Devenir du génome VIH-1 : du transport intracellulaire jusqu`à l

revue
Virologie 2009, 13 (no spcial) : S5-S13
Devenir du génome VIH-1 : du transport
intracellulaire jusqu’à l’intégration
Nathalie Arhel
Pierre Charneau
Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017.
Institut Pasteur,
25-28 rue du Dr-Roux,
75724 Paris, France
<[email protected]>
Adresse actuelle :
Université clinique d’Ulm,
Institut de virologie Albert-Einstein-Allee
11, 89081 Ulm, Allemagne
<[email protected]>
Résumé. L’étude des étapes précoces de l’infection VIH-1 est nécessaire pour
comprendre comment le virus interagit avec la machinerie cellulaire afin
d’usurper les fonctions dont il a besoin pour se répliquer. Les connaissances
acquises dans ce domaine sont d’une grande importance dans la mise en
place de nouvelles stratégies antivirales, ainsi que dans l’élaboration de vecteurs de transfert de gène dérivés du VIH-1 dont les étapes précoces sont identiques à celles du VIH-1. Cette revue présente notre connaissance actuelle des
étapes du cycle réplicatif du VIH-1 depuis son entrée dans la cellule jusqu’à
son intégration dans la chromatine de la cellule-cible.
Mots clés : VIH-1, transport viral, import nucléaire, ADN Flap,
rétrotranscription
Abstract. The study of the early steps of HIV-1 infection is necessary to
understand how the virus interacts with the cellular machinery to usurp the
functions it requires for its replication. Our understanding in this field is critical for the establishment of new antiviral strategies and the development of
gene transfer vectors derived from HIV-1 whose early steps are identical to
those of HIV-1. This review aims to present our current understanding of the
first part of the HIV-1 replication cycle, from its entry into the cell to its integration in the host cell chromatin.
Keywords: HIV-1, viral transport, nuclear import, DNA Flap, reverse
transcription
doi: 10.1684/vir.2009.0245
Introduction
Le prix Nobel de médecine de l’année 2008 a récompensé
la découverte de l’agent responsable du syndrome de
l’immunodéficience acquise (sida), le VIH-1 [1]. À cette
découverte ont succédé 25 années de recherche dont
l’ampleur sans précédent a permis de caractériser de nombreuses étapes clés du cycle réplicatif du VIH-1 et de
développer des approches thérapeutiques qui, bien qu’encore inefficaces en termes d’éradication du virus, ont pu
changer la donne pour les patients infectés par le VIH.
La réplication du VIH-1 dépend entièrement de son accès
au noyau de la cellule-cible et de son intégration dans la
chromatine. Cependant, pour atteindre son site de réplication, le virus doit faire face à une série d’obstacles. Après
son entrée dans la cellule, le VIH-1 doit tout d’abord traverser le cytoplasme afin d’atteindre la membrane
Virologie, Vol. 13, no spcial, mai 2009
nucléaire. Mais la taille du virus exclut sa diffusion passive
dans le cytoplasme dense et visqueux de la cellule, et
implique le besoin d’un transport cytoplasmique actif.
Ensuite, le virus doit pouvoir traverser la membrane
nucléaire afin d’accéder à la chromatine. Alors que la plupart des autres rétrovirus sont dépendants de la désagrégation de la membrane nucléaire afin d’accéder au noyau, le
VIH-1 (ainsi que les autres lentivirus) bénéficie d’un import
nucléaire actif de son génome via un routage intracytoplasmique bien défini suivi de la translocation du génome viral
au travers les pores nucléaires intacts du noyau interphasique [2]. Ainsi, le VIH-1 se distingue de la plupart des
autres rétrovirus par sa capacité unique à s’intégrer et se
répliquer de manière efficace dans des cellules-cibles qui
ne se divisent pas, comme les macrophages [3, 4].
En comparaison aux autres étapes du cycle réplicatif du
VIH-1, peu d’études se sont consacrées au devenir des
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revue
complexes réplicatifs depuis leur présence dans le cytoplasme suite à la fusion avec la membrane plasmique de
la cellule, jusqu’à leur intégration dans la chromatine.
De plus, les études qui s’y sont consacrées ont parfois
conduit à des conclusions trompeuses voire inexactes, à
cause d’hypothèses de départ contraignantes, de méthodes
expérimentales inadaptées au VIH-1, ou tout simplement
d’outils pas encore assez performants pour permettre une
étude fine du comportement des complexes intracellulaires
peu nombreux du VIH-1 durant les étapes précoces de sa
réplication. Le but de cette revue est d’exposer notre
connaissance actuelle des étapes précoces de l’infection
par le VIH-1, depuis les événements immédiatement postfusion jusqu’à son intégration dans l’ADN cellulaire.
plasmiques depuis leur entrée dans la cellule jusqu’à
l’achèvement de la rétrotranscription sont appelés « complexes de rétrotranscription » (RTC) (figure 1). La rétrotranscription est entièrement achevée avant l’import dans le
noyau et l’intégration dans la chromatine [5]. Les complexes VIH-1 intracellulaires rétrotranscrits et jusqu’à leur
intégration dans la chromatine sont alors appelés complexes de pré-intégration (PIC, figure 1). Après intégration,
le provirus est transcrit en ARN messagers (ARNm), qui
permettent la production de protéines virales, et en ARN
génomiques, qui seront à leur tour incorporés dans les
virions nouvellement produits.
Devenir de la capside VIH-1
dans la cellule
Devenir du génome VIH-1 dans la cellule
Le génome des virions VIH-1 consiste en deux molécules
identiques d’ARN simple brin. Ces molécules d’ARN interagissent avec des protéines virales : la nucléocapside
(NC), la transcriptase inverse (RT), et l’intégrase (IN).
Après son entrée dans la cellule, le génome ARN est
converti en double brin d’ADN durant le processus de
rétrotranscription (ou transcription inverse) qui utilise les
fonctions polymérase et RNase H de la RT ainsi que les
nucléotides cellulaires. Les complexes VIH-1 intracyto-
Le modèle du cycle de réplication du VIH-1 couramment
accepté stipule que le virus subit la perte de sa capside
(décapsidation) immédiatement après son entrée dans le
cytoplasme. Cette décapsidation post-fusion serait, selon
ce modèle, l’étape clé pour déclencher la rétrotranscription
rendue dès lors possible par le libre accès des nucléotides
cytoplasmiques au RTC. Cependant, les étapes limitantes
de la rétrotranscription, telles que les pauses de polymérisation, les transferts de brins, et la formation de l’ADN Flap
(voir ci-dessous), nécessitent au contraire le maintien d’une
Filaments
d’actine
Membrane
plasmique
RTC
RTC
Pore nucléaire
Virion
RTC
Microtubules
Filaments
d’actine
PIC
Figure 1. Modèle des étapes précoces de l’infection VIH-1 indiquant la terminologie utilisée pour désigner les différents complexes VIH-1.
Les virions VIH-1 pénètrent la cellule par fusion puis traversent le réseau d’actine qui sous-tend la membrane plasmique. L’environnement
métabolique du cytoplasme et la présence des nucléotides, qui accèdent librement au génome viral au travers la cage de capside,
déclenche la rétrotranscription. Les complexes de rétrotranscription (RTC), qui possèdent encore la capside virale, se déplacent sur les
microtubules vers le noyau. Les RTC sont alors transférés sur les filaments d’actine qui entourent le noyau, pour enfin s’amarrer aux
pores nucléaires. L’achèvement de la rétrotranscription conduit à la décapsidation et la formation des complexes de pré-intégration (PIC)
qui sont désormais de taille compatible à la translocation par le pore nucléaire.
S6
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haute concentration de RT autour des intermédiaires du
génome [6, 7]. Chaque virion ne contient que 80 à
120 copies de RT [8], ce qui laisse supposer qu’une décapsidation immédiatement post-fusion conduirait à la diffusion passive de ces enzymes dans l’ensemble du cytoplasme et rendrait la rétrotranscription impossible. Par
ailleurs, la cage de capside est un arrangement protéique
d’hexamères et de pentamères de capside (p24) comportant
des espacements de 25 à 100 Å [9], et donc entièrement
perméable aux nucléotides dont la taille est de l’ordre de
quelques ångströms. Ainsi, l’hypothèse de la nécessité de
la décapsidation afin de déclencher la rétrotranscription ne
serait pas pertinente.
En accord avec ces observations, des études de microscopie
montrent que les protéines de capsides ne sont pas dispersées dans le cytoplasme après l’entrée virale, comme il
serait attendu d’une décapsidation précoce, mais s’accumulent de manière transitoire à la membrane nucléaire [5]. Par
ailleurs, une technique de microscopie électronique à
balayage sur noyaux décapés montre que ces protéines de
capsides ne sont pas monomériques, mais assemblées sous
forme de cage de capside intègre, issue directement du
« core » de la particule (figure 2) [5], et contenant le génome
viral rétrotranscrit [5, 10]. La disparition des capsides virales entre 24 et 48 heures après infection coïncide avec la
synthèse de l’ADN viral complet et à l’entrée de l’ADN
viral dans le noyau [5, 11, 12], indiquant que le virus perd
sa capside avant d’entrer dans le noyau. Cette étape de décapsidation est d’ailleurs impérative étant donné la taille de la
capside qui excède le diamètre du pore nucléaire.
Le maintien de la cage de capside pendant la totalité de la
rétrotranscription implique donc que la capside VIH-1 est
la structure virale qui interagit avec la cellule hôte pendant
l’ensemble du transport cytoplasmique et de l’amarrage au
pore nucléaire.
Transport cytoplasmique du VIH-1
Durant leur cycle réplicatif, les virus doivent pouvoir se
déplacer de la membrane plasmique à leur site de réplication puis de nouveau à la membrane plasmique afin de pouvoir se propager. La diffusion passive dans le cytoplasme
étant très inefficace et conduisant rarement à la destination
requise, les virus ont développé des mécanismes leur permettant d’usurper la machinerie cellulaire de transport, normalement destinée au transport de protéines et de vésicules
cellulaires [13].
Le transport actif cytoplasmique est assuré par le cytosquelette de la cellule, qui comporte les filaments d’actine (ou
microfilaments), les filaments intermédiaires, et les microtubules. Ces filaments protéiques s’étendent dans tout le
cytoplasme avec des zones de réseau plus denses et permetVirologie, Vol. 13, no spcial, mai 2009
tent aux cellules de s’adapter à leur environnement, tout en
assurant le transit des nombreuses structures et molécules
dans le cytoplasme. Les filaments intermédiaires sont principalement impliqués dans le maintien de la structure cellulaire face aux déformations mécaniques. N’étant pas
polarisés, ils n’assurent pas de transport directionnel.
Les filaments d’actine se concentrent essentiellement en
périphérie de la cellule et au pourtour du noyau. Ces filaments de 7-9 nm d’épaisseur assurent les transports actifs
cytoplasmiques sur de courtes distances, soit par la polymérisation de l’actine monomérique, soit par les protéines
motrices des filaments d’actine, appelées myosines.
Les microtubules, quant à eux, sont plus épais (25 nm de
diamètre) et s’étendent de la périphérie de la cellule au centre d’organisation des microtubules (MTOC). Ils assurent
un transport actif sur de longues distances, soit de la périphérie de la cellule au centre cellulaire (mouvement rétrograde) par la dynéine, soit du centre de la cellule vers la
périphérie (mouvement antérograde) par la kinésine.
L’implication des filaments d’actine ou des microtubules
dans le transport d’un virus vers son site de réplication est
souvent établie par l’utilisation de drogues dépolymérisantes et l’observation de leur effet sur l’infection virale. De par
leur effet concomitant sur de nombreuses fonctions cellulaires, telles que la mitose, le transport de vésicules et
l’interaction avec l’environnement cellulaire, ces drogues
conduisent à des résultats souvent difficiles à interpréter.
Dans le domaine du VIH-1, l’utilisation de drogues affectant la polymérisation du cytosquelette au moment de
l’infection a donné des résultats contradictoires, ne permettant pas de démontrer de façon certaine l’implication d’un
moteur cellulaire. Par ailleurs, une même drogue peut avoir
des effets différents en fonction du moment de l’infection
auquel elle est ajoutée [14, 15]. Ainsi, l’utilisation des drogues affectant la polymérisation de l’actine ou des microtubules peut conduire à des résultats contradictoires selon
leur utilisation expérimentale, et ne procure pas les détails
mécanistiques recherchés.
L’avènement de l’imagerie dynamique couplée au suivi de
particules uniques a ouvert la voie à une étude mécanistique fine de l’implication du cytosquelette dans l’infection
VIH-1. En 2002, le marquage de la protéine virale Vpr a
permis la première observation de l’infection VIH-1 en
cellules vivantes et a démontré l’implication des microtubules dans le transport actif des virus vers le noyau
[10]. Cependant, la nature encombrante de la GFP qui
conduit à une perte d’infectivité lors de sa fusion génétique
dans gag/pol, et l’inaccessibilité de plusieurs étapes de
l’infection VIH-1 par le marquage de Vpr, notamment les
événements intranucléaires, témoignent des limites de cette
étude. Plus récemment, le marquage de l’intégrase (IN), qui
est la seule protéine virale pour laquelle une association
avec le génome viral jusqu’à son intégration est bien étaS7
revue
blie, par l’insertion d’une courte séquence peptidique qui
interagit de manière spécifique avec un dérivé de la fluorescéine appelé FlAsH (Fluorescein Arsenical Helix binder, bis-EDT adduct), a permis de suivre le devenir du
génome VIH-1 depuis son entrée dans la cellule jusqu’à
son intégration [15]. Ainsi, par une méthode qui s’appuie
sur l’observation des complexes VIH-1 individuels par
imagerie dynamique en 3D et sur le suivi semi-automatisé
de particules par un logiciel informatique, les virus individuels ont pu pour la première fois être suivis depuis leur
entrée dans la cellule jusqu’à leur intégration dans le noyau
(figure 3) [15-17].
Les données cinétiques ainsi obtenues ont permis de décrire
de nouvelles étapes dans le cycle précoce de l’infection
VIH-1. Tout d’abord, les virus utilisent le réseau microtubule pour un transport rapide et sur de longues distances
vers le noyau [10, 15]. Ce mouvement rectiligne dirigé
atteint des vitesses de 1 μm/s et transporte les virus depuis
la membrane plasmique jusqu’à la périphérie du noyau.
Bien qu’une accumulation au MTOC du VIH-1 entrant ait
été décrite [10], l’accès des complexes VIH-1 aux pores
nucléaires n’implique ni leur accumulation au MTOC, ni
leur transition directe des microtubules à la membrane
nucléaire [15]. En effet, au voisinage de la membrane
nucléaire, le déplacement des virus devient plus lent et curviligne, traduisant la transition des complexes VIH-1 sur un
autre réseau, les filaments d’actine. Cette implication des
filaments d’actine à proximité de la membrane nucléaire est
confirmée par l’utilisation d’inhibiteurs de l’actine, et par
l’observation de la co-localisation des complexes viraux et
du réseau d’actine par microscopie à fluorescence et
microscopie électronique à balayage [5, 15]. Ainsi le transport cytoplasmique du VIH-1 résulte des transitions successives entre un mouvement rapide et dirigé dépendant
des microtubules [10, 15], suivi d’un mouvement plus
lent mais aussi dirigé dépendant des filaments d’actine à
la membrane nucléaire [15], avant l’association des virus
à la membrane nucléaire.
L’implication des filaments d’actine et des microtubules
dans l’infection VIH-1 a récemment été confirmée et précisée par trois études utilisant un criblage extensif à base
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A
3,33 µm
B
1,25 µm
C
npc
npc
0,1 µm
Marquage anti-capside VIH - 1
S8
Figure 2. Observation par microscopie électronique à balayage de
complexes VIH-1 à la surface de noyaux décapés (technique décrite
dans [5]). (A) Le décapage de cultures cellulaires fixées laisse apparaître les noyaux entourés de restes du cytosquelette. (B) Les pores
nucléaires apparaissent comme de petites structures globulaires ou,
plus précisément, en forme d’anneau sur toute la surface du noyau.
Le décapage emporte parfois le nucléole, laissant une cavité dans
laquelle on aperçoit la chromatine. (C) Après infection avec des
virus dépourvus d’ADN Flap, on observe des structures amarrées
aux pores nucléaires (npc) qui ressemblent à des capsides virales
et sont identifiées par un marquage spécifique anti-capside VIH-1.
Il s’agit donc de capsides VIH-1 intègres (indiquées par une flèche)
issues directement du core de la particule virale.
Virologie, Vol. 13, no spcial, mai 2009
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revue
Figure 3. Les trajectoires de centaines de complexes VIH-1 individuels dans les cellules infectées ont pu être analysées en combinant
imagerie dynamique (en 3 dimensions, 3D) à un logiciel semi-automatisé de suivi de particules [5]. Les trajectoires de complexes viraux
intracellulaires VIH-1 sont représentées en couleurs différentes et superposées sur les noyaux des cellules (représentation 2D à gauche,
et 3D à droite).
d’ARN interférence afin d’identifier les facteurs cellulaires
requis pour l’infection VIH-1 [18-20]. Ces études ont permis d’identifier plusieurs protéines impliquées dans le
modelage de l’actine et des microtubules et requises à
l’infection VIH-1 (tableau 1). L’implication mécanistique
de ces protéines dans le transport du VIH-1 et leur interaction avec une ou plusieurs protéines virales restent à
démontrer.
Amarrage au pore nucléaire
et rétrotranscription
Le transport des complexes VIH-1 à la membrane nucléaire
est très rapide (moins de 2 heures) [11, 15, 21]. Une fois
arrivés au voisinage de la membrane nucléaire, les virus se
détachent des filaments d’actine pour s’amarrer aux pores
nucléaires [15]. Les complexes se distribuent alors de
manière relativement uniforme autour de la membrane
nucléaire, ce qui est caractéristique du mouvement actinedépendant qui précède l’amarrage au pore nucléaire.
Les mécanismes impliqués dans cette transition et le site
d’association des complexes avec le pore nucléaire ne
sont pas connus. Cependant, la continuité qui existe entre
les filaments d’actine et les filaments cytoplasmiques du
pore nucléaire [22, 23] laisse supposer une transition
directe du virus entre les deux. Par ailleurs, l’amarrage
des complexes VIH-1 aux pores nucléaires se caractérise
par un mouvement de vibration confiné dans l’espace
[15], ce qui serait concordant avec une interaction avec
les filaments flexibles du pore, ou la propriété dynamique
de certaines nucléoporines.
Le processus de rétrotranscription est, en comparaison au
transport cytoplasmique du génome viral, beaucoup plus
Tableau 1. Protéines impliquées dans la régulation du cytosquelette et impliquées dans l’infection VIH-1 [18, 19].
Élément du cytosquelette impliqué
Protéine identifiée
Fonction
Actine
Flightless I (FliI)
SPTAN1
SPTBN1
KLHL1
AKAP13
Gelsoline, modelage de l’actine
Spectrine, réticulation de l’actine
Spectrine, réticulation de l’actine
Interaction avec l’actine
Facteur d’échange de nucléotides (NEF), régule la formation des
fibres de stress d’actine
Association avec les protéines WAVE qui régulent l’organisation
de l’actine
Protéine putative de la réticulation de l’actine
Regroupement et stabilisation des microtubules
Stabilisation des microtubules et organisation du cytosquelette
Polymérisation des microtubules et stabilité
Tubuline tyrosine ligase (TTL) putative
NCKAP1
Microtubules
Virologie, Vol. 13, no spcial, mai 2009
TAGLN-2
MID1IP1
Calpain 6
MAP 4
RP3-355C18.2
S9
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revue
lent puisqu’il nécessite entre 8 et 12 heures pour son achèvement [11, 12, 21]. Ainsi la grande majorité de la rétrotranscription se déroule au pore nucléaire après l’amarrage
des capsides intègres.
Après le transport des RTC dans le cytoplasme et l’achèvement de la rétrotranscription, ceux-ci doivent faire face à
une nouvelle difficulté, celle de traverser le pore nucléaire.
En effet, les dimensions de la capside virale (100 à 120 nm
de long et 50 à 60 nm de large) excèdent le diamètre du
pore nucléaire, qui est de 25 à 30 nm, ce qui implique que
la décapsidation doit impérativement avoir lieu afin de permettre l’import nucléaire du génome viral.
Import nucléaire du génome VIH-1
La capacité unique du VIH-1 et des autres lentivirus à se
répliquer de manière efficace dans les cellules qui ne se
divisent pas implique l’existence d’un import nucléaire
actif permettant au génome ADN de traverser la membrane
nucléaire du noyau interphasique pour atteindre et s’intégrer dans la chromatine cellulaire [2]. La réplication
mitose-indépendante des lentivirus est d’ailleurs la propriété clé des vecteurs de transfert de gène dérivés des lentivirus avec des applications thérapeutiques très prometteuses [24, 25]. En effet, leur capacité à transduire des cellules
non mitotiques permet de surmonter une limite majeure à
l’utilisation des vecteurs dérivés des oncovirus en thérapie
génique.
La recherche des déterminants viraux responsables de
l’import nucléaire actif du génome ADN du VIH-1 a
constitué un domaine de recherche actif mais controversé.
C’est sur la base de la recherche de séquences consensus de
localisation nucléaire que trois protéines VIH-1, MA
(matrice), Vpr et IN, ont été suggérées comme contribuant
de manière redondante aux propriétés karyophiliques du
PIC VIH-1. Cependant, la participation de ces protéines
dans l’import nucléaire du génome VIH-1 demeure controversée [26].
Par une approche indépendante, une structure à trois brins
au centre de l’ADN viral et unique aux lentivirus a été identifiée comme déterminant cis-actif de l’import nucléaire du
VIH-1 [21]. Le VIH-1 et les autres lentivirus ont développé
une stratégie de rétrotranscription plus complexe que les
autres rétrovirus, où la présence de deux séquences cisactives supplémentaires au sein du génome lentiviral, le
« central polypurine tract » (cPPT) et la séquence de terminaison centrale (CTS), conduit à la formation d’une structure ADN à trois brins appelée l’ADN Flap central [7, 27,
28] (figure 4). Des mutations dans le cPPT conduisent à un
génome viral ADN linéaire dépourvu de l’ADN Flap central, et réduisent considérablement la réplication virale.
Alors que l’ADN viral sauvage est en grande partie transS10
porté dans le noyau où il s’intègre ou se circularise, les
génomes dépourvus d’ADN Flap s’accumulent sous
forme d’ADN linéaire non intégré en dehors du compartiment nucléaire, indiquant un défaut d’import nucléaire.
Plus particulièrement, les ADN viraux rétrotranscrits
dépourvus de l’ADN Flap s’accumulent à la périphérie de
la membrane nucléaire et ne la traversent pas, ce qui
indique un défaut d’import nucléaire précédant immédiatement la translocation nucléaire [29].
Malgré le rôle démontré de l’ADN Flap dans l’import
nucléaire du VIH-1, il est important de noter que l’absence
de l’ADN Flap n’interdit pas entièrement l’import du
génome VIH-1 puisque 10 à 20 % des génomes dépourvus
d’ADN Flap sont tout de même importés dans le noyau.
Le défaut d’import nucléaire des mutants de l’ADN Flap
peut donc s’avérer atténué lorsqu’une multiplicité d’infection élevée est utilisée. Cependant, l’implication de l’ADN
Flap a été confirmée par des études ultérieures [5, 29-33], et
son inclusion systématique dans les vecteurs de transfert de
gène dérivés du VIH-1, en vue d’accroître l’efficacité de
transduction, indique son importance.
L’inhibition de l’import nucléaire en l’absence de l’ADN
Flap, bien que non absolue, suggère une implication mécanistique de l’ADN Flap dans une étape précédant immédiatement la translocation du génome viral par le pore
nucléaire. Par ailleurs, l’accumulation des cages de capsides à la membrane nucléaire est transitoire dans le cas des
virus sauvages, mais persiste pour les virus dépourvus de
l’ADN Flap [5]. Ces observations trouvent leur sens dans la
démonstration récente que la terminaison centrale qui
conduit à la formation de l’ADN Flap, qui est l’ultime
étape de la rétrotranscription, induit la maturation du complexe de RTC en PIC, libéré de l’assemblage de protéines
de capside et d’une taille compatible avec la translocation
par le pore nucléaire [5]. Ainsi, la décapsidation du VIH-1
n’est pas une étape immédiatement post-fusion, mais se
déroule après l’achèvement de la rétrotranscription et la
formation de l’ADN Flap. Le défaut d’import nucléaire
des virus dépourvus d’ADN Flap résulte de l’emprisonnement des génomes viraux à l’intérieur de capsides qui ne se
désassemblent pas.
Le mécanisme précis de la décapsidation est encore
inconnu. Il est possible que la terminaison de la rétrotranscription et la formation de l’ADN Flap induisent une gêne
stérique qui désassemble la cage de capside. Autre hypothèse, le génome viral pourrait être tiré hors de la capside
par une interaction avec une ou plusieurs protéine(s) virale
(s) ou cellulaire(s). Une fois vide de son contenu, la capside
pourrait dès lors s’affaisser et être dégradée. Après la
décapsidation, il est aussi possible que la structure ADN
Flap recrute des ligands protéiques, d’origine virale ou cellulaire, possédant des signaux de localisation nucléaire, et
permettant ainsi l’initiation de la translocation du filament
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revue
5’
3’
R U5 PBS
U3 R
R U5
U3 R
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PBS
3’ PPT
U3 R U5
PBS
cPPT
U3 R U5
U3 R U5
U3 R U5
U3 R U5
U3 R U5
cPPT CTS
cPPT CTS
U3 R U5
U3 R U5
U3 R U5
U3 R U5
U3 R U5
Lentivirus
HIV-1
U3 R U5
U3 R U5
Retrovirus de type MLV
HIV-1 cPPT-
Figure 4. Représentation comparative de la rétrotranscription des lentivirus et des rétrovirus du type MLV. La conversion du génome
ARN simple brin (trait noir) en ADN double brin (en bas de la figure), processus appelé rétrotranscription, définit les rétrovirus. La rétrotranscription est initiée par la synthèse du brin (-) d’ADN (en vert) au site PBS (primer binding site) en 5’. Après déplacement de brin, ce fragment d’ADN s’associe alors par complémentarité de la région R (Repeated) à l’extrémité 3’ du génome. La synthèse complète du brin (-)
d’ADN s’accompagne de la dégradation progressive de l’ARN de matrice. La synthèse du brin (+) d’ADN (en rouge) est initiée au site
PPT (polypurine tract) en 3’ du génome. Chez les lentivirus, l’initiation s’effectue aussi à un site PPT central. Après un second transfert
de brin, la synthèse du brin (+) se poursuit pour générer le double brin d’ADN final. Dans le cas des lentivirus, l’initiation du brin (+) à
deux sites distincts conduit au déplacement du brin aval, s’achevant au site CTS (central termination sequence) et produisant ainsi un
déplacement de brin discret de 99 nucléotides [7].
d’ADN au travers du pore nucléaire. À ce propos, des
nucléoporines et importines qui se déplacent entre la face
cytoplasmique de la membrane nucléaire et le nucléoVirologie, Vol. 13, no spcial, mai 2009
plasme ont récemment été identifiées comme participant à
l’import nucléaire du VIH-1 [18, 19, 34, 35]. Toutefois, les
mécanismes fins permettant au PIC, un filament de 9,7 kb
S11
revue
probablement complexé à de nombreuses protéines,
d’interagir et de se glisser au travers du pore nucléaire
pour atteindre la chromatine et effectuer une infection productive restent à élucider.
plexes VIH-1 subissent un mouvement intranucléaire peu
caractérisé avant de s’intégrer dans la chromatine ou de se
circulariser.
Références
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Transport intranucléaire du VIH-1
À des temps tardifs après infection (48 heures), l’ADN des
virus sauvages se trouve en majorité dans les régions
ouvertes de la chromatine [29], confirmant des travaux
qui montrent une intégration privilégiée dans les gènes activement transcrits [36]. Par ailleurs, les signaux sont détectés dans l’ensemble du compartiment nucléaire, sans préférence particulière pour les régions proches de la membrane
nucléaire, indiquant l’existence probable d’un transport
intranucléaire après translocation par le pore nucléaire et
jusqu’au site d’intégration. Cela est en accord avec les travaux de criblage des sites d’intégration du VIH, montrant
l’intégration dans tout le génome cellulaire.
En outre, les complexes intranucléaires présentent des cinétiques de déplacement entièrement différentes des complexes cytoplasmiques, avec un mouvement diffus indicatif
d’une interaction possible avec la chromatine [15]. La disparition soudaine de signaux intranucléaires (fluorescence
FlAsH associée à l’IN) pourrait correspondre à l’observation d’événements d’intégration, puis de réparation et
d’association de l’ADN proviral intégré avec les histones.
L’incidence rare des complexes intranucléaires par le marquage fluorescent de l’IN suggère que l’intégration a lieu
rapidement après l’entrée dans le compartiment nucléaire.
Conclusion
Les travaux récents dans le domaine des étapes précoces de
l’infection VIH-1 dans sa cellule hôte nous permettent
désormais de dresser un nouveau modèle du transport intracytoplasmique et de l’import nucléaire du VIH-1 (figure 1).
Les complexes VIH-1 qui entrent dans la cellule doivent
tout d’abord traverser le réseau d’actine qui sous-tend la
membrane plasmique [37]. Les capsides virales intègres
sont alors transportées rapidement vers le noyau le long
des microtubules, puis rejoignent les filaments d’actine à
proximité de la membrane nucléaire, pour enfin s’amarrer
aux pores nucléaires. L’amarrage au pore nucléaire étant
plus rapide que la rétrotranscription, nous proposons que
la majorité de la synthèse d’ADN viral s’effectue au pore
nucléaire dans une cage de capside intègre. Après la fin de
la rétrotranscription et la formation de l’ADN Flap, les
complexes amarrés subissent une décapsidation et sont
importés au travers du pore nucléaire par des mécanismes
encore peu connus. Après l’import nucléaire, les comS12
1. Barré-Sinoussi F, Chermann JC, Rey F, et al. Isolation of a Tlymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome (AIDS). Science 1983 ; 220 : 868-71.
2. Bukrinsky MI, Sharova N, Dempsey MP, et al. Active nuclear import
of human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes.
Proc Natl Acad Sci USA 1992 ; 89 : 6580-4.
3. Gartner S, Markovits P, Markovitz DM, et al. Virus isolation from
and identification of HTLV-III/LAV-producing cells in brain tissue
from a patient with AIDS. JAMA 1986 ; 256 : 2365-71.
4. Weinberg JB, Matthews TJ, Cullen BR, et al. Productive human
immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection of nonproliferating
human monocytes. J Exp Med 1991 ; 174 : 1477-82.
5. Arhel NJ, Souquere-Besse S, Munier S, et al. HIV-1 DNA Flap formation promotes uncoating of the pre-integration complex at the nuclear
pore. EMBO J 2007 ; 26 : 3025-37.
6. Klarmann GJ, Schauber CA, Preston BD. Template-directed pausing
of DNA synthesis by HIV-1 reverse transcriptase during polymerization
of HIV-1 sequences in vitro. J Biol Chem 1993 ; 268 : 9793-802.
7. Charneau P, Mirambeau G, Roux P, et al. HIV-1 reverse transcription.
A termination step at the center of the genome. J Mol Biol 1994 ; 241 :
651-62.
8. Layne SP, Merges MJ, Dembo M, et al. Factors underlying spontaneous inactivation and susceptibility to neutralization of human immunodeficiency virus. Virology 1992 ; 189 : 695-714.
9. Li S, Hill CP, Sundquist WI, et al. Image reconstructions of helical
assemblies of the HIV-1 CA protein. Nature 2000 ; 407 : 409-13.
10. McDonald D, Vodicka MA, Lucero G, et al. Visualization of the
intracellular behavior of HIV in living cells. J Cell Biol 2002 ; 159 :
441-52.
11. Barbosa P, Charneau P, Dumey N, et al. Kinetic analysis of HIV-1
early replicative steps in a coculture system. AIDS Res Hum Retroviruses 1994 ; 10 : 53-9.
12. Kim SY, Byrn R, Groopman J, et al. Temporal aspects of DNA and
RNA synthesis during human immunodeficiency virus infection : evidence for differential gene expression. J Virol 1989 ; 63 : 3708-13.
13. Radtke K, Döhner K, Sodeik B. Viral interactions with the cytoskeleton : a hitchhiker’s guide to the cell. Cell Microbiol 2006 ; 8 :
387-400.
14. Bukrinskaya A, Brichacek B, Mann A, et al. Establishment of a
functional human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) reverse transcription complex involves the cytoskeleton. J Exp Med 1998 ; 188 :
2113-25.
15. Arhel N, Genovesio A, Kim KA, et al. Quantitative fourdimensional tracking of cytoplasmic and nuclear HIV-1 complexes.
Nat Methods 2006 ; 3 : 817-24.
16. Brandenburg B, Zhuang X. Virus trafficking - learning from singlevirus tracking. Nat Rev Microbiol 2007 ; 5 : 197-208.
17. McDonald D. The inside track on HIV. Nat Methods 2006 ; 3 (10) :
782-3.
18. Brass AL, Dykxhoorn DM, Benita Y, et al. Identification of host
proteins required for HIV infection through a functional genomic screen.
Science 2008 ; 319 : 921-6.
19. König R, Zhou Y, Elleder D, et al. Global analysis of host-pathogen
interactions that regulate early-stage HIV-1 replication. Cell 2008 ; 135 :
49-60.
Virologie, Vol. 13, no spcial, mai 2009
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revue
20. Zhou H, Xu M, Huang Q, et al. Genome-scale RNAi screen for host
factors required for HIV replication. Cell Host Microbe 2008 ; 4 :
495-504.
21. Zennou V, Petit C, Guetard D, et al. HIV-1 genome nuclear import
is mediated by a central DNA flap. Cell 2000 ; 101 : 173-85.
22. Kiseleva E, Drummond SP, Goldberg MW, et al. Actin- and
protein-4.1-containing filaments link nuclear pore complexes to subnuclear organelles in Xenopus oocyte nuclei. J Cell Sci 2004 ; 117 :
2481-90.
23. Münter S, Enninga J, Vazquez-Martinez R, et al. Actin polymerisation at the cytoplasmic face of eukaryotic nuclei. BMC Cell Biol 2006 ;
7 : 23.
24. Lever AM. Lentiviral vectors : progress and potential. Curr Opin
Mol Ther 2000 ; 2 : 488-96.
25. Cockrell AS, Kafri T. Gene delivery by lentivirus vectors. Mol Biotechnol 2007 ; 36 : 184-204.
26. Fassati A. HIV infection of non-dividing cells : a divisive problem.
Retrovirology 2006 ; 3 : 74.
27. Charneau P, Clavel F. A single-stranded gap in human immunodeficiency virus unintegrated linear DNA defined by a central copy of the
polypurine tract. J Virol 1991 ; 65 : 2415-21.
28. Charneau P, Alizon M, Clavel F. A second origin of DNA plusstrand synthesis is required for optimal human immunodeficiency virus
replication. J Virol 1992 ; 66 : 2814-20.
29. Arhel NJ, Souquere-Besse S, Charneau P. Wild-type and central
DNA flap defective HIV-1 lentiviral vector genomes : intracellular
Virologie, Vol. 13, no spcial, mai 2009
visualization at ultrastructural resolution levels. Retrovirology 2006 ; 3 :
38.
30. Arhel N, Munier S, Souque P, et al. Nuclear import defect of human
immunodeficiency virus type 1 DNA flap mutants is not dependent on
the viral strain or target cell type. J Virol 2006 ; 80 : 10262-9.
31. De Rijck J, Debyser Z. The central DNA flap of the human immunodeficiency virus type 1 is important for viral replication. Biochem
Biophys Res Commun 2006 ; 349 : 1100-10.
32. Van Maele B, De Rijck J, De Clercq E, et al. Impact of the central
polypurine tract on the kinetics of human immunodeficiency virus type
1 vector transduction. J Virol 2003 ; 77 : 4685-94.
33. Ao Z, Yao X, Cohen EA. Assessment of the role of the central DNA
flap in human immunodeficiency virus type 1 replication by using a
single-cycle replication system. J Virol 2004 ; 78 : 3170-7.
34. Christ F, Thys W, De Rijck J, et al. Transportin-SR2 imports HIV
into the nucleus. Curr Biol 2008 ; 18 : 1192-202.
35. Ebina H, Aoki J, Hatta S, et al. Role of Nup98 in nuclear entry of
human immunodeficiency virus type 1 cDNA. Microbes Infect 2004 ;
6 : 715-24.
36. Schröder AR, Shinn P, Chen H, et al. HIV-1 integration in the
human genome favors active genes and local hotspots. Cell 2002 ; 110 :
521-9.
37. Campbell EM, Nunez R, Hope TJ. Disruption of the actin cytoskeleton can complement the ability of Nef to enhance human immunodeficiency virus type 1 infectivity. J Virol 2004 ; 78 : 5745-55.
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