transformation de cellules souches

EVELYNE LAPOINTE
TRANSFORMATION DE CELLULES SOUCHES
EMBRYONNAIRES EN MYOBLASTES:
PREMIÈRE ÉTAPE
DU DÉVELOPPEMENT D'UN TRAITEMENT DE LA
DYSTROPHIE MUSCULAIRE DE DUCHENNE
Mémoire présenté
à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval
dans le cadre du programme de maîtrise en Microbiologie-Immunologie
pour l'obtention du grade de maître es sciences (M.Se.)
FACULTE DE MEDECINE
UNIVERSITÉ LAVAL
QUÉBEC
2006
Evelyne Lapointe © 2006
Résumé
La dystrophie musculaire de Duchenne est une maladie génétique caractérisée par l'absence
de dystrophine dans les muscles des patients. Un des traitements envisageables est la greffe
de myoblastes dans les muscles dystrophiques afin de permettre l'expression de
dystrophine. Les cellules souches embryonnaires, qui ont la capacité de se différencier en
tous les types de cellules, pourraient servir de source illimitée de cellules pour traiter les
patients. Les résultats présentés dans ce mémoire démontrent premièrement qu'il est
possible d'obtenir
une population de myoblastes dérivées de cellules souches
embryonnaires murines. Il est aussi démontré qu'un traitement à l'azacytidine augmente le
pourcentage de cellules souches embryonnaires différenciées en cellules myogéniques. De
plus, ces cellules différenciées permettent de régénérer la dystrophine lorsque greffées à des
souris dystrophiques. Des essais de purification de ces cellules myogéniques ont été tentés
et sont toujours en cours d'étude. Une bonne purification des cellules différenciées
permettrait en effet d'éviter les risques de formation de tumeurs lors de la greffe des
cellules. Les expériences de différenciation, lorsque mises au point, pourraient être
appliquées à des cellules souches embryonnaires humaines afin de traiter des patients
atteints de dystrophie musculaire de Duchenne.
Avant-Propos
Je désire tout d'abord remercier le Dr Jacques P. Tremblay de m'avoir accueillie dans son
laboratoire. Sa persévérance, son enthousiasme et son professionnalisme m'ont servi
d'exemple tout au long de ma maîtrise. Je tiens aussi à remercier tous les étudiants,
assistants de recherche, techniciens et stagiaires post-doctoraux faisant partie de l'équipe de
recherche. En plus de répondre toujours patiemment à mes questions, ils ont contribué à
rendre l'atmosphère de travail plus qu'agréable.
Je remercie aussi ma famille pour tout le support et l'amour que j'ai reçus. Leur présence
ainsi que leurs encouragements m'ont toujours été très utiles tout au long de ma vie. Je
tiens finalement à remercier Joël pour sa patience et sa grande compréhension.
Je dédie ce mémoire à ma famille,
à mes proches et à mon copain
m
Table des matières
Abréviations
1
1. Introduction
2
1.1 Embryogenèse
2
1.1.1 Formation du disque embryonnaire didermique
2
1.1.2 Gastrulation
5
1.1.3 Somitogenèse
7
1.2 Myogenèse
10
1.3 Le muscle squelettique
16
1.4 La régénération musculaire
18
1.5 La dystrophie musculaire de Duchenne
19
1.5.1 Description et évolution de la maladie
19
1.5.2 Cause de la maladie
21
1.5.3 La dystrophine
21
1.5.4 Les traitements de laDMD
23
1.5.4.1 La thérapie génique
23
1.5.4.2 Le traitement pharmacologique
23
1.5.4.3 La thérapie cellulaire
24
1.6 Les cellules souches embryonnaires
28
1.6.1 Historique des cellules souches embryonnaires de souris
28
1.6.2 Génération d'une lignée de cellules souches embryonnaires murines
29
1.6.3 Cellules ES murines non-différenciées
30
1.6.3.1 Voies de signalisation impliquées
30
1.6.3.2 Expression génique chez les cellules ES pluripotentes murines
32
1.6.4 Différenciation des cellules ES murines....
34
1.6.5 Les cellules souches embryonnaires humaines
38
1.6.6 Les cellules souches provenant de l'adulte
41
1.6.7 Clonage thérapeutique
43
1.6.8 Tolérance immunologique
45
1.7 Législation concernant les cellules souches embryonnaires humaines au Canada
48
1.8 Législations concernant les cellules souches embryonnaires humaines au niveau
international
49
1.9 Objectifs du projet de recherche
.51
2. Matériels et Méthodes
52
2.1 Culture cellulaire
52
2.1.1 Cultures primaires de myoblastes
52
2.1.2 Cellules souches embryonnaires de souris
53
2.1.3 Lignées cellulaires NIH 3T3 et C2C12
53
2.1.4 État des cellules ES non-différenciées
53
2.2 Différenciation des cellules ES
56
2.2.1 Formation de EBs
56
2.3 Animaux
61
2.4 Isolation de l'ARN et «Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction» (RT-PCR)
61
2.5 Analyses cytologiques en immunofluorescence
64
2.6 Purification magnétique des myoblastes
66
2.7 Analyses par FACS des cellules ES
69
2.8 Greffe de cellules souches différenciées
69
2.9 Analyses des muscles greffés
70
2.9.1 Coloration hématoxyline-éosine
70
2.9.2 Analyses histologiques en immunofluorescence
71
2.10 Construction d'un vecteur de résistance
71
2.11 Transfection des cellules ES
74
3. Résultats
75
3.1 Différenciation des cellules ES en myoblastes
75
3.1.1 Sans la formation de EB
75
3.1.2 Avec la formation de EB
75
3.1.3 Augmentation du pourcentage de cellules ES différenciées en cellules myogéniques
78
3.2 Purification des cellules ES différenciées en cellules myogéniques
84
3.3 Alternative à la purification par MACS des cellules différenciées
88
3.4 Greffe des cellules différenciées non purifiées chez la souris mdx
88
3.5 Transfection des cellules ES avec vecteurs de résistance
92
Discussion
96
Conclusion
100
Bibliographie
101
Liste des tableaux
Tableau 1 Marqueurs principaux chez les cellules ES murines et humaines
Tableau 2 Différenciations faites à partir de cellules ES humaines
Tableau 3 Séquences des amorces utilisées pour les PCR
33
40
63
Liste des figures
Fig. 1 Stades menant à la formation du disque embryonnaire didermique
4
Fig. 2 Transformation du disque embryonnaire didermique en un disque tridermique
6
Fig. 3 Différenciation du mésoblaste intra-embryonnaire en trois structures
8
Fig. 4 Augmentation du nombre de somites selon l'âge de l'embryon
9
Fig. 5 Position et description d'un somite
11
Fig. 6 Régulation positive et négative des MRFs primaires dans le somite
13
Fig. 7 Protéines impliquées dans la différenciation myogénique
15
Fig. 8 Anatomie du muscle squelettique.
17
Fig. 9 Signes de Gower typiques à la DMD
20
Fig. 10 Complexe protéique de la dystrophine
22
Fig. 11 Facteurs limitants de la thérapie cellulaire
25
Fig. 12 Effet moléculaire du LIF sur la différenciation cellulaire (54)
31
Fig. 13 Différenciation des cellules à l'intérieur d'un EB
36
Fig. 14 Clonage thérapeutique
44
Fig. 15 Traitement de la DMD avec des cellules ES
47
Fig. 16 Caractéristiques phénotypiques des cellules ES non-différenciées
55
Fig. 17 État du EB après deux jours de suspension
58
Fig. 18 Schéma montrant les étapes effectuées lors de la différenciation des cellules ES en
myoblastes
60
Fig. 19 Technique de purification des myoblastes par MACS
68
Fig. 20 Construction du plasmide permettant la sélection des cellules différenciées en
myoblastes
73
Fig. 21 Différenciation spontanée des ES en cellules myogéniques
77
Fig. 22 Effet de l'AzaC sur l'expression de desmine
79
Fig. 23 Effet de l'AzaC sur l'expression de MHC
81
Fig. 24 Effet de l'AzaC sur l'expression de différents gènes
83
Fig. 25 Purification des myoblastes provenant d'une culture mixte de souris
85
Fig. 26 Expression de I'a7-intégrine sur les cellules ES non-différenciées
87
Fig. 27 Tumeur observée dans un muscle greffé avec des cellules ES différenciées mais
non purifiées
89
Fig. 28 Immunofluorescence anti-dystrophine d'un muscle greffé
91
Fig. 29 Transfection contrôle avec plasmide GFP
93
Fig. 30 Expression du transgène ZéoRFP observée chez les cellules ES transfectées
95
Abréviations
ul : Microlitre
ARN : Acide ribonucléique
ARNm : Acide ribonucléique messager
bFGF : Basic fibroblast growth factor
BSA : Bovine sérum albumin
CRSH : Conseil de recherche en science humaine
CRSNG : Conseil de recherche en sciences naturelles et en génie
CSCS : Comité de surveillance des cellules souches
DMD : Dystrophie musculaire de Duchenne
DMEM : High glucose Dulbecco's modified Eagle médium
DMSO : Diméthyl sulfoxide
EB : Corps embryonnaire
EDTA : Acide éthylène diamine tétra acétique
ES (cellule): Cellule souche embryonnaire
FBS : Sérum de veau fœtal
HBSS : Hank's Balanced Sait Solution
HGF : Facteur de croissance des hépatocytes
HSC : Cellule souche hématopoïétique
ICM: Masse cellulaire interne
IGF-1: Facteur de croissance insulinomimétique de type 1
IRSC : Instituts de recherche en santé du Canada
JAK : Janus-associated tyrosine kinase
LFA-1 : Lymphocyte function-associated antigen 1
LIFR : Récepteur du LIF
MACS : Magnetic-activated cell sorting
MAPK : Ras/mitogen-activated protein kinase
MCK: Muscle creatin kinase
MHC : Myosin Heavy Chain
ml : Millilitre
MRF : Facteur de régulation myogénique
PFA : Paraformaldéhyde
RT-PCR : Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction
SH2 : SRC homology 2
Shh : Sonic hedgehog
TA : Tibialis antérieur
VEGF : Vascular endothelial growth factor
1. Introduction
Le présent mémoire porte sur le traitement de la dystrophie musculaire de Duchenne
(DMD) grâce à l'utilisation de cellules souches embryonnaires. En introduction, la
formation du tissu musculaire à partir du tout premier jour de l'embryon sera d'abord
décrite. Une description de la DMD sera ensuite présentée suivie d'un bref résumé des
thérapies à envisager dans le futur pour traiter les patients atteints. Une partie de
l'introduction portera aussi sur les cellules souches embryonnaires ainsi que de sur leur
potentiel pour traiter différentes maladies comme la DMD. Suivra finalement une
description des objectifs du projet de recherche sur lesquelles sont basées les expériences
de ce mémoire.
1.1 Embryogenèse
L'être humain adulte, qui est composé de plus de 200 types de cellules différentes, provient
à l'origine d'une seule cellule fécondée. Ce premier chapitre permettra de connaître les
premières étapes de la vie ainsi que de mieux comprendre d'où vient le tissu musculaire et
les cellules souches embryonnaires.
1.1.1 Formation du disque embryonnaire didermique
Tout commence d'abord par la fécondation d'un ovule par un spermatozoïde. Ceci mène à
la toute première cellule de l'embryon qui est appelée zygote. Près de 24 heures après sa
formation, le zygote commence ses divisions à environ toutes les 12 heures. Ces cellules en
division sont à l'intérieur de la zone pélucide, qui est une enveloppe inextensible. Puisque
l'espace de croissance est restreint, chaque nouvelle cellule est donc deux fois plus petite
que la cellule dont elle est issue. L'amas d'une trentaine de cellules ainsi générées se
nomme la morula et chaque cellule qui la compose se nomme blastomère.
2
Il est bien de noter que les divisions ne sont pas nécessairement synchrones et que le
matériel cellulaire (ARNm, protéines, ...) n'est pas distribué également à toutes les
cellules. Ces légères différences de composition cytoplasmique influeront ultérieurement
sur la différenciation des cellules [1].
Lorsque la morula se compose d'une centaine de cellules, c'est-à-dire vers le troisième jour
chez la souris et vers le cinquième jour chez l'humain, cette dernière subit plusieurs
changements qui la transforment en blastocyste. Les cellules externes à proximité de la
zone pélucide forment le trophoblaste tandis que les quelques cellules les plus internes de la
morula forme l'embryoblaste. Comme il sera expliqué plus loin dans l'introduction, ce sont
ces cellules qui sont prélevées pour faire les cellules souches embryonnaires.
L'embryoblaste est composé de deux parties : l'épiblaste (cellules externes) et l'hypoblaste
(cellules internes). L'hypoblaste servira à la fabrication du placenta tandis que l'épiblaste
deviendra l'embryon [2].
Ensuite, grâce à des contractions et à des enzymes, le blastocyste perce et se débarrasse de
la zone pélucide qui l'empêche de prendre de l'expansion. Le blastocyste prend par après la
forme d'une sphère ayant deux cavités hémisphériques. L'épiblaste et l'hypoblaste se
retrouvent donc accolés et prennent le nom de disque embryonnaire didermique à cause de
la présence de ces deux feuillets cellulaires. C'est aussi à ce stade que l'implantation de
l'embryon a lieu, c'est-à-dire que l'embryon se niche dans la paroi utérine de la mère [1].
La figure suivante récapitule les étapes de l'embryogenèse décrites précédemment et
illustre la formation du disque embryonnaire didermique à partir du stade de la morula.
Figure 1
Morula
Blastocyste
Éclosion
Implantation
Fig. 1 Stades menant à la formation du disque embryonnaire didermique
Les schémas du haut montrent l'embryon au stade de la morula et du blastocyste. Il est
possible d'apercevoir la zone pélucide (1) ainsi que les blastomères (2) formant la morula.
L'embryoblaste (3) et le trophoblaste (4) commencent à apparaître à partir du stade de
blastocyste. La figure en bas à gauche illustre l'éclosion du blastocyste et la différenciation
de l'embryoblaste en épiblaste (5) et en hypoblaste (6). La figure en bas à droite montre
l'embryon qui possède alors le disque embryonnaire didermique (7). À ce stade, l'embryon
est déjà implanté dans l'utérus de la mère. Figure adaptée du site Internet
www.embryology.ch, Université de Lausanne.
1.1.2 Gastrulation
La gastrulation, qui est la transformation du disque didermique en un disque tridermique,
est illustrée par la figure 2. Ceci se fait tout d'abord par la formation d'une crête dans le
disque didermique qui se nomme ligne primitive. Les cellules de l'épiblaste prolifèrent et
s'invaginent dans ce sillon. Dépendant de la position des cellules avant l'invagination, elles
migrent dans différentes directions qui détermineront leur différenciation future. Par
exemple, des cellules migrent jusqu'à l'hypoblaste et remplacent les cellules de
l'hypoblaste déjà en place. Cette nouvelle couche de cellules épiblastiques naissante se
nomme entoblaste définitif et formera plus tard l'endoderme. Les cellules qui ne migrent
pas à travers la crête formeront quant à elles la lignée ectodermale. La catégorie de cellules
dont il sera question dans ce mémoire est celle qui formera le mésoderme. Ces cellules de
l'épiblaste migrent dans la ligne primitive et s'installent entre l'épiblaste et l'entoblaste
définitif. Ces cellules forment le troisième feuillet qui s'appelle mésoblaste intraembryonnaire. C'est donc par la migration des cellules épiblastiques à travers la ligne
primitive que le disque tridermique est créé [1].
Figure 2
Vue globale
Vue transversale
Fig. 2 Transformation du disque embryonnaire didermique en un disque tridermique
Les schémas représentent la vue globale et transversale d'un embryon au moment de la
gastrulation. Sur le schéma de la vue transversale, il est possible d'apercevoir la migration
des cellules de l'épiblaste (2) à travers la ligne primitive (1). Les cellules ayant migré
jusqu'à l'hypoblaste (5) forment les cellules de l'entoblaste définitif (3) tandis que les
cellules qui s'installent entre l'entoblaste définitif et l'épiblaste forment le mésoblaste intraembryonnaire (4). Figure adaptée du site www.Internet embryology.ch, Université de
Lausanne.
1.1.3 Somitogenèse
Chez l'humain, environ 19 jours après la fécondation, commence à apparaître la notocorde
qui sera plus tard remplacée par la colonne vertébrale. Quelques jours plus tard le
mésoblaste intra-embryonnaire se différencie en trois structures : le mésoblaste para-axial,
le mésoblaste intermédiaire et le mésoblaste latéral (Fig. 3). Le mésoblaste para-axial, qui
se situe de part et d'autre de la notocorde, est celui qui est à l'origine de la formation du
muscle squelettique. Il se segmente d'abord en plusieurs somitomères qui à leur tour
donneront 42 à 44 paires de somites [1]. Ce processus de formation des somites est
hautement régulé et permet d'ailleurs de déterminer l'âge d'un embryon selon le nombre de
somites visibles lors de l'échographie (Fig. 4).
Figure 3
Fig. 3 Différenciation du mésoblaste intra-embryonnaire en trois structures.
Le schéma permet d'observer les trois structures du mésoblaste intra-embryonnaire : le
mésoblaste para-axial (2), le mésoblaste intermédiaire (3) et le mésoblaste latéral (4). Il est
aussi possible d'apercevoir la notocorde en formation (1). Figure adaptée du site Internet
embryology.ch, Université de Lausanne.
Figure 4
23 Jours
tr
26 Jours
1
32 Jours
&*
\
Somites
Fig. 4 Augmentation du nombre de somites selon l'âge de l'embryon.
Les flèches blanches indiquent la location des somites dans des embryons d'âges différents.
La formation de somites est très régulée et le nombre de somites présents dans un embryon
peut permettre de savoir l'âge de celui-ci. Figure adaptée du site Internet
embryology.med.unsw.edu.au, University of South Wales, Australie.
9
Il a été décrit précédemment comment se déroulait le comportement des cellules à partir du
moment de la fécondation jusqu'à la formation des précurseurs myogéniques appelés
somites. Le chapitre suivant traitera maintenant des événements menant à la formation des
cellules musculaires.
1.2 Myogenèse
Les somites, dont le développement a été décrit plus haut, se divisent d'abord en deux
parties : le slérotome ventral et le dermomyotome dorsal. La figure suivante permet
d'ailleurs de situer les parties du somite qui se trouvent près de la notocorde, comme il a été
vu précédemment. Le slérotome sera à l'origine des vertèbres et des côtes tandis que le
dermomyotome donnera la peau dorsale et les muscles squelettiques [3].
10
Figure 5
Fig. 5 Position et description d'un somite.
Le somite, qui se situe près de la notocorde (5), est composé du dermoyotome (2), du
myotome (3) et du sclérotome (4). L'ectoderme (1) est encore présent à ce stade et il se
situe à l'extérieur des somites. Figure adaptée d'une revue faite par Chargé et Rudnicki
[41
11
Plusieurs signaux provenant des tissus environnants vont déterminer si les cellules situées
dans le dermomyotome vont ou non différencier vers la lignée myogénique. Comme le
montre la figure suivante, certains facteurs vont promouvoir la différenciation myogénique
en influençant l'expression des facteurs de régulation myogénique (MRF) primaires MyoD
et Myf5. Les facteurs influençant les MRFs primaires proviennent de la notocorde, du tube
neural, du dermomyotome et de l'ectoderme. Les protéines Wnts, Sonic hedgehog (Shh) et
Noggin régulent positivement les MRFs tandis que BMP4 empêche leur expression. Pax3
a, pour sa part, un rôle à jouer dans la prolifération des précurseurs myogéniques [4]. Les
cellules du dermomyotome qui ont été stimulées positivement et qui sont destinées à
devenir des cellules myogéniques migrent alors latéralement pour former le myotome. Ces
cellules qui ont migré et qui forment le myotome expriment myoD et myf5 et se nomment
myoblastes[3].
12
Figure 6
• Myo
Fig. 6 Régulation positive et négative des MRFs primaires dans le somitc.
L'expression des MRFs primaires MyoD et My/5 est régulée par plusieurs facteurs. Les
protéines Wnts, Shh et Noggin régulent positivement ces MRFs tandis que BMP4 empêche
leur expression. Pax3 est impliqué dans la prolifération cellulaire. Les cellules du
dermomyotome stimulées positivement migrent pour former le myotome. Ectoderme (1),
dermomyotome (2), myotome (3), slérotome (4), tube neural et notocorde (6). Figure
adaptée d'une revue faite par Chargé et Rudnicki [4].
13
Les myoblastes en prolifération finissent par se retirer du cycle cellulaire et expriment par
la suite les MRFs tardives myogénine et MRF4. Les cellules différenciées expriment aussi
graduellement des protéines spécifiques au muscle telles que « myosin heavy chain »
(MHC) et « muscle creatin kinase » (MCK). Ces myocytes mononuclés fusionnent
ensemble pour former un syncytium multinucléé qui deviendra mature et qui formera une
fibre musculaire contractile. Une population distincte de myoblastes n'emprunte cependant
pas le même chemin de différenciation : les cellules satellites. Ces cellules sont
caractérisées par leur expression de Pax-7. Elles resteront attachées à la fibre musculaire
naissante et auront un rôle majeur dans la régénération musculaire. Le schéma suivant
illustre le processus de différenciation myogénique ainsi que les principales protéines
exprimées [4].
14
Figure 7
Cellule du
dermomyotome
Myoblaste
Myocyte
MyoD / Myf5
Myogénine / MRF4
Pax3
Myofibres et
cellules satellites
(§>
Pax7
Pax7
Cellule satellite
Fig. 7 Protéines impliquées dans la différenciation myogénique.
Les MRFs primaires permettent la prolifération des myoblastes. L'expression des MRFs
tardives myogénine et MRF4 pousse alors les myoblastes à se différencier et à fusionner
ensemble pour former une fibre musculaire. Les cellules exprimant Pax7 forment la
population de cellules satellites et restent attachées aux fibres musculaires. Figure adaptée
d'une revue faite par Chargé et Rudnicki [4].
15
La partie suivante portera sur la morphologie du muscle squelettique. Il sera ainsi possible
de mieux comprendre la maladie de la dystrophie musculaire de Duchenne qui sera décrite
un peu plus loin.
1.3 Le muscle squelettique
Ce sont les fibres musculaires, dont la formation a été décrite plus haut, qui constituent le
muscle squelettique. Ces fibres sont alignées parallèlement et sont constituées de
myofibrilles. Celles-ci constituent environ 80 % du volume de la fibre musculaire et sont à
l'origine de la contractilité musculaire. La fibre musculaire a un diamètre qui varie de 10 à
100 \xM et peut atteindre 30 cm de longueur. Plusieurs couches de tissu conjonctif servent à
envelopper et maintenir ensemble les fibres musculaires. Tout d'abord, chaque fibre est
entourée par une fine gaine de tissu conjonctif appelée endomysium. Plusieurs fibres ainsi
enveloppées sont regroupées et entourées d'une gaine plus épaisse appelée périmysium.
Ces fibres regroupées portent le nom de faisceau. La totalité des faisceaux qui forment le
muscle sont ensuite entourés par l'épimysium. Cette gaine est attachée à l'os directement
ou par l'intermédiaire d'un tendon. Lorsque les fibres musculaires se contractent, la force
est transmise de gaine en gaine et se rend ainsi jusqu'à l'os. La figure suivante illustre
l'anatomie du muscle squelettique décrite précédemment [2].
16
Figure 8
Fibre (cellule) musculaire
Endomysium
(recouvre chaque fibre musculaire)
Périmysium (délimite le
faisceau des fibres musculaires)
Épimysium (recouvre
l'ensemble du muscle)
Vaisseau sanguin
Tendon
L
Fig. 8 Anatomie du muscle squelettique.
Chaque fibre est entourée par l'endomysium et plusieurs fibres ainsi enveloppées sont
entourées par le périmysium. Ces fibres regroupées portent le nom de faisceau. Les
faisceaux qui forment le muscle sont ensuite entourés par l'épimysium. Cette gaine est
attachée à l'os directement ou par l'intermédiaire d'un tendon. Figure adaptée du site
Internet www.sci.sdsu.edu, San Diego State University, Etats-Unis.
17
1.4 La régénération musculaire
Puisque le muscle est soumis régulièrement à toutes sortes de traumatismes, il doit être
capable de se réparer rapidement. Ce mécanisme de réparation se sépare en deux phases : la
phase dégénérative et la phase régénérative. La première étape survient après le bris
musculaire qui peut être lié à un effort physique trop intense ou à une maladie. Les fibres
endommagées nécrosent et il y a une réaction inflammatoire au site endommagé. Les
neutrophiles s'infiltrent d'abord puis les macrophages phagocytent les débris causés par la
nécrose des fibres. Par la suite, il y aura régénération du muscle. Cette régénération est
principalement attribuable à la présence de cellules satellites, qui ont été décrites
précédemment. Ces cellules, normalement quiescentes chez l'adulte, reçoivent des signaux
suite aux bris musculaires. Elles vont alors proliférer et migrer jusqu'aux fibres cellulaires
endommagées afin de fusionner avec elles pour réparer les dommages [4].
Tout au long d'une vie, chez la majorité des êtres humains, les muscles se dégénèrent et se
régénèrent constamment. Il peut cependant arriver qu'un défaut dans le génome d'une
personne vienne affecter la composition du muscle. C'est le cas de la dystrophie musculaire
de Duchenne qui sera décrite dans le chapitre suivant.
1.5 La dystrophie musculaire de Duchenne
1.5.1 Description et évolution de la maladie
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) se caractérise par une dégénérescence
progressive des muscles et environ un garçon sur 3500 est atteint. Elle touche les trois types
de muscles : squelettiques, cardiaques et lisses. À la naissance, l'enfant n'a pas de
symptômes et paraît normal. Avant l'âge de trois ans, il peut arriver que l'enfant marche
plus tard ou qu'il tombe fréquemment. La figure 9 montre l'apparition des signes de Gower
entre 3 et 6 ans qui démontrent les effets typiques de la dégénérescence musculaire. Vers
l'âge de douze ans, l'enfant ne peut plus marcher et est confiné au fauteuil roulant.
L'atteinte des muscles respiratoires rend l'enfant susceptible à développer des infections
broncho-pulmonaires. Les trois causes de décès reliées à la maladie sont la défaillance
cardiaque, l'insuffisance respiratoire ainsi que les infections pulmonaires. L'âge du décès
varie de 10 à 29 ans [5].
Figure 9
Fig. 9 Signes de Gower typiques à la DMD.
Ce dessin montre que l'enfant dystrophique a de la difficulté à se lever et doit se servir de
ses bras. Figure tirée du livre Myology écrit par Engel et Franzini-Armstrong.
20
1.5.2 Cause de la maladie
Cette maladie est causée par la mutation d'un gène situé sur le chromosome X. Le gène
atteint est celui qui code pour la dystrophine, une protéine très grosse de 427 kDa présente
dans tous les types de muscles. Les mutations causant la maladie peuvent être des grandes
délétions, des grandes insertions ou encore des mutations ponctuelles. Dans la majorité des
cas, ces mutations provoquent un changement de cadre de lecture et empêchent la synthèse
complète d'une protéine fonctionnelle [6].
1.5.3 La dystrophine
La membrane de la cellule musculaire, composée d'une bicouche lipidique, est protégée
extérieurement par la lamine basale et intérieurement par le réseau de cytosquelette
d'actine. La dystrophine joue un rôle majeur dans le muscle puisqu'elle relie le
cytosquelette d'actine à la matrice extracellulaire [7,8]. Comme le montre la figure 10,
l'extrémité aminé de la dystrophine se lie à la F-actine tandis que son extrémité
carboxylique se lie au complexe des protéines associées à la dystrophine. Ce complexe est
situé dans le sarcolemme, c'est-à-dire à la surface de la membrane plasmique de la fibre
musculaire. Il est en autre composé de dystroglycans et de sarcoglycans qui sont des
protéines jouant un rôle très important dans la structure cellulaire. Lorsque la dystrophine
est absente ou non fonctionnelle, ce complexe protéique est déstabilisé et la quantité de ces
protéines est diminuée. Ceci entraîne donc une fragilité des fibres musculaires qui
s'endommagent alors au moindre effort [9,10].
21
Figure 10
Fig. 10 Complexe protéique de la dystrophine.
La dystrophine (7) relie le cytosquelette d'actine (8) au complexe protéique de la
dystrophine qui est situé dans le sarcolemme (6). Ce complexe est composé d'adystroglycans (4) de (3-dystroglycans (5) et de sarcoglycans (1). Ce complexe est ensuite
relié à la matrice extracellulaire (3) par l'intermédiaire de la laminine-2 (2). Figure adaptée
de la revue Brain, volume 122, section 8.
22
1.5.4 Les traitements de la DMD
II n'existe malheureusement pas encore de traitement efficace pour guérir les patients
atteints de la dystrophie musculaire de Duchenne. Cependant, plusieurs approches sont
envisagées pour des traitements à long terme. Les stratégies thérapeutiques envisagées
peuvent être classées en trois groupes : la thérapie génique, pharmacologique et cellulaire
[6]. Les deux premiers types de thérapie seront brièvement résumés tandis que le troisième
type sera décrit un peu plus en détail.
1.5.4.1 La thérapie génique
La thérapie génique consiste à réintroduire le gène normal de la dystrophine dans les
cellules du patient atteint. Pour ce faire, des vecteurs viraux ou plasmidiques peuvent être
utilisés comme transporteurs du gène correcteur. Par exemple, le gène de la dystrophine
inséré dans un plasmide et injecté dans des souris dystrophiques a permis l'expression de
dystrophine pendant six mois [11,12]. Des adénovirus contenant un gène partiel de la
dystrophine réussissent aussi à régénérer l'expression de la dystrophine dans les muscles
cardiaques et squelettiques de souris dystrophiques. Dans ce cas, l'expression de la
dystrophine n'est cependant que temporaire. En effet, plusieurs facteurs nuisent à ce type
de traitement comme par exemple, la toxicité du vecteur ou le rejet par le système
immunitaire des cellules exprimant la dystrophine [13]. Plusieurs autres stratégies utilisant
la thérapie génique sont présentement en cours d'étude afin d'augmenter l'expression de
dystrophine ainsi que sa durée d'expression [14].
1.5.4.2 Le traitement pharmacologique
Ce type de traitement, contrairement à la thérapie génique et cellulaire, n'a pas pour but
d'amener l'expression de la dystrophine. En général, cette thérapie consiste à utiliser des
médicaments afin de diminuer l'inflammation, augmenter la prolifération cellulaire ainsi
23
qu'augmenter la production de protéines compensatoires telles que l'utrophine [15]. Par
exemple, le traitement des patients avec des corticostéroïdes tels que la prednisolone
permet une amélioration phénotypique à court terme [16]. Le traitement de souris
dystrophiques avec le facteur de croissance insulinomimétique de type 1 (IGF-1) permet
quant à lui, une augmentation de la masse musculaire ainsi qu'une amélioration anatomique
du muscle [17,18]. Pour l'instant, bien que le traitement pharmacologique donne de bons
résultats, il n'est pas assez efficace pour être employé seul. Il pourrait cependant être utilisé
en combinaison avec une autre thérapie afin d'augmenter l'amélioration phénotypique des
patients traités [15].
1.5.4.3 La thérapie cellulaire
La thérapie cellulaire consiste à injecter, dans un muscle dystrophique, des cellules
possédant le gène normal de la dystrophine. Les cellules normales fusionnent alors avec les
fibres
dystrophiques et le noyau de la cellule normale permet l'expression de la
dystrophine dans la nouvelle fibre hybride [19,20]. Suite aux résultats obtenus chez la
souris, plusieurs essais cliniques ont été faits chez l'humain [21-24]. Les résultats étaient
décevants puisque seulement 10 % de fibres exprimaient la dystrophine dans les muscles
greffés. La figure 11 montre les trois facteurs limitants de la thérapie cellulaire : la faible
dispersion des myoblastes après l'injection, la mort rapide des myoblastes suite à
l'injection et le rejet immunitaire des cellules exprimant la dystrophine lorsqu'il n'y a pas
d'immunosuppression [25,26].
24
Figure 11
Fig. 11 Facteurs limitants de la thérapie cellulaire.
La photo 1 montre une coloration révélant le produit du transgène fi-Galactosidase présent
chez les cellules greffées à un singe. Le peu de cellules présentes hors des trajectoires
d'injection démontre la faible migration des myoblastes. La photo 2 montre l'entrée rapide
de calcium extracellulaire (Rouge Alizarine) quelques heures après la greffe chez le singe
démontrant ainsi la forte mortalité des cellules. La photo 3 représente une coloration
hématoxyline-éosine indiquant la forte infiltration des lymphocytes en périphérie des
cellules greffées. Figure adaptée d'un article de Skuk et Tremblay [27].
25
Solutions face aux problèmes responsables du faible succès de greffe
La faible migration des myoblastes lors des greffes peut d'abord être compensée par des
injections rapprochées de cellules. Chez les primates, des injections faites à des intervalles
de 1 millimètre ont permis l'expression de B-galactosidase dans 60 % des fibres [28].
L'utilisation de facteurs de croissance comme l'IGF-1 et le facteur de croissance de base
des fibroblastes (bFGF) permet aussi d'augmenter la dispersion des myoblastes après
l'injection [29].
Un grand pourcentage de cellules greffées meurent suite à la réaction inflammatoire
provoquée par la greffe [30,31]. Pour améliorer leur survie, les cellules peuvent être
modifiées
génétiquement pour qu'elles expriment la protéine
anti-inflammatoire
« transforming growth factor-beta 1 » (TGF-beta 1) [32]. Dans ce cas, la mortalité des
cellules après la greffe est diminuée de 20 %. L'administration d'un anticorps contre le
récepteur « lymphocyte function-associated antigen 1 » (LFA-1) peut aussi permettre une
diminution significative de la mortalité [33].
Le problème de rejet immunitaire des cellules allogéniques greffées peut être réglé de deux
façons. Premièrement, il a été démontré que l'immunosuppresseur FK506 peut empêcher le
rejet des cellules greffées chez la souris [34] et chez le singe [35]. Le traitement continu
avec un tel immunosuppresseur est cependant risqué puisque le produit peut être
néphrotoxique et neurotoxique [36].
L'autre façon d'empêcher un rejet immunologique serait de faire en sorte que les cellules
du receveur ne rejettent pas celles du donneur Cet état d'insensibilité du système
immunitaire vis-à-vis des cellules greffées s'appelle tolérance immunitaire.
Il existe deux types de tolérance immunitaire : la tolérance périphérique et la tolérance
centrale. La modulation des cellules présentes dans les organes lymphoïdes secondaires
(rate, ganglions, etc.) mène à la tolérance périphérique tandis que la modulation des cellules
présentes dans le thymus mène à la tolérance centrale.
26
La tolérance centrale, qui montre de meilleurs succès que la tolérance périphérique, peut
être obtenue par une greffe de moelle osseuse. Il y a généralement une myéloablation
(destruction partielle ou complète des cellules de la moelle osseuse du receveur) avant la
greffe pour pouvoir permettre le repeuplement de la moelle par les cellules du donneur. Des
souris qui ont été ainsi greffées sont d'ailleurs devenues chimériques et ont toléré des
greffes d'organes venant du donneur initial de moelle osseuse [37-39]. Des recherches sont
présentement en cours afin de développer un protocole de tolérance centrale sans
myéloablation massive afin de permette la tolérance de greffes de myoblastes. En effet, il
pourrait être possible d'utiliser ce protocole de tolérance immunitaire pour le traitement de
la DMD. Une personne donneuse ferait d'abord un don de moelle osseuse qui serait greffé
à un patient dystrophique afin de créer l'état de chimérisme immunitaire. Le donneur ferait
ensuite un don de myoblastes qui serait greffé au receveur dystrophique pour régénérer la
dystrophine. Grâce à son système immunitaire chimérique, le receveur ne rejetterait alors
pas les myoblastes greffés.
27
Les cellules souches embryonnaires pourraient être utilisées pour un traitement de la DMD
sans l'utilisation d'immunosuppresseurs en développant un protocole de tolérance
immunologique. Cette hypothèse sera décrite un peu plus loin dans l'introduction. Le
chapitre suivant décrit d'abord ce que sont les cellules souches embryonnaires ainsi que
leur potentiel relatif au traitement de diverses maladies. Les cellules ES murines seront
particulièrement décrites puisqu'elles ont été utilisées pour les expériences de ce mémoire.
La partie 1.6.5 sera quant à elle, consacrée aux cellules ES humaines.
1.6 Les cellules souches embryonnaires
1.6.1 Historique des cellules souches embryonnaires de souris
Dans les années 1970, les scientifiques ont tenté de trouver un type de culture cellulaire qui
pourrait leur permettre de mieux comprendre le développement génétique de l'embryon.
Des essais de culture de cellules provenant d'embryons de souris ont d'abord été faits mais
se sont soldés par un échec. Les cellules ne pouvaient en effet rester indifférenciées
lorsqu'elles étaient mises en culture [40]. Des cellules de tératocarcinomes, qui sont des
tumeurs malignes, ont alors utilisées pour étudier le développement embryonnaire [41].
C'est en 1981 que deux équipes réussirent enfin à isoler et à cultiver les premières lignées
de cellules souches embryonnaires (ES) [42,43]. Ces cellules partageaient d'ailleurs
plusieurs caractéristiques morphologiques, biochimiques et immunologiques avec les
cellules de tératocarcinomes déjà utilisées à cette époque. Ces cellules ES pouvaient rester
longtemps en culture en présence de cellules nourricières sans se différencier. En 1988,
deux autres équipes découvrirent que c'était le facteur inhibant les cellules leucémiques
(LIF), produit par les cellules nourricières, qui était responsable de l'état de pluripotence
des cellules ES [44,45]. Ils réussirent donc à cultiver les cellules ES sans cellules
nourricières en ajoutant au milieu de culture le LIF purifié.
28
La différenciation des cellules ES a commencé à être étudiée plus en détail en 1985. Ces
cellules pouvaient en effet former des agrégats qui ont été appelés corps embryonnaires
(EB). Une équipe démontra donc que ces EB étaient formés de cellules en différenciation
très organisées et hautement régulées [46].
Depuis ce temps, plusieurs équipes à travers le monde ont réussi à caractériser un peu plus
la différenciation in vitro des cellules ES. Le but de la plupart de ces équipes est de réussir
à contrôler parfaitement la différenciation afin d'obtenir une source sûre et illimitée de
cellules différenciées. Il est à noter qu'en plus des souches humaines et murines de cellules
ES présentement disponibles, des cellules souches provenant d'autres espèces ont pu être
isolées. Il existe en effet des cellules souches embryonnaires de hamster [47], de poulet
[48] et de singe [49].
1.6.2 Génération d'une lignée de cellules souches embryonnaires
murines
La technique pour obtenir une lignée de cellules souches embryonnaires est demeurée
relativement la même depuis les premiers succès obtenus en 1981. Pour les cellules
murines, on prélève l'utérus d'une souris 3.5 jours après le coït. On expulse alors le
blastocyste et ensuite le trophoectoderme est enlevé par microchirurgie. Seule la masse
cellulaire interne (ICM) composée de Pépiblaste demeure intacte (Voir figure 1).
L'ICM est alors cultivée sur une couche de cellules nourricières prétraitées à la mytomicine
pour éviter qu'elles prolifèrent. Les colonies ayant l'apparence typique de cellules ES sont
alors transférées à l'aide d'une micropipette sur une nouvelle couche de cellules
nourricières. Les cellules sont ainsi transférées plusieurs fois jusqu'à l'obtention de
colonies totalement non différenciées et possédant les marqueurs caractéristiques de
cellules souches embryonnaires. Ces marqueurs seront d'ailleurs énumérés un peu plus
loin. Le caryotype des cellules, c'est-à-dire la caractérisation des chromosomes, doit aussi
être vérifié pour s'assurer qu'il est normal et diploïde [50].
29
1.6.3 Cellules ES murines non-différenciées
1.6.3.1 Voies de signalisation impliquées
Bien que le potentiel de différenciation de ces cellules ES pluripotentes soit connu, leur
potentiel de prolifération est souvent oublié. En effet, ces cellules indifférenciées présentent
plusieurs caractéristiques de culture très importantes.
Comme il a été cité plus tôt, la propagation des cellules ES de souris non-différenciées est
dépendante de l'ajout de LIF dans le milieu de culture. Il a aussi été démontré que d'autres
cytokines peuvent remplacer le LIF et ainsi empêcher la différenciation des cellules ES
[51]. Comme le montre la figure suivante, la présence de LIF provoque la formation d'un
complexe hétérodimérique constitué de deux récepteurs : le récepteur du LIF (LIFR) et
gpl30 [52]. La formation de ce complexe active les « Janus-associated tyrosine kinases »
(JAK) qui phosphorylent les tyrosines des chaînes de ces récepteurs fraîchement associés.
Cette phosphorylation des récepteurs crée des sites d'ancrage pour les protéines contenant
les domaines « SRC homology 2 » (SH2). Les protéines induisant l'activation de la
transcription (STAT) portent ces domaines SH2 et se lient donc aux chaînes du complexe
de récepteurs. Ces protéines sont par la suite dimérisées puis transférées dans le noyau de la
cellule. Lorsque présentes dans le noyau, ces STATs dimérisées induisent la transcription
de facteurs permettant la prolifération des cellules et l'absence de différenciation cellulaire.
Dans le cas du LIF, c'est précisément la protéine STAT3 qui est impliquée [53].
Figure 12
Fig. 12 Effet moléculaire du LIF sur la différenciation cellulaire [54],
La présence de LIF provoque la formation d'un complexe formé du LIFR et gpl3O (1). La
formation de ce complexe active les JAKs qui phosphorylent les tyrosines des chaînes des
récepteurs fraîchement associés (2). Les STATs se lient ensuite aux chaînes du complexe
de récepteurs (3). Ces STATs sont alors dimérisées puis transférées dans le noyau de la
cellule (4). Dans le noyau, ces STATs dimérisées induisent la transcription de facteurs
permettant la prolifération et la non-différenciation cellulaire. La protéine STAT3 est
représentée dans le schéma puisqu'elle joue un rôle majeur chez les cellules ES nondifférenciées. D'autres STATs seraient aussi impliquées pour le maintien de la
pluripotence.
D'autres voies de signalisation cellulaire seraient aussi à l'origine du maintien de la
pluripotence des cellules ES. Par exemple, la voie des « Ras/mitogen-activated protein
kinase » (MAPK) fait en sorte que lorsque SHP-2 et ERK deviennent actives, les cellules
arrêtent leur auto-renouvellement et se différencient [55,56].
1.6.3.2 Expression génique chez les cellules ES pluripotentes murines
Un des principaux gènes caractérisant une cellule pluripotente non-différenciée est Pou5fl,
qui code pour le facteur de transcription oct-4. Ce gène est d'ailleurs exprimé dès le stade
du zygote et du blastocyste chez la souris [57]. La régulation de ce facteur de transcription
doit être hautement précise car un manque de la protéine ou un excès de celle-ci va résulter
en une différenciation [58]. Ce facteur empêcherait en autre la transcription de gènes
nécessaires à la différenciation cellulaire [59].
FoxD3 et Sox2 sont deux facteurs de transcription qui interagissent avec oct-4 pour
maintenir l'auto-renouvellement [60,61]. Par exemple, les embryons mutants pour FoxD3
meurent après le jour 6 à cause d'un défaut important dans le compartiment embryonnaire
[62]. La protéine Sox2 joue quant à elle, un grand rôle dans la transcription de gènes ciblés
par oct-4 [61].
Nanog est une protéine qui a été récemment identifiée comme étant importante au maintien
de la pluripotence [63,64]. Contrairement aux protéines nommées précédemment, nanog
n'est pas exprimée avant le stade de la morula. Oct-4 jouerait par ailleurs un rôle dans la
régulation quantitative de nanog [65].
Les cellules ES non-différenciées possèdent aussi une activité télomérase. Cette activité est
nécessaire au maintien de la longueur des chromosomes afin que les cellules puissent se
diviser indéfiniment sans perte de matériel génétique [66].
.12
Le tableau suivant résume les marqueurs principaux retrouvés chez les cellules ES murmes
et humaines [65,67,68].
SSEA-1
SSEA-3
SEA-4
TRA-1-60
TRA-1-81
Oct-4
Nanog
Sox2
FoxD3
Phosphatase alcaline
Activité télomérase
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
1
Tableau 1 Marqueurs principaux chez les cellules ES murines et humaines.
En plus des caractéristiques précédemment nommées, les cellules indifférenciées de souris
doivent répondre aux particularités suivantes [50] :
Elles doivent se diviser éternellement de façon symétrique.
Elles doivent former un tératome si elles sont injectées à un organisme.
Lorsque injectées dans un blastocyste, elles doivent avoir la capacité de participer à
la formation de tous les tissus provenant de cet embryon, y compris les cellules
germinales.
Elles doivent être clonogéniques, c'est-à-dire avoir la capacité de donner une lignée
de cellules identiques à partir d'une seule cellule.
33
•
Elles ne doivent pas entrer dans la phase Gl du cycle cellulaire, qui est la phase
entre la mitose et la synthèse d'ADN. Les cellules ES non-différenciées passent
donc la majorité de leur temps dans la phase de synthèse.
•
Contrairement aux cellules somatiques femelles, les cellules ES femelles nondifférenciées n'inactivent pas un de leur chromosome X.
•
Comme il sera expliqué plus loin, les cellules ES indifférenciées doivent pouvoir se
différencier in vitro en cellules de la lignée du mésoderme, de l'ectoderme et de
l'endoderme.
Il est à noter que les cellules indifférenciées humaines ont en théorie les mêmes
caractéristiques listées ci-dessus. Pour des raisons éthiques, il est cependant impossible de
vérifier leur capacité à former tous les types de tissus lorsque injectées dans un blastocyste.
1.6.4 Différenciation des cellules ES murines
Les cellules ES procurent un modèle exceptionnel pour comprendre le développement
embryonnaire. Outre quelques exceptions, la différenciation des cellules ES s'effectue
grâce à la formation de corps embryonnaires (EB) composés d'un agrégat de cellules en
différenciation. La technique pour faire ces EBs sera expliquée en détail dans la section
Méthodologie de ce mémoire.
Afin de bien comprendre le comportement des cellules présentes dans le EB, un bref
résumé de la différenciation précoce in vivo sera décrit dans les lignes suivantes. Il sera
donc plus facile de comparer la différenciation in vitro à la différenciation in vivo qui se
produit normalement chez le blastocyste.
Le développement embryonnaire, dans le blastocyste, commence d'abord avec la
différenciation de la couche externe des cellules pluripotentes de l'ICM. Comme il a été vu
précédemment dans l'introduction, l'épiblaste est entouré de l'endoderme primitif extraembryonnaire et du trophoectoderme (Voir figure 1). Chez la souris, vers le jour 4, les
34
cellules de l'endoderme primitif extra-embryonnaire migrent ensuite près des cellules
pluripotentes de l'épiblaste et se transforment en deux types de cellules. Celles qui restent
accolées aux cellules pluripotentes forment alors l'endoderme viscéral tandis que celles qui
se situent à proximité du trophoectoderme forment l'endoderme pariétal.
Vers le jour 5, une sorte de cavité se forme parmi les cellules pluripotentes et celles-ci
deviennent polarisées. Ce processus de conversion morphogénétique se nomme cavitation.
La cavitation est d'ailleurs retrouvée lors de la formation d'autres structures tubulaires
comme par exemple les conduits menant à certaines glandes [69]. Suite à la formation de la
cavité proamniotique, il y a la formation de l'ectoderme primitif qui fournira les substrats
nécessaires à la gastrulation.
Des expériences qui impliquent la délétion et la recombinaison de facteurs de transcription
produits par l'endoderme viscéral ont été faites. Il a été possible de démontrer le rôle
majeur de cet endoderme dans la formation de l'ectoderme primitif et, par conséquent, son
rôle au niveau dp la gastrulation [70-72]. Suite à ce processus de gastrulation, l'ectoderme
primitif se différencie en mésoderme, ectoderme et endoderme [73].
Dans l'EB, il y a aussi formation de différents types de cellules. La figure suivante montre
qu'au jour 2, les cellules en périphérie de l'agrégat se différencient d'abord en endoderme
primitif. De la même façon que les cellules embryonnaires in vivo, cet endoderme primitif
se différencie ensuite en endoderme viscéral et pariétal. Les cellules situées au centre de
l'EB se transforment quant à elles en ectoderme primitif. Le processus de cavitation est
aussi présent chez les EB. En effet, la couche de cellules endodermales en périphérie du EB
envoie un signal de mort aux cellules ectodermales internes. Plusieurs foyers de cellules
mortes se regroupent alors pour ne former qu'une seule cavité. La couche de cellules
endodermales périphériques envoie aussi un deuxième signal qui permet la survie d'une
monocouche de cellules ectodermales primitives entourant la cavité. Plusieurs jours après
la différenciation, les cellules ectodermales primitives entourant la cavité se différencient
en mésoderme, ectoderme et endoderme. La différenciation en cellules matures se poursuit
et la cavité est ainsi remplacée par un amas de cellules différenciées [74].
35
Figure 13
Jour 1
Jour 2
Jour 3
Jour 4-6
» Cellules ES
• Ectoderme primitif
P Endoderme primitif
P Endoderme viscéral
y Endoderme pariétal
• Mésoderme
) Endoderme
© Ectoderme
Fig. 13 Différenciation des cellules à l'intérieur d'un EB.
Vers le jour 2, les cellules en périphérie de l'EB se différencient d'abord en endoderme
primitif. Au jour 3, cet endoderme primitif se différencie en endoderme viscéral et pariétal.
Cette couche de cellules en périphérie de l'EB envoie alors un signal de mort aux cellules
ectodermales internes pour provoquer la cavitation. Cette même couche de cellules
endodermales envoie aussi un deuxième signal qui permet la survie d'une monocouche de
cellules ectodermales primitives entourant la cavité. Les cellules ectodermales primitives
entourant la cavité se différencient plus tard en mésoderme, ectoderme et endoderme.
Figure adaptée d'un article de Rathjen J, Rathjen [75].
36
Plusieurs équipes de recherche tentent de trouver une manière efficace et reproductible pour
différencier les cellules ES en plusieurs types de cellule qui pourraient être utiles pour
traiter des maladies. Ces cellules, une fois la différenciation contrôlée, pourraient être
disponibles en plus grand nombre que les cellules obtenues de source in vivo
traditionnelles.
Comme il a été dit précédemment, la différenciation spontanée des cellules de Pectoderme
primitif dans l'EB mène à la formation de mésoderme, d'endoderme et d'ectoderme. Pour
obtenir un type de cellules en particulier en assez grande quantité, il est nécessaire
d'orienter la différenciation cellulaire de l'EB. Les EBs peuvent en autre être traités
pendant une courte période de temps avec des agents chimiques. Par exemple, le traitement
des EBs avec de l'acide rétinoïque permet d'augmenter le pourcentage de cellules ayant le
phénotype neuronal [76]. Des cytokines peuvent aussi être ajoutées au milieu dans lequel
les EBs sont maintenus en culture. L'addition de « vascular endothelial growth factor »
(VEGF) permet en effet d'orienter la différenciation vers la lignée hématopoïétique [77].
Finalement, la coculture de cellules ES avec des cellules nourricières particulières peut
aussi orienter la différenciation de l'EB [78].
La modification génétique des cellules ES peut quant à elle, permettre l'enrichissement des
cellules différenciées en un type particulier. Par exemple, pour obtenir une population de
cardiomyocytes relativement pure, une équipe de recherche avait préalablement transfecté
des cellules ES avec un plasmide. Ce plasmide comprenait un gène de résistance au G418
sous le contrôle d'un promoteur spécifique présent chez les cardiomyocytes. Quand les
cellules différenciaient en cardiomyocytes, le promoteur était activé et amenait ainsi une
résistance au G418. L'ajout de l'antibiotique au milieu de culture tuait les cellules qui ne
s'étaient pas différenciées en cardiomyocytes et permettait donc la purification des cellules
voulues [79].
En plus d'avoir contrôlé la différenciation des cellules ES en un certain type cellulaire,
plusieurs équipes de recherche ont réussi à greffer ces cellules différenciées à des souris. En
autre, des progéniteurs neuronaux provenant de cellules ES ont été greffés dans des lésions
37
cérébrales de rongeurs permettant ainsi la régénération du phénotype normal [80].
L'injection de cellules souches hématopoïétiques dérivant de cellules ES à des souris a
aussi permis la formation d'un chimérisme immunologique [81].
Il est bien de préciser que dans tous les cas de transplantation de cellules différenciées à
des animaux, ces cellules devaient avoir été purifiées ou devaient avoir été suffisamment
différenciées pour éviter la formation de tumeurs. Comme il a été mentionné plus haut, les
cellules non-différenciées ont une capacité de division illimitée et causent donc des
tératomes lorsque injectées à un animal. Il est à noter que pour certains cas, les tumeurs
provenant de cellules ES pourraient être dues à des mutations chez les cellules ES cultivées
très longtemps. En effet, il a été prouvé que certaines cellules ES à passage élevé
contenaient des altérations dans leur génome [82-84]. Ces mutations, comme pour toute
autre cellule du corps, pourraient donc être la cause de la formation de certaine tumeur.
L'utilisation de cellules ES ayant un bas passage pourrait donc réduire les risques de
formation de tumeur associés à des altérations génomiques.
Les cellules souches embryonnaires, avec une différenciation et une sélection bien
contrôlées, pourraient donc servir à traiter plusieurs maladies.
1.6.5 Les cellules souches embryonnaires humaines
Même si les premières lignées de cellules ES murines ont été créées en 1981, ce n'est qu'en
1998 que les premières lignées humaines furent établies. La méthode pour parvenir à
l'isolement de cellules ES humaines est relativement semblable à celle utilisée pour isoler
des cellules murines. Les embryons surnuméraires créés in vitro pour des traitements
contre l'infertilité servent à la création des lignées cellulaires. L'ovocyte est considéré
comme étant à son jour un 18 à 24 heures après la fertilisation in vitro. Ce n'est qu'au jour
5 que les cellules internes du blastocyste sont prélevées par microchirurgie. À ce stade,
l'embryon est composé de 200 à 250 cellules et la masse interne qui est prélevée ne
38
contient seulement que 30 à 34 cellules. Les autres étapes nécessaires à la création une
lignée de cellules ES ont été décrites précédemment.
Les cellules ES humaines, tout comme les cellules de souris, doivent exprimer des
marqueurs spécifiques de pluripotence. Ces marqueurs ont déjà été résumés précédemment
dans le tableau 1. Les cellules n'ayant pas tous les critères requis ne peuvent donc pas être
considérées comme des cellules ES.
Les cellules ES humaines ont pu être différenciées à ce jour en plusieurs types de cellules.
Le tableau de la page suivante énumère quelques différenciations qui ont été faites à partir
de cellules ES humaines [85-92].
39
Différenciation en
HES2
cardiomyocytes
Évaluation des
propriétés
cardiomyocytes
H9.2
électrophysiques et
pharmacologiques
J
Différenciation
de
mésoderme
progéniteurs
cellules multipotentes
H1.H9
hématopoïétiques
CD34 +
Isolation et
caractérisation de
cellules endothéliales cellules endothéliales
H9
dérivées de cellules
hES
Différenciation en
neurones
neurones
BG01.BG03
dopaminergiques
ectoderme
Différenciation en
neurones
H1, H9
neurones moteurs
Différenciation en
H9, H9.2,
hépatocytes
cellules produisant de
H13, 16
l'insuline
endoderme
Enrichissement de la
différenciation en
hépatocytes
H1.H9
cellules «hepatocytelike»
Différenciation
HSF-1.HSFcellules germinales
spontannée en cellules
6, H9
germinales
cardiomyocytes
Tableau 2 Différenciations faites à partir de cellules ES humaines.
40
1.6.6 Les cellules souches provenant de l'adulte
Puisque l'utilisation de cellules souches embryonnaires humaines est souvent contestée,
une alternative à l'utilisation de ces cellules pourrait être possible. Il existe en effet chez
l'adulte une population de cellules souches qui possède quelques caractéristiques
communes aux cellules ES.
Ces cellules souches sont celles qui permettent de maintenir l'homéostasie chez l'adulte.
Elles ont différentes fonctions dépendamment de l'endroit où elles se trouvent dans le
corps. Les mieux connues de ces cellules sont sans doute les cellules souches
hématopoïétiques (HSC). Comme tous les types de cellules souches adultes, les HSC se
retrouvent en très petites quantités dans le corps. En effet, on retrouve environ une HSC
pour 10 000 à 15 000 cellules de moelle osseuse. Ces cellules s'auto-renouvellent et se
différencient en cellules sanguines pour remplacer les cellules mortes [93].
Plusieurs autres types de cellules souches adultes ont été identifiés au cours des dernières
années. Ces cellules sont en effet retrouvées dans le cerveau, la moelle épinière, les
vaisseaux sanguins, le muscle squelettique, la couche de cellules épithéliales de la peau et
du système digestif, la cornée, la rétine, le foie et le pancréas [50].
Pour qu'une cellule adulte soit considérée comme une cellule souche, elle doit posséder
plusieurs caractéristiques. Cette cellule doit d'abord avoir le pouvoir de s'auto-renouveler
sur une période équivalente à la durée de vie de l'organisme. Une cellule souche doit aussi
pouvoir se différencier en cellule mature normale et capable de s'intégrer complètement
dans son environnement physiologique. La cellule mature provenant de la cellule souche
doit donc posséder une physiologie, une génétique et un comportement normal.
Malgré le fait que les cellules souches provenant de l'adulte différencient bien, elles ne
peuvent pas remplacer l'utilisation de cellules ES pour le moment. En effet, pour certaines
41
cellules souches adultes, la capacité de prolifération in vitro est très limitée et donc peu de
cellules différenciées pourraient être obtenues.
42
À l'état indifférencié, les cellules souches embryonnaires expriment peu de molécules qui
peuvent activer le système immunitaire. Cependant, lors de la différenciation, l'expression
du complexe majeur d'histocompatibilité de classe 1 (MHC1) est augmentée à la surface
des cellules [94]. Dans ce cas, même si des cellules différenciées pourraient être obtenues
en grande quantité à partir de cellules ES, celles-ci seraient rejetées lorsque greffées à un
humain. Il faudrait alors utiliser des immunosuppresseurs qui possèdent plusieurs effets
secondaires indésirables. Pour éviter l'utilisation de tels agents, il y aurait deux solutions
possibles. L'une de ces solutions, qui est très controversée pour le moment, est le clonage
thérapeutique. L'autre solution, comme il l'a été mentionné plus tôt, est le développement
d'un protocole de tolérance immunologique.
Les chapitres suivants décriront donc les deux types de solutions relatives au problème de
rejet des cellules ES différenciées.
1.6.7 Clonage thérapeutique
Un des moyens pour éviter la prise d'immunosuppresseurs, bien que très controversé pour
le moment, serait le clonage thérapeutique. L'objectif de cette technique est de produire des
cellules pluripotentes portant le génome du patient à traiter pour ensuite les différencier en
cellules dont le patient a besoin [95]. Comme le montre la figure suivante, cette technique
consiste à transférer le noyau d'une cellule somatique adulte à un ovocyte énucléé. Une
légère décharge électrique provoque ensuite la fusion et l'activation de la cellule
nouvellement créée. Cette cellule est mise en culture in vitro afin de former un blastocyste.
Les cellules ES issues de ce blastocyste peuvent ensuite être différenciées en suivant les
protocoles de différenciation habituels. Cette technique de clonage thérapeutique a été
réussie avec succès en utilisant des cellules murines. Les cellules ayant subi un transfert
nucléaire ont en effet été greffées à des souris modèles de la maladie de Parkinson. Ces
cellules greffées ont par ailleurs réussi à régénérer le phénotype normal de ces souris [96].
43
Figure 14
Ovocyte de la donneuse
Cellules du patient
f
Énucléation
c
' Transfert nucléaire
Fusion et activation
m
{
|
<
•
-
Isolation de l'ICM
ICM
Génération de cellules ES
m
Différenciation des ES en différents types de cellule
Éà
' Y
a*
Neurones
Cellules
sanguines
Myoblastes
Fig. 14 Clonage thérapeutique.
Le noyau d'une cellule somatique adulte est d'abord transféré à un ovocyte énucléé. Une
légère décharge électrique provoque ensuite la fusion et l'activation de la cellule
nouvellement créée. Cette cellule est cultivée pour former un blastocyste in vitro. Les
cellules ES de ce blastocyste peuvent ensuite être isolées et différenciées en suivant les
protocoles de différenciation habituels [97].
44
Il est à noter que cette technique de clonage ne pourrait être utile pour traiter certaines
maladies génétiques comme la dystrophie musculaire de Duchenne. En effet, puisque la
cause de cette maladie est une mutation dans le gène de la dystrophine, il serait inutile de
faire un transfert nucléaire avec un noyau du patient puisque l'embryon ainsi créé ne
posséderait pas le gène normal de la dystrophine. Les myoblastes dérivés de cellules ES
venant de cet embryon ne pourraient donc pas servir à régénérer la dystrophine lorsque
greffés dans le muscle dystrophique du patient.
Bien que la technique de clonage thérapeutique pourrait être très utile pour guérir certaines
maladies, l'utilisation de cette technique chez l'humain reste incertaine. Il y a d'abord un
problème éthique au niveau du transfert nucléaire de la cellule somatique à l'ovocyte
énucléé. Ce procédé s'appelle clonage et même s'il n'a pas pour but de créer un être
humain adulte, il est éthiquement très prohibé. De plus, l'embryon créé à partir de l'ovocyte
est automatiquement voué à la mort. Donc, tout comme pour les lignées de cellules souches
créées à partir d'embryons surnuméraires, les éthiciens acceptent mal que des embryons
soient ainsi détruits.
1.6.8 Tolérance immunologique
La deuxième solution pour éviter le rejet des cellules ES différenciées serait le
développement d'un protocole de tolérance immunologique. Cet état d'insensibilité
immunitaire a été décrit précédemment à la section 1.5.4.3. Il pourrait donc être possible de
créer un état de tolérance immunologique en utilisant les cellules souches embryonnaires.
Comme le montre le schéma suivant, les cellules ES du départ seraient d'abord
différenciées en cellules souches hématopoïétiques. Ces cellules, greffées à un patient
dystrophique, auraient possiblement la capacité de créer un chimérisme immunitaire.
Les mêmes cellules ES du départ pourraient, en parallèle, être différenciées en myoblastes.
Ces cellules seraient alors greffées au patient qui a reçu auparavant une greffe de cellules
45
HSC et qui a donc un système immunitaire chimérique. Une partie des cellules
immunitaires du patient proviendraient alors de la même lignée cellulaire que les
myoblastes greffées. Les cellules myogéniques greffées ne seraient donc pas rejetées par
l'organisme et pourraient alors régénérer la dystrophine chez le patient.
Ce protocole de tolérance, lorsque mis au point, pourrait servir à la greffe de plusieurs
autres types de cellules dérivées de cellules ES.
46
Figure 15
Cellules ES
Différenciation en
cellules myogéniques
Greffe de cellules *•*,
myogéniques
Régénération musculaire
Différenciation en HSC
Greffe de HSC
Chimérisme
Tolérance immunitaire envers les cellules myogéniques greffées
Fig. 15 Traitement de la DMD avec des cellules ES.
Les cellules ES du départ seraient d'abord
différenciées
en cellules souches
hématopoïétiques. Ces cellules, greffées à un patient atteint de DMD, auraient la capacité
de créer un chimérisme immunitaire. Les mêmes cellules ES seraient ensuite différenciées
en cellules myogéniques. Ces cellules seraient alors greffées au patient afin de régénérer la
dystrophine. Les cellules myogéniques greffées seraient donc tolérées par le système
immunitaire chimérique du patient.
47
Vu leur provenance particulière, l'utilisation de cellules souches embryonnaires est
contrôlée par plusieurs lois. Le dernier chapitre de l'introduction sert donc à résumer
quelques lois concernant les cellules ES humaines, en vigueur au Canada et ailleurs dans le
monde.
1.7 Législation concernant les cellules souches
embryonnaires humaines au Canada
Même si la recherche sur les cellules ES se fait depuis plus de vingt ans, celle-ci n'a pas
causé de problème au niveau législatif avant 1998. C'est en effet durant cette année-là que
les premières cellules souches ont été isolées d'embryon et de tissus fœtaux humains.
Avant mars 2002, il n'existait aucune loi régissant l'utilisation de cellules ES humaines en
recherche. Les Instituts de Recherche en Santé du Canada (IRSC) ont alors dicté des lignes
directrices sur la recherche de ces cellules souches humaines afin d'avoir un contrôle sur
l'utilisation de ces cellules très prometteuses. Les organismes de financement fédéraux,
c'est-à-dire les IRSC, le Conseil de Recherche en Sciences Naturelles et en Génie
(CRSNG), et le Conseil de Recherche en Science Humaine (CRSH), ont alors convenu
qu'aucune recherche sur les cellules ES humaines ne serait financée sans l'examen et
l'approbation préalable du Comité de Surveillance des Cellules Souches (CSCS). Plusieurs
principes directeurs doivent donc être rigoureusement respectés. Par exemple, l'embryon
d'où proviennent les cellules ES ne doit pas avoir été obtenu par le moyen d'une
transaction financière. Les parents qui ont donné l'embryon doivent également avoir signé
un consentement libre et éclairé avant leur don. Il est à noter que les IRSC interdisent le
transfert de noyaux de cellules somatiques dans un ovocyte afin de créer un embryon
humain. Le clonage thérapeutique, qui a été décrit précédemment, est donc interdit par les
IRSC.
La recherche sur les cellules ES humaines est aussi régie par certaines lois au niveau du
gouvernement canadien. En effet, la Loi sur la procréation assistée et la recherche connexe
a reçu la sanction royale le 29 mars 2004 après de longs débats. Cela veut donc dire qu'à
48
partir de cette date, les articles faisant partie de cette loi ont été mis en vigueur à différents
moments. À ce jour, à cause des débats et du manque de précision de certains articles, il
reste toujours quelques points de la loi sur la procréation assistée qui ne sont toujours pas
en vigueur. Par exemple, l'article 8 de la loi qui concerne le consentement n'est toujours
pas en vigueur mais devrait l'être durant l'année 2006. Dans les lois qui sont déjà en
vigueur, on stipule par exemple, qu'il est interdit de créer un embryon humain in vitro à
moins que ce ne soit pour des fins reproductives (fertilisation in vitro) ou pour
l'apprentissage des techniques de fertilisation in vitro. Quelqu'un qui contreviendrait à la
loi serait soit passible d'une amende de 500 000 $, soit condamné à une peine
d'emprisonnement ou les deux.
Ensemble, la loi canadienne sur la procréation assistée ainsi que les lignes directrices
émises par les IRSC assurent donc l'encadrement de la recherche sur les cellules souches
humaines au Canada. Elles peuvent empêcher les abus de certains chercheurs mais
pourraient un jour ralentir la recherche en interdisant le clonage thérapeutique.
1.8 Législations concernant les cellules souches
embryonnaires humaines au niveau international
Aux États-Unis, les lois fédérales sont semblables à celles du Canada. Le 9 août 2001, le
président George W. Bush a permis le financement de la recherche sur les cellules ES
humaines à trois conditions. Les parents donneurs de l'embryon devaient être consentants,
l'embryon ne devait pas avoir été créé à des fins de recherche et finalement, l'isolation des
cellules ES devait avoir eu lieu avant le 9 août 2001. Le président voulait donc arrêter le
sacrifice des embryons congelés même s'ils n'étaient pas utilisés. Chaque État est
cependant responsable des législations concernant les cellules ES humaines si les équipes
de recherche ne sont pas financées par le gouvernement fédéral. Par exemple, depuis 2002,
l'État de la Californie a permis le financement nécessaire à l'extraction de cellules ES. En
2004, le New Jersey a aussi adopté une loi similaire à celle de la Californie.
Plusieurs autres pays comme le Japon et l'Australie ont des lois similaires aux lois nordaméricaines. Cependant, d'autres pays ont des législations plus strictes. Par exemple, en
Allemagne, une loi de 1992 interdisait toute forme de recherche sur les embryons. Des
débats intenses ont cependant permis en 2002 l'importation de cellules ES pour certains
types de recherche dans ce pays.
Les informations concernant la législation des cellules ES humaines proviennent des sites
Internet du Gouvernement du Canada ainsi que des IRSC.
50
1.9 Objectifs du projet de recherche
Comme il a été mentionné plus tôt, il serait possible de créer un protocole de tolérance
immunologique à l'aide de cellules ES qui permettrait de traiter les patients atteints de
DMD. Ce protocole nécessite d'abord la mise au point de la différenciation des cellules ES
en cellules souches hématopoïétiques pour créer le chimérisme. La deuxième partie du
protocole nécessite quant à elle, la mise au point de la différenciation des cellules ES en
myoblastes afin de pouvoir régénérer la dystrophine chez les patients. C'est d'ailleurs sur
cette partie que les expériences de ce mémoire ont été basées. Il est à noter que toutes les
expériences ont été faites uniquement avec des cellules souches embryonnaires murines.
Lorsque mis au point, le protocole de différenciation pourra être appliqué aux cellules ES
humaines.
Le premier objectif du projet de recherche était d'abord de mettre au point la différenciation
des cellules ES de souris afin de favoriser la différenciation en myoblastes.
Le deuxième objectif était de trouver un moyen de purifier les myoblastes dérivés de
cellules ES afin d'obtenir une population relativement pure ne contenant plus de cellules
souches pluripotentes.
Le troisième objectif était de greffer les myoblastes purifiés dérivés de cellules ES à des
souris dystrophiques afin de régénérer la dystrophine.
51
2. Matériels et Méthodes
2.1 Culture cellulaire
2.1.1 Cultures primaires de myoblastes
Les myoblastes normaux servant de contrôles lors de la purification par « Magneticactivated cell sorting » (MACS) ont été obtenus en faisant une culture primaire de muscle
de souris C57BL/10J. Les souriceaux étaient sacrifiés par guillotine à l'âge de trois jours.
Les quatre pattes étaient alors prélevées et les muscles de ces pattes étaient disséqués sous
un microscope binoculaire. Les muscles étaient ensuite émincés et digérés dans une
solution de Hank's Balanced Sait Solution (HBSS, GIBCO, Burlington, Ontario, Canada)
contenant 2,5 mg / ml de collagénase (Sigma, St-Louis, MO, États-Unis) et 2,5 mg / ml de
dispase II (Roche, Indianapolis, IN). Après une heure de digestion sous agitation à 37°C, les
myoblastes étaient lavés avec du HBSS et mis en culture dans du milieu «High glucose
Dulbecco's modified Eagle médium» (DMEM, Sigma) contenant 10% de sérum de veau
fœtal
(FBS; Biomedia, Drummondville, Québec, Canada) et 100 U/ml de pénicilline-
streptomycine (GIBCO).
Afin d'enrichir la population de myoblastes présente dans les cultures primaires, les
cellules ont d'abord été mises en culture pendant deux heures. Les cellules n'ayant pas
adhéré après deux heures ont été mises dans un autre pétri afin qu'elles prolifèrent. Puisque
les fibroblastes adhèrent plus rapidement au pétri de culture que les myoblastes, la
population de cellules qui était transférée dans de nouveaux pétris se trouvait enrichie en
myoblastes. Après 48 heures, cette population cellulaire était décollée à l'aide de trypsine et
d'acide éthylène diamine tétra acétique (EDTA) à 0,05% (GIBCO). Elle était ensuite
congelée pour une utilisation ultérieure dans du DMEM contenant 50% de FBS et 10% de
diméthyl sulfoxide (DMSO, Sigma). Cette méthode d'enrichissement des myoblastes,
modifiée pour ces expériences, est d'ailleurs utilisée depuis plusieurs années [98].
2.1.2 Cellules souches embryonnaires de souris
La lignée de cellules ES CCE a été fournie par StemCell Technologies et la lignée de
cellules ES RI fut gracieusement donnée par Dr Jana Krosl de l'Université de Montréal.
Les deux types de cellules ont été cultivés de la même façon. Lors de la décongélation, les
cellules ES étaient lavées avec du HBSS pour enlever le DMSO qui pourrait induire une
différenciation cellulaire. Les cellules étaient ensuite mises en culture dans des pétris traités
à la gélatine 0,1% (Sigma). Ce traitement des pétris de culture est essentiel à l'adhésion
des cellules ES murines. Les cellules étaient cultivées dans du milieu DMEM contenant
15% de FBS, 1 mM de sodium pyruvate, 100 U/ml de pénicilline-streptomycine, 2 mM de
L-glutamine, 0,1 mM d'acide aminés non-essentiels (tous obtenus de GIBCO) et 100 |^M
de monothioglycérol (Sigma). Les cellules étaient maintenues dans un état indifférencié par
l'ajout du facteur inhibant les cellules leucémiques (LIF) à une concentration de 103 U/ml.
Les cellules étaient incubées à 37 °C avec 5% de CO2 et subissaient un passage à tous les
deux jours pour éviter une trop grande confluence.
2.1.3 Lignées cellulaires NIH 3T3 et C2C12
Les lignées immortalisées de fibroblastes (NIH 3T3) et de myoblastes (C2C12) servant de
contrôles ont été cultivées dans du milieu DMEM contenant 10% de FBS et 100 U/ml de
pénicilline-streptomycine.
2.1.4 État des cellules ES non-différenciées
Avant de débuter une expérience de différenciation, les cellules étaient d'abord observées
attentivement au microscope afin de confirmer leur état indifférencié. Les colonies de
cellules devaient donc avoir un contour lisse et les limites du cytoplasme des cellules ne
devaient pas être percevables. La figure suivante montre les différentes caractéristiques
recherchées chez les cellules ES utilisées pour la différenciation. Dans le cas où les
53
colonies commençaient à se différencier, un ou deux passages supplémentaires étaient faits
afin d'éliminer les cellules différenciées et ainsi rétablir le phénotype des cellules nondifférenciées.
54
Figure 16
Fig. 16 Caractéristiques phénotypiques des cellules ES non-différenciées.
La photo 1 montre des cellules ES totalement indifférenciées. Le contour des colonies est
bien défini et il est impossible de distinguer le cytoplasme des cellules faisant partie de la
colonie. La photo 2 représente un cas typique où les cellules ont commencé à différencier
spontanément. Quelques colonies présentent un contour irrégulier et il est possible de
distinguer le cytoplasme de chaque cellule faisant partie de ces colonies qui commencent à
différencier.
55
2.2 Différenciation des cellules ES
Les premiers essais de différenciation ont été faits sans passer par la formation de EBs.
Pour initier la différenciation, les cellules étaient d'abord décollées avec de la trypsine. Les
cellules étaient par la suite remises en culture dans des pétris traités à la gélatine avec un
milieu de culture ne contenant pas de LIF. Le facteur de croissance IGF-1 (Sigma) ainsi que
le facteur de croissance des hépatocytes (HGF, Sigma) étaient tous deux ajoutés au milieu
de culture à une concentration de 25 ng/ml.
Les cellules étaient laissées en culture pendant
10 jours et des analyses en
immunofluorescence étaient faites durant la différenciation. Le milieu de ces cellules était
changé tous les deux jours et un passage était fait lorsque les cellules devenaient trop
confluentes.
2.2.1 Formation de EBs
Les seconds essais de différenciation ont été faits en passant par la formation de EB. Ces
EB sont formés par une technique connue sous le nom de « hanging drop method »[99].
Selon cette méthode, les EB sont formés grâce à la gravité dans des gouttes suspendues à
un couvercle de pétri.
Pour ce faire, des cellules ES non-différenciées ont d'abord été décollées à l'aide de
trypsine. Après avoir été lavées et comptées, les cellules ont été resuspendues à une
concentration de 1000 cellules par 10 microlitre (ul) dans du milieu complet (décrit
précédemment) auquel le LIF n'avait pas été ajouté.
La suspension cellulaire a été distribuée par goutte de 10 al dans le couvercle d'un pétri de
culture. Le pétri a ensuite été rempli avec du HBSS et le couvercle portant les gouttes a été
remis sur le pétri. Les gouttes déposées étaient donc suspendues au couvercle au-dessus de
56
la solution de HBSS qui servait à éviter l'assèchement des gouttes. Il est à noter que c'est la
gravité qui fait en sorte que les cellules forment un agrégat au fond de la goutte.
Les cellules présentes dans les gouttes suspendues ont été laissées en culture pendant deux
jours pour permettre la formation du EB. Au terme de la deuxième journée, les EBs
devaient être observés au microscope afin de vérifier que leur formation s'était effectuée
correctement. Comme le montre la figure suivante, il arrivait parfois que les expériences de
différenciation menaient à la formation de EBs qui étaient dans un mauvais état, c'est à dire
qui n'avaient pas une forme sphérique. Ceci était probablement dû à l'utilisation de cellules
ES qui commençaient déjà à différencier comme il a été expliqué à la figure 16. Lorsque les
EBs étaient dans un mauvais état, ceux-ci étaient jetés et une nouvelle expérience de
différenciation était faite.
57
Figure 17
Fig. 17 État du EB après deux jours de suspension.
La photo 1 montre un EB mal formé comparativement à un EB bien formé à la photo 2.
Dans la photo 1, il est possible d'apercevoir que le EB n'est pas sphérique et que plusieurs
cellules ne se sont pas intégrées dans l'agrégat.
58
Puisque la quantité de milieu de culture par EB était très limitée (10 ul), les EBs devaient
être transférés dans un plus grand volume de milieu après deux jours. Ceci était fait en
retirant le d'abord le couvercle du pétri contenant les EB et en stérilisant le contour
intérieur du couvercle avec de l'éthanol 70%. Une fois l'éthanol séché, 10 ml de milieu
complet étaient étendus sur les gouttes contenant chacune un EB. Les EBs se retrouvaient
donc baignés dans une suspension de milieu et pouvaient donc être récupérés à l'aide d'une
pipette. Ces EBs ont alors été transférés dans un pétri à bactérie et mis sous agitation afin
de réduire les risques d'adhérence. Cette agitation devait être assez rapide pour éviter que
les EBs se collent et s'agrègent entre eux. L'incubation des EBs en suspension durait 2
jours et était faite aux conditions habituelles.
Après les deux jours de prolifération sous agitation, la suspension de EBs était récupérée et
transférée sur différents contenants recouverts de gélatine. Une quantité égale de milieu
frais était ensuite ajoutée à la suspension de EB. Pour les différenciations menant à des
greffes, les EBs étaient mis dans des pétris de 6 cm. Pour les analyses de RT-PCR, les EBs
étaient mis en culture dans des plaques 6 puits et pour les analyses en immunofluorescence,
les EBs étaient mis dans des plaques 24 puits ou sur des lames à 4 chambres (« chamber
slides », VWR International, Mississauga, ON, Canada). Les EBs adhères étaient gardés en
culture pendant 22 jours et différentes analyses étaient faites à différents temps.
Les EBs adhères étaient ensuite traités pendant 24 heures au jour 8 avec de la
5'Azacytidine (AzaC, Sigma). L'AzaC était utilisée à une concentration de 10 uM dans le
milieu de culture décrit précédemment. L'AzaC est un analogue chimique de la cytosine.
Durant la transcription et la traduction, l'AzaC qui est incorporée dans l'ADN et dans
TARN inhibe les méthyltransférases causant ainsi la déméthylation de ces régions. Cela
affecte la liaison de protéines régulatrices aux régions de l'ADN et de l'ARN et influe donc
sur l'expression des gènes [100].
Le schéma suivant résume les différentes étapes de la différenciation
décrites
précédemment.
59
Figure 18
Culture de cellules ES non-différenciées
Formation des EBs à l'aide de gouttes suspendues
JOURO
Transfert des EBs pour les cultiver
en suspension
JOUR 2
Transfert des EBs afin qu'ils adhèrent
JOUR 4
Dans un pétri, une plaque 24 puits
ou une lame à chambres
Culture des EBs adhères et analyses
à différents temps
JOUR 4 et +
Fig. 18 Schéma montrant les étapes effectuées lors de la différenciation des cellules
ES en myoblastes. Il est à noter qu'au jour 8 certains des EBs ont reçu un traitement à
l'AzaC.
60
2.3 Animaux
La souris mdx, qui est un modèle de la Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD), a été
utilisée pour les expériences de greffe. Cette souris, qui provient à l'origine de la souche
C57BL10J, possède une mutation ponctuelle dans le gène de la dystrophine qui fait en sorte
que la synthèse de la protéine est terminée prématurément. La souris n'exprime donc pas
une dystrophine fonctionnelle et contrairement à l'humain, le phénotype de la souris est peu
affecté [101]. Les souriceaux normaux utilisés pour les cultures primaires de myoblastes
provenaient quant à eux de la souche C57BL10J.
Les souris ont été achetées du laboratoire Jackson et ont été reproduites dans l'animalerie
du Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université Laval (CRCHUL). Toutes les
expériences effectuées sur les souris ont été approuvées par le comité de protection des
animaux du CRCHUL.
2.4 Isolation de l'ARN et «Reverse Transcription
Polymerase Chain Reaction» (RT-PCR)
Afin de pouvoir analyser l'expression de différents gènes durant la différenciation des
cellules ES, des expériences de RT-PCR ont été effectuées. Le principe de la RT-PCR est le
suivant; il y a d'abord une transcription inverse (RT) qui est faite pour transformer les
ARNs messagers des cellules en ADN. L'ADN ainsi synthétisé est ensuite amplifié par une
réaction de polymerase en chaîne traditionnelle (PCR). Donc, plus il y a d'ARNs messagers
exprimés par la cellule, plus il va y avoir de l'ADN transcrit et par conséquent plus il va y
avoir d'amplification. La RT-PCR est donc une méthode semi-quantitative pour analyser le
niveau d'expression des gènes.
Les ARNs totaux des EBs en différenciation ont été extraits en utilisant le réactif Trizol
(Invitrogen, Carlsbad, CA, États-Unis). Le milieu présent sur les EBs en différenciation a
61
été enlevé et remplacé par 1 ml de Trizol par puit. L'ARN a ensuite été extrait en suivant
les instructions du manufacturier.
Pour pouvoir comparer les niveaux d'expression des gènes entre les cellules différenciées,
il a été nécessaire de doser les ARNs totaux qui avaient été extraits. Le dosage a été fait par
spectrophotométrie et la qualité de l'ARN a été vérifiée avec le rapport de la densité
optique à 260 nm sur la densité optique à 280 nm qui devait être environ de 2.
Même après l'extraction de l'ARN avec le réactif Trizol, il se peut qu'il reste de l'ADN
dans les échantillons. S'il n'est pas enlevé, cet ADN pourrait être amplifié par la réaction
de PCR et ainsi causer des résultats erronés. Pour éviter la contamination de l'ARN avec de
l'ADN, les échantillons d'ARN ont été traités à la DNase I (Roche) selon la recette
suivante : 5 u£ d'ARN avec 1 ul de DNase dans un volume total de 20 ul complété avec de
l'eau. Les échantillons étaient incubés à 37 °C pendant une heure.
Les réactions de transcription inverse ont ensuite été effectuées en utilisant 1' « Omniscript
RT Kit » (Qiagen, Mississauga, Ontario). Chaque réaction était faite en utilisant 1 ug
d'ARN préalablement traité à la DNase (4 ul), le tampon spécifique (1 ul), 0.5 M de dNTP
(2 ul), 1 uM d'oligo dT (1 ul) et 4 unités d'enzyme transcriptase inverse (1 ul) dans un
volume total de 20 (il complété avec de l'eau. Une incubation à 42 °C pendant une heure
permettait la transcription inverse par l'enzyme puis une incubation de 15 minutes à 65 °C
inactivait celle-ci.
L'amplification de l'ADN nouvellement transcrit a été faite en utilisant l'ADN polymérase
Taq (Quiagen) selon la recette suivante : 5 ul de la solution d'ADN transcrit (< 1 ug), le
tampon spécifique (5 ul), 10 mM de chaque dNTP (1 ul), 1 uM de chaque amorce (1 ul) et
2.5 unités de polymérase Taq dans un volume total de 50 ul complété avec de l'eau. Les
séquences des amorces utilisées pour les amplifications par PCR sont données dans le
tableau suivant.
62
p-Actine
GATGACGATATCGCTGCGCTG
MyoD
GCCCGCGCTCCAACTGCTGCTAT
CCTACGGTGGTGCGCCCTCTGC
Myogénine
GGGCCCCTGGAAGAAAAG
AGGAGGCGCTGTGGGAGT
Desimine
AAGGCCAAACTACAGGAGGA
CATGTTGTTGCTGTGTAGCC
Oct-4
GGCGTTCTCTTTGGAAAGGTGTTC
CTCGAACCACATCCTTCTCT
Tableau 3 Séquences des amorces utilisées pour les PCR
La P-actine est une protéine présente de façon constitutive dans les microfilaments.
L'expression de cette protéine a servi de contrôle quantitatif entre les divers échantillons.
Le facteur de transcription MyoD est exprimé chez les myoblastes tandis que la protéine
myogénine est exprimée chez les myoblastes et chez les cellules musculaires fusionnées. La
desmine est quant à elle une protéine musculaire de la famille des filaments intermédiaires
exprimée chez les myoblastes et les cellules fusionnées. Oct-4 est un facteur de
transcription exprimé chez les cellules ES pluripotentes [100].
Pour la réaction de PCR, les échantillons ont d'abord subit une dénaturation initiale de 5
minutes à 95 °C afin séparer les deux brins d'ADN. L'amplification exponentielle de
l'ADN pour les quatre premiers gènes a été effectuée avec 35 cycles composés comme
suit : une minute à 95 °C pour la séparation des brins d'ADN, une minute à 63 °C pour
l'appariement de l'amorce au brin matrice et une minute à 72 °C pour la synthèse du
nouveau brin par la polymérase Taq. L'amplification était terminée par une synthèse finale
des brins à 72 ° C pendant dix minutes. Pour le dernier gène analysé (oct-4), la température
d'appariement de l'amorce était de 55 °C étant donné la composition différente des amorces
utilisées. Les amplifications se faisaient en utilisant le Perkin Elmer Cetus DNA thermal
cycler (Rockville, MD, États-Unis).
63
Pour vérifier l'expression des gènes analysés, les ADN amplifiés étaient séparés par
migration sur un gel d'agarose à 1%. Les bandes étaient visualisées grâce au bromure
d'éthidium et étaient photographiées avec le système d'« Alphalmager® Imaging » (Alpha
Innotech Corporation, San Leandro, CA, États-Unis). Les expériences de RT-PCR ont été
reproduites trois fois.
2.5 Analyses cytologiques en immunofluorescence
Comme il a été vu précédemment, les EBs étaient mis en culture au jour 4 dans des puits de
plaques 24 puits pour les analyses en immunofluorescence de l'expression de desmine ou
sur des lames à 4 chambres pour l'analyse de l'expression de Pax7 et de Myosine Heavy
Chain (MHC). Comme il a été mentionné plus tôt, la protéine Pax7 est exprimée chez les
cellules satellites. La protéine MHC peut quant à elle être retrouvée chez les cellules
musculaires squelettiques et cardiaques [100].
Les cellules étaient distribuées à raison d'environ 8 EBs par puit ou par chambre afin
d'éviter une trop forte confluence. À différents jours durant la différenciation, les EBs ont
été fixés à l'aide d'éthanol 95% ou de paraformaldéhyde 4%, dépendamment des analyses à
faire.
Pour les immunocolorations anti-desmine, les EBs adhères étaient d'abord rincés avec du
HBSS puis fixés à l'éthanol 95% pendant 15 minutes. Les cellules étaient lavées puis
traitées pendant une heure avec la solution de blocage contenant 10% de FBS dans une
solution de « Phosphate buffered saline » (PBS). Le marquage était fait en utilisant un
anticorps anti-desmine fait chez la souris (DAKO, Mississauga, Ontario, Canada).
L'anticorps était utilisé à une dilution de 1/50 dans du PBS contenant 1% de FBS. Les EBs
ont été incubés avec 300 ul de cette solution pendant 1 heure à la température ambiante.
Après avoir été lavées, les cellules ont ensuite été incubées avec l'anticorps secondaire
fluorescent qui était un anti-IgG de souris couplé à l'Alexa 546 (Molecular probes,
Carlsbad, CA). L'anticorps était utilisé à une dilution de 1 :300 dans une solution de PBS
contenant 1% FBS. Les EBs ont été incubés avec 300 (il de solution pendant une heure à la
64
température ambiante. Les EBs ont été lavés et incubés avec une solution de PBS contenant
du 4'-6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI, Invitrogen) à une dilution de 1 : 3000. Ce
dernier colorant servait à marquer les noyaux cellulaires.
Il est bien de noter que des analyses d'immunocoloration anti-desmine ont aussi été faites
sur les cultures primaires de souris afin de déterminer la quantité de myoblastes présents.
Pour les immunocolorations anti-Pax7 et anti-MHC, les EBs adhères étaient d'abord rincés
avec du HBSS puis fixés avec de la paraformaldéhyde (PFA, Sigma) pendant 10 minutes.
Ces cellules étaient ensuite traitées pendant 5 minutes avec une solution de PBS contenant
100 mM de glycine puis lavées trois fois avec une solution de PBS supplémentée en
MgCb et en CaC^. Les cellules étaient ensuite baignées une heure avec la solution de
blocage contenant 5% de FBS, 2 % de « bovine sérum albumin » (BSA) et 0,5% de tritonX dans du PBS. Pour les immunocolorations anti-Pax7, l'anticorps primaire utilisé était un
anti-pax7 IgGl de souris (Developmental Studies Hybridoma Bank, DSHB, Iowa City, IA,
États-Unis) à une dilution de 1 :5 et l'anticorps secondaire était un anti-IgGl de chèvre
couplé à l'Alexa 568 (Invitrogen) utilisé à une dilution de 1 :1000. Pour les
immunocolorations anti-MHC, l'anticorps primaire utilisé était un anti-MHC IgG2B de
souris (DSHB) à une dilution de 1 :5 et l'anticorps secondaire était un anti-IgG2B de
chèvre couplé à l'Alexa 647 (Invitrogen) utilisé à une dilution de 1 :1000. Les temps
d'incubation ainsi que les lavages ont été les mêmes que ceux décrits pour les
immunocolorations anti-desmine. Tous les anticorps utilisés pour ces deux derniers types
d'immunocoloration provenaient du laboratoire de Dr Rudnicki, de l'Université d'Ottawa.
65
2.6 Purification magnétique des myoblastes
Afin de pouvoir purifier les cellules myogéniques dérivées de cellules ES, un anticorps
contre I'a7-intégrine a été testé sur une culture primaire de souris. L' a7-intégrine est une
protéine impliquée dans l'adhésion et elle est présente sur les myoblastes. L'anticorps a été
fait chez le rat et provient du clone CY8. Il a été gracieusement donné par le Dr Kramer, de
Stanford University School of Medicine en Californie. Un anticorps semblable provenant
d'un autre de leur clone (CA5.5) a d'ailleurs servi à la purification de myoblastes provenant
d'une culture primaire [102].
Le but de cette technique était de pouvoir isoler par MACS la population de myoblastes
portant 1' a7-intégrine parmi les cellules totales d'une culture primaire. Ce protocole aurait
ensuite été appliqué sur les cellules ES en différenciation pour en isoler les cellules
différenciées en myoblastes. Pour vérifier si la technique de purification était au point avec
des cellules provenant d'une culture primaire, des immunocolorations anti-desmine ont été
réalisées avant et après la purification pour vérifier le pourcentage de myoblastes dans les
populations purifiées et non purifiées.
Les cultures primaires étaient d'abord décongelées et mises en culture pendant deux jours.
Les cellules étaient ensuite décollées avec de la trypsine et comptées. Ces cellules étaient
incubées sur glace pendant une heure dans du HBSS contenant l'anticorps CY8 à une
dilution de 1:75. Les cellules étaient ensuite lavées avec du HBSS puis centrifugées. Ce
lavage était répété deux autres fois pour s'assurer qu'il ne restait plus d'anticorps primaire
en solution. Les cellules étaient alors incubées sur glace pendant une heure dans du HBSS
contenant un anti-immunoglobuline de rat couplé à de la biotine (DAKO) à une dilution de
1 :100. Trois autres lavages étaient faits et les cellules étaient finalement incubées 15
minutes dans une solution de HBSS contenant un anti-biotine couplé à une bille
magnétique (Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA, Etats-Unis) à une dilution de 1 :20. La
population de cellules étaient lavées trois autres fois avant d'être passée à travers une
colonne ferromagnétique fixée sur un appareil MiniMACS™ (Miltenyi Biotec).
66
Les cellules positives étaient alors retenues dans la colonne grâce à un champ magnétique.
Les cellules négatives étaient éliminées de la colonne en faisant passer trois fois un volume
de HBSS à travers la colonne. La portion de cellules positives étaient alors récupérée en
décrochant d'abord la colonne du MiniMACS™ et en faisant l'élution avec du HBSS. Les
cellules n'étant plus retenues par le champ magnétique pouvaient alors être récupérées.
La figure suivante montre le principe d'une purification cellulaire par MACS.
Figure 19
Anticorps CY8 couplé à
une bille magnétique
Étape 1:
• Myoblaste reconnu par CY8
Attachement de
l'anticorps couplé à
une bille magnétique
Cellule non reconnue par CY8
Étape 2:
Colonne ferromagnétique
Attachement à la colonne
des cellules couplées à la
bille magnétique
Bloc magnétique
. ^ Piston utilisé pour l'élution
des cellules positives
Étape 3:
Élution des cellules
purifiées
i- - ••
Myoblaste purifié
Fig. 19 Technique de purification des myoblastes par MACS.
La première étape de la purification par MACS consiste à incuber les cellules avec un
anticorps spécifique couplé à une bille magnétique. Dans ce cas, c'est l'anticorps CY8 qui
était utilisé et il était relié à une bille magnétique grâce à un anticorps secondaire. La
deuxième étape de la purification consiste à passer les cellules dans une colonne attachée à
un bloc magnétique. Les cellules liées à des billes magnétiques restent alors prises dans la
colonne. La troisième étape s'effectue en détachant la colonne du bloc magnétique et en
éluant les cellules positives.
2.7 Analyses par FACS des cellules ES
Afin de vérifier si les cellules ES non-différenciées exprimaient 1' a7-intégrine, des
analyses par « Fluorescence Activated Cell Sorting » (FACS) ont été effectuées. Les
cellules non-différenciées ont donc été incubées pendant une heure dans du HBSS
contenant l'anticorps CY8 à une concentration de 1 :75. Les cellules ont été lavées trois
fois puis incubées une heure dans du HBSS contenant un anti-immunoglobuline de rat
couplé à de la biotine (DAKO) à une dilution de 1 :100. Après trois lavages, les cellules
étaient alors incubées pendant une demi-heure dans du HBSS contenant de la
Streptavidine-R-Phycoerythrine (Sigma) à une dilution de 1 :100. L'analyse et le calcul du
nombre de cellules positives à CY8 ont été faits avec l'appareil de FACS du centre de
recherche du CHUL.
2.8 Greffe de cellules souches différenciées
Les cellules ES en différenciation ont été greffées au jour 22. Pour ce faire, une suspension
unicellulaire était obtenue en traitant les EBs à la trypsine et en les agitant gentiment à
l'aide d'une pipette de 1000 \û. Après le comptage, les cellules étaient mises en suspension
à une densité de 500 000 cellules par 20 ul dans une solution de HBSS contenant 100 ng de
notexine (Sigma). La notexine est une phospholipase A qui provient du venin d'un serpent
d'Australie[103]. En affectant l'intégrité de la membrane plasmique, elle induit une nécrose
du muscle [104]. Les cellules greffées servent alors à régénérer le muscle endommagé par
la toxine. Il est à noter que les cellules greffées ne sont pas tuées par la notexine puisque
cette enzyme se lie au sarcolemme de la fibre musculaire[105].
Les cellules étaient donc greffées dans le Tibialis antérieur (TA) de souris mdx. Pour éviter
le rejet des cellules greffées, les souris étaient injectées quotidiennement avec du tacrolimus
(gracieusement fourni par Fujisawa Pharmaceutical Co.,Osaka, Japon) à une dose de 2.5
mg/kg.
69
Trois semaines après la greffe, les souris étaient sacrifiées en les laissant quelques minutes
dans un environnement saturé en dioxyde de carbone (CO2). Les TA étaient prélevés et
trempés toute une nuit dans une solution de PBS contenant 30% de sucrose (Sigma). Cette
étape sert à maintenir l'intégrité du muscle lors de la congélation ultérieure diminuant la
formation de cristaux d'eau. Les muscles étaient ensuite enrobés dans un milieu « Shandon
Cryomatrix™ » (Thermo électron corpotation, Ottawa, Ontario, Canada) et congelés dans de
l'azote liquide. Des coupes de 12 uM ont été faites à l'aide d'un cryomicrotome à une
température de -20 °C et ont été mises sur des lames traités à la gélatine. La gélatine est
d'ailleurs essentielle à l'adhésion des coupes de muscles sur la lame. Les lames portant les
coupes de muscles étaient alors conservées à une température de -20 °C.
2.9 Analyses des muscles greffés
2.9.1 Coloration hématoxyline-éosine
Afin de bien observer la physiologie du muscle et ainsi détecter la présence de tumeurs,
des colorations hématoxyline-éosine ont été faites sur les coupes de muscles. Les lames
portant les coupes étaient donc premièrement traitées pendant deux minutes avec une
solution d'hématoxyline standard. Après un lavage de 5 minutes sous l'eau du robinet, les
lames étaient traitées pendant une minute avec une solution d'éosine standard.
Pour être déshydratées et conservées, les coupes ont ensuite été mises successivement dans
l'éthanol 70%, dans l'éthanol 100% et puis dans le toluène. Une solution de toluène ainsi
qu'une lamelle permettaient la bonne conservation des coupes.
70
2.9.2 Analyses histologiques en immunofluorescence
Afin de pouvoir détecter la présence de fibres exprimant la dystrophine dans les muscles
greffés, des analyses histologiques en immunofluorescence ont été effectuées. Les coupes
de muscle reposant sur les lames étaient d'abord décongelées à température pièce pendant
quelques minutes. Une solution de PBS contenant 10% de sérum était alors étendue sur les
coupes pendant une heure afin de prévenir le marquage non-spécifique. Les coupes étaient
lavées une fois avec du PBS puis incubées une heure dans une solution de PBS contenant
un anti-dystrophine de lapin à une dilution de 1 : 3000 et 1% de FBS. Les coupes étaient
lavées trois autres fois puis incubées une heure avec un anti-IgG de lapin conjugué avec
l'Alexa 488 (Invitrogen) à une dilution de 1 :300 dans du PBS contenant 1% de FBS.
2.10 Construction d'un vecteur de résistance
La construction du vecteur permettant la sélection de cellules différenciées en myoblastes a
été faite en plusieurs étapes.
Un plasmide pCR®3.1 (Invitrogen) a été utilisé pour la construction. Le promoteur CMV,
qui permet une expression constitutive des gènes dans les cellules transfectées, a été enlevé
du plasmide à l'aide des enzymes de restriction BSSHII et Nhe I (New England Biolabs,
NEB, Pickering, Ontario, Canada). Les extrémités cohésives du plasmide ont été
transformées en extrémités franches à l'aide de l'enzyme Klenow (Roche). Le plasmide a
par la suite été religué sur lui-même à l'aide de la T4 ligase (NEB).
Le promoteur CMV précédemment enlevé a été par la suite remplacé par le promoteur
MEF2/Myogénine normalement exprimé chez les myoblastes. Ce promoteur a été fourni
par Ilona Skerjanc de l'Université d'Ottawa. MEF2/Myogénine, qui se trouvait
originalement dans un plasmide pCR®2.1, a d'abord été extrait à l'aide des enzymes de
restriction BamH I et Xho I (NEB). Le promoteur a ensuite été clone de manière
71
unidirectionnelle dans le plasmide pCR®3.1 - CMV décrit précédemment. Le fragment a
été ligué au plasmide à l'aide de la T4 ligase.
Le gène de fusion zéoRFP a par la suite été inséré en aval du promoteur MEF2/Myogénine.
ZéoRFP est formé du gène de résistance à la zéocine et du gène de fluorescence « Red
Fluorescent Protein » (RFP). Ce gène de fusion a été obtenu du Dr Strathdee, du John P.
Robarts Research Institute, en Ontario. Pour obtenir ce gène, le plasmide reçu a été
amplifié par PCR à l'aide des amorces suivantes :
ATATCTCGAGATGGCCAAGTTGACCAGTGC
ATATTCTAGACTACAGGAACAGGTGGTGGC
Ces amorces permettaient l'amplification de ZéoRFP et permettaient aussi l'ajout des sites
de restrictions Xho I et Xba I aux extrémités du gène. Le fragment était donc amplifié,
digéré avec Xho I et Xba I puis clone de manière unidirectionnelle dans le plasmide
pCR®3.1 - CMV + MEF2/Myogénine. Le fragment était ligué au plasmide à l'aide de la T4
ligase.
La figure suivante représente les éléments principaux de la construction décrite
précédemment. L'utilisation de ce vecteur est aussi brièvement expliquée.
72
Figure 20
s—|MI
pCIf 3.1 - CMV
Fig. 20 Construction du plasmide permettant la sélection des cellules différenciées en
myoblastes.
Suite à la transfection, les cellules qui ont reçu le plasmide peuvent être sélectionnées à
l'aide de la néomycine. En effet, le promoteur SV40 permet l'expression constitutive du
gène de résistance à la néomycine chez toutes les cellules qui ont reçu le plasmide.
Lorsque les cellules transfectées se différencieraient ensuite en myoblastes, la présence du
promoteur MEF2/Myogénine permettrait l'expression du gène ZéoRFP. Les cellules ainsi
différenciées deviendraient donc rouges et résistantes à la zéocine. L'ajout de zéocine au
milieu de culture permettrait donc la sélection des cellules différenciées en myoblastes.
2.11 Transfection des cellules ES
Les cellules ES CCE non-différenciées ont été transfectées avec le plasmide pCR®3.1 CMV + MEF2/Myogénine. Pour voir l'efficacité de la méthode, un plasmide portant le
gène de fluorescence verte (GFP) a aussi été transfecté en parallèle chez la même lignée de
cellules.
Pour les transfections, les cellules ES étaient mises en culture de façon habituelle dans des
puits de plaque 6 puits jusqu'à ce qu'elles atteignent une confluence d'environ 40%. Le
milieu était alors remplacé par un milieu semblable ne contenant pas de sérum et additionné
de 10 ul lipofectamine (Invitrogen) et de 4 ug d'ADN à transfecter. Les cellules ont été
laissées 6 heures dans ce milieu aux conditions d'incubation habituelles. Le milieu a par la
suite été remplacé par du milieu frais. Il est à noter qu'à cause de la sensibilité des cellules,
l'incubation avec la lipofectamine dans un milieu sans sérum ne s'est faite que pour 6
heures seulement au lieu d'une nuit complète.
L'efficacité de la transfection a pu être évaluée en observant la fluorescence verte des
cellules transfectées avec le plasmide contrôle.
74
3. Résultats
3.1 Différenciation des cellules ES en myoblastes
3.1.1 Sans la formation de EB
Les premiers essais de différenciation étaient faits sans passer par la formation de corps
embryonnaires. Les résultats étaient alors non concluants puisque l'ajout de facteurs de
croissance au milieu de culture n'augmentait pas de façon reproductive le pourcentage de
cellules exprimant la desmine. Il n'était donc pas possible de d'obtenir de façon
reproductible des myoblastes dérivés de cellules ES de cette façon. De plus, cette façon de
différencier les cellules était peu pratique puisque les cellules avaient tendance à mourir et
proliféraient peu. Les cellules différenciées avaient tendance à ne pas adhérer à un pétri de
culture après un passage cellulaire.
3.1.2 Avec la formation de EB
Plusieurs équipes travaillant sur la différenciation des cellules ES passent par la formation
de corps embryonnaires (EB) pour obtenir des cellules différenciées. Des mises au point
ont donc été faites afin de former des corps embryonnaires pour ainsi augmenter le
pourcentage de cellules ES se différenciant en myoblastes.
Pour les premiers essais de différenciation en passant par la formation de corps
embryonnaires, aucun facteur de croissance n'était ajouté au milieu. Seul le LIF, qui
empêche la différenciation des cellules ES, était enlevé du milieu de culture.
La formation de corps embryonnaires a donc premièrement permis d'obtenir des cellules
qui proliféraient très bien et qui n'avaient pas tendance à mourir, contrairement à la
méthode de différenciation précédente. Les interactions entre les cellules ainsi que les
facteurs sécrétés à l'intérieur du EB sont probablement les raisons pour lesquelles les
cellules en différenciation avaient un taux de mortalité peu élevé.
Les immunocolorations anti-desmine des cellules différenciées en passant par la formation
de corps embryonnaires ont permis d'observer des cellules différenciées en cellules
myogéniques. Comme le montre la figure ci-dessous, quelques régions des EBs en
différentiation exprimaient fortement la desmine. Cette différenciation était donc spontanée
puisque aucun facteur de croissance n'avait été ajouté au milieu pour orienter la
différenciation.
76
Figure 21
Desmine
DAPI
Fusion
Fig. 21 Différenciation spontanée des ES en cellules myogéniques.
La différenciation des cellules ES en passant par la formation de EB permet d'obtenir des
cellules myogéniques spontanément. L'immunocoloration révèle l'expression de desmine
dans quelques parties des EBs. La confluence des cellules est mise en évidence à l'aide du
DAPI.
77
3.1.3 Augmentation du pourcentage de cellules ES différenciées
en cellules myogéniques
Puisque un faible pourcentage de cellules myogéniques était obtenu par la formation de EB,
il fallait trouver un moyen d'augmenter ce pourcentage avec différents produits. Les
facteurs de croissance nommés précédemment, IGF-1 et HGF, ont d'abord été mis dans le
milieu de culture des EBs en différenciation. L'ajout de ces facteurs n'a cependant pas
augmenté le pourcentage de desmine dans les cellules en différenciation.
L'agent déméthylant AzaC a alors été testé sur les cellules. Les EBs, traités pendant 24
heures avec l'AzaC, ont montré une plus forte différenciation en cellules myogéniques. La
figure suivante montre premièrement que l'AzaC augmente l'expression de desmine dans
les EBs à différents temps durant la différenciation.
Figure 22
Temps
Condition
DAPI
Fusion
Contrôle
J9
Azacytidine
Contrôle
J12
Azacytidine
Contrôle
J14
Azacytidine
Contrôle
J16
Azacytidine
Fig. 22 Effet de l'AzaC sur l'expression de desmine.
Les immunocolorations anti-desmine montrent que le traitement des EBs avec l'AzaC
augmente l'expression de desmine à différents jours. La coloration au DAPI montre les
niveaux comparables de confluence entre les contrôles et les cellules traitées.
L'AzaC a aussi permis d'augmenter l'expression de MHC dans les cellules en
différenciation. La figure suivante montre l'augmentation du pourcentage de cellules
exprimant MHC à différents temps durant la différenciation.
Il est à noter qu'il n'y a pas eu de détection de la protéine Pax7. La différenciation des
cellules ES avec ou sans traitement à l'AzaC n'emmènerait donc pas la formation de
cellules satellites.
80
Figure 23
Jour de la
différenciation
Sans AzaC
Avec AzaC
J9
Jll
J14
J25
Fig. 23 Effet de l'AzaC sur l'expression de MHC.
Les immunocolorations anti-MHC fusionnées avec les colorations au DAPI montrent que le
traitement avec l'AzaC augmente le pourcentage de cellules exprimant MHC. À l'exception
du jour 11, il y avait une plus grande expression de MHC dans les cellules traitées à l'AzaC
que dans les cellules contrôles non traitées.
81
L'expression de desmine et de MHC, comme mentionné plus tôt, n'est pas spécifique aux
cellules du muscle squelettique. Les cellules pourraient avoir différenciées
en
cardiomyocytes et exprimer ces mêmes protéines. Il a alors été nécessaire d'analyser
l'expression d'autres gènes spécifiques aux myoblastes pour confirmer la présence de ce
type de cellules dans les cultures en différenciation.
La figure suivante montre les résultats obtenus par RT-PCR concernant l'expression de
MyoD, myogénine et desmine. L'expression du gène oct-4, exprimé chez les cellules ES
non-différenciées, a aussi été analysé. Trois types de cellules différents étaient d'abord
utilisés comme contrôle d'amplification d'ADN. Les cellules NIH 3T3, une lignée de
fibroblastes, servaient de contrôle négatif pour l'expression des gènes myogéniques. Les
cellules C2C12, qui sont une lignée de myoblastes, servaient quant à elles de contrôle
positif pour les trois gènes myogéniques. La lignée de cellules ES non-différenciées, qui
servait à démarrer les expériences de différenciation, a été utilisée comme contrôle positif
pour le gène oct-4. Ce contrôle cellulaire permettait aussi de confirmer qu'aucun des gènes
myogéniques n'était exprimé avant le début de la différenciation.
L'expression de MyoD et myogénine à partir du jour 12 de la différenciation confirme
premièrement qu'il est possible d'observer la présence de cellules myogéniques spécifiques
au muscle squelettique dans les EBs. Il est aussi possible d'apercevoir que l'expression du
gène de pluripotence oct-4 cesse à partir du jour 19 chez les cellules non traitées à l'AzaC
et à partir du jour 22 chez les cellules traitées à l'AzaC.
Il est finalement possible de vérifier que le traitement des cellules à l'AzaC augmente bien
l'expression de la desmine. Ce même traitement ne semble cependant pas affecter de façon
significative l'expression des autres gènes myogéniques.
K2
Figure 24
u
Desmin
Myogén
MyoD
Oct-4
P-Actin
Avec AzaC
<u
Desmin
.S
Myogén
MyoD
P-Actin
Sans AzaC
I
T
C2C12
NIH 3T3
Cellules
ES
EB J9
EB J12
EBJ19
EB J22
Fig. 24 Effet de l'AzaC sur l'expression de différents gènes.
Les différents contrôles cellulaires utilisés confirment d'abord la validité de la méthode. La
lignée cellulaire de myoblastes C2C12 exprime les gènes MyoD, myogénine et desmine et
elle n'exprime pas le gène de pluripotence oct-4. La lignée de fibroblastes NIH 3T3
n'exprime aucun des gènes précédemment nommés. Les cellules ES ayant servi aux
expériences de différenciation n'expriment pas les gènes myogéniques et expriment le gène
oct-4. Les résultats obtenus confirment donc que le traitement des EBs à l'AzaC augmente
l'expression de desmine. Ce même traitement ne semble cependant pas influencer
l'expression des autres gènes myogéniques testés.
83
3.2 Purification des cellules ES différenciées en cellules
myogéniques
Les résultats précédents démontraient clairement la présence de cellules myogéniques dans
les cultures en différenciation. Il fallait donc trouver un moyen efficace de purifier ces
cellules différenciées.
Des essais de purification ont d'abord été faits avec CY8, un anticorps reconnaissant
I'alpha7-intégrine présente sur les myoblastes. Afin de mettre au point une méthode de
purification efficace avec cet anticorps, des tests ont été faits avec des cellules de culture
primaire de souris. Le but de la mise au point était de purifier les myoblastes présents dans
une culture primaire mixte de souris.
La technique de MACS permettait d'obtenir une très bonne purification des myoblastes
présents dans une culture primaire. En effet, comme le montre la figure suivante, des
immunocolorations anti-desmine montraient que la population initiale de la culture
primaire comprenait environ seulement 30% de myoblastes. Après la purification par
MACS, la population de myoblastes dans la culture était de 94%. Le 6% de cellules
n'exprimant pas la desmine dans la population purifiée provient probablement de cellules
négatives restées coincées dans la colonne magnétique.
Cette méthode de purification par MACS, mise au point à l'aide d'une culture primaire de
souris, est donc très efficace pour purifier les cellules portant I'a7-intégrine.
Figure 25
Cellules nonpurifïées
Cellules
purifiées
Fig. 25 Purification des myoblastes provenant d'une culture mixte de souris.
La purification par MACS à l'aide de l'anticorps CY8 a permis une bonne purification des
myoblastes présents dans la culture primaire de souris. L'immunocoloration anti-desmine
ainsi que la coloration au DAPI ont permis de calculer le pourcentage de myoblastes. Avant
la purification, il y avait seulement 30% de myoblastes dans la culture mixte. La
purification par MACS a permis d'obtenir une culture de myoblastes pure à 94%.
85
Des essais de purification de myoblastes à l'aide de cette méthode ont alors été faits sur les
cellules ES en différenciation. L'anticorps CY8 allait théoriquement se fixer sur les cellules
différenciées en myoblastes pour permettre la purification de celles-ci.
Les essais se sont par contre révélés peu concluants puisque premièrement peu de cellules
purifiées pouvaient être obtenues. En effet, des analyses préliminaires par FACS avaient
révélé que 25 % des cellules exprimaient I'a7-intégrine au jour 22 de la différenciation. Or,
la purification de ces cellules par MACS au même jour de la différenciation ne donnait
seulement que 1 % pourcent de cellules positives à I'a7-intégrine. Ce faible pourcentage de
cellules positives était probablement dû à la faible expression de 1' I'a7-intégrine par les
cellules différenciées. Par exemple, une cellule portait peut- être assez d'a7-intégrines pour
être détectée par FACS mais pas assez de cette intégrine pour rester prise dans la colonne
magnétique.
Un autre problème majeur était que les quelques greffes faites à l'aide de ces cellules
purifiées menaient à la formation de tumeurs. Cela signifiait donc qu'il restait des cellules
pluripotentes non-différenciées parmi les cellules purifiées.
Des analyses par FACS ont donc été faites durant la différenciation pour observer
l'expression de I'a7-intégrine sur les cellules différenciées. Le but de ces analyses était de
trouver le moment idéal pour purifier les cellules différenciées, c'est-à-dire cibler le
moment où l'expression de I'a7-intégrine était à son maximum.
Le problème de purification avec CY8 a alors bien été mis en évidence. L'analyse par
FACS au jour 0 de la différenciation a permis de constater qu'une partie des cellules ES
non-différenciées exprime I'a7-intégrine. La figure suivante montre donc que 20% des
cellules non-différenciées expriment I'a7-intégrine. Cela expliquait donc pourquoi les
greffes de cellules différenciées purifiées avec CY8 causaient des tumeurs dans les
muscles.
86
Figure 26
Fig. 26 Expression de I'a7-intégrine sur les cellules ES non-différenciées.
L'analyse par FACS montre que 20% des cellules ES non-différenciées expriment I'a7intégrine. La courbe foncée représente le contrôle isotypique tandis que la courbe pâle
représente les cellules marquées avec CY8.
S7
3.3 Alternative à la purification par MACS des cellules
différenciées
Puisque la purification par MACS était impossible à réaliser, une alternative à cette
purification a été tentée. Elle consistait en effet à laisser les cellules en culture assez
longtemps pour qu'il ne reste plus de cellules indifférenciées dans les cellules en culture.
La greffe de ces cellules non purifiées, s'il ne reste plus de cellules indifférenciées, ne
mènerait donc pas à la formation de tumeurs dans les muscles.
La greffe de ces cellules a donc été fait au jour 22. Ce jour a été choisi puisque les
expériences de RT-PCR décrites précédemment montraient qu'il n'y avait plus
d'expression de oct-4 à ce jour de la différenciation.
3.4 Greffe des cellules différenciées non purifiées chez la
souris mdx
Pour vérifier si les cellules différenciées mais non purifiées avaient réussi à former des
fibres musculaires exprimant de la dystrophine sans causer la formation de tumeurs, les
coupes de muscles greffés ont été analysées.
Les colorations hématoxyline-éosine ont d'abord clairement montré qu'il y avait eu
formation de tumeurs dans les muscles greffés. Même si les celles étaient laissées en
différenciation plus longtemps, certaines cellules pluripotentes devaient être encore
présentes et ont permis la formation de ces tumeurs. La figure suivante montre une tumeur
observée dans un des muscles greffés.
Figure 27
Fig. 27 Tumeur observée dans un muscle greffé avec des cellules ES différenciées mais
non purifiées.
La présence de quelques cellules pluripotentes dans les cellules non purifiées a quand
même entraîné la formation d'une tumeur massive dans le muscle greffé.
89
Malgré la formation de tumeurs par les cellules différenciées, il a été possible d'observer la
présence de fibres exprimant la dystrophine dans les muscles greffés. Cela montre donc que
les cellules souches embryonnaires peuvent fusionner avec les fibres de l'hôte pour former
des fibres hybrides et ainsi régénérer la dystrophine. L'analyse histologique en
immunofiuorescence sur la figure suivante montre les fibres exprimant la dystrophine
obtenues chez la souris mdx. Il est à noter que peu de fibres positives ont été comptées
comparativement aux greffes de myoblastes habituelles. Des mises au point restent donc à
faire pour augmenter le succès de greffe.
90
Figure 28
Fig. 28 Immunocoloration anti-dystrophine d'un muscle greffé.
La photo montre qu'il y a eu expression de la dystrophine grâce à la fusion des cellules
greffées aux fibres de l'hôte.
91
5.5 Transfeetion des cellules ES avec vecteurs de
résistance
Puisque les cellules non purifiées induisaient la formation de tumeurs lorsque greffées, un
moyen de purification devait être mis au point. La construction du plasmide
pCR®3.1 - CMV + MEF2/Myogénine pourrait donc permettre une sélection des cellules
différenciées en myoblastes.
Comme il avait été décrit plus tôt, les cellules ES non-différenciées ont d'abord été
transfectées avec le plasmide en utilisant de la lipofectamine. Une transfeetion contrôle
avec un plasmide portant le gène GFP sous le contrôle du promoteur CMV a été faite pour
s'assurer que la transfeetion avait été efficace. Il était en effet impossible de vérifier le taux
de transfeetion avec le plasmide pCR®3.1 - CMV + MEF2/Myogénine puisqu'il ne
contient pas de gène de fluorescence exprimé constitutivement dans les cellules
transfectées. La figure suivante montre la transfeetion efficace des ES mis en évidence par
la transfeetion du plasmide contrôle contenant le gène GFP.
Figure 29
Fig. 29 Transfection contrôle avec plasmide GFP.
Le haut taux de fluorescence verte dans les cellules ES transfectées avec le plasmide GFP
montre l'efficacité de la transfection en utilisant la lipofectamine comme agent de
transfection.
93
Les cellules ES sélectionnées avec le G418 ont subi plusieurs passages afin d'éliminer les
cellules qui auraient commencé à différencier. Les cellules ES transfectées ont donc été
cultivées afin d'obtenir une réserve de cellules ES non-différenciées
modifiées
génétiquement. De plus, des observations au microscope ont permis de voir que
les
colonies de cellules ES non-différenciées n'expriment pas le gène ZéoRFP (puisqu'elles ne
fluorescent pas en rouge), ce qui veut donc dire que le promoteur n'est pas activé dans ces
cellules non-différenciées. Comme le montre la figure suivante, seules quelques cellules
ayant différencié spontanément ont exprimé ZéoRFP.
Des expériences sont présentement en cours afin de tester l'efficacité de cette méthode de
sélection génétique.
94
Figure 30
Fig. 30 Expression du transgène ZéoRFP observée chez les cellules ES transfectées.
Une cellule qui s'est différenciée spontanément dans la culture de cellules ES exprime
RFP. Cette cellule s'est donc probablement différenciée spontanément en cellule
myogénique.
Discussion
Plusieurs expériences de greffes de myoblastes pour le traitement de la DMD ont été
publiées à travers le monde. Le nombre d'expériences de greffes de myoblastes dérivés de
cellules souches embryonnaires est cependant très restreint. Le seul article concernant ce
type de greffe a été publié en juillet 2005 [106]. Cette équipe de recherche américaine avait
cultivé des cellules ES murines avec des précurseurs de cellules musculaires. La greffe de
ces cellules à des souris mdx avait permis la formation de quelques fibres exprimant la
dystrophine. Les résultats publiés par cette équipe de recherche étaient cependant peu
satisfaisants vu la très faible expression de dystrophine dans les muscles greffés.
Le but global des expériences présentées dans ce mémoire était donc de permettre
l'expression élevée de dystrophine dans le muscle de souris dystrophiques grâce à la greffe
de cellules dérivées de cellules ES. Pour ce faire, il fallait donc premièrement trouver un
moyen d'augmenter le pourcentage de cellules différenciées en myoblastes. Il fallait en
suite réussir à purifier la population de cellules différenciées en myoblastes. Il fallait
ensuite greffer ces cellules différenciées à des souris dystrophiques afin d'observer
l'expression de dystrophine.
Tout d'abord, pour augmenter in vitro le pourcentage de cellules qui se différenciaient en
myoblastes, un traitement des EBs à l'azacytidine a été fait. Cet agent, reconnu pour induire
une différenciation vers la lignée du mésoderme, a en effet permis une augmentation de
cellules différenciées en cellules myogéniques. L'expression de MHC et de desmine, des
protéines présentes chez les cellules myogéniques, était augmentée chez les cellules traitées
à l'AzaC. Ces deux protéines sont cependant présentes tant chez les cardiomyocytes que
chez les myoblastes. Il n'était donc pas certain que des myoblastes se trouvaient dans la
culture en différenciation.
De plus, une augmentation de la différenciation
en
cardiomyocytes dans les cellules en culture n'était pas nécessairement souhaitable. En
effet, aucune étude n'a jusqu'à maintenant démontré que la greffe de cardiomyocytes dans
un muscle squelettique pourrait aider à la régénération de celui-ci. De plus, contrairement
aux myoblastes, les cardiomyocytes ne peuvent fusionner ensemble. Ces cellules ne
pourraient donc probablement pas fusionner avec les fibres du receveur et ne seraient donc
pas aptes à permettre l'expression de dystrophine.
Afin de vérifier s'il y avait bien une différenciation en myoblastes, des expériences de RTPCR ont été faites. L'expression des gènes MyoD, myogénine et desmine a été analysée.
Les gènes codant pour MyoD et myogénine ne sont pas exprimés chez les cardiomyocytes,
ce qui permettait de voir la présence ou non de myoblastes. L'expression du gène de
pluripotence oct-4, présent chez les cellules ES non différenciées, a aussi été analysée. Ce
dernier permettait de dire si la différenciation était complète ou s'il restait des cellules
pluripotentes dans la culture. L'expression de MyoD et de myogénine après plusieurs jours
de culture a d'abord prouvé qu'il y avait eu une différenciation des cellules ES en
myoblastes. Le traitement des EBs à l'AzaC n'a cependant pas influencé le niveau
d'expression de ces deux gènes. L'analyse de d'autres gènes spécifiques aux myoblastes
pourrait donc permettre de voir si l'AzaC augmente ou non le pourcentage de cellules
différenciées en myoblastes. Les analyses de RT-PCR ont aussi permis de voir qu'au jour
22, les cellules traitées à l'AzaC n'exprimaient plus le gène de pluripotence oct-4. Ce
résultat a d'ailleurs permis de supposer qu'au jour 22, il ne restait plus de cellules capables
de former des tumeurs.
Puisque les expériences de RT-PCR montraient qu'il y avait bel et bien présence de
myoblastes dans les cultures en différenciation, des essais de purification de ces cellules ont
été tentés. Une technique de purification par MACS utilisant I'a7-intégrine comme protéine
de sélection a été effectuée. Cette méthode de purification s'était d'ailleurs montrée très
efficace pour la purification de myoblastes présents dans une culture primaire.
Malheureusement, cette technique n'a pas pu être appliquée pour la purification des cellules
différenciées en myoblastes puisque une partie de la population de cellules ES non
différenciées exprimaient I'a7-intégrine.
97
La purification des cellules différenciées n'étant pas possible, une alternative à celle-ci a été
tentée. Des greffes de cellules non purifiées ont été effectuées afin de voir si les myoblastes
ou d'autres cellules présentes dans la population de cellules différenciées pouvaient quand
même se fusionner avec les fibres musculaires de l'hôte pour ainsi permettre l'expression
de dystrophine. Les cellules ont été greffées au jour 22 de la différenciation puisque les
expériences de RT-PCR avaient montré que le gène oct-4 n'était plus exprimé. Ces cellules
ont donc en effet été capables de former des fibres exprimant la dystrophine dans les
muscles greffés. Malheureusement, les cellules non purifiées greffées ont aussi permis la
formation de tumeurs même si le gène oct-4 n'était pas exprimé. L'expression de oct-4 par
les quelques cellules pluripotentes restantes était donc peut-être trop faible pour être
détectée par RT-PCR avec les conditions utilisées. La présence de telles tumeurs a donc
confirmé qu'une purification est essentielle lorsque des cellules ES sont utilisées comme
source initiale de cellules.
Afin de pouvoir sélectionner les cellules différenciées en myoblastes et ainsi éviter la
formation de tumeurs, une lignée de cellules ES murine a été modifiée génétiquement. Lors
de différenciations ultérieures, ces modifications permettront aux cellules d'exprimer le
gène ZéoRFP lorsqu'elles seront différenciées en myoblastes. Les cellules différenciées
seront alors fluorescentes rouges et résistantes à l'antibiotique zéocine. Lors de la
différenciation, des observations quotidiennes des cellules pourront être faites pour vérifier
l'expression de fluorescence rouge. Lorsque l'expression sera à son maximum,
l'antibiotique zéocine pourra alors être appliqué afin de sélectionner les cellules
différenciées en myoblastes.
Cette technique de purification par modification génétique demandera la formation et la
vérification de plusieurs clones différents. En effet, il se peut que l'intégration nonspécifique du plasmide cause des changements dans le génome qui seraient nuisibles pour
les cellules ou pour l'organisme qui sera greffé avec ces cellules. La fabrication de
plusieurs clones permettra de choisir une cellule qui a intégré le plasmide à un bon endroit,
c'est-à-dire qu'elle est ni tumorigène et qu'elle conserve toutes ses fonctions habituelles.
98
Lorsque un moyen de purification des cellules différenciées en myoblastes sera mis au
point, il sera possible d'améliorer les différentes étapes de la thérapie afin d'augmenter le
succès de greffe. Par exemple, d'autres produits pourront être appliquées sur les cellules ES
lors de la différenciation afin d'augmenter le pourcentage de myoblastes. De plus, les
paramètres de greffe pourront être optimisés afin d'augmenter le nombre de fibres
exprimant la dystrophine (nombre de cellules greffés, trajectoires d'injection, etc.).
99
Conclusion
La dystrophie musculaire de Duchenne pourrait être traitée par la thérapie cellulaire. Cette
thérapie, qui consiste en l'injection de myoblastes dans le muscle dystrophique, a
cependant plusieurs désavantages. Le rejet des cellules greffées par le système immunitaire
de l'hôte est l'un des principaux problèmes. Un protocole de tolérance immunologique
pourrait donc être développé grâce à l'utilisation des cellules souches embryonnaires. Les
cellules ES seraient premièrement différenciées en cellules souches hématopoïétiques puis
greffées à un patient dystrophique. La même lignée de cellules ES serait par la suite
différenciée en myoblastes. Ces myoblastes seraient alors greffés au patient dystrophique
ayant un système immunitaire chimérique. Les myoblastes dérivés de cellules ES ne
seraient donc pas rejetés par l'hôte et suite à leur fusion avec les fibres musculaires de
l'hôte ils permettraient l'expression de la dystrophine.
Des expériences concernant la différenciation des ES en myoblastes ont été décrites dans ce
mémoire. Il a été d'abord possible d'augmenter le pourcentage de différenciation des
cellules ES en cellules myogéniques grâce à l'utilisation d'Azacytidine. La greffe de ces
cellules différenciées a aussi permis l'expression de dystrophine dans les muscles de souris
dystrophiques. Ceci confirme donc la possibilité d'utiliser la greffe de cellules dérivées de
cellules ES pour le traitement de la DMD. La construction d'un plasmide permettant la
sélection des cellules différenciées en myoblastes a été faite. Des expériences sont
présentement en cours afin de vérifier la fonctionnalité de cette construction.
Lorsque la sélection des cellules différenciées en myoblastes sera bien contrôlée, il sera
possible d'évaluer le potentiel réel de ce type de cellules pour le traitement de la DMD. La
différenciation des cellules ES en cellules myogéniques sera ensuite combinée à la
différenciation en cellules souches hématopoïétiques afin de mettre au point le protocole de
tolérance immunologique décrit dans le mémoire. Les techniques pourront alors être
reproduites sur des cellules souches humaines afin de traiter ultérieurement des patients
atteints de la DMD.
100
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