04/05/2016 (10h-11h)

AIH – Diagnostic des maladies infectieuses bactériennes
04/05/2016 (10h-11h)
PARELLO Prescyllia L2 Médecine
CR : NICOLAS Margot
AIH
Pr Florence FENOLLAR
12 pages
Diagnostic des maladies infectieuses bactériennes
A. Généralités
I. Stratégie diagnostique
Le diagnostic non spécifique permet une orientation, un diagnostic vers une maladie infectieuse
bactérienne ou virale. Puis, on a le diagnostic spécifique ou étiologique qui permet d'identifier le micro-
organisme responsable de l'infection.
On peut prendre les exemples suivants :
•Hémogramme : on fait une NFS puis on recherche :
◦Hyperleucocytose à polynucléaires neutrophiles souvent associée aux infections bactériennes.
◦Leuconeutropénie souvent associée aux infections à bactéries intracellulaires et virales.
•Dosage Protéine C-réactive : Élévation en cas d'infection. Dans les infections bactériennes, la protéine
C réactive est très élevée alors que dans les infections virales, elle est assez modérée.
•Dosage de la Procalcitonine : Élévation en cas d'infections bactériennes, parasitaires, ou fongiques
(mais pas virales).
Le diagnostic spécifique permet d'établir le diagnostic étiologique.
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Plan
A. Généralités
I. Stratégie diagnostique
II. Les prélèvements
III. Les pré-requis pour un prélèvement réussi
B. Diagnostic direct
I. Examen microscopique
II. Détection immunologique
III. Détection moléculaire
IV. Isolement bactérienne
V. Spectrométrie de masse
C. Diagnostic indirect
I. Sérologie par immunofluorescence indirect
II. Sérologie par ELISA
III. Sérologie par Western Blot

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Diagnostic direct •Examen microscopique ++
•Détection immunologique
•Détection moléculaire
•Isolement bactérie (Culture axénique++)
•Spectrométrie de masse
Mise en évidence directement du
micro-organisme à partir de
prélèvements
Diagnostic
indirect
•Sérologie ++ Mise en évidence à partir du sérum
du patient de la réponse
immunitaire vis à vis d'un micro-
organisme
II. Les prélèvements
Ils sont faits en fonction de la symptomatologie et de la symptomatologie clinique.
Les 2 grands types de prélèvements :
•Provenant d'un site contaminé : par exemple au niveau de la peau, des selles, de la bouche.
•Provenant d'un site stérile : au niveau du cœur, tout ce qui est prélèvement profond.
Les grandes catégories :
•Hémocultures.
•Fluides biologiques : urines.
•Collections (CR : comme un abcès)
•Biopsiques.
•Cutanéo-muqueux.
Tout type de prélèvement peut être réalisé, mais le type de prélèvement se fait en fonction de ce que l'on
cherche et donc de la symptomatologie clinique du patient.
III. Pré-requis pour un prélèvement réussi
•Quand prélever ?
◦Le plus tôt possible, avant tout traitement si possible (sauf en cas de purpura fébrile où il faut traiter
directement).
◦Lors de pic fébrile : quand le patient a de la fièvre.
◦Lors d'échec thérapeutique ou d'évolution défavorable.
•Précautions indispensables :
◦Stérilement (attention à la contamination avec la flore commensale) : par exemple, il faut
désinfecter avant de faire une hémoculture.
◦Transport rapide au laboratoire (il faut choisir une utilisation idéale de milieu de transport).
◦Si écouvillonnage : charger un maximum l'écouvillon.
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B. Diagnostic direct
I. Examen microscopique
La microscopie optique (+) est la base au laboratoire et permet de réaliser :
•État frais.
•Coloration de Gram.
•Coloration de Ziehl Neelsen.
Examen au MO à l'état frais
Pour faire un état frais, on dispose le prélèvement entre lame et lamelle au MO
(Grossissement x 100, x 400), il est composé de bactéries vivantes en suspension, de
levures et de parasites, ainsi on pourra observer :
•Corps réfringents d'aspects différents suivant les espèces (caractère constant) :
cocci, bacilles, cocco-bacilles, vibrions, spirilles, fuseaux...
•Certaines espèces sont mobiles, d'autres immobiles.
•Certaines espèces ont des individus isolés et d'autres des bactéries groupées
par deux ou en amas, chaînettes, …
La morphologie de la bactérie va nous renseigner sur son type.
C'est un examen de routine dans tous les laboratoires.
Coloration de Gram
C'est à partir d'un étalement du prélèvement sur une lame. On fixe puis on fait une coloration. Ensuite, on peut
mettre en évidence des bactéries au grossissement x 1000.
Cette technique sépare les bactéries en 2 groupes suivant la structure et la composition de la paroi :
•Gram positif (+) colorés en violet.
•Gram négatif (-) colorés en rose.
C'est un examen de routine dans tous les laboratoires.
Exemple de prélèvement où réside une flore bactérienne commensale :
Coloration de Gram d’un prélèvement vaginal, on voit une cellule épithéliale et on
observe des bacilles à Gram positif qui est lactobacille, bactérie présente dans la
flore bactérienne (polymicrobienne) vaginale.
L'interprétation des colorations de Gram par les techniciens de laboratoire ou les internes sont très mauvaises à
l'heure actuelle.
Exemple de prélèvement normalement stérile : Coloration de Gram de liquide céphalo-rachidien.
Méningite à méningocoques car on observe des diplocoques à Gram négatif
autour d'un polynucléaire.
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On ne fait plus trop de coloration de Gram, car maintenant, on peut observer que la biologie moléculaire prend
le dessus.
Mise en évidence de levures (gros grains violets regroupés) : A ne pas confondre avec des bactéries à Gram
positif.
Coloration de Ziehl-Neelsen
Cela permet la mise en évidence de bacilles acido-alcoolo résistants.
Exemple de Myxobacterium tuberculosis, agent de la tuberculose :
La paroi de ces mycobactéries contiennent des acides glycoliques qui font
que la coloration de Gram ne va pas pouvoir pénétrer, ce sont des bacilles
acido-alcoolo résistants.
Le prélèvement est assez compliqué (CR : c'est un geste très technique),
c'est une coloration sur le crachat d'un patient. De ce fait, les laboratoires
préfèrent la biologie moléculaire.
Examen au microscope à fond noir :
Exemples de la Mise en évidence de Treponema pallidum, bactérie responsable de la syphilis.
Ici, c'est une infection dans une ulcération génitale.
C'est un examen réservé à des laboratoires très spécialisés. Non réalisé en routine. CR : Même si
cela donne de jolies images, le geste étant très technique, c'est en train de disparaître.
II. Détection immunologique
On va rechercher l'antigène par technique d'immunochromatographie :
On a des anticorps ciblant spécifiquement le microorganisme recherché :
•Présents sur un support inerte.
•Et les anticorps sont marqués par des particules permettant de visualiser le résultat.
Intérêts de cette technique : Précocité, simplicité, rapidité (environ 15min), diagnostic tardif. C'est ce qui est
utilisé en première intention.
Limites:
•Pas d'isolement de la bactérie (CR : on ne peut pas étudier sa sensibilité aux antibiotiques)
•Certaines souches ne peuvent pas être détectées (CR : cette technique peut donc manquer de sensibilité)
•Positivité pouvant persister plusieurs mois après la guérison : elle manque aussi un peu de spécificité.
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Exemple de recherche d'antigènes par technique d'immunochromatographique :
•Détection d'antigènes urinaires de Legionella pneumophila seulement du sérogroupe 1 ou Streptococcus
pneumoniae ++ (CR : manque de sensibilité): rôle dans le diagnostic des pneumopathies à
L.pneumophila sérogroupe 1.
•Détection d'antigènes de Streptococcus pyogenes (A) 1 ++ : rôle dans le diagnostic des angines et
pharyngites à Streptococcus A. Si c’est positif, on donne une antibiothérapie, si c’est négatif, c’est
d’origine virale.
•Détection de toxines de Clostridium difficile à bactérie responsable de diarrhée et colite pseudo-
membraneuse, peut entraîner des épidémies, et peut contaminer les personnes âgées et les personnes
fragiles.
III. Diagnostic direct par biologie moléculaire
Cela se fait par amplification génique par Polymérase Chain Reaction (PCR) : on extrait l’ADN à partir
d'un prélèvement de souche et on l’amplifie par PCR. On fait en général 35 à 45 cycles de dénaturation/
renaturation.
Amplification génique par PCR :
•Mise en évidence du matériel génétique des bactéries.
•Gènes cibles des réactions de PCR et méthodes d'identification :
◦Gène "universel" pour les bactéries → c’est l’avantage de l’ARN 16 S ribosomique :
Identification précise de presque toutes les bactéries par amplification puis séquençage et
comparaison aux banques de séquences (GenBank). Si la bactérie est connue, on aura son
identification, mais si elle n’est pas connue dans le GenBank, on a une identification de nouvelles
bactéries par séquençage (=Séquence nouvelle).
◦Gènes spécifiques de bactéries : Identification précise d'une bactérie par séquençage (CR : mais on
ne le fait plus trop) ou sonde spécifique d'une bactérie (exemple de la méningite à méningocoque).
Cela se fait en laboratoire à l’aide d’une sonde spécifique, CR : permettant de faire le diagnostic de
manière très rapide.
Site Internet avec démonstration
PCR : http://faculty.plattsburgh.edu/donald.slish/PCRmov.html
Séquençage : http://highered.mcgrawhill.com/sites/0072556781/student_view0/chapter15/animation_quiz_1.html
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