10 enzymologie

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ENZYMOLOGIE
(Examen Juin 2006)
La malate déshydrogénase catalyse la réduction de l’oxaloacétate en malate en présence de NADH.
La réaction globale peut s’écrire :
Oxaloacétate + NADH + H
+
→ malate + NAD
+
1- Quelle expérience doit-on réaliser pour mesurer avec approximation la vitesse maximale (Vmax) de
la réaction et le K
M
de cette enzyme. Indiquez les unités dans lesquelles sont généralement exprimées ces
deux paramètres.
2- Dans les conditions de phase stationnaire, donnez l’expression de l’équation de Michaelis-Menten.
L’activité de cette enzyme extraite de la pomme de terre a été mesurée en présence de différentes
concentrations d’oxaloacétate avec une quantité d’enzyme constante.
3- Quel(s) graphique(s) va-t-on pouvoir tracer ? Indiquez sur ce(s) graphique(s) les différentes
constantes que vous pouvez déterminer.
Une enzyme, à la concentration [E
o
] = 10
-9
M, catalyse la transformation d’un substrat S en produit
P. Des mesures de la vitesse initiale Vi pour différentes concentrations en substrat ont été
effectuées et les valeurs sont présentées dans le tableau ci-dessous :
[S] x 10
4
M
0,2
0,3
0,4
0,5
0,8
1
2
4
40
45
Vi (µM.min
-
1
)
0,18
0,24
0,30
0,33
0,40
0,45
0,52
0,59
0,60
0,60
Sans aucun tracé de courbe et sans utiliser l’équation de Michaelis-Menten :
1 - Estimer les valeurs de la vitesse maximale Vmax et de la constante de Michaelis K
M
.
2 - Estimer les nouvelles valeurs de Vmax et K
M
si la concentration initiale en enzyme est
[E
o
] = 2 x 10
-9
M. Justifier votre réponse.
(Examen Mai 2006)
1 - La mesure par spectrophotométrie de l’activité en fonction du temps de la citrate
synthase extraite de la pomme de terre, donne une vitesse de 0.2 unités d’absorbance par minute.
Sachant que le coefficient d’extinction moléculaire ( ε
m
) du substrat à sa longueur d’onde d’absorption
maximale (longueur d’onde à laquelle ont été faites les mesures d’absorption précédemment réalisées) est de
20 000 M
-1
.cm
-1
, que le volume de la cuve de spectrophotométrie est de 3 mL et que la longueur du trajet
optique est de 1cm, exprimez la vitesse de cette réaction enzymatique en µmol min
-1
en justifiant vos calculs.
2 - L’ajout, en plus de la citrate synthase et de son substrat, d’une molécule inconnue dans la cuve de
réaction réduit par 2 la vitesse maximale (Vmax) observée, mais ne modifie pas le K
M
de l’enzyme pour son
substrat.
Comment définiriez-vous cette molécule inconnue vis-à-vis de la citrate synthase et de son substrat ?
Pourquoi ?
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Une lactase sert de matériel expérimental. Aux concentrations données de lactose, les vitesses
initiales de la réaction sont les suivantes :
[lactose] M
V (moles de lactose hydrolysé par
min et par mg d’enzyme)
50 x 10
-
4
155
x 10
-
6
20 x 10
-
4
103
x 10
-
6
10 x 10
-
4
68,5 x 10
-
6
7 x 10
-
4
53,0 x 10
-
6
5 x 10
-
4
40,6 x 10
-
6
1 – Déterminer graphiquement les constantes de l’équation de Michaelis (K
M
et Vmax) relatives à ce
système.
2 – Sachant que la masse moléculaire de cette lactase est 135 000, calculer l’activité moléculaire
spécifique en moles de substrat hydrolysé par mole d’enzyme et par minute.
On considère la réaction enzymatique suivante :
β-galactosidase
S P
0n mesure la vitesse de la réaction exprimée en moles de produit par minute et par gramme d’enzyme en
fonction de la concentration du substrat exprimée en M. On obtient les valeurs suivantes :
V
8
12,5
20
25
33
S
0,65 x 10
-
2
1,1 x 10
-
2
2,2 x 10
-
2
3,3 x 10
-
2
6,6 x 10
-
2
1 - Tracer cette cinétique en utilisant la représentation de Linewaever-Burk.
2 - Déterminer graphiquement K
M
et Vmax de l’enzyme. Justifier votre réponse.
3 - Tracer les courbes correspondant à la cinétique de la réaction lorsqu’on ajoute au milieu un
analogue structural du substrat, de concentration I
1
ou I
2
avec I
2
> I
1
. Expliquer.
Soit une enzyme E fonctionnant avec le FAD comme coenzyme. La variation de la vitesse de
réaction en fonction de la concentration donne, selon les conditions expérimentales les courbes (a)
et (b). Parmi les propositions suivantes, quelles sont celles qui pourraient expliquer les résultats
obtenus ?
1 – Variation de [FAD]
2 – Variation de [E]
3 – Présence d’un inhibiteur compétitif
4 – Présence d’un inhibiteur non compétitif
V
24
2
5
2
6
a
b
[S]