A compressed DNA program for digital - ETH E

DISS. ETH NO. 23914
A compressed DNA program for digital identification
of cancer specific microRNA profile
A thesis submitted to attain the degree of
DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH
(Dr. sc. ETH Zurich)
presented by
Nicolas Lapique
MSc in Genomics and Experimental Biology, University of Lausanne
born on 7th May 1982
citizen of
Jorat-Menthue, VD
Accepted on the recomandation of
Prof. Yaakov Benenson (ETH Zurich)
Prof. Frank Buchholz (TU Dresden)
Prof. Sai. Reddy (ETH Zurich)
2016

!
i!
Abstract
The identification and programmed death of cancer cells, using a genetic
circuit, have been successfully achieved in cell culture within our research group,
shortly before I started my thesis. This gene circuit can analyse a combination of six
microRNAs that acts as a cancer signature. When the circuit meets the correct level
of expression of each microRNA, it produces a killing protein that destroys the cancer
cell. Based on these promising results, an ambitious project has been undertaken to
develop an efficient therapeutic method against cancerous tumours with minimal side
effects. There is a very long list of technical specifications and biological
complications that needs to be addressed before moving toward the pre-clinical
phase. In my thesis, I have specifically focused on two challenges, namely,
minimising the false positive rate to improve the safety of the system, and reducing
the size of the circuit to fit into efficient gene therapy vehicles.
Although the cell identification performed by the original gene circuit was
overall excellent, the reliability of the system was compromised by some persistent
mistakes. Hence, some cancer cells were not identified as such, and some healthy
cells were killed by the circuit. The gene circuit is designed to identify more reliably
the cancer cells and to decrease the side effects, therefore, the false positive
identification was a priority issue to address. To understand what causes the
mistakes of computation, the dynamic of the circuit performance was analysed from
the delivery of the DNA program until the expression of all circuit components has
reached the steady state. The analysis of the dynamic revealed that almost every
time a healthy microRNA profile was incorrectly identified as cancerous, this was
immediately after the delivery while the circuit is still assembling. Then, it has been
demonstrated that in some cells the regulatory mechanism is delayed, resulting in
uncontrolled expression of the output. To solve this problem, a site specific
recombinase was employed to engineer a mechanism that withholds the output until
the other components, which control the output, are fully functioning and optimally
connected. The timing of desynchronization between the output and the controllers
can be entirely programmed to work in an autonomous fashion inside the cells. This
innovation resulted in striking effects on circuit performance, enabling the elimination
of circuit’s leakage in the presence of a not-cancerous microRNA profile. With a
dynamic range of up to 2000-fold, the performance of the circuit can be considered
as digital, which is a vast improvement over previously published data computed with
endogenous inputs.

!
ii!
Before even initiating the first mice experiments, the circuit needs to fit a
vehicle that can bring it to the majority of the cancer cells, which are spread
throughout the organism. Many of the efficient vectors in gene therapy have a cargo
capacity lower than the actual DNA size of the microRNA classifier. Moreover the
redundancy of this circuit is a major issue, since repetitive regions would recombine
and prevent the production of viral particles. A strategy was designed to eliminate the
redundancy of the circuit and consequently reduces its size. Using the same
recombinase as in the leakage-free system described in the above paragraph, the
circuit genome can be compressed enough to fit to a dual AAV system or a
recombinant adenovirus. The genetic program can then be autonomously
decompressed in situ and perform the identification of the microRNA profile as
efficiently as the source circuit. Even more importantly, this work is probably the first-
of-this-kind to show that a compressed DNA program can be decompressed in a cell,
similar to a conventional computing program. I believe that the DNA compression
and decompression concept creates a new bridge between biology and information
theory, which could stimulate scientific thought and creativity in the theoretical, as
well as in the applied fields.

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iii!
Résumé
L’identification et la destruction des cellules cancéreuses à l’aide d’un circuit
génétique avaient été accomplies en cultures cellulaires au sein de notre groupe de
recherche, peu avant le début de mon doctorat. Ce circuit génétique pouvait intégrer
un signal composé d’une demi-douzaine de molécules de type microARNs,
caractéristique d’une signature cancéreuse. Le circuit était ainsi programmé pour
tuer uniquement les cellules qui présentaient cette combinaison spécifique de six
marqueurs microARNs. C’est à partir de ces résultats prometteurs qu’un ambitieux
projet a été entrepris afin de développer un traitement efficace contre le cancer. Le
circuit pouvant être programmé pour reconnaître une très grande variété de profiles
moléculaires, il pourrait cibler très spécifiquement n’importe quel type de cellules
cancéreuses, ce qui limiterait les effets secondaires du traitement. Cette technologie
étant très récente, la feuille de route qui doit conduire à la phase d’essai pré-clinique
est encore très longue. Durant ma thèse je me suis consacré à deux défis
particuliers, à savoir, limiter le taux de faux positifs afin de rendre le système plus sûr
et réduire la taille du circuit pour pouvoir le rendre transportable par des vecteurs de
thérapie génique.
L’identification et la destruction des cellules cancéreuses par le circuit
génétique publié avant le début de ma thèse étaient dans l’ensemble très
spécifiques. Néanmoins, dans certaines cellules le profile moléculaire n’était pas
analysé correctement. Ainsi, il arrivait que certaines cellules cancéreuses étaient
identifiées comme saines et inversement certaines cellules saines étaient détruites
par le circuit. Le circuit a été développé dans le but de réduire les effets
secondaires, ainsi la diminution du taux de faux positifs était prioritaire. Afin de
comprendre ce qui causait les erreurs d’identification, la réponse du circuit a été
analysée du début de son expression dans la cellule jusqu’à ce que tous les
composants y soient à l’état d’équilibre. L’étude de la dynamique de production a
révélé que la majorité des erreurs se produisaient lors de l’assemblage du circuit,
immédiatement après son transport dans la cellule. Il a ainsi été démontré que dans
certaines cellules le mécanisme de régulation n’est pas produit suffisamment
rapidement, ce qui crée un décalage pendant lequel la réponse du circuit est
incontrôlée. Afin de résoudre ce problème, un dispositif de retardement de la
molécule réponse a été conçu à l’aide d’une enzyme de recombinaison. Le
mécanisme permet de différer la production de la molécule réponse, qui sera alors
relâché uniquement quand tous les composants nécessaires au bon fonctionnement
du circuit seront présents en quantité suffisante. Le timing de désynchronisation

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iv!
entre la molécule réponse et les autres composants du circuit peut être programmé
pour fonctionner de manière autonome dans la cellule. Cette innovation conceptuelle
a permis une amélioration radicale des performances du circuit, éliminant tous les
faux positifs dans les cellules qui ne présentent pas de profile moléculaire de type
cancéreux. Avec une gamme dynamique d’environ 2000 fois, le circuit est à pésent
capable de produire un signal réponse de type numérique.
Avant de commencer les premières expérimentations animales, le circuit doit
pouvoir être contenu dans un vecteur, lequel pourra le transporter dans la majorité
des cellules cancéreuses dispersées dans tout l’organisme. La plupart des vecteurs
utilisés en thérapie génique ont une capacité de transport de l’ADN inférieur au
‘génome’ du circuit utilisé pour classifier les profiles microARNs. De plus, la
redondance du code génétique du circuit est un obstacle majeur à la production des
vecteurs viraux, car les éléments répétés vont se recombiner entre eux. Un
mécanisme de compression a été conçu pour éliminer la redondance du circuit, et
par conséquent en réduire sa taille. À l’aide d’une recombinase identique à celle
utilisée dans le mécanisme d’élimination des faux-positifs, le ‘génome’ du circuit peut
être compressé suffisamment pour être contenu dans un système à double AAV ou
un adénovirus recombinant. Le programme génétique peut être décompressé de
manière autonome dans la cellule et y analyser le profile microRNA de manière aussi
efficace que le circuit non-compressé. Ce travail est sans doute le premier exemple
de compression et décompression d’un circuit génétique et crée ainsi de nouvelle
passerelles entre la biologie et la théorie de l’information.