Diagnostic des maladies infectieuses bactériennes 04/03

AIH – Diagnostic des maladies infectieuses bactériennes
04/03/2015 (10h-11h)
ALLEGRO Mégane (CR: Hamza Berguigua)
AIH
Pr. Fenollar
18 Pages
Diagnostic des maladies infectieuses bactériennes
Plan :
A. Diagnostic direct
I. Examen microscopique
II. Détection immunologique
III. Détection moléculaire
IV. Isolement bactérie
V. Spectrométrie de masse
B. Diagnostic indirect
I. Sérologie par immunofluorescence indirecte
II. Sérologie par ELISA
III. Sérologie par Western Blot
Stratégie diagnostique :
Le diagnostic non spécifique permet une orientation. On peut prendre les exemples suivants :
-Hémogramme :
Hyperleucocytose à polynucléaire neutrophiles souvent associée aux infections bactériennes.
Leuconeutropénie souvent associée aux infections à bactéries intracellulaires et virales.
-Dosage Protéine C-réactive :
Elévation en cas d'infection.
-Dosage de la Procalcitonine :
Elévation en cas d'infections bactériennes, parasitaires, ou fongiques (mais pas virales).
Le diagnostic spécifique permet diagnostic étiologique.
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*Diagnostic direct
Examen microscopique ++
Détection immunologique
Détection moléculaire
Isolement bactérie (Culture axénique++)
Spectrométrie de masse
*Diagnostic indirect = Sérologie ++
Mise en évidence
du microorganisme
à partir de prélèvements
Mise en évidence à partir du sérum du patient de la
réponse immunitaire
Les prélèvements :
Ils sont faits en fonction de la symptomatologie et de la symptomatologie clinique.
Les 2 grands types de prélèvements :
-provenant d'un site contaminé
-provenant d'un site stérile
Les grandes catégories :
-hémocultures
-fluides biologiques
-collections
-biopsiques
-cutanéo-muqueux
Pré-requis pour un prélèvement réussi :
-Quand prélever ?
Le plus tôt possible, avant tout traitement (sauf en cas de purpura fébrile où il faut traiter directement).
Lors de pic fébrile.
Lors d'échec thérapeutique ou d'évolution défavorable.
-Précautions indispensables
Stérilement (attention à la contamination avec la flore commensale).
Transport rapide au laboratoire (idéal utilisation de milieu de transport).
Si écouvillonnage : charger un maximum l'écouvillon.
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A. Diagnostic direct :
I. Examen microscopique :

Microscopie optique (+) permet de réaliser :
-Etat frais
-Coloration de Gram
-Coloration de Ziehl Neelsen
- Examen au MO à l'état frais :
Préparation faite avec lame et lamelle au MO (Grossissement x 100, x
400).
Bactéries vivantes en suspension, de levures et de parasites.
Corps réfringents d'aspects différents suivant les espèces (caractère
constant) : cocci, bacilles, cocco-bacilles, vibrions, spirilles, fuseaux...
Certaines espèces sont mobiles, d'autres immobiles.
Certaines espèces ont des individus isolés et d'autres des bactéries
groupées par deux ou en amas, chaînettes..
Examen de routine dans tous les laboratoires.
- Coloration de Gram :
Etalement du prélèvement sur une lame.
Fixation puis coloration.
Mise en évidence de bactéries au grossissement x 1000.
Sépare les bactéries en 2 groupes suivant la structure et la composition de la paroi.
Gram positif (+) colorés en violet et Gram négatif (-) colorés en rose.
Examen de routine dans tous les laboratoires.
Exemple de prélèvement où réside une flore bactérienne
commensale :
Coloration de Gram d’un prélèvement vaginal= Flore bactérienne
polymicrobienne.
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Exemple de prélèvement normalement stérile :
Coloration de Gram de liquide céphalo-rachidien.
Méningite à méningocoques = Diplocoques à Gram négatif
dans un polynucléaire.
Mise en évidence de levures (gros grains violets
regroupés) :
A ne pas confondre avec des bactéries à Gram positif.
-Coloration de Ziehl-Neelsen
Mise en évidence de bacilles acido-alcoolo résistants
Ex : Myxobacterium tuberculosis, agent de la tuberculose
- Examen au microscope à fond noir :
Exemples :
Mise en évidence de Treponema pallidum, bactérie
responsable de la syphilis. Ici dans une ulcération génitale.
Examen réservé à des laboratoires très spécialisés
Non réalisé en routine.
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II. Detection immunologique :
Recherche d'antigène par technique d'immunochromatographie
Des anticorps ciblant spécifiquement le microorganisme recherché :
-Présents sur un support inerte
-Marqués par des particules permettant de visualiser le résultat
Intérêts : Précocité, simplicité, rapidité, diagnostic tardif.
Limites: pas d'isolement de la bactérie
certaines souches ne peuvent pas être détectées
positivité pouvant persister plusieurs mois après la guérison
Tests immunochromatographique sur membrane :
-Détection d'antigènes urinaires de Legionella pneumophila sérogroupe 1 ou Streptococcus pneumoniae ++ : Des
anticorps anti-Legionella pneumophila sérogroupe 1 marqués par des particules permettant de visualiser le résultat
sont présents sur un support inerte.
Rôle dans le diagnostic des pneumopathies à L.pneumophila séropgroupe 1.
-Détection d'antigènes de Streptococcus pyogenes (A) 1 ++ :
rôle dans le diagnostic des angines et pharyngites à
Streptococcus A.
-Détection de toxines de Clostridium difficile -> diarrhée et colite pseudo-membraneuse
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III. Diagnostic moléculaire :
Amplification génique par Polymérase Chain Reaction (PCR)
Principe général par Polymerase Chain Reaction : 1. Extraction de l'ADN à partir des prélèvements
2. PCR
-Mise en évidence du matériel génétique des bactéries
-Gênes cibles des réactions de PCR et méthodes d'identification :
1. Gène "universel" pour les bactéries : ARN 16 S ribosomique : Identification précise des bactéries par
séquençage par comparaison aux banques de séquences (GenBank)
Identification de nouvelles bactéries par séquençage (=Séquence nouvelle)
2. Gènes spécifiques de bactéries : Identification précise d'une bactérie par séquençage ou sonde spécifique
d'une bactérie.
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Une fois l'ADN extrait on a deux techniques différentes :
-la PCR quantitative spécifique en temps réel (réponse en 2 ou 3 heures maximum)
-PCR classique à large spectre ciblant ARN 16S : *Amplification par PCR classique (environ 3h)
*migration sur gel (20 mn)
*séquençage du produit amplifié (24h)
*analyse informatique
Intérêts :
Utile pour les bactéries difficilement ou non cultivables.
Intérêt si le patient a eu des antibiotiques.
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Automatisation possible.
Diagnostic moléculaire rapide (<3h) disponible de nos jours :
méningite, purpura fulminans (méningocoque et pneumocoque)
portage vaginal du streptocoque B chez les femmes enceintes
Neisseria gonorrhae, Chlamydophila trachomatis, Treponema pallidum (IST)
Limites :
Risques de contamination pour les techniques de PCR (donc de faux positif)
Coût encore relativement élevé
Pas réalisé en routine dans la plupart des laboratoires
IV. Isolement bactérie : Diagnostic direct par culture :

Sur gélose ou milieu liquide (culture axénique) ++
milieux solides (= milieux gélosés)
milieux séléctifs
milieux non séléctifs
milieux liquides
milieux spéciaux
 Sur support vivants tels que des cellules (culture xénique)

Sur inoculation animale
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Diagnostic par culture sur gélose (Culture axénique) :
Examen de routine dans tous les laboratoires (hôpital + ville)
Objectif : isoler les bactéries (levures aussi) présentes dans les prélèvements
-Gélose non séléctive (pour les prélèvements normalement stériles) et riche. Exemple : Milieu chocolat ou sang
cuit
-Gélose sélective (Présence d’antibiotiques):
Exemple: Milieu CIN (cefsulodine-irgasan novobiocine)
Culture de Yersinia enterocolitica à partir de prélèvements de selles. Les antibiotiques permettent de tuer la flore
commensale des selles pour que Yersinia enterocolitica puisse pousser plus facilement.
Incubation des milieux dans une étuve :
Durée : au minimum 24h, parfois plus d'un mois.
Température : À 37° le plus souvent, parfois 4°C (Listeria monocytogenes), 30°C (Yersinia sp).
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A partir d'une colonie isolée : identification phénotypique par galerie biochimique de la
bactérie. On recherche un certain nombre de réactions biochimiques (ex :
consommation des sucres …).
Compte bactérien : Exemple des urines
Seuil de positivité: 105/ml (parfois 103 pour certaines bactéries comme E. Coli par exemple)
*UFC= Unité Formant Colonies
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Exemple de la
gestion des hémocultures :
Devant tout patient fébrile ou hypothermique :
Réalisation systématique de la culture du sang des patients = Hémoculture.
Idéalement avant toute antibiothérapie (sauf purpura fébrile).
Prélèvement par ponction veineuse au pli du coude après désinfection de la peau (attention au risque contamination
du prélèvement).
Prélèvement dans les flacons d'hémocultures -aérobies
-anaérobies
Classiquement on prélève 3 paires d’hémoculture, soit à 30 mn d’intervalle soit à chaque pic fébrile.
Les flacons sont mis dans des automates qui vont détecter ou non des dégagements de CO2 (qui peut être
synonyme de croissance bactérienne).
-Interpretation des résultats
Intérêt de l'examen se définit par sa valeur prédictive (VP) incriminant 1 bactérie dans la fièvre
-1 hémoculture unique positive à
Staphylococcus epidermidis : très faible VP
le plus souvent contaminant
meilleur VP chez les patients avec un cathéter ou porteur d'une prothèse cardiaque
Staphyococcus aureus : VP de 70%
Salmonella enterica Typhi : VP de 100%
-3 paires d’hémocultures sur 3 positives : Rechercher une prolifération endovasculaire : infection sur cathéter,
valve cardiaque…
Automates (Identification bactéries + Antibiogramme) :
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- Identification des bactéries isolées par automate
- Permettant la réalisation de la sensibilité aux antibiotiques
Culture cellulaire
Technique de microculture cellulaire
Support de culture : Fibroblastes humains par exemple
Détection de croissance et identification des bactéries
Coloration de Gimenez
Immunofluorescence (IFI)
PCR ciblant l’ARNr 16S
Poste de travail pour les cultures cellulaires : Hotte à flux laminaire, matériel jetable et stérile
Observation de cultures cellulaires (tubes, boîtes multi-puits de plastique et flacons) au microscope optique
inversé.
Intérêts : isolement de microorganismes intracellulaires strictes (certaines bactéries = Coxiella burnetii, Rickettsia
sp, Chlamydophyla sp) et des bactéries de culture fastidieuse (Brucella sp, Francisella tularensis)
Etude de leur résistance aux antibiotiques !!
Limites
Délai usuel d’obtention du résultat (variable selon les microorganismes)
Culture cellulaire est pratiquée dans des laboratoires spécialisés
Microorganismes hautement pathogènes (+/- agents de bioterrorisme).
Exemple: Coxiella burnetii, Rickettsia prowazekii
Culture dans un laboratoire de niveau de sécurité biologique III
Inoculation animale : 2 exemples :
Treponema pallidum
Agent de la syphilis
Non cultivable pour le moment en milieux axénique ou cellulaire
Injection intra-testiculaire chez un lapin
En quelques jours une orchite riche en tréponèmes
Mycobacterium leprae
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Agent de la lèpre
Non cultivable pour le moment en milieux axénique ou cellulaire
Injection dans le coussinet du Tatou à 9 bandes
Non réalisée en routine
V. Spectrométrie de masse (MALDI-TOF MS) :
Principe :
-identification bactérienne : lyse acide (acide formique, acide trifluoro-acétique, les 2...) et matrice (acide
cinnamique) qui fournit l'énergie pour ioniser les protéines quand on envoie le laser.
-Ionisation essentiellement de protéines par un laser -> obtention de spectres.
Les peptides vont s’accélérer, les petits vont arriver les premiers, les plus gros seront les derniers, grâce au
détecteur on obtient un spectre en fonction de la masse sur charge.
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B. Diagnostic indirect ( Sérologie ++ ):
Le prélèvement : sérum +++ (sang sur tube sec)
Type d'antigène : bactéries totales, antigènes ou épitopes isolés.
Les principales techniques :
Screening : immunofluorescence indirecte ou ELISA
Confirmation : Western Blot
Mise en évidence :
De la présence d ’IgM = Infection précoce le plus souvent
d'IgG = Persiste très longtemps
2 prélèvements consécutifs à 2 semaines minimum d’intervalle =
Recherche de l’élévation des anticorps
Recherche d’1 séroconversion
Limite : Manque de spécificité = Réaction croisée entre bactéries
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En cas d’infection virale : stimule le système immunitaire donc risque de faux positif
-Patients transfusés
I. Sérologie par immunofluorescence indirecte :
Lame où on dépose l’antigène de la bactérie que l’on recherche puis incubation avec le sérum du patient.
Deuxième incubation avec les anticorps dirigés contre les Ig humaines et marqués à la fluoroscéine.
II. Sérologie par ELISA :
On met l’antigène sur un support, puis le sérum du patient et enfin l’anticorps ciblant l’Ig humaine que l’on
recherche couplé cette fois ci à une ENZYME.
Ensuite on rajoute le substrat, si les anticorps du patient sont fixés il y a une coloration qui apparait.
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-Mesure de la densité optique
-Lecture par un automate
III.Sérologie par Western Blot :
C’est une technique de confirmation.
1. Séparation des protéines en fonction de leur PM sur gel de polyacrylamide : électrophorèse de type SDS-PAGE
2. Transfert sur une feuille de nitrocellulose
3. Incubation avec le sérum du patient
4. Incubation avec anticorps ciblant les Ig humaines et couplés à une enzyme
5. Revelation par un substrat
Intérêt principal: Diagnostic sérologique spécifique
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Principales sérologies d'intérêt dans le diagnostic des infections bactériennes
 Bactéries responsables d'infections pulmonaires
Coxiella burnetii
Chlamydophila pneumoniae
Mycoplasma pneumoniae
Legionella spp
 Bactéries responsables d'infections génitales
Treponema pallidum
 Bactéries responsables de maladies disséminées
Brucellose
Maladie de Lyme
 Rickettsioses
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