Les chemins conformationnels de la citrate synthase L

Edifices moléculaires
Les chemins conformationnels de
la citrate synthase
Certaines protéines (les enzymes) sont capables d’agir en tant que catalyseurs des réactions
biochimiques. Ce processus comporte trois étapes : la fixation des réactifs sur l’enzyme, la réaction
chimique et finalement la séparation de l’enzyme et des produits de la réaction. Le mécanisme de
la catalyse enzymatique implique généralement des transitions conformationnelles. Pour comprendre,
et éventuellement modifier le fonctionnement de l’enzyme, il faut étudier le comment et le pourquoi
de ces transitions. Ceci est expérimentalement hors d’atteinte aujourd’hui. L’approche de choix pour
ce type de problèmes est la modélisation sur ordinateur. Dans cet article nous décrivons l’apport
de la modélisation dans l’étude des chemins réactionnels de la citrate synthase. Les résultats
obtenus permettent de démontrer la complexité des mouvements mis en jeu.
INTRODUCTION
L
’étude des biopolymères, et
singulièrement des protéines
d’une part, des acides ribo-
nucléiques (ARN) d’autre part, pose
au physicien des problèmes aussi
redoutables qu’inhabituels. Prenons
pour exemple, parmi bien d’autres,
les topoisomérases. Ces molécules,
qui sont des enzymes et par consé-
quent appartiennent à la classe des
protéines, peuvent attaquer une dou-
ble hélice d’acide désoxyribonucléi-
que (ADN) formant un cercle
fermé, couper en un point donné
l’un des brins de la double hélice,
ajouter à celle-ci un tour d’enroule-
ment supplémentaire (ce qui accroît
la tension interne de la double hé-
lice), puis recoller les morceaux. El-
les peuvent aussi faire le même
ouvrage mais en sens inverse, en
enlevant à la double hélice un tour
d’enroulement. Le fait qu’un pareil
travail de broderie puisse être effec-
tué par une simple molécule, com-
posée de quelques milliers d’atomes
(C, H, N, O, et quelques S) et qui a
priori ne contient pas d’autre infor-
mation que l’arrangement particulier
de ses atomes par des liaisons chi-
miques covalentes (voir l’encadré),
semble relever de la magie. Nous
employons ce mot à dessein car, on
en conviendra aisément, la survenue
dans une vie humaine d’un événe-
ment dont la probabilité a priori se-
rait de l’ordre de 10
–600
, par exem-
ple qu’un joueur de poker ait
pendant cent parties de suite un
flush royal à pique servi d’entrée,
alors qu’il n’a jamais triché, serait
qualifiée de magique ou surnatu-
relle.
L’analogie est ici dans le fait que
l’évolution biologique a dessiné (au
sens de designed) cette molécule en
la sélectionnant parmi par exemple
10
700
analogues possibles, dont
peut-être 10
100
autres auraient
d’ailleurs aussi bien fait l’affaire
(ces chiffres, bien entendu, n’ont
qu’une valeur indicative). Autre-
ment dit, ces molécules jouissent
d’une quantité d’information de
log
2
(10
700
/10
100
), soit 2 000 bits.
On arrive ici à un point extrême-
ment difficile et aujourd’hui encore
controversé : se peut-il qu’une mo-
lécule résultant d’une sélection par
un processus évolutif requérant N
choix binaires puisse mettre en
oeuvre plus d’information que ces
N bits ? Une analogie un peu osée
fera comprendre cette question.
Dans une célèbre bande dessinée de
F’mur, Le génie des alpages, une
brebis pataphysicienne tâtonne à
écrire les formules m = Ec
2
,
c=Em
2
, etc., jusqu’à trouver la
bonne. Un tout petit calcul montre
qu’il y avait 6 possibilités, soit donc
2,6 bits d’information dans la for-
mule d’Einstein-Langevin... On voit
le piège de ce type de calcul. Plus
sérieusement, l’évolution n’a-t-elle
pas sélectionné précisément les mo-
lécules susceptibles de mettre en
oeuvre plus d’information que n’en
contenait la séquence qui les défi-
nit ?
Cette information, ce serait celle
que représente la structure tridimen-
sionnelle particulière de la protéine.
L’une des propriétés les plus remar-
quables de ces molécules est en ef-
fet que, une fois synthétisées dans la
cellule, elles adoptent spontané-
– Laboratoire de physique quantique,
Université Paul Sabatier (URA 505
CNRS), IRSAMC, 118, route de Narbonne,
31062 Toulouse, Cedex.
– Laboratoire de biochimie théorique
(URA 77 CNRS), IBPC, 13, rue Pierre et
Marie Curie, 75005 Paris.
– Laboratoire de chimie théorique, Fa-
culté des Sciences, Université Mohammed
V, Rabat, Maroc.
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ment, en un temps de l’ordre de la
seconde (ce qui bien sûr est extrê-
mement long à l’échelle des mouve-
ments atomiques) une conformation
tridimensionnelle spécifique dite
l’état natif de la protéine, et bien
sûr ce sera cette conformation parti-
culière qui lui confèrera ses proprié-
tés fonctionnelles « magiques ».
L’idée maîtresse que nous vou-
lions faire ressortir de cette brève
analyse est que le physicien consi-
dèrera une protéine comme une mo-
lécule qui, d’une part, ne possède
pas d’autres propriétés que celles
qu’on pourrait théoriquement dé-
duire de sa topologie chimique en
intégrant (avec un calculateur de
puissance suffisante, et sans oublier
de prendre en compte le milieu en-
vironnant) l’équation de Schrödin-
ger dépendant du temps, mais
d’autre part a été sélectionnée de
telle sorte que ces propriétés soient
tout à fait exceptionnelles. Or, si
l’on commence à bien connaître les
propriétés des protéines dans leur
aspect fonctionnel, biologique, on
est encore loin de pouvoir identifier
le caractère exceptionnel que pour-
raient revêtir certaines de leurs pro-
priétés vues du point de vue de la
physique moléculaire (hypersurface
de potentiel, modes de vibration,
couplages, anharmonicité, etc.).
L’une des tâches essentielles du
biophysicien moléculaire sera donc
de discerner les propriétés spécifi-
ques d’une protéine particulière,
celles qui seraient communes à l’en-
semble des protéines, et celles qui
seraient partagées par l’ensemble
des polypeptides ou même de tous
les hétéropolymères.
Les données expérimentales sur
la structure tridimensionnelle des
protéines globulaires ont été obte-
nues principalement par radiocristal-
lographie, et aussi plus récemment
(pour les petites protéines) par réso-
nance magnétique nucléaire utilisant
l’effet Overhauser nucléaire. Toutes
ces données peuvent être consultées
dans la Protein Data Bank de Broo-
khaven.
TRANSITIONS CONFORMATIONNELLES
DANS LES ENZYMES
Une enzyme est par définition une
protéine dont le rôle est de servir de
catalyseur à une réaction biochimi-
que spécifique. Comme dans toute
réaction chimique, la ou les molécu-
les réagissantes (les réactants, ou
dans le langage des biochimistes les
substrats) vont être transformées en
des molécules produits. Dans la ca-
talyse par une enzyme, les substrats
se fixent sur l’enzyme (en général
par un certain nombre de liaisons
faibles, non covalentes, mais qui
déjà sélectionnent le bon substrat
par rapport à ses analogues présents
dans le milieu), puis a lieu la réac-
tion chimique proprement dite, et
enfin les produits se détachent de
l’enzyme, qui est alors prête à fonc-
tionner à nouveau. C’est ce que
nous appellerons un cycle catalyti-
que.
Chez de nombreuses enzymes, ce
cycle s’accompagne de deux ou plu-
sieurs transitions conformationnel-
les de l’enzyme. Typiquement, par
exemple, l’enzyme sera initialement
dans la conformation tridimension-
nelle correspondant à son état natif,
puis la fixation soit des substrats
eux-mêmes, soit de molécules diffé-
rentes dites effecteurs allostériques,
va induire une transition de l’en-
zyme vers une autre conformation
(c’est-à-dire une autre configuration
dans l’espace des coordonnées ato-
miques), plus propice à la réaction
chimique voulue ; une fois la réac-
tion achevée et les produits libérés,
l’enzyme retournera à sa conforma-
tion initiale. Ces conformations dif-
fèrent non par l’enchaînement des
atomes, qui est conservé, mais par
le résultat d’un certain nombre de
mouvements de rotation de parties
de la molécule autour de liaisons
covalentes simples (sur le schéma
de l’encadré, les liaisons C-NH,
N-CH, ainsi que des liaisons sim-
ples existant dans les groupements
latéraux R
i
). Une analogie, qui nous
resservira, est celle des mouvements
permis dans le cube de Rubik.
Ce sont les biochimistes qui iden-
tifient les premiers les différentes
conformations d’une enzyme, en les
stabilisant sélectivement par un
choix judicieux du milieu et en par-
ticulier de sa teneur en différents
substrats, produits, ou effecteurs,
puis en étudiant les caractères
physico-chimiques de l’enzyme
dans chacune de ces conformations.
Dans les cas favorables, les diverses
conformations peuvent donner lieu à
une cristallisation sélective, et ainsi
à la détermination des coordonnées
atomiques dans chaque conforma-
tion. Les conclusions des biochimis-
tes sont alors susceptibles d’être
corroborées par les particularités
structurales révélées par les cristal-
lographes.
Il n’existe par contre aucune tech-
nique expérimentale permettant de
déterminer comment s’effectue une
transition conformationnelle, en par-
ticulier quel chemin elle suit dans
l’espace de configuration, c’est-à-
dire dans l’espace des coordonnées
de tous les noyaux atomiques de
l’enzyme. C’est pourquoi il a paru
utile à quelques groupes de cher-
cheurs de s’attaquer à ce problème
par des techniques de simulation sur
ordinateur, basées sur la dynamique
moléculaire. La dynamique molécu-
laire consiste, dans ses grandes li-
gnes, en une solution numérique des
équations de mouvement de Newton
pour chaque atome du système, en
connaissant les masses et les vites-
ses de tous les atomes et les forces
qui agissent sur eux. Les durées
d’accomplissement de ces transi-
tions sont également inconnues ; on
peut penser qu’elles se situent quel-
que part entre 10
–9
et 10
–3
s. Notons
que, serait-on sûr qu’une transition
ne demandât qu’une nanoseconde,
on pourrait mettre en œuvre les mil-
liers d’heures de supercalculateur
qui permettraient de reproduire cette
transition et donc de l’analyser en
détail. Mais dans le doute, ce serait
comme sauter dans le brouillard
par-dessus une rivière inconnue en
espérant que la rive opposée ne sera
qu’à quelques mètres !
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Ainsi, au lieu de tenter de repro-
duire dans le temps la dynamique
d’une transition conformationnelle,
le théoricien, ou plus exactement le
modélisateur, s’est efforcé plutôt de
rechercher de façon en quelque
sorte statique un chemin joignant
deux conformations connues par
leurs coordonnées atomiques cristal-
lographiques. Il s’agit bien sûr ici
de chemins non triviaux entre deux
conformations significativement dif-
férentes, chez des protéines dont le
nombre nd’atomes est de quelques
milliers. On peut se représenter ce
chemin comme joignant deux cir-
ques distants dans un paysage mon-
tagneux qui serait ici l’hypersurface
de potentiel de la molécule, soit une
variété à 3n-5 dimensions, donc de
l’ordre de 10
4
dimensions. L’alti-
tude symbolise ici l’énergie poten-
tielle de la molécule, une fonction
de la configuration des noyaux, qui
n’est autre que la valeur propre,
pour chacune de ces configurations,
de l’hamiltonien à noyaux fixes ou
hamiltonien de Born-Oppenheimer.
En pratique, on est obligé d’utiliser
un hamiltonien classique, construit à
partir des fonctions potentielles ato-
miques très soigneusement paramé-
trisées par rapport aux méthodes
quantiques pour les petites molécu-
les de la même nature et/ou par rap-
port aux données expérimentales.
La métaphore du paysage de monta-
gne est très bien adaptée à la plupart
des considérations que nous allons
développer, pour peu qu’on se sou-
vienne qu’à la place de la latitude et
de la longitude il y a ici une dizaine
de milliers de coordonnées.
Il y a plusieurs questions aux-
quelles le théoricien aimerait pou-
voir répondre.
Le chemin effectivement suivi par
la molécule pour « se rendre » d’une
conformation à une autre est-il tou-
jours le même (disons, à des varia-
tions continues près) ou y a-t-il un
ensemble de chemins possibles non
connexes ? Dans le cas de paysage
montagneux on peut s’imaginer fa-
cilement plusieurs routes qui ont le
même point de départ et arrivent au
Figure 1 - La structure tridimensionnelle de la citrate synthase. Elle est composée de deux types de
structures secondaires : 20 hélices
a représentées par des tire-bouchons et un feuillet breprésenté
par une flèche plate. Le cordon fin correspond aux parties irrégulières, appelées « boucles », qui as-
surent à l’enzyme sa flexibilité. Les hélices à gauche constituent le petit domaine qui se déplace par
rapport au reste de l’enzyme en ouvrant ainsi le site actif. Les lettres ZC pointent vers « les zones
charnières » de l’enzyme où la chaîne peptidique passe du grand domaine au petit. Dans ces zones
on observe des grands changements des angles conformationnels φet w.
Edifices moléculaires
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même point en passant par des sé-
ries de cols différentes (par exemple
de deux côtés d’une chaîne de mon-
tagnes).
On peut soupçonner que le che-
min ne comporte ni puits, dans le-
quel le système serait piégé indéfi-
niment sans pouvoir atteindre son
« but », ni barrière d’énergie trop
élevée devant laquelle il perdrait un
temps précieux à attendre que le
facteur statistique de Boltzmann fi-
nisse par lui autoriser le passage. Il
est cependant probable que le che-
min passe par une succession de
bassins peu profonds, que les spé-
cialistes des protéines appellent des
sous-états conformationnels ; si les
cols entre ces bassins ne dépassent
pas une hauteur de l’ordre de k
B
T
(k
B
: constante de Boltzmann ; T :
température absolue), la transition
sera facile, mais des retours en ar-
rière seront possibles, de sorte qu’à
la limite, le chemin serait parcouru
par une marche aléatoire.
On peut également s’interroger
sur le degré de sinuosité du chemin.
Si les conformations extrêmes sont
très différentes, on peut s’imaginer,
de nouveau par analogie avec le
cube de Rubik, que le chemin com-
prendra un grand nombre de seg-
ments de directions différentes.
Cette hypothèse, comme la précé-
dente, serait de nature à suggérer
l’idée d’une transition par marche
aléatoire.
La principale difficulté à vaincre
pour une transition conformation-
nelle importante est que la compa-
cité d’une protéine globulaire (dont
la densité est de l’ordre de 1,4)
s’oppose aux mouvements locaux
internes. Est-ce donc que tout chan-
gement structural local doit attendre
que des fluctuations de l’environne-
ment viennent à le rendre possible,
ou est-ce que la transition confor-
mationnelle ne fait intervenir que
des mouvements concertés (à la ma-
nière, encore une fois, des rotations
dans le cube de Rubik), ou enfin
est-ce que la transition passe par
une phase initiale de dilatation de la
molécule rendant sa structure moins
compacte ?
LA RECHERCHE THÉORIQUE DE
CHEMINS CONFORMATIONNELS DANS
LA CITRATE SYNTHASE
L’objet de nos travaux a été la ci-
trate synthase, une enzyme jouant
un rôle crucial dans la respiration
cellulaire ; elle consomme l’acide
acétique, produit du métabolisme
des sucres, en le combinant à une
molécule à quatre atomes de car-
bone, l’oxaloacétate, pour former
l’acide citrique, à six carbones dont
trois porteurs de fonctions acide ;
dans cette synthèse, l’acide acétique
arrive transporté par une molécule
dite coenzyme A, qui, comme son
nom l’indique, coopère avec l’en-
zyme dans la catalyse de la réaction.
Les cristallographes ont identifié
au moins trois conformations de la
citrate synthase de coeur de porc.
Deux d’entre elles, une forme dite
ouverte et une forme dite fermée,
interviennent dans la réaction dé-
crite ci-dessus et c’est la transition
entre ces deux formes que nous
avons étudiée (voir figure 1).
La particularité de notre travail
est que deux méthodes radicalement
différentes ont été utilisées pour dé-
terminer un chemin conformation-
nel. La première méthode reproduit
avec quelques modifications la dé-
marche d’Elber et Karplus. Elle
consiste à minimiser l’intégrale de
l’énergie potentielle le long du che-
Figure 2 - Différences d’angles conformationnels φet wentre les formes ouverte et fermée de la ci-
trate synthase. Seules quelques dizaines d’acides aminés subissent des changements qui dépassent 40°
entre les deux formes conformationnelles, dont la majorité est localisée dans les boucles flexibles.
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min conformationnel joignant les
deux états connus, divisée par la
longueur totale du chemin. Cette in-
tégrale est approximée par une
somme sur un nombre fini de points
qui définissent n intervalles devant
être égaux dans un espace multidi-
mensionnel. Une série de calculs a
été effectuée pour un nombre crois-
sant des points intermédiaires obte-
nus par une interpolation entre cha-
que paire de points du cycle
précédent, suivie de la minimisation
de la somme de l’énergie potentielle
à laquelle on ajoute une fonction de
pénalité assurant la condition
d’équidistance. A la fin, un chemin
ayant 16 intervalles pour 17 structu-
res a été obtenu, dont la 1ère struc-
ture correspond à la forme fermée et
la 17ème à la forme ouverte de l’en-
zyme. La seconde méthode, origi-
nale, dite de dynamique dirigée,
consistait à reconstituer par mor-
ceaux le chemin, à partir de simula-
tions de dynamique à très basse
température (quelques degrés Kel-
vin), dans lesquelles les atomes re-
cevaient d’abord, partant de cha-
cune des deux conformations
connues, une faible vitesse dirigée
vers l’autre conformation ; le pro-
cédé était itéré 70 fois, jusqu’à la
rencontre des deux demi-trajectoires
ainsi obtenues. Par « dirigée » il
faut entendre des directions définies
dans un espace de coordonnées po-
laires internes approprié. De cette
décomposition du chemin confor-
mationnel on a pu déduire un ordre
de grandeur de la durée nécessaire à
la transition à 300 K, qui serait de
quelques nanosecondes. Cette mé-
thode de dynamique dirigée a été
reprise plus récemment sous une
forme différente par des auteurs al-
lemands.
Ces procédures, en particulier la
première, furent loin d’être menées
à leur terme : le chemin comportait
encore des variations d’énergie de
l’ordre du milliélectronvolt par
atome, donc considérables en valeur
totale pour une molécule de près de
5 000 atomes effectifs. Achever
« d’aplatir » les chemins exigera en-
core des temps de calcul considéra-
bles, qui ne se justifiaient pas vu le
modèle utilisé dans ce travail à vo-
cation essentiellement méthodologi-
que, où l’enzyme était correctement
décrite dans sa forme dimérique
(deux molécules identiques se cor-
respondant par un axe de rotation
d’ordre 2) mais privée de son envi-
ronnement aqueux.
L’analyse des deux chemins
conformationnels obtenus a été ef-
fectuée à l’aide de plusieurs indica-
teurs, en partant des plus locaux : la
distribution des angles dièdres φet
ψ, l’accessibilité au solvant de cha-
que résidu, pour finir par les plus
globaux : les paramètres hélicoïdaux
du squelette peptidique et l’analyse
des mouvements concertés des
Figure 3 - Evolution des angles φet wpour quelques résidus impliqués dans les mouvements tran-
sitoires. Les « cartes de Ramachandran » montrent les zones permises de deux angles de rotation qui
définissent le repliement spatial de la chaîne peptidique. Dans ces zones se trouvent aussi les angles
principalement observés dans des cristaux des polypeptides et des protéines. La glycine est beaucoup
plus flexible que les autres acides aminés. Ainsi pour la Gly 197 seules les valeurs autour de
φ=0°ouw= 0° sont stériquement interdites. Pour le reste des résidus on distingue trois zones per-
mises. Les feuillets bse trouvent dans la zone 1, les hélices
a main droite dans la zone 2 et les héli-
ces
a main gauche dans la zone 3.
Edifices moléculaires
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