux échantillons s’étaient montrés positifs à E. coli (ECEP), un positif à Shigella flexneri et les deux étaient négatifs. En considérant l’ensemble des résultats obtenus grâce aux 2 méthodes conventionnelles et moléculaires, 21 sur les 200 échantillons (soit 10,50%) ont été positifs à au moins un pathogène. Le tableau VII montre le nomb re et le pourcentage de germes diagnostiqués en combinant les 2 types de résultats (culture et PCR). Tableau VII: Résumé des résultats de culture et de PCR Germe ECEP Salmonella Shigella Campylobacter Nombre (N) et pourcentage (%) des échantillons positifs Par la PCR Par la culture N % N % ND 1 17 2 ND 0,50 8,50 1,00 4 3 5 ND 10,81 1,50 2,50 ND ND = non déterminé Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 46 DISCUSSION Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 47 5. Discussion Cette étude s’est faite sur des échantillons de coproculture de deux laboratoires pendant une période relativement courte et donc pas forcément représentatifs de la population drainée par l’ensemble des laboratoires de la ville de Ouagadougou. Néanmoins, la recherche concomitante des 3 germes en question a permis d’avoir des données au plan moléculaire sur 200 échantillons de selles pour la première fois dans notre pays en plus des quelques données existantes issues des méthodes traditionnelles de diagnostic et portant le plus souvent sur les enfants diarrhéiques (SANOU et al., 1999 ; DJENEBA et al., 2007 ; SIMPORE et al., 2009 ; NITIEMA et al., 2011; BONKOUNGOU, et al., 2013). En particulier, il manque beaucoup d’informations sur Campylobacter spp. qui n’est pas recherché en routine dans les échantillons de coproculture. Sur les caractéristiques des patients L’étude a permis de faire un point sur le profil clinique et épidémiologique de ces 200 patients. Ainsi, on constate que les demandes de coproculture émanent pour 57,5% des adultes, que dans 94,5% des cas, il s’agit d’échantillons venant de patients non hospitalisés. La diarrhée, critère important dans la décision de prescrire une coproculture (ANAES 2003, REMIC 2004), n’est présente que chez 42 patients (21,0%) parmi lesquels 13 (6,5%) manifestaient également des vomissements. Au total, on a noté les vomissements chez 26 patients (13,0%). La fièvre était présente chez 89 patients (44,5%) et la positivité d’un échantillon à la culture et/ou à la PCR chez les patients fébriles et non fébriles n’était pas statistiquement significative (p= 0,602). Quant aux échantillons liquides ou semi-liquides, ils représentaient 17,5%. Ceci semble indiquer que la coproculture fait probablement partie au même titre que la recherche de parasites, du bilan systématique de certains syndromes gastro-intestinaux non infectieux en pratique médicale courante. Cela pourrait contribuer à expliquer la faible prévalence des bactéries entéropathogènes recherchées dans les échantillons analysés. Par ailleurs, il ressort de cette étude que les nourrissons sont plus touchés par la diarrhée que les adultes avec une fréquence de 68,57% versus 12,17% (p < 0,05). Un fort taux similaire Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 48 avait déjà été rapporté par SANOU et al. (1999) lors d’une étude réalisée au Centre Hospitalier Yalagado Ouédraogo au Burkina Faso avec une fréquence de 55,70% ; par ORLANDI et al. (2006) à Porto Velho au Bresil (53,30%) et par DJENEBA et al. en 2007 (46,97%). Chez ces nourrissons, la faible fréquence des bactéries entéropathogènes pourrait s’expliquer par le fait que les virus dont les Rotavirus sont la première cause de diarrhée ( SIMPORE et al., 2009 ; MARIANI et al., 2011 ). Ceci est d’autant vrai que l’étude a lieu pendant l’harmattan, période où l’on constate des fréquences plus élevées de ces virus chez les enfants de cette tranche d’âge (NITIEMA et al., 2011 ; BONKOUNGOU et al., 2013). Tous les 10 échantillons qui avaient montré des leucocytes à l’examen microscopique se sont révélés positifs à la coproculture et/ou au diagnostic moléculaire confirmant ainsi la présence des leucocytes retrouvés le plus souvent dans les échantillons de selles des sujets infectés par les germes entéro-invasifs (REMIC, 2004). Cependant, certains résultats positifs émanent d’échantillons qui n’avaient pas de leucocytes (sur 190 échantillons qui n’avaient pas de leucocytes, 10 d’entre eux ont montré un résultat positif à la culture et/ou à la PCR). Sur les résultats de diagnostic par les 2 méthodes Selon les résultats de la culture, 6,0% des échantillons ont été positifs. La PCR quant à elle a été positive 20 fois (soit 10,0% des échantillons). Pris globalement, ces 2 pourcentages ne montrent pas de différence significative (p=0,140). Ceci est du au fait que d’une part tous les germes recherchés ne l’ont pas été dans tous les échantillons et d’autre part, les 2 méthodes de culture et de PCR n’ont pas été utilisées pour toutes ces bactéries diagnostiquées. Shigella aussi bien au niveau de la coproculture qu’à celui de la PCR, était plus diagnostiqué que Salmonella (2,5% à la coproculture contre 8,5% à la PCR pour Shigella et 1,5% à la coproculture contre 0,5% à la PCR pour Salmonella). Concernant la culture, même si ces résultats présentent la même tendance (Shigella le plus souvent mis en cause que Salmonella) que ceux de SANOU et al. (1999), les taux diffèrent. Ces derniers avaient rapporté les taux d’isolement suivants : Shigella 42,0%, Salmonella 26,0%. Par contre, la tendance n’est pas la même que les résultats de BONKOUNGOU et al. (2013) qui avaient trouvé 6,0% et 9,0% respectivement pour Shigella et Salmonella. Il est à Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 49 noter toutefois que ces deux études citées concernaient exclusivement des échantillons d’enfants de 0 à 5 ans qui présentaient une diarrhée aigue. L’étude de SIMPORE et al. (2009) chez les enfants de 2 à 41 mois avait isolé Salmonella dans 1,9% des échantillons contre Shigella dans 1,0%. En comparaison, l'enquête réalisée en 1999-2000 par l’Institut de veille sanitaire en France portant sur 4838 échantillons de coproculture dans 14 laboratoires avait rapporté un taux de positivité totale de 5,3 % avec Salmonella et Shigella isolés respectivement dans 2,6 % et 0,3% des échantillons (WEBER et al., 2003). Shigella flexneri a été le plus isolé (3 cas sur le total de 5), ce qui est similaire aux données de plusieurs études qui indiquent que celui-ci est la plus fréquente des 4 espèces de Shigella dans les pays en développement (YANG et al., 2005 ). NITIEMA et al (2011), BONKOUNGOU et al (2013) avaient également rapporté cela. Quant à la PCR, le taux de positivité de Shigella prend en compte aussi bien Shigella spp. que E. coli entéro-invasif (ECEI) ; étant entendu qu’IpaH est présent chez toutes les espèces de Shigella et chez ECEI, et qu’il n’existe pas à nos jours des techniques moléculaires permettant de différencier Shigella des ECEI (VAN et REUBSAET, 2011). Les 5 échantillons positifs à la culture étant également positifs à la PCR, on peut affirmer pour ces 5 qu’il s’agit effectivement de Shigella. Pour les 12 autres, la positivité serait due à Shigella avec la possibilité que ce soit un E. coli entéro-invasif. Il en résulte une différence statistiquement significative entre résultats de culture et résultats de PCR dans le diagnostic de cette bactérie (p= 0,008). Un grand écart entre résultats de PCR et de culture avait été également noté par VU et al., (2004) dans le cadre d'une vaste étude de surveillance de la shigellose à Nha Trang (Vietnam) qui avait montré que parmi 245 échantillons négatifs à la culture, 87 d’entre eux (36,0%) étaient positifs à la PCR (présence du gène IpaH). Les auteurs avaient conclu à la faible sensibilité de la coproculture dans le diagnostic de Shigella. Cette assertion avait également été faite lors d’autres études : en Inde, (DUTTA et al., 2001 ) où 22 des 46 échantillons positifs à la PCR (48,0%) étaient négatifs à la culture ; en Thaïlande, la culture avait détecté 50 cas de shigellose chez 119 patients (42,0%) atteints de dysenterie, alors que l'amplification par PCR a détecté 72 cas (61,0%) (SETHABUTR et al., 1994). Dans la présente étude, même si parmi les 12 cas, la probabilité que certains soient des ECEI n’est pas nulle, même si une PCR positive n’est pas synonyme de présence de bactérie viable, ce nombre élevé de cas qui sont positifs à la PCR et négatifs à la culture suggère également une faible sensibilité de la culture dans le diagnostic de Shigella. Plusieurs données plaident Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 50 en faveur de cette hypothèse. En effet, grâce au nombre élevé de cycles, la PCR permet de détecter de très faibles charges bactériennes de Shigella dans les selles que la culture ne puisse détecter ; dans leur étude, VU et ses collaborateurs avaient remarqué que le nombre moyen de cycles PCR pour détecter un résultat positif était de 36,6 lorsque la culture était négative et de 25,3 lorsque la culture était positive (VU et al., 2004). Contrairement à Salmonella, dans la réalisation de la coproculture, il n’existe pas de milieu d’enrichissement pour Shigella (MARIANI et BIGEN, 2011) ; ce qui n’est pas de nature à augmenter les chances de détection de Shigella et donc de culture positive lorsque l’on est dans un contexte de faible charge bactérienne dans l’échantillon , lorsqu’il ya une concurrence des autres organismes commensaux dans le milieu de culture. Néanmoins, d’autres recherches s’avèrent nécessaires pour déterminer la part des ECEI dans les échantillons positifs au gène IpaH et élucider davantage la question sur la sensibilité de la culture. La récente étude de BONKOUNGOU sur les échantillons des enfants diarrhéiques avait montré une très faible fréquence des ECEI (0,3%) comparativement aux ECEA (12%) et aux ECEP (8,0%) (BONKOUNGOU et al., 2013). L’autre question soulevée par ces résultats porte sur la recherche en pratique courante des ECEI. Compte tenu du fait que les déterminants génétiques de virulence dans toutes les espèces de Shigella et les ECEI sont fonctionnellement identiques, on est en droit de se poser la question si ces éventuels ECEI méritent d’être ignorés chez un patient symptomatique fut-il adulte? Autrement dit, ne serait-il pas indiqué que les laboratoires de biologie médicale intègrent la recherche des ECEI dans leur pratique de routine lors du diagnostic étiologique des diarrhées ? Concernant Salmonella, sur les 3 échantillons positifs à la culture, deux ont donné un résultat négatif à la PCR. A titre de comparaison, BESSEDE et al (2011) en France qui avaient utilisé dans leur étude la coproculture et une PCR multiplex avaient trouvé 5 échantillons positifs à la culture qui étaient négatifs à la PCR, 8 échantillons positifs par PCR mais négatifs à la culture, 14 échantillons positifs aux 2 méthodes. Le non diagnostic de ces 2 échantillons par la PCR suggère 2 hypothèses : une moindre spécificité de la culture (par ressemblance biochimique et communauté antigénique de Salmonella avec d’autres bactéries) ou une sensibilité inférieure de la PCR dans le diagnostic de Salmonella par rapport à la coproculture. La seconde va dans le même sens des résultats rapportés lors de l’étude comparative entre PCR et culture réalisée aux États unis d’Amérique Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 51 par CUNNINGHAM et al. (2010). Les auteurs en comparant la PCR à la culture des selles avec et sans enrichissement au sélénite avaient trouvé qu’avec le bouillon d’enrichissement, la culture détectait plus de cas que la PCR. Cependant, au regard des résultats de la présente étude, des recherches complémentaires avec un plus grand nombre d’échantillons s’avèrent indispensables pour confirmer cette hypothèse. Sur Campylobacter, l'étude a profité de la récente disponibilité des méthodes modernes de diagnostic du germe dans les selles autres que la culture pour réaliser pour la première fois son diagnostic moléculaire dans notre pays. Le nombre de deux cas trouvés (1,0%) chez des enfants symptomatiques semble indiquer que la fréquence de Campylobacter dans les échantillons de coproculture est proche de celle de Salmonella. En France, WEBER et al. (2003) avaient obtenu par la coproculture un taux de 2,0%, tandis que BESSEDE et al.(2011) en combinant les méthodes immuno-enzymatiques, moléculaires et la culture avaient rapporté un taux de 9,5% chez des patients tous hospitalisés et présentant des problèmes gastrointestinaux. L’étude de BONKOUNGOU et al. (2013) sur des échantillons d’enfants diarrhéiques avait diagnostiqué par la culture 2,0% de cas parmi les 283 échantillons. La recherche systématique de Campylobacter dans les échantillons de selles lors des coprocultures systématiquement comme cela est recommandé par certaines études (WEBER et al., 2003 ; AFSSA, 2004 ) et certains référentiels ( REMIC, 2004), s’avère donc importante dans le diagnostic étiologique de certaines entérites et diarrhées en pratique courante ; cette recherche pouvant se faire par la culture ou par d’autres méthodes. Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 52 CONCLUSION ET PERSPECTIVES Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 53 Conclusion et perspectives Au Burkina Faso, Il existe peu de données concernant la présence des bactéries entéropathogènes dans les coprocultures à visée diagnostique effectuées en laboratoire d’analyses de biologie médicale. La présente étude a utilisé les méthodes modernes de diagnostic pour évaluer pour la première fois dans notre pays la fréquence de ces germes dans les échantillons de selles reçus en routine pour examen bactériologique. La diarrhée était présente chez 21,0% des patients alors que 94,5% des échantillons venaient de patients ambulatoires. Il ressort de l’étude que Shigella spp. est le plus fréquent avec 17 cas rencontrés sur les 200 échantillons (8,5%). Même si Campylobacter spp. et Salmonella spp. ont été diagnostiqués rarement (1,0% et 0,5% respectivement), l’étude montre qu’aucune raison ne justifie la non recherche de Campylobacter dans les échantillons de selles reçus pour examen bactériologique. Campylobacter spp. doit donc être systématiquement recherché dans les coprocultures. Les résultats préliminaires obtenus dans le cadre de cette étude nous permettent de penser aux perspectives suivantes : Envisager une étude à grande échelle au niveau national sur les bactéries entéropathogènes grâce à la combinaison des méthodes conventionnelles et modernes ; Juger des performances de chacune des méthodes utilisées ; Contribuer à l’amélioration des protocoles de recherche des bactéries entéropathogènes par les laboratoires de biologie médicale au Burkina Faso ; Promouvoir en particulier la recherche de Campylobacter dans les échantillons de coproculture ; Participer à des actions de formation et de standardisation des techniques qui accompagnent la mise en œuvre de cette recherche. Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 54 RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 55 Références Bibliographiques Articles ALLOS, B. M. (2001) Campylobacter jejuni Infections: update on emerging issues and trends. 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Examen macroscopique des selles Aspect des selles : pâteuse ⃝ Couleur : molle ⃝ moulée⃝ liquide ⃝ semi-liquide⃝ jaunâtre ⃝ verdâtre ⃝ noire ⃝ rouge⃝ brunâtre⃝ Présence de sang : Oui ⃝ Non ⃝ Présence de glaire : Oui ⃝ Non ⃝ Présence de pus : Oui ⃝ Non ⃝ Présence de vers adultes : Oui ⃝ Non ⃝ Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 66 Annexe 2 Contenu du kit « Sacace, TB44-50RT » A- Composition du « DNA-Sorb-B » (pour 50 extractions) • Lysis Solution, 15 ml; • Washing Solution 1, 15 ml; • Washing Solution 2, 50 ml; • Sorbent, 1,25 ml; • DNA-eluent, 5,0 ml. B- Composition du kit « Shigella/Salmonella/Campylobacter Real – TM » (pour 55 tests) • PCR-mix-1 Shigella spp. / Salmonella spp., 0,6 ml; • PCR-mix-1 Campylobacter spp. /IC, 0,6 ml; • PCR-mix-2-Flu, 2 x 0,3 ml; • TaqF Polymerase, 2 x 0,02 ml; • Positive Control Shigella sonnei/Salmonella C+, 0,1 ml; • Positive Control Campylobacter jejuni/Internal Control (IC) C+, 0,1 ml; • Negative Control C-, 1,2 ml; • Internal Control IC, 1,0 ml; • DNA-buffer, 0,5 ml; Annexe 3 Protocole d’extraction de l’ADN avec le « DNA-Sorb-B, Sacace Biotechnologies® » 1 - Chauffage de “ Lysis Solution” et de “Washing Solution” au bain marie à 60°C jusqu’à la disparition totale des éventuels cristaux. 2 - Disposition sur un portoir du nombre requis de tubes stériles en polypropylène de 1.5ml (un tube pour chaque échantillon et un tube pour le contrôle négatif). 3 - Ajout dans chaque tube de 300 µl de Lysis Solution et de 10 µl de IC. 4 – Ajout de 100 µl de chaque échantillon au tube correspondant. 5 - Ajout de 100 µl de C– (Negative Control ) au tube étiquetté contrôle négatif. 6 - Mélange au vortex des tubes et incubation 5 min à 65°C puis recentrifugation pendant 5 secondes. 7 - Mélange au vortex vigoureux du Sorbent et son ajout à chaque tube en raison de 25 µl par tube. 8 - Mélange au vortex pendant 5-7 secondes et incubation pendant 10 mn à la température du laboratoire de tous les tubes. 9 - Mélange au vortex périodiquement Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 67 10 - Centrifugation de tous les tubes 1 mn à 5000g 11 - Utilisation de micropipette avec embouts stériles munis de filtre pour éliminer le surnageant de chaque tube sans toucher au culot (en changeant d’embout entre échantillons). 11 - Ajout de 300 µl de Washing Solution 1 à chaque tube, Mélange au vortex vigoureux et centrifugation 1 mn à 5000g puis élimination du surnageant de chaque tube (comme à l’étape 10). 12 - Ajout de 500 µl de Washing Solution 2 à chaque tube, Mélange au vortex vigoureux et centrifugation 1 mn à 10000g puis élimination du surnageant de chaque tube (comme à l’étape 10). 13 - Répétition de l’étape 12. 13 - Incubation de tous les tubes avec capuchons ouverts pendant 5 mn à 65°C. 16 - Remise en suspension du culot par ajout de 50 µl de DNA-eluent à chaque culot. 17 - Incubation pendant 5 mn à 65°C et Mélange au vortex périodiquement. 18 - Centrifugation de tous les tubes pendant 2 mn à vitesse maximale de 1200016000 g. Les surnageant contiennent les ADN prêts à être amplifiés immédiatement et peuvent être conservés à -20ºC pour une utilisation ultérieure. Master II BIOGEMA 2011-2012 / SAWADOGOGO Salfo Page 68
