Devenir du génome VIH-1 : du transport intracellulaire jusqu`à l

Devenir du génome VIH-1 : du transport
intracellulaire jusqu’àl’intégration
Nathalie Arhel
Pierre Charneau
Institut Pasteur,
25-28 rue du Dr-Roux,
75724 Paris, France
<[email protected]>
Adresse actuelle :
Université clinique d’Ulm,
Institut de virologie Albert-Einstein-Allee
11, 89081 Ulm, Allemagne
<[email protected]>
Résumé. L’étude des étapes précoces de l’infection VIH-1 est nécessaire pour
comprendre comment le virus interagit avec la machinerie cellulaire afin
d’usurper les fonctions dont il a besoin pour se répliquer. Les connaissances
acquises dans ce domaine sont d’une grande importance dans la mise en
place de nouvelles stratégies antivirales, ainsi que dans l’élaboration de vec-
teurs de transfert de gène dérivés du VIH-1 dont les étapes précoces sont iden-
tiques à celles du VIH-1. Cette revue présente notre connaissance actuelle des
étapes du cycle réplicatif du VIH-1 depuis son entrée dans la cellule jusqu’à
son intégration dans la chromatine de la cellule-cible.
Mots clés
: VIH-1, transport viral, import nucléaire, ADN Flap,
rétrotranscription
Abstract. The study of the early steps of HIV-1 infection is necessary to
understand how the virus interacts with the cellular machinery to usurp the
functions it requires for its replication. Our understanding in this field is criti-
cal for the establishment of new antiviral strategies and the development of
gene transfer vectors derived from HIV-1 whose early steps are identical to
those of HIV-1. This review aims to present our current understanding of the
first part of the HIV-1 replication cycle, from its entry into the cell to its inte-
gration in the host cell chromatin.
Keywords
: HIV-1, viral transport, nuclear import, DNA Flap, reverse
transcription
Introduction
Le prix Nobel de médecine de l’année 2008 a récompensé
la découverte de l’agent responsable du syndrome de
l’immunodéficience acquise (sida), le VIH-1 [1]. À cette
découverte ont succédé 25 années de recherche dont
l’ampleur sans précédent a permis de caractériser de nom-
breuses étapes clés du cycle réplicatif du VIH-1 et de
développer des approches thérapeutiques qui, bien qu’en-
core inefficaces en termes d’éradication du virus, ont pu
changer la donne pour les patients infectés par le VIH.
La réplication du VIH-1 dépend entièrement de son accès
au noyau de la cellule-cible et de son intégration dans la
chromatine. Cependant, pour atteindre son site de réplica-
tion, le virus doit faire face à une série d’obstacles. Après
son entrée dans la cellule, le VIH-1 doit tout d’abord tra-
verser le cytoplasme afin d’atteindre la membrane
nucléaire. Mais la taille du virus exclut sa diffusion passive
dans le cytoplasme dense et visqueux de la cellule, et
implique le besoin d’un transport cytoplasmique actif.
Ensuite, le virus doit pouvoir traverser la membrane
nucléaire afin d’accéder à la chromatine. Alors que la plu-
part des autres rétrovirus sont dépendants de la désagréga-
tion de la membrane nucléaire afin d’accéder au noyau, le
VIH-1 (ainsi que les autres lentivirus) bénéficie d’un import
nucléaire actif de son génome via un routage intracytoplas-
mique bien défini suivi de la translocation du génome viral
au travers les pores nucléaires intacts du noyau interpha-
sique [2]. Ainsi, le VIH-1 se distingue de la plupart des
autres rétrovirus par sa capacité unique à s’intégrer et se
répliquer de manière efficace dans des cellules-cibles qui
ne se divisent pas, comme les macrophages [3, 4].
En comparaison aux autres étapes du cycle réplicatif du
VIH-1, peu d’études se sont consacrées au devenir des
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doi: 10.1684/vir.2009.0245
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complexes réplicatifs depuis leur présence dans le cyto-
plasme suite à la fusion avec la membrane plasmique de
la cellule, jusqu’à leur intégration dans la chromatine.
De plus, les études qui s’y sont consacrées ont parfois
conduit à des conclusions trompeuses voire inexactes, à
cause d’hypothèses de départ contraignantes, de méthodes
expérimentales inadaptées au VIH-1, ou tout simplement
d’outils pas encore assez performants pour permettre une
étude fine du comportement des complexes intracellulaires
peu nombreux du VIH-1 durant les étapes précoces de sa
réplication. Le but de cette revue est d’exposer notre
connaissance actuelle des étapes précoces de l’infection
par le VIH-1, depuis les événements immédiatement post-
fusion jusqu’à son intégration dans l’ADN cellulaire.
Devenir du génome VIH-1 dans la cellule
Le génome des virions VIH-1 consiste en deux molécules
identiques d’ARN simple brin. Ces molécules d’ARN inte-
ragissent avec des protéines virales : la nucléocapside
(NC), la transcriptase inverse (RT), et l’intégrase (IN).
Après son entrée dans la cellule, le génome ARN est
converti en double brin d’ADN durant le processus de
rétrotranscription (ou transcription inverse) qui utilise les
fonctions polymérase et RNase H de la RT ainsi que les
nucléotides cellulaires. Les complexes VIH-1 intracyto-
plasmiques depuis leur entrée dans la cellule jusqu’à
l’achèvement de la rétrotranscription sont appelés « com-
plexes de rétrotranscription » (RTC) (figure 1). La rétrotran-
scription est entièrement achevée avant l’import dans le
noyau et l’intégration dans la chromatine [5]. Les com-
plexes VIH-1 intracellulaires rétrotranscrits et jusqu’à leur
intégration dans la chromatine sont alors appelés com-
plexes de pré-intégration (PIC, figure 1). Après intégration,
le provirus est transcrit en ARN messagers (ARNm), qui
permettent la production de protéines virales, et en ARN
génomiques, qui seront à leur tour incorporés dans les
virions nouvellement produits.
Devenir de la capside VIH-1
dans la cellule
Le modèle du cycle de réplication du VIH-1 couramment
accepté stipule que le virus subit la perte de sa capside
(décapsidation) immédiatement après son entrée dans le
cytoplasme. Cette décapsidation post-fusion serait, selon
ce modèle, l’étape clé pour déclencher la rétrotranscription
rendue dès lors possible par le libre accès des nucléotides
cytoplasmiques au RTC. Cependant, les étapes limitantes
de la rétrotranscription, telles que les pauses de polyméri-
sation, les transferts de brins, et la formation de l’ADN Flap
(voir ci-dessous), nécessitent au contraire le maintien d’une
Virion
RTC
RTC
RTC
PIC
Microtubules
Filaments
d’actine
Filaments
d’actine
Pore nucléaire
Membrane
plasmique
Figure 1. Modèle des étapes précoces de l’infection VIH-1 indiquant la terminologie utilisée pour désigner les différents complexes VIH-1.
Les virions VIH-1 pénètrent la cellule par fusion puis traversent le réseau d’actine qui sous-tend la membrane plasmique. L’environnement
métabolique du cytoplasme et la présence des nucléotides, qui accèdent librement au génome viral au travers la cage de capside,
déclenche la rétrotranscription. Les complexes de rétrotranscription (RTC), qui possèdent encore la capside virale, se déplacent sur les
microtubules vers le noyau. Les RTC sont alors transférés sur les filaments d’actine qui entourent le noyau, pour enfin s’amarrer aux
pores nucléaires. L’achèvement de la rétrotranscription conduit à la décapsidation et la formation des complexes de pré-intégration (PIC)
qui sont désormais de taille compatible à la translocation par le pore nucléaire.
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haute concentration de RT autour des intermédiaires du
génome [6, 7]. Chaque virion ne contient que 80 à
120 copies de RT [8], ce qui laisse supposer qu’une déca-
psidation immédiatement post-fusion conduirait à la diffu-
sion passive de ces enzymes dans l’ensemble du cyto-
plasme et rendrait la rétrotranscription impossible. Par
ailleurs, la cage de capside est un arrangement protéique
d’hexamères et de pentamères de capside (p24) comportant
des espacements de 25 à 100 Å [9], et donc entièrement
perméable aux nucléotides dont la taille est de l’ordre de
quelques ångströms. Ainsi, l’hypothèse de la nécessité de
la décapsidation afin de déclencher la rétrotranscription ne
serait pas pertinente.
En accord avec ces observations, des études de microscopie
montrent que les protéines de capsides ne sont pas disper-
sées dans le cytoplasme après l’entrée virale, comme il
serait attendu d’une décapsidation précoce, mais s’accumu-
lent de manière transitoire à la membrane nucléaire [5]. Par
ailleurs, une technique de microscopie électronique à
balayage sur noyaux décapés montre que ces protéines de
capsides ne sont pas monomériques, mais assemblées sous
forme de cage de capside intègre, issue directement du
« core » de la particule (figure 2) [5], et contenant le génome
viral rétrotranscrit [5, 10]. La disparition des capsides vira-
les entre 24 et 48 heures après infection coïncide avec la
synthèse de l’ADN viral complet et à l’entrée de l’ADN
viral dans le noyau [5, 11, 12], indiquant que le virus perd
sa capside avant d’entrer dans le noyau. Cette étape de déca-
psidation est d’ailleurs impérative étant donné la taille de la
capside qui excède le diamètre du pore nucléaire.
Le maintien de la cage de capside pendant la totalité de la
rétrotranscription implique donc que la capside VIH-1 est
la structure virale qui interagit avec la cellule hôte pendant
l’ensemble du transport cytoplasmique et de l’amarrage au
pore nucléaire.
Transport cytoplasmique du VIH-1
Durant leur cycle réplicatif, les virus doivent pouvoir se
déplacer de la membrane plasmique à leur site de réplica-
tion puis de nouveau à la membrane plasmique afin de pou-
voir se propager. La diffusion passive dans le cytoplasme
étant très inefficace et conduisant rarement à la destination
requise, les virus ont développé des mécanismes leur per-
mettant d’usurper la machinerie cellulaire de transport, nor-
malement destinée au transport de protéines et de vésicules
cellulaires [13].
Le transport actif cytoplasmique est assuré par le cytosque-
lette de la cellule, qui comporte les filaments d’actine (ou
microfilaments), les filaments intermédiaires, et les micro-
tubules. Ces filaments protéiques s’étendent dans tout le
cytoplasme avec des zones de réseau plus denses et permet-
tent aux cellules de s’adapter à leur environnement, tout en
assurant le transit des nombreuses structures et molécules
dans le cytoplasme. Les filaments intermédiaires sont prin-
cipalement impliqués dans le maintien de la structure cel-
lulaire face aux déformations mécaniques. N’étant pas
polarisés, ils n’assurent pas de transport directionnel.
Les filaments d’actine se concentrent essentiellement en
périphérie de la cellule et au pourtour du noyau. Ces fila-
ments de 7-9 nm d’épaisseur assurent les transports actifs
cytoplasmiques sur de courtes distances, soit par la poly-
mérisation de l’actine monomérique, soit par les protéines
motrices des filaments d’actine, appelées myosines.
Les microtubules, quant à eux, sont plus épais (25 nm de
diamètre) et s’étendent de la périphérie de la cellule au cen-
tre d’organisation des microtubules (MTOC). Ils assurent
un transport actif sur de longues distances, soit de la péri-
phérie de la cellule au centre cellulaire (mouvement rétro-
grade) par la dynéine, soit du centre de la cellule vers la
périphérie (mouvement antérograde) par la kinésine.
L’implication des filaments d’actine ou des microtubules
dans le transport d’un virus vers son site de réplication est
souvent établie par l’utilisation de drogues dépolymérisan-
tes et l’observation de leur effet sur l’infection virale. De par
leur effet concomitant sur de nombreuses fonctions cellu-
laires, telles que la mitose, le transport de vésicules et
l’interaction avec l’environnement cellulaire, ces drogues
conduisent à des résultats souvent difficiles à interpréter.
Dans le domaine du VIH-1, l’utilisation de drogues affec-
tant la polymérisation du cytosquelette au moment de
l’infection a donné des résultats contradictoires, ne permet-
tant pas de démontrer de façon certaine l’implication d’un
moteur cellulaire. Par ailleurs, une même drogue peut avoir
des effets différents en fonction du moment de l’infection
auquel elle est ajoutée [14, 15]. Ainsi, l’utilisation des dro-
gues affectant la polymérisation de l’actine ou des micro-
tubules peut conduire à des résultats contradictoires selon
leur utilisation expérimentale, et ne procure pas les détails
mécanistiques recherchés.
L’avènement de l’imagerie dynamique couplée au suivi de
particules uniques a ouvert la voie à une étude mécanis-
tique fine de l’implication du cytosquelette dans l’infection
VIH-1. En 2002, le marquage de la protéine virale Vpr a
permis la première observation de l’infection VIH-1 en
cellules vivantes et a démontré l’implication des micro-
tubules dans le transport actif des virus vers le noyau
[10]. Cependant, la nature encombrante de la GFP qui
conduit à une perte d’infectivité lors de sa fusion génétique
dans gag/pol,etl’inaccessibilité de plusieurs étapes de
l’infection VIH-1 par le marquage de Vpr, notamment les
événements intranucléaires, témoignent des limites de cette
étude. Plus récemment, le marquage de l’intégrase (IN), qui
est la seule protéine virale pour laquelle une association
avec le génome viral jusqu’à son intégration est bien éta-
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blie, par l’insertion d’une courte séquence peptidique qui
interagit de manière spécifique avec un dérivé de la fluo-
rescéine appelé FlAsH (Fluorescein Arsenical Helix bin-
der, bis-EDT adduct), a permis de suivre le devenir du
génome VIH-1 depuis son entrée dans la cellule jusqu’à
son intégration [15]. Ainsi, par une méthode qui s’appuie
sur l’observation des complexes VIH-1 individuels par
imagerie dynamique en 3D et sur le suivi semi-automatisé
de particules par un logiciel informatique, les virus indivi-
duels ont pu pour la première fois être suivis depuis leur
entrée dans la cellule jusqu’à leur intégration dans le noyau
(figure 3) [15-17].
Les données cinétiques ainsi obtenues ont permis de décrire
de nouvelles étapes dans le cycle précoce de l’infection
VIH-1. Tout d’abord, les virus utilisent le réseau microtu-
bule pour un transport rapide et sur de longues distances
vers le noyau [10, 15]. Ce mouvement rectiligne dirigé
atteint des vitesses de 1 μm/s et transporte les virus depuis
la membrane plasmique jusqu’à la périphérie du noyau.
Bien qu’une accumulation au MTOC du VIH-1 entrant ait
été décrite [10], l’accès des complexes VIH-1 aux pores
nucléaires n’implique ni leur accumulation au MTOC, ni
leur transition directe des microtubules à la membrane
nucléaire [15]. En effet, au voisinage de la membrane
nucléaire, le déplacement des virus devient plus lent et cur-
viligne, traduisant la transition des complexes VIH-1 sur un
autre réseau, les filaments d’actine. Cette implication des
filaments d’actine à proximité de la membrane nucléaire est
confirmée par l’utilisation d’inhibiteurs de l’actine, et par
l’observation de la co-localisation des complexes viraux et
du réseau d’actine par microscopie à fluorescence et
microscopie électronique à balayage [5, 15]. Ainsi le trans-
port cytoplasmique du VIH-1 résulte des transitions suc-
cessives entre un mouvement rapide et dirigé dépendant
des microtubules [10, 15], suivi d’un mouvement plus
lent mais aussi dirigé dépendant des filaments d’actine à
la membrane nucléaire [15], avant l’association des virus
à la membrane nucléaire.
L’implication des filaments d’actine et des microtubules
dans l’infection VIH-1 a récemment été confirmée et pré-
cisée par trois études utilisant un criblage extensif à base
3,33 µm
A
1,25 µm
B
0,1 µm
npc
npc
Marquage anti-capside VIH - 1
C
Figure 2. Observation par microscopie électronique à balayage de
complexes VIH-1 à la surface de noyaux décapés (technique décrite
dans [5]). (A) Le décapage de cultures cellulaires fixées laisse appa-
raître les noyaux entourés de restes du cytosquelette. (B) Les pores
nucléaires apparaissent comme de petites structures globulaires ou,
plus précisément, en forme d’anneau sur toute la surface du noyau.
Le décapage emporte parfois le nucléole, laissant une cavité dans
laquelle on aperçoit la chromatine. (C) Après infection avec des
virus dépourvus d’ADN Flap, on observe des structures amarrées
aux pores nucléaires (npc) qui ressemblent à des capsides virales
et sont identifiées par un marquage spécifique anti-capside VIH-1.
Il s’agit donc de capsides VIH-1 intègres (indiquées par une flèche)
issues directement du core de la particule virale.
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d’ARN interférence afin d’identifier les facteurs cellulaires
requis pour l’infection VIH-1 [18-20]. Ces études ont per-
mis d’identifier plusieurs protéines impliquées dans le
modelage de l’actine et des microtubules et requises à
l’infection VIH-1 (tableau 1).L’implication mécanistique
de ces protéines dans le transport du VIH-1 et leur inter-
action avec une ou plusieurs protéines virales restent à
démontrer.
Amarrage au pore nucléaire
et rétrotranscription
Le transport des complexes VIH-1 à la membrane nucléaire
est très rapide (moins de 2 heures) [11, 15, 21]. Une fois
arrivés au voisinage de la membrane nucléaire, les virus se
détachent des filaments d’actine pour s’amarrer aux pores
nucléaires [15]. Les complexes se distribuent alors de
manière relativement uniforme autour de la membrane
nucléaire, ce qui est caractéristique du mouvement actine-
dépendant qui précède l’amarrage au pore nucléaire.
Les mécanismes impliqués dans cette transition et le site
d’association des complexes avec le pore nucléaire ne
sont pas connus. Cependant, la continuité qui existe entre
les filaments d’actine et les filaments cytoplasmiques du
pore nucléaire [22, 23] laisse supposer une transition
directe du virus entre les deux. Par ailleurs, l’amarrage
des complexes VIH-1 aux pores nucléaires se caractérise
par un mouvement de vibration confiné dans l’espace
[15], ce qui serait concordant avec une interaction avec
les filaments flexibles du pore, ou la propriété dynamique
de certaines nucléoporines.
Le processus de rétrotranscription est, en comparaison au
transport cytoplasmique du génome viral, beaucoup plus
Figure 3. Les trajectoires de centaines de complexes VIH-1 individuels dans les cellules infectées ont pu être analysées en combinant
imagerie dynamique (en 3 dimensions, 3D) à un logiciel semi-automatisé de suivi de particules [5]. Les trajectoires de complexes viraux
intracellulaires VIH-1 sont représentées en couleurs différentes et superposées sur les noyaux des cellules (représentation 2D à gauche,
et 3D à droite).
Tableau 1. Prote
´ines implique ´es dans la re ´gulation du cytosquelette et implique ´es dans l’infection VIH-1 [18, 19].
Élément du cytosquelette impliqué Protéine identifiée Fonction
Actine Flightless I (FliI) Gelsoline, modelage de l’actine
SPTAN1 Spectrine, réticulation de l’actine
SPTBN1 Spectrine, réticulation de l’actine
KLHL1 Interaction avec l’actine
AKAP13 Facteur d’échange de nucléotides (NEF), régule la formation des
fibres de stress d’actine
NCKAP1 Association avec les protéines WAVE qui régulent l’organisation
de l’actine
TAGLN-2 Protéineputativedelaréticulationdel’actine
Microtubules MID1IP1 Regroupement et stabilisation des microtubules
Calpain 6 Stabilisation des microtubules et organisation du cytosquelette
MAP 4 Polymérisation des microtubules et stabilité
RP3-355C18.2 Tubuline tyrosine ligase (TTL) putative
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