L2 SCB Année universitaire 2011-12 Première session d'examen Cinétique enzymatique Étude expérimentale et cinétique Ce sujet comporte 3 pages. Les calculatrices sont autorisées Partie I. (2 points) Répondez aux questions suivantes : Q1. Quelles sont les propriétés des enzymes permettant de les différentier des catalyseurs classiques utilisés en chimie ? Q2. Quelles avantages et quels inconvénients voyez vous à utiliser des enzymes dans de transformations chimiques? Q3. Donnez la définition de KM Q4. Quelle avantage voyez vous à connaitre le KM d’une enzyme ? Exercice 2 (10 points) Les estérases sont des enzymes que catalysent l'hydrolyse d'esters RCOOR' selon la réaction : RCOOR' + H2O RCOO- + R'OH + H + On se propose de déterminer avec exactitude le KM expérimentale d’une estérase dans un milieu de pH 7. Les informations disponibles sont : • Le KM théorique de cette enzyme est de 4 mM. • On dispose d’un substrat (RCOOR’, en solution à 200 mM) qui n’absorbe pas à la lumière mais qui donne un produit (R’OH) absorbant convenablement à 450 nm (ε=8000 M-1cm-1). • On souhaite fixer le volume réactionnel à 2 mL • On dispose aussi d’une préparation d’enzyme contenant 2,5 U/mL En tenant compte de l’ensemble de ces éléments, vous avez proposé un protocole permettant de déterminer le KM expérimentale avec exactitude. Q5. Répondre aux questions suivantes : a) Quel volume de solution de substrat (RCOOR') et de tampon proposez-vous d'introduire dans la cuve pour faire la première mesure d’activité ? b) Quel volume d’estérase proposez-vous d'introduire dans la cuve pour faire la première mesure d’activité ? c) Quel type d’expérience devez vous réaliser afin de confirmer que la quantité d’enzyme que vous proposez est correcte ? Indiquez le type de graphes à tracer. d) Quelles mesures devez vous réaliser pour déterminer KM avec précision ? Aidez vous d’un tableau dans lequel vous indiquerez les volumes à utiliser des différentes solutions. e) Quelles sont les différentes graphiques que vous devez tracer pour déterminer KM avec précision ? 1 On réalise une expérience à saturation de substrat. On introduit dans la cuve les composés dans les quantités requises. On mesure la DO en fonction du temps et on trace ainsi la courbe suivante : Q6. Quelle était en réalité l’activité par mL de la préparation initiale ? Vous testez maintenant le composé ‘A’, le composé ‘B’ et le composé ‘C’, qui ont des effets différents sur l’activité de l’enzyme : L’un d’entre eux est un inhibiteur compétitif, un autre est un activateur, et le troisième est un inhibiteur incompétitif. On ne sait pas qui est qui. Q7. Quel type d’expérience proposez vous de réaliser pour définir qui est qui ? Q8. Quels sont les types de graphes et quelles sont les allures de courbes que seront obtenues à partir des expériences proposées ? Exercice 2 (8 points) On considère une enzyme michaélienne présentant un mécanisme à 2 étapes de modifications covalentes : S E ES ES' E+P k2 K1 k3 De plus un inhibiteur I se fixe sur l’enzyme libre E et sur le complexe ES’ avec la même affinité. Par contre il ne se fixe pas sur ES : S E ES K1 I Ki EI ES' E+P k2 k3 I Ki ES'I NB : L’affinité de I pour E et ES’ est la même Q9. Sans développer la loi de vitesse, posez le système d’équations permettant de l’établir. 2 En résolvant ce système, on trouve la loi suivante : k2[E]T[S] [I] [I] K1(1+ )+[S][1+ Ke(1+ )] Ki Ki Q10. Donnez à cette loi une allure michaelienne. a= Q11. Donnez les expressions des constantes vraies KM et kcat et des constantes apparentes KM(I) et kcat(I). Q12. Quel est le type d’inhibition provoqué alors par I. ? On considère que l’étape 2 est la plus lente (k2<k3). Q1 3. Donnez les expressions simplifiées de ces quatre constantes dans ce cas. Quel est le type d’inhibition provoqué alors par I. Q14. Dans ce cas (k2<k3), construisez un modèle simplifié tenant compte de la forme du complexe enzyme substrat qui s’accumule lorsque l’enzyme se sature. Ceci permet t’il de prévoir le type d’inhibition obtenu ? Q15. Quel sera le modèle simplifié si l’étape 3 est la plus lente (k3<k2)? Q16. Quel est le type d’inhibition provoqué alors par I.? 3