Identification de mutations inactivatrices de RPS6KA3 dans
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Identification de mutations inactivatrices de RPS6KA3 dans les carcinomes hépatocellulaires Laura Pelletier, Cécile Guichard, Sandrine Imbeaud et Jessica Zucman-Rossi Inserm U674, Université Paris Descartes Conflits d’intérêts Pas de conflit d’intérêts Identification de mutations dans RPS6KA3 par séquençage d’exome de CHC • Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est la 3ème cause de mort par cancer dans le monde et la tumeur la plus fréquente issue de la transformation maligne d’hépatocytes. • La connaissance des altérations génétiques présentes dans les CHC permet d’identifier des nouvelles cibles thérapeutiques. • Dans notre laboratoire, 24 CHC ont été analysés par séquençage d’exome (Guichard et al., Nat Genet 2012). • 4 CHC présentaient des mutations somatiques dans le gène RPS6KA3. RPS6KA3 • Gène situé sur le Chromosome X. • Code la protéine RSK2 (Ribosomal protein S6 Kinase), Sérine/thréonine kinase impliquée dans la voie RAS/MEK/ERK. Hormones Neurotransmetteurs Cytoplasme Noyau une Facteurs de croissance • RSK2 peut phosphoryler de nombreux substrats impliqués dans différents processus cellulaires. • La famille des RSK est composée de 4 isoformes (RSK1-4) • Pas de mutation somatique récurrente de RPS6KA3 identifiée dans les cancers jusqu’ici. Mutations germinales de RPS6KA3 dans le syndrome de Coffin-Lowry • Des mutations inactivatrices germinales de RPS6KA3 ont été associées au syndrome de Coffin-Lowry, un retard mental lié au chromosome X (Trivier et al., Nature 1996). • L’hippocampe et les muscles squelettiques des souris rps6ka3-/présentent une augmentation de la phosphorylation de ERK 1/2, en accord avec un possible rétrocontrôle négatif de RSK2 sur la voie RAS/MEK/ERK (Schneider et al., J. Neurochem 2011 ; Dufresne et al., Mol. Cell. Biol. 2001). Objectif et Méthodes • Objectif : Caractériser les mutations de RPS6KA3 dans les CHC . Comprendre l’implication des mutations de RPS6KA3 dans la carcinogenèse hépatique. • Méthodes : Criblage de RPS6KA3 (22 exons) dans 125 CHC et 24 lignées cellulaires de cancer du foie. Etudes fonctionnelles par inhibition de l’expression de RPS6KA3 par siRNAs dans 5 lignées cellulaires (PLC/PRF/5, Huh7, HepaRG, HepG2, Huh6). Etude des voies de signalisation (dont RAS/MEK/ERK) Spectre de mutations de RPS6KA3 dans les CHC • • 12 CHC mutés (14 mutations somatiques) sur 125 CHC criblés (9,6%) 1/24 lignées cellulaires hépatiques (Hep3B) Délétion : 1 lignée cellulaire D’après Guichard et al., Nat Genet, 2012 Spectre de mutations de RPS6KA3 dans les CHC • • 12 CHC mutés (14 mutations somatiques) sur 125 CHC criblés (9,6%) 1/24 lignées cellulaires hépatiques (Hep3B) Stop : 3 CHC Frameshift : 2 CHC Site d’épissage : 2 CHC Délétion : 1 lignée cellulaire D’après Guichard et al., Nat Genet, 2012 Spectre de mutations de RPS6KA3 dans les CHC • • 12 CHC mutés (14 mutations somatiques) sur 125 CHC criblés (9,6%) 1/24 lignées cellulaires hépatiques (Hep3B) Stop : 3 CHC Substitution : 7 CHC Frameshift : 2 CHC Site d’épissage : 2 CHC Délétion : 1 lignée cellulaire D’après Guichard et al., Nat Genet, 2012 Spectre de mutations de RPS6KA3 dans les CHC • • 12 CHC mutés (14 mutations somatiques) sur 125 CHC criblés (9,6%) 1/24 lignées cellulaires hépatiques (Hep3B) Substitution : 7 CHC Stop : 3 CHC Frameshift : 2 CHC Site d’épissage : 2 CHC Délétion : 1 lignée cellulaire Mutations inactivatrices D’après Guichard et al., Nat Genet, 2012 Suppresseur de tumeurs Caractéristiques des CHC mutés RPS6KA3 • 11/12 CHC mutés RPS6KA3 ont été développés sur foie noncirrhotique (p=0.05). • Les mutations RPS6KA3 sont associées aux mutations AXIN1 (p=0.02) et à l’activation de la voie Wnt/b-caténine. D’après Guichard et al., Nature Genetics, 2012 Inhibition de RPS6KA3 in vitro Inhibition de l’expression de RPS6KA3 par transfection de 3 siRNAs dans 5 lignées d’hépatocytes tumoraux (PLC/PRF/5, Huh7, HepaRG, HepG2, Huh6) PLC/PRF/5, transfection de 2 nM de siRNA pendant 72h RSK-2 Actine-b RPS6KA3 siRNA 3 RPS6KA3 siRNA 2 siRNA (2 nM) RPS6KA3 siRNA 1 Western Blot Control siRNA RT-PCRq mock • Inhibition de RPS6KA3 in vitro • Augmentation de la phosphorylation de ERK dans la lignée PLC/PRF/5 transfectée avec 3 siRNAs ciblant RPS6KA3. RPS6KA3 3 siRNA RPS6KA3 2 siRNA RPS6KA3 1 siRNA Control siRNA siRNA (2 nM) mock PLC/PRF/5 RSK-2 Phospho ERK1/2 ERK1 ERK2 ERK 1/2 ERK1 ERK2 Actine-b Inhibition de RPS6KA3 in vitro • Augmentation de la phosphorylation de ERK renforcée quand la voie RAS/MEK/ERK est stimulée par un traitement à l’EGF de 10 min. PLC/PRF/5 EGF RPS6KA3 3 siRNA RPS6KA3 2 siRNA RPS6KA3 1 siRNA Control siRNA mock RPS6KA3 3 siRNA RPS6KA3 2 siRNA RPS6KA3 1 siRNA Control siRNA siRNA (2 nM) mock + EGF RSK-2 Phospho ERK1/2 ERK1 ERK2 ERK 1/2 ERK1 ERK2 Actine-b Inhibition de RPS6KA3 in vitro Augmentation inhibitée en présence de l’inhibiteur de MEK AZD6244. RPS6KA3 3 siRNA RPS6KA3 2 siRNA RPS6KA3 1 siRNA mock RPS6KA3 3 siRNA RPS6KA3 2 siRNA RPS6KA3 1 siRNA Control siRNA mock siRNA (2 nM) Control siRNA + AZD6244 (Selumetinib) PLC/PRF/5 mock • RSK-2 Phospho ERK1/2 ERK1 ERK2 ERK 1/2 ERK1 ERK2 Actine-b Conclusions • Nous avons identifié pour la première fois des mutations inactivatrices récurrentes de RPS6KA3 dans des carcinomes hépatocellulaires. • Environ 10% des CHC sont mutés. Ces CHC se développent essentiellement sur foie non-cirrhotique et en association avec les mutations AXIN1. • Les lignées cellulaires hépatocytaires transfectées avec des siRNAs ciblant RPS6KA3 montrent une augmentation de la phosphorylation de ERK. • La voie de signalisation Ras/MEK/ERK pourrait être une nouvelle cible thérapeutique pour le traîtement des CHC mutés RPS6KA3. Remerciements Inserm U674, Paris Jessica Zucman-Rossi Cécile Guichard Sandrine Imbeaud Giuliana Amaddeo Ichrafe Ben Maad Anais Boulai Qian Cao Julien Calderaro Gabrielle Couchy Jean-Charles Nault Guillaume Mocrette Camilla Pilati Karine Poussin Abdelhadi Tout Ligue Nationale Contre le Cancer Eric Letouzé Bordeaux Hospital Paulette Bioulac-Sage Charles Balabaud Jean Saric Jean-Frédéric Blanc Créteil Hospital Daniel Azoulay Alexis Laurent CRB: Bruno Clement Françoise Degos Synergie: Gilles Thomas All clinicians and pathologists Inca: Fabien Calvo Inserm UMR-1053 Eric Chevet Integragen Mélanie Letexier Caractéristiques des CHC mutés RPS6KA3 • 11/12 CHC mutés RPS6KA3 ont été développés sur foie noncirrhotique (p=0.05). D’après Guichard et al., Nature Genetics, 2012
