Thérapie génique de la myopathie de Duchenne
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Nouvelle thérapie génique pour la myopathie de Duchenne Evaluation pré-clinique chez le chien GRMD et réseau de compétences Caroline Le Guiner Colloque AFSTAL - Lyon - 25/11/10 La myopathie de Duchenne • La plus fréquente des dystrophies musculaires (1/3500 naissances de petits garçons) • Maladie génétique héréditaire liée à l’X : mutation dans le gène codant pour la protéine Dystrophine • La Dystrophine est indispensable à l’intégrité des membranes des fibres musculaires Muscle sain Muscle myopathe Dystrophine = ciment du muscle Absence de Dystrophine La myopathie de Duchenne Absence de Dystrophine Détérioration des fibres musculaires Affaiblissement progressif des muscles Mort prématurée (20 à 30 ans) A ce jour: Pas de thérapie… La thérapie génique gène muté Gène « sain » pas de protéine protéine fonctionnelle maladie pas de maladie Comment amener le gène « sain » dans la cellule? Utiliser d’un « vecteur », viral ou non viral rAAV = Vecteur dérivé de l’Adéno-Associated Virus L’Adeno-Associated Virus et les vecteurs rAAV AAV WT AAV WT rAAV ITR REP ITR TRANSGENE THERAPEUTIQUE CAP ITR ITR rAAV et muscle squelettique Expression à long terme du transgène (> 10 ans) après une administration unique d’un rAAV Thérapie génique de la myopathie de Duchenne LE MEDICAMENT… • Thérapie génique « conventionnelle »: Grâce à un rAAV, transfert du gène correct de la Dystrophine dans les muscles du patient. -> Problème: le gène de la dystrophine (ou son cDNA) est trop grand pour tenir dans un rAAV… cDNA dystrophine: 14000 bases rAAV: contenance maximale, 4700 bases • « Thérapie génique correctrice »: Plutôt que de remplacer le gène défectueux, on va aller « réparer ses pièces défectueuses » Parmi les techniques de réparation: le SAUT d’EXON… Le saut d’exon Gène normal Exon 1 Intron 1 Exon 2 Intron 2 Exon 3 Gène muté Intron 3 Exon 4 Exon 1 Intron 1 * Exon 2 Intron 2 Exon 3 Intron 3 Epissage Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exon 1 Exon 3 Exon 4 Protéine normale Protéine anormale « La phrase contient tous les mots » « La phrase est interrompue et ne veut plus rien dire » MALADIE Exon 4 Le saut d’exon Petite séquence « snRNA U7 » apportée artificiellement et capable de venir bloquer l’inclusion de l’exon 3 Gène de la dystrophine muté (patient Duchenne): Exon 1 Intron 1 * Exon 2 Exon 1 Intron 2 Exon 3 Intron 3 Exon 4 Exon 4 « Quasi » Dystrophine DIMINUTION des SYMPTOMES « La phrase est incomplète mais a toujours la même signification » Le saut d’exon Petite séquence « snRNA U7 » apportée artificiellement et capable de venir bloquer l’inclusion de l’exon 3 Gène de la dystrophine muté (patient Duchenne): Exon 1 Intron 1 * Exon 2 Intron 2 Exon 3 Intron 3 Exon 4 Taille = 1000 à 2000pb rAAV: contenance maximale, 4700 bases NOTRE MEDICAMENT = rAAV/snRNA-U7 Thérapie génique de la myopathie de Duchenne LA VOIE D’INJECTION… • Objectif thérapeutique: toucher tous les muscles de l’organisme (dont le cœur et le diaphragme) Injection Intramusculaire Injection Intraveineuse Locorégionale Garrot Injection Intraveineuse Objectif « Essai Clinique » PRODUIT THERAPEUTIQUE: rAAV/snRNA-U7 Années 2000 Validation du concept thérapeutique ✓ In vitro ✓ Chez la souris mdx (20g) MODE D’INJECTION: IV locorégionale (avant bras) 2009-2011 2011-2012 Développement pré-clinique 2013-2015 Etude de toxicologie Essai clinique Chez le chien GRMD (10kg) Modèle pathologique plus proche de l’homme Adaptation d’un mode d’injection pertinent cliniquement Détermination de la dose thérapeutique (dose « active ») Production de l’AAVr • Utilisation d’un système de production baculovirus/cellules d’insectes • Contrôles qualité exhaustifs • Conditions adaptables à une production en « grade clinique » Etude chez le chien GRMD en 2010/2011 IV locorégionale rAAV8/snRNA-U7 IRM Naissance des chiots (Centre de Boisbonne ou CEDS) Test de Force Test de Force J -120 à -90 Production des vecteurs AAV + contrôles qualités Test de Force Suivi clinique hebdomadaire J0 J+45 à 60 J+90 à 120 Prélèvements sanguins et de fluides (salive, lacrymal, nasal, urine): - Etude de la dissémination du vecteur dans les fluides - Etude de l’éventuelle réponse immune anti-AAV et anti-Dystrophine Biopsie musculaire intermédiaire: Euthanasie: - Correction de la Dystrophine? - Correction de la dystrophine dans chaque muscle du membre injecté? - Correction de la pathologie musculaire locale? - Présence du vecteur dans les autres organes? Format « PRE-CLINIQUE REGLEMENTAIRE »: Notions de qualité et de traçabilité aidant à la constitution d’un dossier de demande d’essai clinique auprès des agences règlementaires (AFFSAPS/EMEA) Injections Cathéter dans la veine céphalique + Garrot pneumatique atraumatique au dessus du coude + Injection du vecteur rAAV - dilué dans gros volume de tampon(12mL/kg) - sous pression - en l’absence de tout agent perméabilisant + « Infusion » pendant 15 min • 10 chiens myopathes déjà injectés (3 doses ≠ d’AAVr + témoins avec tampon) • Déjà plus de 1500 échantillons à analyser Pathologie locale Chien GRMD non injecté Chien GRMD – Dose 1 3,5 mois post-injection Expression de la Dystrophine Chien GRMD non injecté Chien sain Biopsies musculaires intermédiaires (5-7 semaines post-injection) Extensor digitorum communis Nombre de fibres Dys + Chien GRMD + Dose 1 Chien GRMD + Dose 1/5 Chien GRMD + Dose 1/10 80-90% 50-80% 30-45% Test de Force • Méthode non invasive (stimulation électrique) • Mesure du couple de force extension/flexion du carpe Analyse RMN Chien sain Examen qualitatif et quantitatif Chien GRMD Objectif « Essai Clinique » ! Agences Réglementaires Années 2000 Validation du concept thérapeutique ✓ In vitro ✓ Chez la souris myopathe 2009-2011 2011-2012 Développement pré-clinique Etude de toxicologie Chez le chien GRMD Primates, souris Durée: 7 ans Coût total estimé: 11,5 Millions € 2013-2015 Essai clinique - Plus de 80 personnes impliquées sur 5 sites Médecins, Scientifiques, Vétérinaires, Ingénieurs… STUDY DESIGN Philippe Moullier Thomas Voit Luis Garcia Caroline Le Guiner Yves Fromes Vector production & QC Dog colony Quality Assurance ADNA Mehdi Gasmi AFM / CEDS Ariane Kobrine Anne Douar Rob Kotin INJECTIONS Jack-Yves Deschamps Yves Fromes Caroline Le Guiner Clinical safety Phentotypic assessment Imagery Pathology Sophie Moullec Jean-Yves Hogrel Pierre Carlier Yan Chérel Institut of Myology Yan Chérel Vector expression Yan Chérel (IF) Biodistribution study Immunological study Caroline Le Guiner Carole Masurier Maud Beuvin (WB) Virginie François Oumeya Adjali Généthon Nantes PI: Thomas Voit & Philippe Moullier Coordination Nantes + réseau: Caroline Le Guiner Coordination Généthon: Marie Montus Coordination Institut de Myologie: Laurent Servais
