transformation de cellules souches

EVELYNE LAPOINTE
TRANSFORMATION DE CELLULES SOUCHES
EMBRYONNAIRES EN MYOBLASTES:
PREMIÈRE ÉTAPE
DU DÉVELOPPEMENT D'UN TRAITEMENT DE LA
DYSTROPHIE MUSCULAIRE DE DUCHENNE
Mémoire présenté
à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval
dans le cadre du programme de maîtrise en Microbiologie-Immunologie
pour l'obtention du grade de maître es sciences (M.Se.)
FACULTE DE MEDECINE
UNIVERSITÉ LAVAL
QUÉBEC
2006
Evelyne Lapointe © 2006

Résumé
La dystrophie musculaire de Duchenne est une maladie génétique caractérisée par l'absence
de dystrophine dans les muscles des patients. Un des traitements envisageables est la greffe
de myoblastes dans les muscles dystrophiques afin de permettre l'expression de
dystrophine. Les cellules souches embryonnaires, qui ont la capacité de se différencier en
tous les types de cellules, pourraient servir de source illimitée de cellules pour traiter les
patients. Les résultats présentés dans ce mémoire démontrent premièrement qu'il est
possible d'obtenir une population de myoblastes dérivées de cellules souches
embryonnaires murines. Il est aussi démontré qu'un traitement à l'azacytidine augmente le
pourcentage de cellules souches embryonnaires différenciées en cellules myogéniques. De
plus, ces cellules différenciées permettent de régénérer la dystrophine lorsque greffées à des
souris dystrophiques. Des essais de purification de ces cellules myogéniques ont été tentés
et sont toujours en cours d'étude. Une bonne purification des cellules différenciées
permettrait en effet d'éviter les risques de formation de tumeurs lors de la greffe des
cellules. Les expériences de différenciation, lorsque mises au point, pourraient être
appliquées à des cellules souches embryonnaires humaines afin de traiter des patients
atteints de dystrophie musculaire de Duchenne.

Avant-Propos
Je désire tout d'abord remercier le Dr Jacques P. Tremblay de m'avoir accueillie dans son
laboratoire. Sa persévérance, son enthousiasme et son professionnalisme m'ont servi
d'exemple tout au long de ma maîtrise. Je tiens aussi à remercier tous les étudiants,
assistants de recherche, techniciens et stagiaires post-doctoraux faisant partie de l'équipe de
recherche. En plus de répondre toujours patiemment à mes questions, ils ont contribué à
rendre l'atmosphère de travail plus qu'agréable.
Je remercie aussi ma famille pour tout le support et l'amour que j'ai reçus. Leur présence
ainsi que leurs encouragements m'ont toujours été très utiles tout au long de ma vie. Je
tiens finalement à remercier Joël pour sa patience et sa grande compréhension.

Je dédie ce mémoire à ma famille,
à mes proches et à mon copain
m

Table des matières
Abréviations 1
1. Introduction 2
1.1 Embryogenèse 2
1.1.1 Formation du disque embryonnaire didermique 2
1.1.2 Gastrulation 5
1.1.3 Somitogenèse 7
1.2 Myogenèse 10
1.3 Le muscle squelettique 16
1.4 La régénération musculaire 18
1.5 La dystrophie musculaire de Duchenne 19
1.5.1 Description et évolution de la maladie 19
1.5.2 Cause de la maladie 21
1.5.3 La dystrophine 21
1.5.4 Les traitements de laDMD 23
1.5.4.1 La thérapie génique 23
1.5.4.2 Le traitement pharmacologique 23
1.5.4.3 La thérapie cellulaire 24
1.6 Les cellules souches embryonnaires 28
1.6.1 Historique des cellules souches embryonnaires de souris 28
1.6.2 Génération d'une lignée de cellules souches embryonnaires murines 29
1.6.3 Cellules ES murines non-différenciées 30
1.6.3.1 Voies de signalisation impliquées 30
1.6.3.2 Expression génique chez les cellules ES pluripotentes murines 32
1.6.4 Différenciation des cellules ES murines.... 34
1.6.5 Les cellules souches embryonnaires humaines 38
1.6.6 Les cellules souches provenant de l'adulte 41
1.6.7 Clonage thérapeutique 43
1.6.8 Tolérance immunologique 45
1.7 Législation concernant les cellules souches embryonnaires humaines au Canada 48
1.8 Législations concernant les cellules souches embryonnaires humaines au niveau
international 49
1.9 Objectifs du projet de recherche .51
2. Matériels et Méthodes 52
2.1 Culture cellulaire 52
2.1.1 Cultures primaires de myoblastes 52
2.1.2 Cellules souches embryonnaires de souris 53
2.1.3 Lignées cellulaires NIH 3T3 et C2C12 53
2.1.4 État des cellules ES non-différenciées 53
2.2 Différenciation des cellules ES 56
2.2.1 Formation de EBs 56
2.3 Animaux 61
2.4 Isolation de l'ARN et «Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction» (RT-PCR)
61
2.5 Analyses cytologiques en immunofluorescence 64