Production elective de la phocomelie sous

J. Embryol. exp. Morph., Vol. 16, 2, pp. 339-354. October 1966
With 4 plates
Printed in Great Britain
339
Production elective de la phocomelie sous Finfluence
d'yperite azotee, chez Fenibryon de Poulet
II.—Etude histologique des bourgeons de membres
au cours du d£veloppement
Par BERTHE SALZGEBER1
Institut d''Embryologie Experimentale du C.N.R.S. et du College de France
{Directeur: Professeur Et. Wolff)
INTRODUCTION
Des recherches anterieures (Salzgeber, 1963) ont montre que l'yperite azotee,
administree a l'embryon de Poulet, entre le 3eme et le 4eme jour de l'incubation,
exerce une action intense sur les ebauches de membres. 90 % des embryons,
autopsies apres le 1 leme jour de l'incubation, presentent des malformations des
pattes et des ailes. La phocomelie, caracterisee par l'atrophie ou la reduction
extreme de segments intermediaries a ete observee chez 75 sur 154 embryons
traites par l'yperite et autopsies a partir du 1 leme jour. Les autres embryons sont
micromeles, leurs membres sont moins courts que ceux des embryons phocomeles. Dans la plupart des cas, et quelle que soit l'intensite de la malformation,
la partie distale du membre est presente. Dans le cadre de l'etude de la genese de
la phocomelie, trois problemes se sont alors poses: Sur quel territoire de membre
agit l'yperite azotee? A quel moment apparaissent les premieres lesions?
Quel est le type de lesion responsable de la phocomelie? Les recherches, exposees dans ce memoire, publiees partiellement dans une note a l'Academie des
Sciences (Salzgeber, 1964), concernent revolution morphologique et histologique
des membres apres traitement de l'embryon par l'yperite azotee. Elles montrent
que les premieres alterations decelees par les methodes histologiques apparaissent
environ 11 h apres le traitement et que l'action de l'yperite azotee porte
essentiellement sur les territoires mesodermiques.
TECHNIQUES
Les embryons de Poulet sont traites a differents stades de l'incubation (stades
18 a 21 de Hamburger & Hamilton (1951), soit 3 a 4 jours de l'incubation) par
1
Adresse de Vauteur: Institut d'Embryologie Experimentale du C.N.R.S., 49 bis, avenue
de la Belle Gabrielle, Nogent-sur-Marne, France.
340
B. SALZGEBER
une solution d'yperite azotee et d'eau distillee, preparee a la concentration
de
3X10-4M.
Deux series d'experiences ont ete effectuees:
(1) La solution (volume: 0,01 a 0,02cm3) est deposee sur la membrane
vitelline de l'embryon de Poulet, de preference sur la region situee entre l'ebauche
alaire et pedieuse. De ce territoire, la solution diffuse vers la region anterieure
et vers la region posterieure. L'embryon est ainsi expose en entier a Finfluence
de la substance toxique. Cependant, les ebauches embryonnaires sont plus ou
moins atteintes, ce qui explique la diversite des malformations de membres
obtenues apres un tel traitement, depuis les membres reduits a leur seule partie
distale jusqu'aux membres normalement conformes mais de taille reduite.
(2) Aiin d'obtenir des sujets phocomeles de maniere constante, j'ai cherche
a localiser la substance sur le territoire patte ou sur le territoire aile. Un petit
carre de pate a modeler (4 a 5 mm de cote), perce d'un trou d'un diametre de 2 mm,
est pose sur l'ebauche de patte ou d'aile. Dans la cavite, on depose 10 /A ou
0,01 cm3 de solution. L'ecran est enleve apres 4 a 5 heures. Des sujets temoins
sont traites de la meme maniere et recoivent le meme volume d'eau distillee.
Les embryons sont examines in situ 5, 24, 48, 72 h apres le traitement. Les
membres etant rapidement masques par les annexes embryonnaires, certains
embryons sont autopsies a differents stades de leur evolution. Les membres
sont dessines a la chambre claire a la meme echelle. Certains d'entre eux sont
fixes au liquide de Bouin, de Zenker ou de Carnoy en vue de l'etude histologique.
Les preparations sont colorees a rhematoxyline-eosine, a l'azan selon la methode
de Heidenhain ou encore au Bleu Alcian et hemalun.
Pour la mise en evidence des acides nucleiques, j'ai utilise la reaction nucleique
de Feulgen pour les ADN et la coloration au vert de methyl-pyronine pour les
ARN. La specificite de la reaction est controlee par action prealable de la ribonuclease dans le cas duvert de methyle-pyronine (Brachet, 1942). La reaction
de Feulgen est controlee en effectuant la reaction sur une preparation non
hydrolysee qui ne developpe aucune coloration avec le reactif de Scruff.
RESULTATS EXPERIMENTAUX
L'evolution des pattes et des ailes a ete suivie dans l'ceuf 24, 48 et parfois 72 h
apres le traitement, si Fobservation le permettait. A ce stade de developpement,
l'allantoide s'etend au dessus de l'embryon et masque souvent les membres. Les
observations ulterieures ne peuvent etre faites in situ; les embryons, examines a
ces stades precoces, sont autopsies a l'age de 10-11 jours, stade auquel le type de
malformation: micromelie, phocomelie et ectromelie, peutetre aisementreconnu.
L'ensemble des observations ont porte sur des embryons provenant de deux
series experimentales:
(1) La solution d'yperite azotee est deposee sur la membrane vitelline recouvrant l'embryon. On obtient des sujets phocomeles typiques et des sujets
La phocomelie et Vyperite azotee
341
micromeles a membres raccourcis (Tableau 1). Les membres, 41 ailes et 32
pattes, provenant de 41 embryons, ont ete examines in situ. Dans 9 cas, les
bourgeons de pattes, recouverts par l'allantoide, n'etaient pas visibles 24 h apres
le traitement.
(2) La solution d'yperite azotee est localisee sur le territoire patte ou le
territoire aile (Tableau 2). La mortalite est moins elevee dans ce cas et le type de
malformation obtenue est plus constant que dans l'experience precedente.
Grace a cette technique, on peut aussi obtenir des effets plus prononces sur
les membres sans que la survie de l'embryon en soit affectee.
Tableau 1. Repartition des malformations 8 jours apres le depot de la substance sur Vembryon (lire serie experimentale) — embryons ages de 11 jours
Nombre
de cas
observes Normaux
Pattes
Ailes
32
41
3
5
Malformations
A
Phocomelie Micromelie Ectromelie
15
17
14
14
0
5
Tableau 2. Repartition des malformations 8 jours apres le depot localise de la
substance sur Vaile ou la patte de Vembryon (2eme serie experimentale) —
embryons ages de 11 jours
Nombre
de cas
observes Normaux
Pattes
Ailes
17
17
0
0
Malformations
_^
Phocomelie Micromelie Ectromelie
13
6
1
5
3
6
(A) Evolution morphologique des membres apres traitement
par Vyperite azotee
Les travaux de Saunders (1948) sur Febauche alaire et ceux de Hampe (1959)
sur Febauche pedieuse ont montre que le developpement des jeunes bourgeons
s'effectue en direction proximo-distale. Rappelons que la premiere ebauche du
bourgeon d'aile apparait au stade 16 de Hamburger & Hamilton (26 a 28
somites, 51 a 56 h), alors que la premiere ebauche de patte est reconnaissable au
stade 17 (29 a 32 somites, 56 a 64 h d'incubation). La croissance des bourgeons
est rapide. Us s'allongent d'abord et au stade 24 (4^ jours), l'extremite distale
du bourgeon de patte commence a s'elargir; elle evoluera ulterieurement en
palette pedieuse, ebauche du futur pied. A ce stade, le reseau de fins capillaires,
present dans le bourgeon de membre depuis le debut du developpement, est peu
a peu remplace par des vaisseaux sanguins. Au centre des bourgeons apparaissent une artere brachiale dans le cas de 1'aile, une artere sciatique ou femorale
342
B. SALZGEBER
dans le cas de la patte, et dans les deux bourgeons se dessine une veine marginale peripherique.
Au stade 27 (5 a 5^ jours), des sillons separant les doigts I, II et III sont
visibles dans la palette.
Au stade 30 (6Jr a 7 jours), on reconnait nettement les differents segments des
ailes et des pattes. Dans ce dernier cas, la cuisse avec le femur, la jambe avec
le tibia et le perone, le pied avec les metatarsiens et les premieres phalanges des
doigts. La membrane interdigitale relie encore les doigts entre eux.
St. 20+48 h
St. 20+24 h
Stade 20
St. 20+96 h
St. 20+72 h
1 mm
Fig. 1. Temoins. Bourgeons de pattes traites au stade 20 de Hamburger & Hamilton
(3£ jours) avec de l'eau distillee. Quelques bourgeons de membres (2 a 4) sont
fixes 24,48,72 et 96 h apres le traitement. Notons la croissance rapide des bourgeons.
Les bourgeons de membres n'ont pas ete dessines, in situ, dans l'ceuf, mais seulement
apres prelevement dans le liquide de Tyrode. Les dessins ne representent done pas
revolution d'un meme bourgeon, mais se rapportent a quelques types caracteristiques
observes au cours de nos experiences.
St. 20+48 h
St. 20+24 h
Stade 20
St. 20+96 h
St. 20+72 h
1 mm
Fig. 2. Yperite azotee. Bourgeons de pattes traites au stade 20 avec de l'yperite
azotee ( 3 X 1 0 ~ 4 M , volume: 10/*1). La fixation a lieu 24, 48, 72 et 96 h apres le
traitement. Apparition d'hematomes (en pointille) dans les bourgeons 48 h et 72 h
apres le traitement. La croissance des membres est inhibee; cette inhibition debute
entre 25 h et 48 h apres le traitement. Les sillons des doigts represented schematiquement par des traits et la palette pedieuse apparaissent tardivement.
La phocomelie et Vyperite azotee
343
Au stade 34 (8 jours), les pieces cartilagineuses sont en place, la patte et l'aile
ont acquis leur forme definitive. Leur croissance se poursuivra au cours des
stades ulterieurs tandis que le squelette cartilagineux s'ossifiera progressivement.
Les bourgeons de membres, soumis a un traitement d'yperite azotee, montrent
d'importantes alterations morphologiques. Mais celles-ci n'apparaissent pas
immediatement. Pendant les premieres 24 h, l'accroissement des membres
d'embryons soumis a l'yperite (Fig. 2) est tres voisin de celui d'embryons
temoins (Fig. 1) et jusqu'a ce stade, aucune lesion n'est visible exterieurement.
Vers la 30eme heure, les premieres lesions apparaissent; elles sont d'abord
discretes; la frange transparente de l'epiblaste se detache nettement du mesenchyme sous-jacent; le reseau sanguin est perturbe. Quarante-huit heures apres
le traitement, la taille du bourgeon est reduite comparee a celle du membre
temoin (Figs. 1, 2); la palette distale n'apparait pas; l'organe a un aspect
transparent qui le differencie nettement des temoins du meme age, ceux-ci ayant
une structure massive et compacte.
Des hematomes apparaissent. Ces alterations vasculaires sont plus ou moins
etendues et n'ont pas de localisations bien precises. On les observe aussi bien a la
base qu'au centre de l'organe; elles sont cependant plus rares a l'extremite
distale du bourgeon. Celui-ci continue de croitre mais la croissance est faible.
Des hematomes et des oedemes sont encore visibles 72 h et 96 h apres le traitement. Dans certains cas, on voit apparaitre, dans la zone distale, les ebauches des
futurs doigts mais en general la palette pedieuse est encore peu distincte; elle se
dessine plus nettement 96 h apres le traitement; les doigts, relies par une membrane interdigitale sont bien marques mais leur nombre est souvent reduit. Le
zeugopode, formant la partie moyenne du membre est considerablement raccourci par rapport au zeugopode de la patte temoin (Figs. 1, 2). L'aile, atteinte
par la substance toxique, presente les memes types d'alterations que la patte.
La croissance du membre est inhibee, des hematomes et des oedemes plus ou
moins etendus apparaissent.
La plupart des pattes ou des ailes phocomeles (23 pattes, 17 ailes) provenant
d'embryons ages de 10 a 11 jours presentaient un hematome 24 a 72 h apres le
traitement (Tableaux 3, 4), 5 pattes et 6 ailes etaient de taille reduite et avaient
un aspect opaque. Ces plages hemorragiques sont surtout visibles 48 h apres le
traitement, elles apparaissent plus tardivement dans la patte que dans l'aile.
Notons qu'a l'autopsie, on ne retrouve ni cedeme, ni kyste hemorragique. Les
parties distales qui subsistent sont saines, irriguees et innervees.
Les experiences de localisation de la substance sur les membres ont, en outre,
montre que dans les cas de fortes hemorragies, observees 48 h apres le traitement,
la croissance du membre est definitivement arretee. A l'autopsie, l'aile ou la
patte sont absentes ou encore sont reduites a de petits moignons sans structure
bien definie. Le type de malformation obtenue depend du degre d'alterations du
bourgeon de membre, ces alterations etant particulierement intenses 48 a 72 h
apres le traitement.
22
JEEM l 6
344
B. SALZGEBER
Tableau 3. Etude de revolution des bourgeons de pattes (resultats
portant sur les 2 series experimentales)
Aspect morpholoTypes de malformations observes 8 jours
gique des bourgeons
apres le traitement
de membre 48 h
apres le traitement
Micromeles
Ectromeles
(en pointille: hematomes) Phocomeles
11
23
Total
28
15
46 cas
Tableau 4. Etude de revolution des bourgeons d'ailes (resultats
portant sur les 2 series experimentales)
Aspect morphologique des bourgeons
Types de malformations observes 8 jours
de membre 48 h
apres le traitement
apres le traitement r
Micromeles
(en pointille: hematomes) Phocomeles
Ectromeles
17
Total
23
11
0
11
19
11
53 cas
La phocomelie et Vyperite azotee
345
,
(B) Etude histologique
/1A „ ,
v J
(1) Membres normaux
°*
L'etude histologique des bourgeons de membres de l'embryon de Poulet a ete
effectuee par Saunders (1948), O'Rahilly & Gardner (1956) et recemment par
Jurand (1965). Rappelons qu'au stade 16 a 17 de Hamburger & Hamilton
(environ 30 somites), les bourgeons qui apparaissent comme de petits renflements de la paroi laterale du corps sont constitues de deux parties bien distinctes: un constituant mesodermique et un constituant epidermique, celui-ci
formant un revetement a l'ensemble du bourgeon.
Au stade 18 (3 jours), l'epiblaste s'epaissit a l'extremite de l'ebauche pour
former la crete apicale. Celle-ci joue un role important dans la morphogenese
du membre ainsi que l'ont montre les travaux de Saunders (1948), Hampe (1957,
1959) et Zwilling (1955). Elle est, a ce stade, constitute de deux couches de
cellules mais elle s'epaissit au cours du developpement pour atteindre un maximum de croissance aux stades 20 a 24 (3^ a 4 jours). Elle presente alors, 4 ou 5
couches de cellules, la couche la plus superficielle etant formee de cellules
aplaties alors que dans la couche profonde, on observe des cellules cylindriques
(Planche 1, fig. A). L'ectoderme et sa crete apicale sont separes du mesenchyme
sous-jacent par une membrane basale. Dans sa partie centrale, le bourgeon est
constitue d'un amas de cellules mesoblastiques, de structure dense sous la
crete, du cote dorsal et du cote ventral mais de structure plus lache au centre.
Les mitoses sont nombreuses a ce stade (Planche 1, fig. C). Des foyers d'elements
pycnotiques apparaissent localement. Us ont ete decrits par Saunders, Gasseling
& Saunders (1962), dans certaines regions de l'ebauche alaire en voie de croissance (stades 21 a 31). Ces zones d'alterations cellulaires contribueraient a
donner au membre sa forme definitive.
Aux stades 22 et 23 (3£ a 4 jours), les sections histologiques montrent la
presence, au centre du bourgeon, d'un amas de cellules compactes a petits
noyaux; cette region est nettement delimited par des vaisseaux sanguins. II
s'agit la de la condensation du mesenchyme a partir de laquelle se formera le
futur cartilage. Des troncs nerveux apparaissent a la racine du membre.
Au stade 25 (4£ a 5 jours) la condensation squelettique est nettement distincte de l'ebauche musculaire (Planche 3, fig. I). Ulterieurement, au stade 26
(5 jours), une zone de precartilage a noyaux arrondis occupe la partie centrale
du membre. La segmentation en femur et en tibia perone commence a ce stade
et des vaisseaux sanguins sont visibles le long de cet axe precartilagineux. Les
mitoses sont nombreuses, aussi bien dans la zone de precartilage que dans le
faisceau musculaire.
Les differentes pieces cartilagineuses apparaitront progressivement au cours
des stades ulterieurs; elles sont en place dans la patte de l'embryon age de 8 jours.
Notons que 1'ossification de la diaphyse des femurs et des tibias commence a
partir des stades 6^- a 7 jours.
346
B. SALZGEBER
(2) Membres soumis a Vaction de Vyperite azotee
Les ailes et les pattes provenant de 82 embryons ont ete examinees histologiquement a differents stades de leur developpement. Les membres des
embryons traites au stade de 3 a 3^ jours (18, 19 et 20 de Hamburger et Hamilton) ont ete preleves entre 1 et 120 h apres le traitement (Tableau 5).
Evolution du mesoderme
Une heure a 5 h apres action de l'yperite azotee, aucune alteration n'est
visible dans les bourgeons. Dix a 11 h plus tard, on constate une legere difference
entre les membres traites et les membres temoins. La structure du mesenchyme
est moins dense et les mitoses sont moins nombreuses dans les organes traites.
On observe un leger accroissement de la taille des noyaux. A un stade ulterieur,
soit 17 a 18 h apres le traitement, alors qu'on ne peut deceler d'anomalies
morphologiques, l'etude histologique revele une structure desorganisee; des
foyers d'elements necroses apparaissent dans le mesenchyme.
Vingt-quatre heures apres le traitement, on est frappe par la structure lache
du mesoderme et par la grande dimension des cellules et des noyaux dont le
diametre atteint le double ou le triple de celui des noyaux des membres temoins
(Planche 1, figs. A, B). Les alterations mitotiques sont nombreuses. Ce sont
PLANCHE1
Sections de bourgeons de pattes provenant d'embryons ages de 4 jours (stades 19 de H.
& H. + 24 h.). Traitement au stade de 3 jours (stade 19) et fixation 24 h apres le traitement.
Fig. A. Bourgeon temoin traite a l'eau distillee. Le mesenchyme (Af), de structure dense, est
recouvert d'un epiderme. L'ectoderme (E) s'epaissit dans la zone marginale pour former
une crete apicale {ed).
Fig. B. Bourgeon traite a l'yperite azotee. Le mesenchyme (M) presente une structure vacuolaire a gros noyaux. La crete apicale {ed) est bien developpee.
Fig. C. Fragment du bourgeon de patte temoin. Zone moyenne. Nombreuses mitoses dans le
mesenchyme de structure dense.
Fig. D. Fragment du bourgeon de patte traite a l'yperite azotee. Zone moyenne — au meme
grossissement que la patte temoin. Presence de noyaux hypertrophies, d'elements pycnotiques
{py) et de mitoses aberrantes.
PLANCHE 2
Fig. E. Bourgeon de patte fixe 24 h apres traitement par 1'yperite azotee. Coloration au vert
de methyle-pyronine. Noter la forte degenerescence du mesoderme (M), alors que la cape
apicale {ed) est saine. Nombreux noyaux pycnotiques. Presence de petits agglomerats intensement colores en rouge (pyronine ->).
Fig. F. Bourgeon de patte traite a l'yperite au stade de 3 jours (stade 19), 48 h apres le traitement. Structure lacunaire. Presence d'un cedeme a gauche. Noyaux a gros nucleole. La
cape apicale {ed) est bien developpee. (Vert de methyle pyronine.)
Fig. G. Fragment d'un bourgeon de membre d'un embryon age de 4£ jours. Prelevement du
bourgeon de patte 22 h apres le traitement. Structure lacunaire. Presence de nombreux noyaux
aberrants.
Fig. H. Detail de la fig. G montrant un groupe de mitoses anormales.
/. Embryo/, exp. Morph., Vol. 16, Part 2
PLANCHE 1
M
B. SALZGEBER
facing p. 346
/. Embryo], exp. Morph., Vol. 16, Part 2
PLANCHE 2
H
B. SALZGEBER
PLANCHE 3
/. Embryol. exp. Morph., Vol. 16, Part 2
K
B. SALZGEBER
/. Embryol. exp. Morph., Vol. 16, Part 2
PLANCHE 4
MT
M
B. SALZGEBER
N
facing p. 347
La phocomelie et Vyperite azotee
347
essentiellement des fragmentations ou des ruptures de chromosomes (Planche 1,
fig. D). Aucune mitose normale n'est visible dans ce tissu alors qu'elles sont
nombreuses dans l'organe non traite par l'yperite (Planche 1, fig. C). Une zone
de condensation prechondrale se dessine. On peut y observer des noyaux
aberrants et pycnotiques. Dans les cas d'alterations moins prononcees, la zone
de condensation est saine; les autres territoires contiennent de gros noyaux, les
elements pycnotiques sont peu nombreux.
Quarante a 48 h apres action de l'yperite azotee sur le bourgeon de membre,
la vacuolisation du tissu est plus prononcee qu'au stade precedent. Les cellules
sont dissociees et separees les unes des autres par des lacunes et des vacuoles,
ce qui confere a l'ensemble du bourgeon une structure peu dense. L'epiderme se
Tableau 5. Nombre de sujets soumisa Vexamen histologique a
differents stades apres le traitement {pattes et ailes)
Stades de prelevement
( d'heures apres
Nombre
le traitement
Age des embryons
1 a 12
18 a 24
28 a 48
50 a 72
96
120
Nombre total d'observations
histologiques
3 a 3| h
4 jours
5 jours
6 jours
7 jours
8 jours
Embryons
temoins
Embryons traites
a 1'yperite
azotee
10
10
7
4
3
2
36
18
17
20
12
10
5
82
PLANCHE 3
Sections sagittales de bourgeons d'ailes. Traitement au stade de 3 jours (stade 19 de H. & H.).
Fixation: 48 heures apres le traitement.
Fig. I. Bourgeon temoin. Noter la structure tres dense du mesenchyme. On peut observer
un debut de differenciation avec une condensation prechondrale (C) au centre et des amas
myogenes de part et d'autre.
Fig. J. Detail de la figure 9 — region de la crete apicale (ed).
Fig. K. Bourgeon traite a l'yperite azotee. Alterations du tissu mesodermique. Nombreuses
lacunes. L'ectoderme et sa crete sont conserves.
Fig. L. Fragment du bourgeon representsfig.K. Region de la crete apicale (ed). Des lacunes
et des vacuoles dissocient les cellules. Mais presence d'elements sains et de divisions mitotiques normales (->).
PLANCHE4
Fig. M. Patte normale d'un embryon de 7£ jours. Traitement a l'eau distillee au stade 20
(3-J- jours) et fixation 96 h apres le traitement. Les pieces cartilagineuses sont nettement
differenciees. F, femur; T, tibia; MT, metatarsien.
Fig. N. Patte d'un embryon de 71 jours. Traitement a l'yperite azotee (stade 20) et fixation
96 h apres le traitement. Reduction du membre. Les pieces cartilagineuses sont peu developpees. nc, Nodules cartilagineux; n, nerf; Mu, muscle.)
348
B. SALZGEBER
detache nettement du mesoderme et parfois ce decollement est accentue par la
presence d'un cedeme ou d'une zone hemorragique (Planche 2, figs. E, F ;
Planche 3, fig. K). Alors que l'organe temoin presente a ce stade des zones de
differentiation bien individualists: une region de condensation prechondrale
au centre, des formations musculaires de part et d'autre de cette zone (Planche 3,
fig. I), l'organe traite a souvent un aspect peu differencie, depourvu de toute
organisation (Planche 3, fig. K). Dans certains cas, une zone de condensation
s'ebauche; dans d'autres cas, la zone de chondrification est presente mais elle
est reduite et contient de nombreux elements pycnotiques.
Notons que de nombreuses cellules ne sont pas atteintes et le tissu, quoique
altere, est capable par les cellules restees saines, de poursuivre son developpement. Des mitoses normales apparaissent au sein de ce tissu (Planche 3, fig. L).
Les reactions au vert de methyle pyronine effectuees sur des bourgeons, 24 ou
48 h apres le traitement, montrent de gros amas d'un rouge intense repartis un
peu au hasard dans le bourgeon (Planche 2, fig. E). II s'agit la, vraisemblablement, d'une alteration cytoplasmique consecutive a une alteration des noyaux,
car on y observe aussi des debris de chromatine pycnotique colores en vert.
Dans l'ensemble, le cytoplasme des cellules du mesenchyme presente une coloration a la pyronine assez dense, et, dans la plupart des cas, 1 ou 2 amas de
materiel pyronine sont situes au contact du noyau. Celui-ci contient un gros
nucleole. Des pycnoses et des anomalies mitotiques sont aussi visibles mais elles
sont plus nettes apres reaction au Feulgen; on apercoit des ponts chromosomiques
et des fragmentations de chromosomes.
Soixante-douze heures apres le traitement, on observe un remaniement des
structures. Les elements pycnotiques ont disparu, les tissus qui subsistent sont
sains. Mais on observe souvent des zones hemorragiques ou des lacunes qui
contiennent des debris cellulaires. Des zones de condensation cellulaire, ebauche
du futur cartilage, apparaissent dans la partie distale tandis qu'un petit nodule
cartilagineux se developpe dans la region proximale. L'innervation du membre
et son irrigation par les vaisseaux sanguins s'effectuent normalement, du moins
dans les territoires sains non hemorragiques. Dans la partie moyenne du bourgeon, on peut observer des amas musculaires enveloppant une zone peu differenciee, a cellules dispersees. II s'agit, vraisemblablement, d'une alteration
importante d'un territoire qui, dans les conditions normales, aurait donne du
cartilage.
96 et 120 h apres le traitement (Planche 4, figs. M, N), le membre, bien que de
dimensions reduites, presente une structure d'aile ou de patte. Les elements
cartilagineux sont peu developpes; le nombre de pieces qui subsistent, dependent du degre d'alteration du l'ebauche. On constate, en outre, que l'evolution du cartilage est retardee dans le membre traite. Celui-ci contient des
nodules precartilagineux alors que chez le temoin, le cartilage de la diaphyse du
femur et du tibia est deja au stade hypertrophie, et une zone d'ossification fait
son apparition.
La phocomelie et Vyperite azotee
349
La plupart des alterations observees dans le mesoderme de jeune bourgeon de
membre ont pour consequence l'apparition de malformations de type phocomele ou micromele. Dans les cas de degenerescence intense du mesoderme, le
membre est incapable de poursuivre son developpement. Trois a 4 jours apres
le traitement, il degenere. Le mesenchyme de telles ebauches est reduit a quelques
debris cellulaires et d'importantes hemorragies contribuent a la destruction de
l'organe. Les embryons, autopsies le lleme jour de Fincubation, sont des
sujets ectromeles auxquels il manque soit l'aile droite, soit la patte droite ou
encore les deux membres.
L'ensemble de ces observations montrent que le territoire mesodermique est
toujours atteint. Le degre d'alteration varie selon la dose administree et le stade
de traitement de l'embryon.
Evolution de Vectoderme
A l'inverse du mesoderme, l'ectoderme qui le coiffe est sain dans la plupart des
cas. La crete apicale a cellules hautes et cylindriques est normalement developpee (Planche 1, fig. B; Planche 2, figs. E, F). Elle se maintiendra dans tous les
bourgeons traites par l'yperite azotee et qui evoluent par la suite en membres
phocomeles. Notons que l'ectoderme peut presenter, 24 h apres le traitement,
des cellules hypertrophiees identiques a celles qu'on voit dans le mesoderme,
mais elles sont rares. Des phenomenes de degenerescence ont cependant ete
observes dans les cas d'alterations intenses du mesoderme, par exemple, lorsque
celui-ci est reduit a une grande lacune contenant quelques debris cellulaires.
Dans ces cas, l'ectoderme et la cape apicale sont presents mais ils s'effritent. De
tels membres degenerent, et a Tautopsie, on ne retrouve qu'un minuscule
moignon.
CONCLUSIONS
Ces recherches montrent que la croissance et la differentiation du bourgeon
de membre, traite par l'yperite azotee, sont gravement perturbees. Aux doses
utilisees, cette alteration n'est pas immediate; le bourgeon continue de croitre.
Les premiers signes morphologiques de degenerescence des bourgeons de
membre n'apparaissent qu'environ 30 h apres le traitement, mais les observations histologiques revelent des anomalies aux stades plus precoces, environ 11 h
apres le traitement.
L'action de l'yperite azotee porte essentiellement sur les structures mesodermiques; ce sont d'abord des perturbations discretes: diminution du nombre
des mitoses, hypertrophie des noyaux et des cellules, suivie 24 a 72 h apres le
traitement defiguresde degenerescences importantes. Des mitoses anormales, des
alterations chromosomiques, des foyers de pycnoses et de cellules necrotiques
apparaissent. Le tissu prend un aspect lacunaire et vacuolaire alors qu'il est
dense et compact chez le temoin. L'apparition d'hematomes contribuent a la
degenerescence du tissu. Cependant, des regions a cellules saines subsistent et
350
B. SALZGEBER
presentent une activite mitotique intense. Notons que la substance n'agit pas de
maniere elective sur un territoire precis du mesoderme. Du 3eme au 5eme jour
apres le traitement, les tissus se differencient; de petits nodules cartilagineux et
des amas musculaires apparaissent: des nerfs et des vaisseaux sanguins penetrent
dans les membres. Ces recherches montrent que l'yperite azotee provoque 2
types de lesions:
(1) Alterations des noyaux du constituant mesodermique a un stade ou
celui-ci presente une activite mitotique intense. Les mitoses sont arretees,
entrainant l'inhibition de la croissance du bourgeon.
(2) Apparition d'hematomes plus ou moins etendus, environ 40 h apres le
traitement, attestant une action de l'yperite sur la paroi des vaisseaux.
Quelle est la lesion responsable de la genese des malformations de membre de
type phocomele, brachymele ou ectromele? Ancel & Lallemand (1942) et Jost
(1950) ont montre que des hemorragies intraembryonnaires pouvaient entrainer
des degenerescences de membres. Les hemorragies, selon Ancel & Lallemand
(1942), apparaissent de 16 a 36 h apres le depot de certaines substances sur
l'embryon, elles disparaissent 24 a 48 h apres leur apparition. Des cas d'ectromelie ou d'hemimeiie de membres posterieurs ont ete signales par Ancel (1950)
apres action de diverses substances telles que le bleu Trypan, la quinine et la
strychnine. Jost (1950), administrant certaines preparations hypophysaires au
foetus de rat ou de lapin observe des lesions des extremites avec degenerescence
complete de la partie distale. II observe la formation d'oedemes et une dilatation des vaisseaux produisant une extravasation sanguine.
Etant donne le pourcentage eleve de malformations obtenues apres action
de l'yperite azotee, on peut penser que les deux types de lesions interviennent
dans la degenerescence du mesoderme.
Le revetement ectodermique et sa crete apicale evoluent normalement dans la
plupart des cas. Une telle action preferentielle sur les tissus mesodermiques a ete
signalee par d'autres auteurs. Chez les batraciens, Gillette & Bodenstein (1946)
constatent que l'yperite azotee agit sur le mesenchyme cartilagineux du membre.
Apres traitement, le bourgeon continue sa croissance pendant plusieurs jours puis
il degenere. Des sections, faites a ce stade, montrent la presence de nombreux
noyaux hypertrophies. Les auteurs pensent que les zones de proliferation intense
sont electivement atteintes par la substance toxique. Jurand(1961,1963) insiste
egalement sur l'activite antimesodermique de derives de l'yperite azotee. Chez
l'embryon de Souris, ou de telles substances provoquent des raccourcissements de membres, le mesoblaste presente des phenomenes de necrose localises
a la partie interne du mesoderme, mais l'epiderme et les 2 ou 3 couches de
cellules mesodermiques adjacentes a l'epiderme sont preservees. Recemment,
Rickenbacher (1963), etudiant l'action de la thalidomide sur les ebauches de
membres de l'embryon de Poulet age de 2 jours, observe des phenomenes de
necrose dans le mesenchyme des bourgeons de membre traites. Ces foyers
d'alterations sont localises a la zone proximale et a la zone centrale. Les noyaux
La phocomelie et Vyperite azotee
351
se sont contracted et le cytoplasme tres eosinophile est decompose. En laissant
incuber des embryons de Poulet pendant un certain temps dans une atmosphere
pauvre en oxygene, Naujoks (1953) et Riibsaamen (1955) obtiennent des malformations de pattes et en particulier des micromeles. L'etude histologique
revele l'absence ou la reduction de la cape apicale chez les sujets malformes.
Au cours de mes experiences, j'ai obtenu 3 types de malformations: la micromelie, la phocomelie et l'ectromelie. Les etudes histologiques montrent que
l'obtention de ces divers types d'anomalies depend essentiellement du degre
d'alteration du mesoderme. Dans les cas de la micromelie et de la phocomelie,
l'ectoderme et la cape apicale se developpent normalement, meme en presence
d'un mesoderme altere. Dans le cas de Fectromelie, l'atteinte du mesoderme est
plus severe, l'ectoderme et sa cape apicale presentent egalement des signes de
deficience. La substance toxique agit-elle dans ces cas extremes sur les 2 constituants ou bien l'ectoderme ne peut-il se maintenir en presence d'un mesoderme
profondement altere?
On sait qu'il existe des interactions etroites entre les constituants ectodermiques
et mesodermiques de l'ebauche de membre. La calotte ectodermique est indispensable au mesoderme pour assurer sa croissance et former des parties
distales (Saunders, 1948; Zwilling, 1955, 1956; Hampe, 1959); inversement,
le mesoderme maintient l'activite de l'ectoderme apical (Saunders, 1949;
Saunders & Gasseling, 1963; Zwilling, 1949, 1964; Zwilling & Hansborough,
1956). II est certain que l'atteinte de l'un des territoires perturbe le developpement
normal de l'ebauche. Dans le cas de la phocomelie, Faction de la substance
teratogene porte sur l'ensemble du territoire mesodermique; mais des regions
saines subsistent. On peut imaginer que l'epiblaste continue d'exercer son
pouvoir inducteur sur ce tissu mais celui-ci, plus ou moins altere perd sa competence et ne peut fournir suffisamment de materiel pour edifier un zeugopode
complet. Des territoires sains, situes sous la cape apicale, pourraient etre induits
a former des doigts.
Dans le cas de l'ectromelie, le mesoderme perturbe aurait perdu toute sa
competence et ne pourrait plus maintenir la cape apicale. Ce phenomene provoquerait non seulement un arret de croissance du mesoderme mais encore
l'absence de parties distales entrainant ainsi la degenerescence complete du
membre. Ajoutons que l'administration d'yperite azotee aux stades precoces,
avant l'apparition morphologique du bourgeon de membre, a pour consequence
la production de sujets ectromeles. Or d'apres les recherches de Kieny (1960),
le mesoderme a ces stades precoces induit l'ectoderme a s'epaissir en une crete
apicale. On peut penser qu'apres action de l'yperite azotee, le mesoderme ne
peut plus induire cette crete necessaire a devolution ulterieure du membre.
Des recherches sont actuellement en cours, qui, nous l'esperons, apporteront
les preuves experimentales de cette action elective de l'yperite azotee sur les
territoires mesodermiques du membre.
352
B. SALZGEBER
RESUME
1. Les embryons de Poulet, ages de 3 a 3^ jours (stades 18 a 20) sont traites
a l'yperite azotee, avec une dose de 3 x 10~4 M. La substance est deposee, soit
sur l'ensemble de 1'embryon, soit localement sur les ebauches de membres.
2. Les bourgeons sont examines, in situ, pendant 24 a 48 h, puis ils sont
autopsies le lleme jour de l'incubation. D'autres bourgeons, ailes et pattes, sont
preleves a differents stades du developpement, environ 1 h a 120 h apres le
traitement, et sont soumis a l'examen histologique.
3. Les premieres lesions, decelables morphologiquement, apparaissent entre
24 et 30 h apres le traitement. La croissance du bourgeon est inhibee; des
hematomes, plus ou moins etendus, sont visibles au centre ou a la base du
bourgeon.
4. L'etude histologique des ebauches de membres, effectuee quelques heures
ou plusieurs jours apres le traitement, apporte des precisions sur le mode
d'alterations du membre. La structure compacte du mesenchyme central a
petits noyaux fait place a un tissu de structure vacuolaire a gros noyaux.
Quarante heures apres le traitement, on observe une desorganisation importante
de la structure du bourgeon de membre, caracterisee par l'absence de condensation du mesenchyme dans la zone centrale, la presence de lacunes, de vacuoles
et de noyaux pycnotiques. Le developpement du cartilage est inhibe ou retarde.
Quatre a cinq jours apres le traitement, on observe une reorganisation des
structures. Les parties distales se forment, des nodules de pre-cartilage ainsi que
des ebauches musculaires apparaissent. Des nerfs et des vaisseaux sanguins
penetrent dans le membre. Celui-ci est de taille reduite. Dans les cas d'atteinte
severe du mesoderme, les bourgeons degenerent. On obtient alors des sujets
ectromeles, depourvus de membres. L'autre constituant, l'ectoderme et sa cape
apicale, evoluent normalement dans la plupart des cas. En presence d'un mesoderme tres altere et reduit, le revetement ectodermique presents des signes de
degenerescence.
5. Ces resultats font penser a une action specifique de l'yperite azotee sur les
structures mesodermiques. Les resultats sont compares a ceux qui ont ete
obtenus par d'autres auteurs et sont discutes dans le cadre des problemes des
interactions entre mesoderme et ectoderme.
SUMMARY
The production of phocomelia in the chick embryo by the action of nitrogen
mustard. II. Histological study of developing limb buds
1. Nitrogen mustard at a concentration of 3x 10~4M was administered to
chick embryos of 3-3^ days incubation (stages 18-20 of Hamburger & Hamilton).
The solution was deposited either over the whole embryo or locally on the limb
rudiments.
La phocomelie et Vyperite azotee
353
2. Some limb buds were examined in situ during the period 24-48 h after the
administration and were subject to examination at autopsy at the 11th day of
incubation. Others, both wing and leg-buds, were taken for histological examination at times between 1 h and 120 h of the beginning of treatment.
3. The first detectable morphological lesions appear between 24 and 30 h
of the administration of the nitrogen mustard. The growth of the bud is inhibited and haematomata of varying sizes are seen at the centre of the bud or
near its base.
4. Histological study of limb rudiments fixed within the first hours or days of
treatment gives a more detailed picture of the changes suffered by them. The dense
central mesenchyme with small cell nuclei is replaced by a vacuolated tissue with
large cell nuclei. Forty hours after treatment the disorganization of the limb bud
is characterized by the absence of the central mesenchymal condensation and
the presence of lacunae, of vacuoles and pyknotic nuclei. Chondrogenesis is
inhibited or delayed. Four or five days after treatment there is a reorganization
of the limb rudiment. The distal structures appear, as do nodules of precartilaginous cells and muscle rudiments. Nerves and blood vessels enter the
limb which is of reduced size. In those cases where the mesoderm is greatly reduced the buds degenerate. This gives rise to ectromelia, the complete absence
of limbs. The ectoderm, including the apical cap, develops normally in most
cases. In cases of extreme mesodermal atrophy the ectodermal covering shows
signs of degeneration.
5. These results suggest a specific action of nitrogen mustard on mesodermal
structures. They are compared with the results of other authors and their relevance to problems of mesodermal-ectodermal interactions is discussed.
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