Nombre de B mémoires différenciés in vitro en CS d'antiHBs en fonction des taux sériques d'anti-HBs 10000 1000 100 10 1 1 10 Anti-HBs 100 SCs/106 1000 lymphocytes B Tuaillon et al. J Immunol Methods. 2007 Infection à EBV • Virus ubiquitaire • > 90% population mondiale • Persistance à vie • Contrôlé par le système immunitaire Pathogenèse • EBV infecte le LB naïf • Il persiste dans les lymphocytes B mémoire circulants (Souza et al. PNAS 2005). • Représente un réservoir de 1 à 50 cellules B mémoire infectées /106 lymphocytes B circulants (Khan et al. Immunity 1996). • Dans la MNI, 50% LB mémoire infectés (Souza et al. J. Immunol. 2007). • Induction de la phase lytique après différenciation des cellules B mémoire en plasmablastes (Laichalk et al. J. Virol. 2005). Exploration Unwanted cells are crosslinked to red blood cells plasma Cellules B enrichies Ficoll-Hypaque Ficoll-Hypaque centrifugation Globules rouges et rosettes CD40L-transfected CDw32L cells CD40L J7 CD40 + IL-2 + IL-10 Énumération des cellules sécrétrices d’Ag EBV par ELISpot Cellules B mémoire Quantification du génome EBV dans les surnageants de culture par PCR en temps réel Cellules sécrétrices d’Ag EBV J7 Un immunospot = une empreinte cellulaire Caractéristiques d’un spot : - le diamètre - la couleur - la forme - la saturation - le contraste - le gradient de diffusion Determination of EBV-infected B cells producing EBV-antigens B cell subsets 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 mediane 25th percentile 75th percentile 7 ZEBRA-Ag-SCs/10 B cells 7 MA-Ag-SCs/10 B cells 7 EBV virions/10 B cells 200 190 480 130 60 80 80 150 50 70 70 20 20 40 10 10 12 20 21 10 20 10 83 80 80 17 14 17 70 10 960 150 20 18580 900 1300 53200 960 18580 2100 9360 40200 ND ND ND 500 ND 2100 E nume ra tion of E BV -infe cte d B ce ll subse ts producing E BV -a ntige ns EBV healthy carriers 1 2 3 4 17 7 6 6 MA-Ag-SCs / 10 B cells ND ND 3 ND EBV DNA copies/10 7 B cells* ND 36 1940 ND 143 156 407 51 20 10 30 10 353 ND 23100 ND B cell subsets Splenic marginal zone B cell subset ZEBRA-Ag-SCs / 10 B cells Memory B cell subset ZEBRA-Ag-SCs / 10 B cells MA-Ag-SCs / 10 B cells 7 EBV DNA copies/10 B cells* * EBV DNA copies were quantified in culture supernatants of each cell subsets. Réservoir fonctionnel EBV • Mise en évidence d’un réservoir EBV inductible – < 50 × 10-6 cellules B initient la réplication virale • Mise en évidence d’un réservoir EBV fonctionnel – 15% de ces cellules produisent des virions – < 4 × 10-6 cellules B produisent des particules virales MNI • Mise en évidence de cellules – spontanément sécrétrices EBV ex vivo? – Responsables de la charge virale plasmatique? • Mise en place d’un réservoir EBV – cellules B mémoire oui – Latent et inductible oui Mise en évidence de cellules spontanément sécrétrices EBV ex vivo ????? B mémoire réservoir EBV en constitution t Exploration de la Maladie Résiduelle en Cancérologie Cancer de la Prostate Prostate Technique ELISPOT-PSA NBT-BCIP PSA Ac2 anti-PSA total Ac1 anti-PSA total Lignée cellulaire LNCAP 500 cellules 175 sfc Sécrétion = 35% 29 ± 4,9% 0% 0% 27 ± 2,1% Cellules CK+ Cellules PSA+ Cellules LNCaP Cellules CK+ Cellules PSA+ Cellules PC3 LNCaP cells (cells/well) PSA-ELISPOT assaya (spots /well) PSA-immunometric assayb (µg/L in supernatant) LNCaP cells PC-3 cells LNCaP cells PC-3 cells 100 000 / 0 1.29 0.17c 0 10 000 / 0 0.03 0.02 0 1 000 259.0 24.7 0 0 0 100 24.0 2.1 0 0 0 10 3.7 1.2 0 0 0 1 0.3 0.4 0 0 0 ELISPOT-PSA = 4 log plus sensible que le test ELISA ! 122 Patients - 48 patients “cancer de la prostate”: * 24 localisés = LPCa (73,5 ans), avant et après PT (T1-T3, M0) * 24 métastatiques = MPCA (71,5 ans) (T3, M1) - 31 patients “pathologie bénigne de la prostate” * 27 HBP (69 ans) * 4 PA (60 ans) - 35 patients “sans maladie prostatique” (67 ans) - 8 donneurs sains (67 ans) 5-28 ml de sang 1 SCs 150 000 cells/puits Patient avec cancer de la prostate RESULTATS Groupe LPCa 24 patients PSA-SC 5 + (41.6%) 7 12 patients avant PT (médiane 9.2 -172) 0+ 12 12 patients après PT (1-12 mois) P = 0.04 PSA sérique (ng/ml) 15 (4,5–20) 34 (22–5300) (p = 0,001) 1,2 (0–5,5) Groupe MPCa PSA-SC 20 + 62 (14 – 167) 4 24 patients (83,3%) (médiane 29: 1 - 684) 20/24 vs 5/12 (MPCa) (LPCa) PSA sérique (ng/ml) P = 0,02 92,5 (0,3 – 8400) Groupe HBP, PA, contrôles PSA-SC 27 HBP 4 PA 27 NPD 8 contrôles + 0 + 0 + 0 + 0 PSA sérique (ng/ml) 5,3 (0,7 – 19,8) 10,4 (2 – 14,8) 6 (0,2 – 71) <4 Spécificité = 100% (IC 95% : 94,6 - 100) Sensibilité = 69.4% (IC 95% : 54,4 - 84,5) Immunocytochimie Cytokératine PSA MPCa MPCa Contrôle CONCLUSION Nouvelle application de la technique ELISPOT Détection de cellules circulantes sécrétrices de PSA Cellules prostatiques Tumorales chez la plupart des patients au stade M+ chez des patients au stade M0 ! Absence de ces chirurgical récent cellules après traitement EXPLORATION DU RESERVOIR VIRAL CELLULAIRE VIH-1 INFECTION VIH-1 Réservoirs plasmatique : charge virale exprimée en nombre de copies/ml de plasma (patients non traités et traités) cellulaires : lymphocytes T CD4+, monocytes, etc. d’organes : ganglionnaire, muqueux,SNC, etc. Lymphocytes TCD4+ infectés dans le compartiment circulant - cellules en cycle viral (patients non traités) - cellules quiescentes (patients non traités et traités) Le RESERVOIR VIH-1 dans le Compartiment Circulant n Lymphocytes TCD4+ ayant intégré l’ADN proviral n Vaisseau sanguin M n M M n n M n M Mo n n M n M n M M n n n n n n n n M n n n M n M PN n M Fréquence théorique 103 à 105 dans le compartiment circulant Soit 1 à 100 cellules/ml de sang (Fauci & Siliciano) La Problématique : ces cellules sont - des lymphocytes T CD4+ infectés par le VIH-1 - quiescentes (DNA proviral intégré dans le DNA), ce DNA est capable d’être transcrit et traduit au cours de l’activation cellulaire - insensibles aux traitements anti-rétroviraux -non reconnues par le système immunitaire -présentes et persistentes chez les patients bons répondeurs aux traitements anti-rétroviraux - très rares, leur nombre a été estimé par modèle mathématique entre 105 à 107 cellules dans l’organisme (A. Fauci NIH Bethesda et R. Siliciano Johns Hopkins Hospital, Baltimore), Le prototype d’un réservoir viral cellulaire Comment explorer ce RESERVOIR VIRAL CELLULAIRE VIH-1 ?