Production elective de la phocomelie sous

J. Embryol. exp. Morph., Vol. 16, 2, pp. 339-354. October 1966 339
With 4 plates
Printed in Great Britain
Production elective de la phocomelie sous Finfluence
d'yperite azotee, chez Fenibryon de Poulet
II.—Etude histologique des bourgeons de membres
au cours du d£veloppement
Par BERTHE SALZGEBER1
Institut d''Embryologie Experimentale du C.N.R.S. et du College de France
{Directeur: Professeur Et. Wolff)
INTRODUCTION
Des recherches anterieures (Salzgeber, 1963) ont montre que l'yperite azotee,
administree a l'embryon de Poulet, entre le 3eme et le 4eme jour de l'incubation,
exerce une action intense sur les ebauches de membres. 90 % des embryons,
autopsies apres le
1 leme jour de l'incubation, presentent des malformations des
pattes et des ailes. La phocomelie, caracterisee par l'atrophie ou la reduction
extreme de segments intermediaries a ete observee chez 75 sur 154 embryons
traites par l'yperite et autopsies a partir du
1 leme jour. Les autres embryons sont
micromeles, leurs membres sont moins courts que ceux des embryons phoco-
meles. Dans la plupart des cas, et quelle que soit l'intensite de la malformation,
la partie distale du membre est presente. Dans le cadre de l'etude de la genese de
la phocomelie, trois problemes se sont alors poses: Sur quel territoire de membre
agit l'yperite azotee? A quel moment apparaissent les premieres lesions?
Quel est le type de lesion responsable de la phocomelie? Les recherches, ex-
posees dans ce memoire, publiees partiellement dans une note a l'Academie des
Sciences (Salzgeber, 1964), concernent revolution morphologique et histologique
des membres apres traitement de l'embryon par l'yperite azotee. Elles montrent
que
les premieres alterations decelees par les methodes histologiques apparaissent
environ 11 h apres le traitement et que l'action de l'yperite azotee porte
essentiellement sur les territoires mesodermiques.
TECHNIQUES
Les embryons de Poulet sont traites a differents stades de l'incubation (stades
18 a
21 de Hamburger & Hamilton (1951), soit 3 a 4 jours de l'incubation) par
1
Adresse de Vauteur: Institut d'Embryologie Experimentale du C.N.R.S., 49 bis, avenue
de la Belle Gabrielle, Nogent-sur-Marne, France.

340 B. SALZGEBER
une solution d'yperite azotee et d'eau distillee, preparee a la concentration
de 3X10-4M.
Deux series d'experiences ont ete effectuees:
(1) La solution (volume: 0,01 a 0,02cm3) est deposee sur la membrane
vitelline de l'embryon de Poulet, de preference sur la region situee entre l'ebauche
alaire et pedieuse. De ce territoire, la solution diffuse vers la region anterieure
et vers la region posterieure. L'embryon est ainsi expose en entier a Finfluence
de la substance toxique. Cependant, les ebauches embryonnaires sont plus ou
moins atteintes, ce qui explique la diversite des malformations de membres
obtenues apres un tel traitement, depuis les membres reduits a leur seule partie
distale jusqu'aux membres normalement conformes mais de taille reduite.
(2) Aiin d'obtenir des sujets phocomeles de maniere constante, j'ai cherche
a localiser la substance sur le territoire patte ou sur le territoire aile. Un petit
carre de pate a modeler (4 a
5 mm de cote), perce d'un trou d'un diametre de 2 mm,
est pose sur l'ebauche de patte ou d'aile. Dans la cavite, on depose 10 /A ou
0,01 cm3 de solution. L'ecran est enleve apres 4 a 5 heures. Des sujets temoins
sont traites de la meme maniere et recoivent le meme volume d'eau distillee.
Les embryons sont examines in situ 5, 24, 48, 72 h apres le traitement. Les
membres etant rapidement masques par les annexes embryonnaires, certains
embryons sont autopsies a differents stades de leur evolution. Les membres
sont dessines a la chambre claire a la meme echelle. Certains d'entre eux sont
fixes au liquide de Bouin, de Zenker ou de Carnoy en vue de l'etude histologique.
Les preparations sont colorees a rhematoxyline-eosine, a l'azan selon la methode
de Heidenhain ou encore au Bleu Alcian et hemalun.
Pour la mise en evidence des acides nucleiques, j'ai utilise la reaction nucleique
de Feulgen pour les ADN et la coloration au vert de methyl-pyronine pour les
ARN. La specificite de la reaction est controlee par action prealable de la ribo-
nuclease dans le cas duvert de methyle-pyronine (Brachet, 1942). La reaction
de Feulgen est controlee en effectuant la reaction sur une preparation non
hydrolysee qui ne developpe aucune coloration avec le reactif de
Scruff.
RESULTATS EXPERIMENTAUX
L'evolution des pattes et des ailes a ete suivie dans l'ceuf 24, 48 et parfois 72 h
apres le traitement, si Fobservation le permettait. A ce stade de developpement,
l'allantoide s'etend au dessus de l'embryon et masque souvent les membres. Les
observations ulterieures ne peuvent etre faites in situ; les embryons, examines a
ces stades precoces, sont autopsies a l'age de 10-11 jours, stade auquel le type de
malformation: micromelie, phocomelie et ectromelie, peutetre aisementreconnu.
L'ensemble des observations ont porte sur des embryons provenant de deux
series experimentales:
(1) La solution d'yperite azotee est deposee sur la membrane vitelline re-
couvrant l'embryon. On obtient des sujets phocomeles typiques et des sujets

La phocomelie et Vyperite azotee 341
micromeles a membres raccourcis (Tableau 1). Les membres, 41 ailes et 32
pattes, provenant de 41 embryons, ont ete examines in situ. Dans 9 cas, les
bourgeons de pattes, recouverts par l'allantoide, n'etaient pas visibles
24 h apres
le traitement.
(2) La solution d'yperite azotee est localisee sur le territoire patte ou le
territoire aile (Tableau 2). La mortalite est moins elevee dans ce cas et le type de
malformation obtenue est plus constant que dans l'experience precedente.
Grace a cette technique, on peut aussi obtenir des effets plus prononces sur
les membres sans que la survie de l'embryon en soit affectee.
Tableau 1. Repartition des malformations 8 jours apres le depot de la sub-
stance sur Vembryon (lire serie experimentale) — embryons ages de
11 jours
Pattes
Ailes
Nombre
de cas
observes
32
41
Normaux
3
5
Malformations
A
Phocomelie Micromelie
15 14
17 14
Ectromelie
0
5
Tableau 2. Repartition des malformations 8 jours apres le depot localise de la
substance sur Vaile ou la patte de Vembryon (2eme serie experimentale) —
embryons ages de
11 jours
Pattes
Ailes
Nombre
de cas
observes
17
17
Normaux
0
0
Phocomelie
13
6
Malformations
_^
Micromelie
1
5
Ectromelie
3
6
(A) Evolution morphologique des membres apres traitement
par Vyperite azotee
Les travaux de Saunders (1948) sur Febauche alaire et ceux de Hampe (1959)
sur Febauche pedieuse ont montre que le developpement des jeunes bourgeons
s'effectue en direction proximo-distale. Rappelons que la premiere ebauche du
bourgeon d'aile apparait au stade 16 de Hamburger & Hamilton (26 a 28
somites,
51 a 56 h), alors que la premiere ebauche de patte est reconnaissable au
stade 17 (29 a 32 somites, 56 a 64 h d'incubation). La croissance des bourgeons
est rapide. Us s'allongent d'abord et au stade 24
(4^ jours), l'extremite distale
du bourgeon de patte commence a s'elargir; elle evoluera ulterieurement en
palette pedieuse, ebauche du futur pied. A ce stade, le reseau de fins capillaires,
present dans le bourgeon de membre depuis le debut du developpement, est peu
a peu remplace par des vaisseaux sanguins. Au centre des bourgeons apparais-
sent une artere brachiale dans le cas de
1'aile, une artere sciatique ou femorale

342B.
SALZGEBER
dans le cas de la patte, et dans les deux bourgeons se dessine une veine mar-
ginale peripherique.
Au stade 27 (5 a 5^ jours), des sillons separant les doigts I, II et III sont
visibles dans la palette.
Au stade 30 (6Jr a 7 jours), on reconnait nettement les differents segments des
ailes et des pattes. Dans ce dernier cas, la cuisse avec le femur, la jambe avec
le tibia et le perone, le pied avec les metatarsiens et les premieres phalanges des
doigts. La membrane interdigitale relie encore les doigts entre eux.
Stade 20
St. 20+24 h
St. 20+48 h
St. 20+72 h
St. 20+96 h
1 mm
Fig. 1. Temoins. Bourgeons de pattes traites au stade 20 de Hamburger & Hamilton
(3£ jours) avec de l'eau distillee. Quelques bourgeons de membres (2 a 4) sont
fixes 24,48,72 et 96 h apres le traitement. Notons la croissance rapide des bourgeons.
Les bourgeons de membres n'ont pas ete dessines, in situ, dans l'ceuf, mais seulement
apres prelevement dans le liquide de Tyrode. Les dessins ne representent done pas
revolution d'un meme bourgeon, mais se rapportent a quelques types caracteristiques
observes au cours de nos experiences.
Stade 20
St. 20+24 h
St. 20+48 h
St. 20+72 h
St. 20+96 h
1 mm
Fig. 2. Yperite azotee. Bourgeons de pattes traites au stade 20 avec de l'yperite
azotee (3X10~4M, volume: 10/*1). La fixation a lieu 24, 48, 72 et 96 h apres le
traitement. Apparition d'hematomes (en pointille) dans les bourgeons 48 h et 72 h
apres le traitement. La croissance des membres est inhibee; cette inhibition debute
entre 25 h et 48 h apres le traitement. Les sillons des doigts represented schematique-
ment par des traits et la palette pedieuse apparaissent tardivement.

La phocomelie et Vyperite azotee 343
Au stade 34 (8 jours), les pieces cartilagineuses sont en place, la patte et l'aile
ont acquis leur forme definitive. Leur croissance se poursuivra au cours des
stades ulterieurs tandis que le squelette cartilagineux s'ossifiera progressivement.
Les bourgeons de membres, soumis a un traitement d'yperite azotee, montrent
d'importantes alterations morphologiques. Mais celles-ci n'apparaissent pas
immediatement. Pendant les premieres 24 h, l'accroissement des membres
d'embryons soumis a l'yperite (Fig. 2) est tres voisin de celui d'embryons
temoins (Fig. 1) et jusqu'a ce stade, aucune lesion n'est visible exterieurement.
Vers la 30eme heure, les premieres lesions apparaissent; elles sont d'abord
discretes; la frange transparente de l'epiblaste se detache nettement du mesen-
chyme sous-jacent; le reseau sanguin est perturbe. Quarante-huit heures apres
le traitement, la taille du bourgeon est reduite comparee a celle du membre
temoin (Figs. 1, 2); la palette distale n'apparait pas; l'organe a un aspect
transparent qui le differencie nettement des temoins du meme
age, ceux-ci ayant
une structure massive et compacte.
Des hematomes apparaissent. Ces alterations vasculaires sont plus ou moins
etendues et n'ont pas de localisations bien precises. On les observe aussi bien a la
base qu'au centre de l'organe; elles sont cependant plus rares a l'extremite
distale du bourgeon. Celui-ci continue de croitre mais la croissance est faible.
Des hematomes et des oedemes sont encore visibles 72 h et 96 h apres le traite-
ment. Dans certains cas, on voit apparaitre, dans la zone distale, les ebauches des
futurs doigts mais en general la palette pedieuse est encore peu distincte; elle se
dessine plus nettement 96 h apres le traitement; les doigts, relies par une mem-
brane interdigitale sont bien marques mais leur nombre est souvent reduit. Le
zeugopode, formant la partie moyenne du membre est considerablement rac-
courci par rapport au zeugopode de la patte temoin (Figs. 1, 2). L'aile, atteinte
par la substance toxique, presente les memes types d'alterations que la patte.
La croissance du membre est inhibee, des hematomes et des oedemes plus ou
moins etendus apparaissent.
La plupart des pattes ou des ailes phocomeles (23 pattes, 17 ailes) provenant
d'embryons ages de 10 a 11 jours presentaient un hematome 24 a 72 h apres le
traitement (Tableaux 3, 4), 5 pattes et 6 ailes etaient de taille reduite et avaient
un aspect opaque. Ces plages hemorragiques sont surtout visibles 48 h apres le
traitement, elles apparaissent plus tardivement dans la patte que dans l'aile.
Notons qu'a l'autopsie, on ne retrouve ni cedeme, ni kyste hemorragique. Les
parties distales qui subsistent sont saines, irriguees et innervees.
Les experiences de localisation de la substance sur les membres ont, en outre,
montre que dans les cas
de fortes hemorragies, observees 48 h apres le traitement,
la croissance du membre est definitivement arretee. A l'autopsie, l'aile ou la
patte sont absentes ou encore sont reduites a de petits moignons sans structure
bien definie. Le type de malformation obtenue depend du degre d'alterations du
bourgeon de membre, ces alterations etant particulierement intenses 48 a 72 h
apres le traitement.
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