L`effet du Palmitoyl Carnitine sur des cellules de levure_Toedli

Etude de l’effet du Palmitoyl-Carnitine sur des
cellules de levure Saccharomyces cerevisiae
Lara Toedtli – Lycée Jean-Piaget – Neuchâtel
Margot Riggi et Karolina Niewola
Robbie Loewith

31 Mars 2016 Rapport Lara Toedtli
Nous avons, pendant une semaine, étudié l’effet que la substance lipidique appelée
Palmitoyl-carnitine a sur des cellules de levure Saccharomyces cerevisiae. Le but
final est de trouver un nouveau traitement envisageable contre le cancer. Des
recherches très assidues sont menées dans ce but à l’université de Genève dans la
faculté des sciences.
Introduction
Se trouvent dans chaque cellule, les protéines TOR 1 et TOR 2 qui ont été
découvertes grâce à la molécule « Rapamycine ». Elle inhibe la protéine « Target of
Rapamycin » ou TOR. Cette protéine régule la prolifération et la croissance
cellulaire ; c’est une enzyme de la famille des kinases. Malheureusement, des
mutations de cette enzyme peuvent, entre autre, être responsables de différents
types de cancer. Ces deux protéines peuvent faire partie de deux complexes
distincts ; TORC 1 et TORC 2. Ils sont formés tous deux de plusieurs protéines. On a
remarqué que le premier complexe était sensible à la Rapamycine alors que le
second ne l’était pas. Une étude à grande échelle a été conduite pour essayer de
trouver des nouvelles molécules inhibant TORC 2 ; parmi elles une substance
lipidique se trouvant naturellement dans les cellules de mammifères, appelée
«palmitoyl-carnitine », permettrait d’inhiber l’activité de TORC 2. Mais comment
fonctionne-t-elle? Comment ce lipide agit-il sur une cellule de levure Saccharomyces
cerevisiae ? Quel effet a-t-il sur TORC 1 et TORC 2 ?
Matériels et méthodes
Premièrement, nous avons transformé des cellules de levure avec le plasmide
PRS426-GFP-2Xph-PLCdelta. La GFP est une protéine fluorescente verte qui est
issue d’une méduse ; elle est ici fusionnée avec le domaine PH de la protéine

31 Mars 2016 Rapport Lara Toedtli
phospholipase C, lui-même capable de se lier à certains lipides de la membrane
plasmique. Cette construction permet ainsi de visualiser la membrane des cellules.
Nous avons observé au microscope confocal, l’effet « en direct » du palmitoyl-
carnitine sur des cellules de Saccharomyces cerevisiae transformées. Ce type de
microscope permet de réaliser des images de très peu de profondeur ; on l’utilise
surtout pour voir les cellules exprimant des protéines marquées avec des protéines
fluorescentes.
Ensuite nous avons procédé à une extraction protéique : il s’agit d’extraire les
protéines des cellules de levure. La première étape est d’inoculer une culture et de la
laisser croître jusqu’une densité optique de 0.8. On traite par la suite la culture avec
le palmitoyl-carnitine (PLC), ou uniquement avec le solvant dans lequel il est dilué
(DMSO) dans le but d’avoir un contrôle négatif. Après différents temps, on ajoute un
acide TCA, représentant 6 % du volume total. Tous ces échantillons sont refroidis,
puis centrifugés plusieurs fois afin de séparer les cellules du surnageant. Les cellules
sont lavées à l’acétone, ensuite séchées. On ajoute une solution de lyse pour
favoriser l’explosion des cellules, qui sont agitées mécaniquement à grande vitesse.
Puis les échantillons sont soumis à une chaleur de 65°C, et mélangés à un tampon
de migration contenant notamment du SDS et du β-mercaptoéthanol, afin de
dénaturer les protéines.
Par la suite, un Western Blot est indispensable pour détecter et identifier les
protéines extraites. Tout d’abord il sera nécessaire de réaliser un gel de
polyacrylamide et d’y déposer les échantillons de protéines. Ensuite, un courant
électrique est appliqué afin que les protéines migrent le long du gel. Les protéines
sont alors transférées sur une membrane. La membrane est alors exposée à un
anticorps primaire caractéristique de la protéine, puis à un anticorps secondaire
reconnaissant l’anticorps primaire, et détectable. Grâce à cette technique il est
possible de distinguer la taille, la concentration, des variations de la concentration de
la protéine d’intérêt.
Résultats

31 Mars 2016 Rapport Lara Toedtli
Analyse Western Blot
La
protéine YPK1 se fait normalement phosphoryler (addition de groupe phosphate) par
TORC2, ce qui fait que l’on peut observer l’effet du PLC sur l’activité de ce
complexe. Sur le graphe on voit clairement que dès 10 secondes l’activité de TORC2
sur YPK1 est inhibée : il y a diminution du niveau de phosphorylation.
De plus on peut corréler ces résultats, à ceux de microscopie.
On aperçoit que dès 30 secondes, après injection de PLC dans le milieu de culture
des cellules, l’effet commence. On remarque des structures circulaires vertes plus
fluorescentes que la membrane. L’intensité de ces signaux augmente au cours du
temps puis atteint un plateau après 5 minutes. Maintenant quel effet a la substance
lipidique Palmitoyl-carnitine sur TORC2 concrètement, nous ne pouvons pas savoir.

31 Mars 2016 Rapport Lara Toedtli
Conclusion
Pour conclure, nous savons que la substance PLC possède un effet sur TORC2 et
sur la structure de la membrane plasmique, mais son mécanisme d’action nous reste
inconnu. Il serait notamment intéressant de corréler les effets sur ces deux cibles. Il
est important de continuer les recherches dans le but de trouver un nouveau
traitement contre le cancer, puisque TOR peut engendre la prolifération incontrôlée
des cellules.
Références
• Two TOR complexes, Only one of which is Rapamycin sensitive, have distinct
roles in cell growth control / R.Loewith & al / Mol Cell / 2002
• TOR signaling in Growth and Metabolism / Stephan Wullschleger, Robbie
Loewith and Michael N. Hall / Cell / 2006
• A brief story of TOR / Robbie Loewith / Biochemical Society transactions/
2011