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Titre du projet de thèse
Microbiote intestinal et maladies chroniques : ciblage pour le développement
d’une nouvelle génération de probiotiques
Directeur de thèse : Corinne GRANGETTE
Equipe Bactéries lactiques et Immunité des Muqueuses, CIIL, Institut Pasteur de Lille, CNRS UMR 8204, 1
rue du Pr Calmette- 59019 Lille Cedex 19
Téléphone : 03 20 87 11 88 Télécopie : 03 20 87 11 92 ; E-mail : [e-mail]
Co- directeur de thèse: Emmanuelle Maguin
Chef du département MICA de l’INRA, Responsable de l’équipe IFE, UMR1319 MICALIS
Equipe Interaction des Firmicutes avec l’Environnement, UMR1319 MICALIS, INRA-AgroParisTech,
Domaine de Vilvert, Jouy-en-Josas, 78350.
[e-mail]
Résumé du projet de thèse
Les bactéries commensales que nous hébergeons au sein de notre tube digestif jouent un rôle clé dans de
nombreux processus physiologiques dont la régulation des réponses immunitaires et métaboliques, laissant
considérer le microbiote comme un véritable organe à part entière qu’il est essentiel de préserver.
L’altération de cet écosystème bactérien est en effet associée à de nombreuses maladies chroniques dont
l’incidence ne cesse d’augmenter, telles que des pathologies inflammatoires intestinales, l’obésité, le diabète
et les allergies. Dans ce contexte, le ciblage du microbiote est devenu un axe de recherche important en
santé humaine. L’utilisation de bactéries bénéfiques pour la santé, appelées probiotiques connait de ce fait
un essor considérable, cependant les bactéries actuellement utilisées (essentiellement lactobacilles et
bifidobactéries) présentent certaines limites. Le projet vise à isoler de nouvelles souches commensales à
partir de microbiote humain, capables d’être cultivables dans des conditions satisfaisantes et de caractériser
à l’aide de différents modèles in vitro et in vivo leurs potentielles propriétés bénéfiques afin 1) de mieux
comprendre leur rôle dans l’homéostasie immunitaire et métabolique et 2) sélectionner de futurs candidats
probiotiques d’intérêt thérapeutique dans le contexte de l’obésité. Le projet visera également à étudier la
fonctionnalité de clones métagénomiques, obtenus par clonage de séquence de gènes issus du microbiote.
Ce projet collaboratif sera réalisé au sein de deux équipes apportant des compétences complémentaires
dans le domaine du microbiote, des probiotiques, des réponses immunes et métaboliques et devrait
déboucher à terme sur un partenariat avec un industriel.
Descriptif du projet de thèse
 Le sujet de recherche et son contexte scientifique
L’intestin héberge un écosystème complexe et dynamique composé d’environ 100 000 milliards de bactéries
commensales, représentant un millier d’espèces différentes, appartenant à trois phyla majeurs, Firmicutes,
Bacteroidetes et Actinobacteria 1. Le génome de ce microbiote code 150 fois plus de gènes que notre propre
génome humain et participe ainsi à de nombreuses fonctions de notre organisme. Bien que la nature et
l’abondance des espèces bactériennes puissent être très différentes d’un individu à l’autre, la composition du
microbiote reste relativement stable chez l’adulte sain. Cependant, des déséquilibres entre les différentes
populations bactériennes composant le microbiote intestinal (dysbioses) et une réduction de la diversité
bactérienne ont été mis en cause dans le développement de nombreuses pathologies telles que les
maladies inflammatoires chroniques (MICI), l’obésité, le diabète et les allergies. Dans ce contexte, le ciblage
du microbiote est devenu un axe de recherche important en santé humaine. Des études menées chez des
animaux ont confirmé que l’obésité est associée à des modifications de la composition du microbiote
intestinal; avec une augmentation relative des Firmicutes au détriment des Bacteroidetes et une diminution
de la diversité bactérienne 2. Le lien causal a été confirmé par transfert de microbiote entrainant l’acquisition

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du phénotype obèse. Ces observations ont été également démontrées chez l’homme 3, confirmant le rôle du
microbiote intestinal dans la régulation du métabolisme énergétique et le développement de l’obésité.
Plusieurs études ont observé que certaines populations bactériennes, tel que Akkermansia muciniphila,
Methanobrevibacter smithii et Christensenellaceae sont moins abondantes chez les sujets obèses 4,
néanmoins il reste difficile de relier certaines bactéries à des effets bénéfiques ou néfastes. Les recherches
portent désormais sur les mécanismes moléculaires d'interaction entre ces bactéries commensales et l'hôte
et sur le ciblage du microbiote comme nouvelle alternative thérapeutique. Le microbiote semble affecter le
métabolisme énergétique en agissante par différents mécanismes, tel que la libération de métabolites
pouvant initier l’inflammation (tel que le LPS), ou la production d’acides gras chaines courtes (AGCC) jouant
un rôle crucial dans l’extraction de l’énergie, mais également dans le contrôle de la satiété. Le microbiote
joue aussi un rôle primordial dans le métabolisme du cholestérol et des acides biliaires.
Les probiotiques sont, selon l’OMS, des « micro-organismes vivants qui, ingérés en quantité suffisante,
confèrent des effets bénéfiques pour la santé de l’hôte ». Leur utilisation connait depuis quelques années un
essor important en santé humaine et animale. Les bactéries lactiques, microaérophiles, notamment des
lactobacilles et bifidobactéries sont les plus utilisées comme probiotiques depuis déjà quelques années,
cependant elles présentent certaines limites. L'intérêt pour les bactéries commensales et leurs propriétés a
conduit au concept de probiotiques de nouvelle génération, a priori plus adaptés au tractus digestif et
capables de mieux exprimer les fonctions d'intérêt dans cet environnement. A. muciniphila, a été
utilisée avec succès chez la souris dans différents modèles d’obésité. Faecalibacterium prausnitzii, bactéries
commensales déficientes chez les patients souffrant de maladie de Crohn, possède d’excellentes capacités
anti-inflammtoires. Cependant l’utilisation de telles bactéries du fait de leur extrême sensibilité à l'oxygène,
reste difficile pour une production à l’échelle industrielle.
Nous proposons dans ce projet d’isoler et caractériser des bactéries commensales microaérophiles à
partir de microbiote humain (fécès), de tester leur robustesse en procédés et leurs fonctionnalités pour
développer des probiotiques de nouvelle génération plus proches des contraintes industrielles actuelles. Ce
travail permettra non seulement de développer de nouvelles approches thérapeutiques mais également
mieux comprendre le rôle fonctionnel de ces microorganismes chez l’hôte et en particulier l’impact sur les
fonctions métaboliques et immunitaires. Ceci sera complété par une approche métagénomique qui
permettra d’identifier les fonctions de gènes appartenant à des groupes orthologues conservés pour la
majorité des individus et les plus représentés au niveau du tube digestif, avec un ciblage pour les gènes
codant des protéines de surface et/ou excrétées. Les souches et clones sélectionnés seront caractérisés à
l’aide de modèles in vitro pour identifier leurs propriétés bénéfiques potentiels, notamment dans le contexte
de l’obésité et du syndrome métabolique. Nous évaluerons notamment leurs propriétés immuno-
modulatrices, leurs capacités à restaurer (ou perturber) la barrière intestinale, à induire des peptides anti-
microbiens (PAM) importants pour le façonnage du microbiote et les conséquences sur le développement
d’une inflammation de bas grade associée au syndrome métabolique 5. Nous nous attacherons également à
évaluer la capacité des souches/clones à activer les voies impliquées dans le contrôle de la prise alimentaire
(satiété) 6 et de la différenciation adipocytaire. Ceci sera complété par une approche in vivo chez la souris
soumise à régime hypercalorique. Nous évaluerons l’impact de l’administration des souches et/ou clones les
plus intéressants (Top 7 suite à l’étude in vitro) sur les perturbations immunitaires et métaboliques et la
modification de la composition du microbiote.
 Etat du sujet au sein des équipes d’accueil
Le projet proposé est un projet collaboratif qui sera réalisé en étroite collaboration entre notre équipe (Equipe
bactéries Lactiques et Immunité des Muqueuse BLIM, CIIL, Institut pasteur de Lille, CNRS UMR8204) et
l’équipe « Interaction des Firmicutes avec l’Environnement (IFE, UMR1319 MICALIS, INRA-AgroParisTech,
Jouy-en-Josas). L’étudiant(e) en thèse sera en co-tutelle entre les deux équipes.
L’équipe BLIM a une longue expertise dans les applications santé des bactéries lactiques avec un intérêt
particulier pour l’étude de leurs propriétés anti-inflammatoires, conduisant à la sélection de souches très
prometteuses dans le contexte des maladies inflammatoires chroniques intestinales. Plus récemment, le
groupe de Corinne Grangette s’est intéressé à sélectionner des souches capables de protéger des souris de
l’obésité induite par un régime hyperlipidique, mettant en évidence leurs capacités à réduire la prise de
poids, l’insulino-résistance, la stéatose hépatique et les perturbations métaboliques associées, notamment
en bloquant le recrutement de macrophages et l’inflammation au niveau du tissu adipeux, en restaurant la
dysbiose du microbiote et en activant des récepteurs aux AGCC 7. Dans ce contexte, le groupe a développé

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divers modèles in vitro permettant un pré-criblage des souches pour mettre notamment en évidence leurs
propriétés immuno-modulatrices, leurs capacités à restaurer la barrière intestinale et à activer l’induction de
peptides entéro-endocrines impliqués dans la satiété. Ces modèles pourront donc être utilisés pour tester et
sélectionner des souches commensales d’intérêt avant de les évaluer in vivo et identifier les mécanismes
d’action.
L’équipe IFE (MICALIS, INRA) considère les écosystèmes microbiens complexes de l’Aliment et de l’Intestin
Humain en tant qu’éléments déterminants du maintien de la qualité des aliments et de la santé. Ces travaux
visent à la compréhension du rôle du microbiote commensal dans des pathologies chroniques, graves,
fréquentes et/ou incurables, d’étiologie le plus souvent indéterminée. Afin d'avancer vers une prise en
compte holistique incluant sa composante non cultivable encore majoritaire à ce jour, l’Unité MICALIS a
contribué à l'élaboration d’une approche nouvelle et puissante, la métagénomique qui a permis des progrès
rapides dans la caractérisation de la diversité génomique et génétique du microbiote intestinal. En utilisant
des approches de métagénomique et génomique fonctionnelles, l’équipe IFE a pour but d’identifier des
gènes et molécules/métabolites bactériens et déterminer leurs rôles notamment sur l’homéostasie
intestinale, immunitaire et métabolique 8. L’équipe s’intéresse également à isoler des bactéries commensales
du microbiote appartenant à différents phyla et genres et caractériser leurs propriétés immuno-modulatrices
à l’aide de différents systèmes de criblage haut débit disponible à MICALIS.
Les deux équipes apportent ainsi des compétences complémentaires dans le domaine du microbiote, des
probiotiques, des réponses immunes et métaboliques, permettant ainsi à l’étudiant d’acquérir des
compétences diverses et réaliser un projet trans-disciplinaire.
 Programme et l’échéancier de travail
Etape 1 : Isolement et caractérisation de la robustesse de souches isolées du microbiote humain et
sélection de clones métagénomiques (IFE)
Cette étape a été initiée dans le cadre du stage de Master 2 de Mlle Bogdana MICHAJLOVOVA au cours
duquel elle a participé à la sélection de souches d’intérêt du microbiote capables d’être suffisamment aéro-
tolérantes pour pouvoir être sélectionnées comme candidats probiotiques de seconde génération. De plus,
une première analyse de clones métagénomiques modulant la réponse immune de l’hôte réalisée au sein de
l’équipe IFE, nous a permis de sélectionner une centaine de clones ayant potentiellement des effets
immuno-modulateurs. Ces clones feront l’objet d’une étude approfondie dans le cadre du Master 2 de Mlle
Bogdana MICHAJLOVOVA afin de confirmer leurs effets.
Etape 2 : Evaluation des propriétés fonctionnelles des souches et caractérisation de clones
métagénomiques à l’aide de différents modèles in vitro (BLIM, IFE)
1) Propriétés immuno-modulatrices
Cette étape est actuellement initiée dans le cadre du stage M2 de Bogdana MICHAJLOVOVA. Les
propriétés immuno-modulatrices des souches et clones sélectionnés seront tout d’abord évaluées par
stimulation in vitro de cellules mononuclées de sang humain (PBMC) et dosage des cytokines induites (pro-
inflammatoires/proTh1 versus anti-inflammatoires/régulatrices). Elle sera poursuivie par l’étude de leur
impact sur des cellules dendritiques différentiées à partir de cellules de moelle osseuse de souris (BMDC) et
la polarisation de lymphocytes T (CD4+) après co-culture (BLIM). La capacité des souches/ clones à moduler
l’activation de NFB sera également évaluée à l’aide de modèles rapporteur (MICALIS). Les souches/clones
présentant les meilleurs profils anti-inflammatoires seront sélectionnés.
2) Restauration de la fonction barrière intestinale et activation de peptides anti-microbiens (PAM)
La modification de la barrière intestinale s’observe dans un grand nombre de pathologies, dont les MICI, les
infections gastro-intestinales et également au cours de l’obésité, favorisant la translocation de bactéries
potentiellement pathogènes et ainsi exacerbant le statut inflammatoire de l’hôte. Certains probiotiques sont
connus pour prévenir et/ou restaurer l’intégrité de cette barrière Un modèle in vitro de barrière intestinale a
été mis au point au sein de l’équipe BLIM à l’aide de cellules épithéliale CaCo2, sensibilisée avec différents
agents (tel que H2O2). Les capacités des souches à restaurer la barrière seront suivies par mesure de la
résistance trans-épithéliale et le passage de petites molécules fluorescentes (inuline FITC), ainsi que par la
mesure de l’expression de gènes codant des protéines de jonctions serrées (BLIM). Le façonnage du
microbiote pouvant être contrôlé par l’activation de réponses anti-microbiennes telle que la production de
défensines, nous évaluerons également la capacité des souches/clones à induire des PAM après
stimulation in vitro d’une lignée de cellules épithéliales murines de crypte (m-ICcl2) et suivi de l’expression de

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divers PAM (-défensine2, cryptidine 4, Reg3 Reg3 mais également de l'IL-22 impliquée dans
l’homéostasie intestinale (BLIM).
3) Induction de peptides entéro-endocrines et métabolisme lipidique
Le microbiote peut influencer le métabolisme lipidique et le contrôle de la prise alimentaire en produisant
divers métabolites et en métabolisant le cholestérol et les acides biliaires. Par la dégradation de fibres
alimentaires, les bactéries commensales peuvent générer des AGCC, tel que l’acétate, le propionate et le
butyrate. L’acétate est absorbé et métabolisé dans les tissus périphériques où il sert de précurseur à la
synthèse de cholestérol et d’acides gras. Le propionate est absorbé et métabolisé dans le foie et est un
précurseur de la gluconéogénèse. Il inhibe également la liponéogénèse et la synthèse de cholestérol. De ce
fait, le propionate est proposé comme un métabolite potentiellement intéressant pour prévenir l’obésité et le
diabète 9. Le butyrate est proposé comme un métabolite qui participe au maintien de l’intégrité de la barrière
intestinale et exerce des propriétés anti-inflammatoires. Globalement les AGCC stimulent la motricité
intestinale et donc le transit et activent la production d’hormones de satiété 9. Nous évaluerons donc les
capacités des souches/clones à produire des AGCC in vitro, à métaboliser le cholestérol et les acides
biliaires (activité hydrolase BSH) (IFE). Par l’utilisation d’une lignée de cellules entéro-endocrines murines
(STC1), nous suivrons la capacité des souches à induire la sécrétion de peptides entéroendocrines
impliqués dans la satiété (PYY, CCK, GIP) par suivi de l’expression génique (RT-qPCR) et dosage Multiplex.
Ceci pourra être confirmé ex vivo (sur segments intestinaux de souris) pour certaines souches (BLIM).
Etape 3 : Evaluation des propriétés fonctionnelles des souches et/ou clones métagénomiques in vivo
et études mécanistiques (BLIM, IFE)
Les souches et/ou clones présentant les meilleures capacités (Top 7) anti-inflammatoires, à maintenir la
barrière intestinale et à favoriser la sécrétion de peptides endocriniens impliqués dans le contrôle de la prise
alimentaire, et à métaboliser les acides biliaires et le cholestérol, seront évaluées in vivo, dans un modèle
murin de régime hypercalorique (HFD à 60% de gras) comparativement à un régime à basse calorie (LFD à
10% de gras) chez des souris C57BL/6J mâles âgés de 5 semaines (N° accréditation 00033.02). Nous
suivrons l’impact de l’administration des souches sur la prise de poids corporel, le développement de
l’insulino-résistance, de la stéatose hépatique, de l’inflammation associée et les modifications métaboliques
(dosage cholestérol, acides gras, expression des gènes impliqués dans le métabolisme lipidique…). Les
mécanismes impliqués seront appréhendés en suivant 1) la modification du microbiote intestinal, 2) la
modulation du profil des AGCC (contenus caecaux), 3) la modulation des acides biliaires plasmatiques et
fécaux, 4) l’induction de peptides entéro-endocrines (dosage plasmatique à la veine porte). Nous
analyserons au sein des cellules de la fraction stromale les modifications de réponses immunes, notamment
le pourcentage de macrophages (CD11b/ F4/80), de cellules T régulatrices (CD4+/ FoxP3+) et l’induction de
populations de type ILCs (Innate lyphoid cells), dont le rôle semble intéressant dans le contexte du syndrome
métabolique, en s’attachant également à la régulation de la voie IL-23/IL-22, potentiellement capables de
réguler les désordres métaboliques 10.
Cette étude pourra être complété par l’utilisation de modèles de souris gnotobiotiques. Nous coloniserons
des souris axéniques par la(les) souches et/ou clones les plus intéressants pour suivre dans ce modèle
l’impact sur le développement de réponses immunes et métaboliques….
 Les retombées scientifiques et économiques attendues
L’évolution de l’espérance de vie et de notre mode de vie et d’alimentation actuels s’accompagne d’un
changement progressif de la prévalence des principales causes de morbidité et de mortalité, 70 % des décès
étant imputables à des maladies chroniques. Le surpoids et l’obésité sont le 5eme facteur de risque de décès
au niveau mondial et représentent un problème majeur de santé publique, touchant plus de 300 millions de
personnes dans le monde. Le Nord-Pas-de Calais est l’une des régions de France où la prévalence de
l'obésité est la plus forte. Dans ce contexte, la communauté scientifique s’intéresse de plus en plus au rôle
du microbiote et à la façon de restaurer les déséquilibres observés. Ces études soulignent la nécessité de
cultiver de nouveaux microbes pour mieux comprendre le rôle spécifique des communautés bactériennes sur
le maintien de l’homéostasie immunitaire et métabolique de l’hôte et donc sur notre santé.
L'alternative thérapeutique par les probiotiques connaît un engouement cette dernière décennie, étant donné
le caractère « naturel » et l'innocuité d’un tel traitement. Le marché mondial des probiotiques a été estimé à
presque 25 milliards de dollars en 2012 avec plus de 500 produits commercialisés cette dernière décennie et
une croissance annuelle de 7% pouvant atteindre 48 milliards de dollars en 2020. En 2015, l'Europe devrait

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représenter le plus grand marché des probiotiques, le marché français représentant 21 % du marché
européen. Il est évident que le développement de compléments alimentaires ou de préparations
pharmaceutiques capables d’avoir un impact sur la prise de poids ou d’améliorer les troubles
métaboliques associés, constituerait une stratégie sans risque et peu couteuse.
En dépit de certaines évidences, tous les résultats concernant les probiotiques ne sont pas probants; cet
insuccès pouvant être attribué à un manque d’attention dans la sélection de des souches utilisées et dans la
pertinence des paramètres évalués. Les défis actuels dans le domaine des probiotiques exigent donc
l'amélioration des connaissances sur leurs modes d’action afin de bénéficier de critères de sélection adaptés
aux contextes pathophysiologiques. L’utilisation de bactéries commensales a priori plus adaptés au
tractus digestif et capables de mieux exprimer les fonctions d'intérêt dans cet environnement,
peuvent être une alternative entre l’utilisation de probiotiques « classiques » et le transfert de flore fécale.
Les recherches sur le microbiote auront un impact majeur sur la nutrition, la médecine et la pharmacie de
demain. Ce projet pourra déboucher sur des applications santé. Bruno Pot qui dirige l’équipe BLIM est
président du PRI (Phamabiotic Research Institute) qui a pour but de faciliter le développement de
probiotiques médicaments (pharmabiotiques) en améliorant la visibilité l'industrie du microbiote et de la santé
humaine, et l’interface avec les agences de réglementation (www.pharmabiotic.org). L’équipe BLIM est de
plus en forte interaction avec de nombreux partenaires industriels intéressés par ce type de développement.
Les objectifs de la recherche en métagénomique fonctionnelle sont d’identifier les signaux, les
molécules par lesquelles les bactéries intestinales ou alimentaires établissent un dialogue avec les cellules
humaines. Ces molécules, qui régulent les défenses naturelles, le renouvellement des cellules de la paroi
intestinale ou encore la fixation des graisses sont autant de sources pour de nouveaux médicaments. Nous
espérons également par l’étude de clones métagénomiques apporter de nouvelles connaissances sur la
relation génome/ fonction des bactéries du microbiote.
 Les collaborations prévues (préciser le cadre, la nature des collaborations
L’étudiant(e) sera directement encadrée par le Dr Corinne Grangette (Directeur de Recherche IPL, PhD,
HDR) et en co-tutelle avec le Dr Emmanuelle Maguin (Responsable de l’équipe IFE, Chef du département
MICA de l’INRA) et l’encadrement de Moez Rhimi (CR INRA).
Au sein de l’INRA, le projet bénéficiera de collaboration pour le criblage haut débit des souches et clones
(plateforme Métagenopolys) et l’accès aux souris axéniques (plateforme Anaxem, Sylbie Rabot).
Il sera également effectué en collaboration avec Philippe Gérard (Equipe Alimentation, Microbiote Intestinal,
Pathologies Encéphaliques et Métaboliques, MICALIS) pour l’évaluation des activités anti-
cholestérolémiantes et d’hydrolyse des acides biliaires.
L’étude de l’induction de peptides entéro-endocrines (modèle lignée STC1) se fera en collaboration avec
l’équipe de Rozenn Ravallec et Benoit Cudennec (Institut Charles Violette, Université de Lille 1)
Le dosage des acides biliaires in vivo (fécès) sera effectué en collaboration avec l’équipe d’Anne Tailleux
(Unité Inserm 1011, Lille).
 Ancrage national, international et transdisciplinarité éventuellement
Le microbiote intestinal, impliqué dans le développement de nombreuses pathologies chroniques, est
devenu en quelques années un domaine de recherche majeur au niveau national et international comme en
témoigne l’explosion du nombre de publications et de congrès traitant du sujet, particulièrement riche en
résultats scientifiques prometteurs, ouvrant de formidables perspectives pour la communauté scientifique
mais également pour des débouchés thérapeutiques. Etudier l'impact du microbiote intestinal humain sur la
santé et mieux comprendre le rôle qu’il joue dans le développement des maladies chroniques tel que
l’obésité sont devenus des axes de recherche prioritaires. Ce thème de recherche fait également l’objet de
débat parlementaire à l’assemblée nationale, dans le contexte de la construction d’une société nouvelle
visant à améliorer notre compétitivité grâce à la recherche environnementale, le bien-être, la santé et la
sécurité alimentaire. Renforcer les interfaces en recherche biomédicale entre les champs de recherche
fondamentale, translationnelle, technologique et clinique et consolider le continuum vers la valorisation
économique et sociétale représente le défi des organismes de recherche pour 2020. En particulier tout ce
qui concerne le bien-être et le vieillissement est devenu un champ d’application très important pour la
société. Les traitements antidiabétiques/anti-obésité ont montré un effet faible voir nul chez certains patients
et pose un défi majeur en santé publique. Dans ce contexte, le microbiote peut représenter la pièce