République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique Université d’Oran Faculté des Sciences Département de Biologie Pour obtenir le diplôme de Docteur ES SCIENCES en Biologie Spécialité Microbiologie Intitulé Mise en évidence de Helicobacter pylori à partir des biopsies gastriques et son antagonisme avec les lactobacilles Présenté par Mme : MEDOUAKH Lynda . Sous direction du : Pr BENSOLTANE Ahmed Devant le jury : Président AOUES Abdelkader Professeur Université d’Oran Directeur de thèse BENSOLTANE Ahmed Professeur Université d’Oran Examinateur LAROUS Larbi Professeur Université de Sétif Maitre de conférence -A- Université de Mostaganem Examinateur DJIBAOUI Rachid Examinateur CHOUGRANI Fadéla Maitre de conférence -A- Université de Mostaganem Examinateur BEKADA M. Ahmed Maitre de conférence -A- Université d’Oran Année : 2010 - 2011 Sommaire Résumé Liste des tableaux Liste des figures Liste des abréviations Revue bibliographique Introduction………………………………………………...........................................................................................1 I Généralité sur H. pylori I-1 Historique ………………………….……………………………………………………….………………………………………………4 I-2 Anatomie et Histologie…………………………………………………………………….…………………………………………..6 I-2-1 Anatomie……………………..…………………………………………………………..........……………………………………..6 I-2-2 Histologie………………………………………………………………………..………………………………………..……………….7 I-3 Physiologie de l’estomac……………………………………..………………………………………………………………………. 9 I-3-1-Fonction mécanique………………………………..…………………………………………………………………………………9 I-3-2-Fonction chimique…………………………………………………………………………………………..………………..........9 I-4 Mécanisme de régulation…………………………………………………………………………………………………………..10 I-5 Taxonomie de H. pylori …………………………………………………………..…………………………………….……………10 I-6 Ecologie………………………………………………………………………..………………………………………………….………...12 I-7 caractères morphologiques………………………………………………………………….........................................16 I-8 Caractères culturaux…......................................................................................................................17 I-9 caractères phénotypiques .........................................................................................................…...17 I-10 Caractères génétiques…………………………………………………………………………………………………………..…..19 I-11 Transmission…………………………………………………………………………......................................................21 I-12 Prévalence…………………………………………………………………………………………………………………….………….22 I-13 Facteurs de colonisation ………………………………………………………………………………………………….……….24 I-13-1 Mobilité …………………………………………………………………………………………………………..…………………….25 I-13-2 l’Urease …………………………………………………………………………………………………………………………..…….25 I-13-3 Adhérence ………………………………………………………………………………………………………………….…..…….25 I-14 MECANISME DE PERSISTANCE………………………………………………………………………………………………………....26 I-15 REACTIONS INFLAMMATOIRES…………………………………………………………………………………………………………..26 I-16 MÉTHODES DE DIAGNOSTIC ……………………………………………………………………………………………………….…...28 I-16-1 METHODES INVASIVES……………………………………………..………………………………………………………………….28 I-16-1-1 TEST À L’URÉASE ……………………………………………………………………………………………………………………28 I-16-1-2 EXAMEN CYTOLOGIQUE…………………………………… ………………………………………………………………………31 I-16-1-3 EXAMEN ANATOMOPATHOLOGIQUE…………………………………………………………………………………………....31 I-16-1-4 CULTURE…………………………………………………………………………………………………………………................32 I-16-1-5 PCR EN TEMPS REEL………………………………………………………………..………………………..……………….......32 I-16-2 METHODES NON INVASIVES………………………………..……………………………..………………….………………………33 I-16-2-1 TESTS RESPIRATOIRES ……………………………………….………………………………..……………..…………………….33 I-16-2-2 SEROLOGIE …………......................................................................................................................34 I-17 PATHOLOGIES ASSOCIEES A HELICOBACTER PYLORI ………………………………………………..………….……………….…35 I-17-1 GASTRITES…………………………………………………….…………………………………………………..………………………35 I-17-1-1 GASTRITE AIGUE………………………………….…………………………..…………………………………..………………...37 I-17-1-2 GASTRITE CHRONIQUE ……………………………..…….…………………………………………………………..………….. 37 I-17-2 ULCÈRE DUODÉNAL……………………………………………………………………………………………………………………. 38 I-17-3 ULCÈRE GASTRIQUE ………………………………………………………………....……………………………………………..…39 I-17-4 CANCER GASTRIQUE………………………………………….……………………………..………………………………………….40 I-17-5 LYMPHOME GASTRIQUE DE MALT ………………………………………………………..………………..………………..….41 I-18 SENSIBILITE AUX ANTIBIOTIQUES…………………………..……….………………………………..………………………………..43 I-19 Traitement………………………………………………………………………………………………………………………………..43 I-20 Traitement par les probiotiques ……………………………………………………………………………………………… 46 I-21 Vaccination………………………………………………………………………………………………………………………………..47 II- Généralité sur les bactéries lactiques………………………………………………………………………….…………......48 II-1 Historique……………………………………………………………………………………………………………………….………... 48 II-2 Caractères généraux ……………………………………………………………………….............................................48 II-3 Taxonomie ………………………………………………………………………………………………………………………………...50 II-4 Habitat ……………………………………………………………………………………....................................................52 II-5 Ecosystème gastro-intestinal……………………………………………………………….........................................52 II-6 Utilisation des bactéries lactiques dans le domaine agro-alimentaire …........................................55 II-7 Intérêts des bactéries lactiques en santé humaine ………………………………………...............................59 II-8 Souches probiotiques utilisées…………………………………………………………… ………………………………….. .59 II-9 Probiotiques et les infections gastro-intestinales……………………………………………………………............60 II-10 Interaction entre les bactéries lactiques…………………………………………………………………………….…...60 II-10-1 Inhibition des bactéries lactiques…………………………………………………………………………………….…….61 II-10-1-1 Acides organiques……………………………………………………………………….…………………………………....61 II-10-1-2 peroxyde d'hydrogène ……………………………………………………………………………………………………. 64 II-10-1-3 dioxyde de carbone ………………………………………………………………………………………………….........65 II-10-1-4 Diacétyle……………………………………………………………………………………………………………………………65 II-10-1-5 Acétaldéhyde………..…………………………………………………………………………………………………………..66 II-10-1-6 Reutérine……………………………………………………………….…………………………………………………………..66 II-10-1-7 Bactériocines …………………………………………………………………………………………………………………..67 II-11 Les lactobacilles………………………………………………………………………………………………………………………..68 II-11-1 Caractères généraux……………………………………………………………………………………………….…………….68 II-11-2 Habitat………………………………………………………………………………………………………………..…………………71 II-11-3 Effets des lactobacilles sur la santé…………………………………………….……………………………………71 Matériel et méthodes Objectif du travail………………………………………….……………………………………………………………………………….74 I-Isolement et identification de H. pylori …………………………………………………………………..…………………….75 I-1 Echantillon et origine du matériel……………………………………….……………………………………………………..75 I-2 Prélèvement ……………………………………………………………………………………………………………………………...75 I-3 Conservation des biopsies …………………………………………………………………………………………….…………76 I-4 Examen anatomopathologique …………………………………………….…………………………………………………..76 I-5 Examens microbiologiques …………………………………………………………………………………………………..….. 76 I-5-1 Examen cytologique ………………………………………………………………………………………………….……….... 76 I-5-2 Test rapide à l’Urée……………………………………………………………………………..………………………………...77 I-5-3 Culture et isolement ……………………………………………………………………………..…………………...........78 I-5-3-1 Condition de culture ……………………………………………………………………………………..………………...78 I-5-3-2 Milieux de culture ……………………………………………………………………………………………………………..78 I-5-3-3 Isolement ………………………………………………………………………………….……………………………………...79 I-5-3-4 Identification ………………………………………………………………………………..…………………………………...79 I-5-3-4-1 Examen macroscopique…………………………………………………….……………………………………………….79 I-5-3-4-2 Examen microscopique …………………………………………………..…………………………………………………80 I-5-3-4-3 Etat frais………………………………………………………………………………………………………………………….…80 I-5-3-4-4 Tests biochimiques ………………………………………………………………………………………………………… 80 I-5-4 Antibiogramme ……………………………………………………………………………………………………………………….80 I-5-5 Conservation ..………………………………………………..………..…………………………………….……………………..81 I-5-6 APPLICATION DE LA TECHNIQUE PCR EN TEMPS REEL……………………………………………………………………… 83 II- ISOLEMENT ET CARACTERISATION DES LACTOBACILLES…………………………………………………………………………......85 II-1 PROVENANCES DES ECHANTILLONS DU LAIT…………………………………………………………………….…………………...85 II-2 MILIEUX DE CULTURE ……………………………………………………………………………….…………………………………….85 II-3 ISOLEMENT ET IDENTIFICATION DES LACTOBACILLES……………………………………………………………………………….85 II-3-1 ISOLEMENT……………………………………………………………………………………….……………………………………...85 II-3-2 IDENTIFICATION DES LACTOBACILLES……………………………………………………………..……………………………...86 II-3-2-1 CARACTERISATION MORPHOLOGIQUE……………………………………………………..…………………………………....86 II-3-2-2 DETERMINATION DES ISOLATS………………………………………………………................................................86 II-3-2-3 DETERMINATION DU GENRE………………………………………………………………………………………………....…..87 II-3-2-3-1 TEMPERATURE……………………………………………………………… ………………………………………………….. 87 II-3-2-3-2 TYPE FERMENTAIRE………………………………………………………………………………………………………………87 II-3-2-3-3 HYDROLYSE DE L’ARGININE……………………………………………………………………………………………………..87 II-3-2-3-4 UTILISATION DU CITRATE ……………………………………………………………………………………………..…………88 II-3-2-3-5 HYDROLYSE DE L’ESCULINE ………………………………………………………………….…………………………………88 II-3-2-4 DETERMINATION DE L’ESPECE……………………………………………………………………..…………………………….88 II-3-2-4-1 IDENTIFICATION PAR LE SYSTEME API 50 CHL……………………………………………………………………………89 II-3-3 CONSERVATION DES SOUCHES…………………………………………………………………….…………………………………90 III- MISE EN EVIDENCE DES INHIBITIONS ENTRE LACTOBACILLE ET H. PYLORI……………………….............................91 III-1 METHODE DIRECTE ……………………………………………………………………………………………………………………….91 III-2 METHODE INDIRECTE ……………………………………………………………………………………………………………………92 III-3 DETERMINATION DE LA NATURE DE L’AGENT INHIBITEUR……………………………………………………………………….93 III-3-1 INHIBITION DUE AU PEROXYDE D’HYDROGENE ……………………………………………………………………………….93 III-3-2 INHIBITION DUE A L’ACIDE LACTIQUE ……………………………………………………………………………………………..93 III-3-3 INHIBITION DUE AUX BACTERIOPHAGES………………………………………………………………………………………….94 III-3-4 RECHERCHES DE LA NATURE PROTEIQUE DE LA SUBSTANCE ANTIMICROBIENNE …………………………………….94 III-3-5 EFFET DE LA TEMPERATURE…………………………………………………………...................................................95 III-4 MESURE DE L’ACIDITE TITRABLE………………………………………………………………………………………………………..95 III-4-1 DOSAGE DE L’ACIDITE…………………………………………………………………………………………………………………95 III-5 MISE EN EVIDENCE DES INHIBITIONS EN MILIEU LIQUIDE…………………………………………….………………………..96 III-6 EFFET INHIBITEUR DES LACTOBACILLES SUR LES BACTERIES PATHOGENES……………………….........................97 RESULTAT I-MISE EN EVIDENCE DE H.PYLORI………………………………….…………..…………………..……………………………………..98 I-1 EXAMEN CYTOLOGIQUE…………………………………………………………………………………………………………………….98 I-2 TEST RAPIDE A L’UREE ………………………………………………………………….…………………………………………………..98 I-3 EXAMEN ANATOMOPATHOLOGIQUE………………………………………………………..……………………………………….100 I-4 ISOLEMENT ET IDENTIFICATION ………………………………………………………..……………………………………………….100 I-4-1 ASPECT MACROSCOPIQUE ……………………………………………………………..……………………………………………100 I-4-2 ASPECT MICROSCOPIQUE ……………………………………………………………………………………………..……………100 I-4-3 ETAT FRAIS ……………………………………………………………………………………………………………………………….104 I-4-4 ETUDE BIOCHIMIQUE …………………………………………………………….……………………………………………………104 I-5 ANTIBIOGRAMME…………………………………………………………………………………………………………………………105 I-6 MISE EN EVIDENCE DE H. PYLORI PAR LA PCR EN TEMPS REEL………………………………………………………….……. 109 II ISOLEMENT ET IDENTIFICATION DES LACTOBACILLES…………………………………………………………………………………115 II-1 EXAMEN MORPHOLOGIQUE …………………………………………………………………………………………………………...115 II-2 CARACTERES PHYSIOLOGIQUES ET BIOCHIMIQUES………………………………………………………………………………..115 II-3 REPARTITION DES ESPECES DE LACTOBACILLE………………………………………………………………………..……………127 III PRODUCTION DES SUBSTANCES ANTIMICROBIENNES ………………………………………………………………………….....129 III-1 Mise en évidence des inhibitions entre les lactobacilles et H. pylori …………………………………….…129 III- 2 Acidification……………………………………………….…………………………………………………………………………..139 III-3 Détermination de l’agent inhibiteur ………………………………………..……………………………………………..143 III-3-1 Effet de la production d’acide lactique ………………………………………………………………………………..144 III-3-2 Effet du peroxyde d’hydrogène ……………………………………………………………………..……………………146 III-3-3 productions de phage lysogène: ………………………………………………………………………………………….146 III-3-4 Effet de la bactériocine…………………..……………………………………………………………………….…….…... 147 III-4 Effet de surnageant de lactobacille sur H. pylori en milieu liquide ………….…………………………....150 III-5 Inhibitions des bactéries pathogènes par les lactobacilles…………………………………………………..…..152 Discussion ……………….………………………………………………………………………………………….…………………………156 Conclusion et perspectives….………………………………............................................................................179 Références bibliographiques ….……………………………………………………………………………..………………………182 Annexe……………………………………………………………………………………………………………................................215 Activités scientifiques…………………………………………………………………………………………………………………….219 Résumé Le but de ce présent travail est de détecter in vitro le pouvoir inhibiteur des souches de Lactobacilles isolés du lait de chèvre sur la bactérie pathogène de H. pylori isolée des biopsies gastriques et de déterminer l’agent inhibiteur. En premier temps, la recherche de H. pylori a été réalisé à partir des biopsies gastriques des patients atteints de maladies gastroduodénales (gastrite chronique, ulcére gastroduodénale), et ayant subi une endoscopie digestive haute. La présence de cette bactérie a été mise en évidence par des tests invasifs : test rapide à l’uréase, l’examen cytologique, l’examen histologique, la culture et l’amplification génique PCR en temps réel. L’identification des souches de H. pylori isolées a été basée sur les caractères morphologiques (macroscopique et microscopique) et biochimiques (test à l’uréase, test à l’oxydase et la catalase).Nous avons pu isoler trois souches de H. pylori alors que les autres tests invasifs utilisés montrent parfois la présence de H. pylori dans les échantillons présentant une négativité de la culture (résultat faussement négatif). Ceci est probablement du à l’erreur de l’échantillonnage ou la sensibilité de la culture. . Par ailleurs, l’étude de la sensibilité des souches de H. pylori aux antibiotiques habituellement utilisés dans le choix thérapeutique a montré l’excellente activité de la plupart des antibiotiques testés vis-à-vis de H. pylori. Aucune résistance à la clarithromycine n’a été observée chez toutes les souches de H. pylori, cette résistance constitue le facteur majeur d’échec du traitement d’éradication de H. pylori. De plus, La technique moléculaire de la PCR en temps réel a permis de détecter à la fois H. pylori et d’éventuelle mutation de résistance à la clarithromycine à partir des biopsies gastriques ou de la colonie. En effet, les souches isolées de H. pylori (HP1, HP2, HP3), traitées par cette technique ont révélé d’une part leur conformité à l’Helicobacter pylori (ADN positif). Elles sont identifiées comme des souches dites sauvages (Wite type), et d’autre part, montre que ces souches ne présentent aucune mutation de résistance à la clarithromycine En second temps, 42 souches de lactobacilles ont été isolés à partir du lait cru de chèvre, et identifiés en se basant sur des critères morpholologiques,biochimiques et physiologiques. Les souches lactiques sont rattachées aux 3 groupes (I, II, III). Par ailleurs, cette identification a révélé la présence d’une diversité en espéces dans le genre de lactobacilles répartie essentiellement entre Lb. delbrueckii (sp. bulgaricus et sp. lactis ); Lb. helveticus; Lb. salivarius ; Lb. plantarum ; Lb. casei (sp. casei et sp. rahmnosus) ; Lb. rhamnosus ; Lb. paracasei ; Lb. pentosus ; Lb. brevis et Lb. fermentum. D’autre part, nous avons testé l’activité antimicrobienne in vitro des lactobacilles isolés ainsi que la souche de référence vis-à-vis des souches isolés de H. pylori (HP1, HP2, HP3) et les souches de référence (HP4) et (HP5) par la méthode directe de diffusion (Geis et al., 1983). Les souches de Lactobacillus sp. ont présenté dans l’ensemble une activité antagoniste vis-àvis de H. pylori, démontrée par l'apparition de zone d’inhibition avec des diamètres variés d’une souche à l’autre. La souche de Lb. rhamnosus (LBR1) a prouvé un pouvoir inhibiteur le plus élevé dont le diamètre d’inhibition est de 19 mm. L’évaluation du pouvoir acidifiant chez les 14 souches sélectionnés pour leur pouvoir inhibiteur élevé a été réalisée par la mesure du degré Dornic. Les espèces ayant un pouvoir acidifiant élevé sont: Lb. rhamnosus (LBR1) avec 69 D°, Lb. delbrukii sp. bulgaricus (LBDB1, LBDB3) et Lb. plantarum (LBP1) avec une acidité de 65 D°. La recherche de la nature de l’agent inhibiteur chez les 14 souches de lactobacilles par la méthode indirecte des puits a révélé que la production d’acide lactique est le facteur responsable de l’inhibition de H. pylori chez la majorité des lactobacilles testés. Tandis que chez la souche Lb. brevis, l’agent inhibiteur est l’acide lactique et une autre substance indéterminé, qui n’est pas une bactériocine, ni peroxude d’hydrogéne. Par ailleurs, l’étude de la viabilité de H. pylori en milieu liquide en présence de surnageant de la souche Lb. rhamnosus1, selectionné pour son pouvoir inhibiteur élevé, et de l’acide lactique a confirmé l’effet inhibiteur de l’acide lactique sur la croissance de H. pylori. Enfin, nous avons testé le pouvoir inhibiteur de nos souches lactiques vis-à-vis des bactéries pathogènes Gram positive (St aureus, B. subtilis) et bactéries gram négatives (E. coli, Kb. Pneumoniae, S.entertidis, Ps. aeruginosa). Les souches de lactobacilles testées exercent également une activité antimicrobienne contre les bactéries pathogènes et présentent un spectre d’activité large renfermant les bactéries Gram positive et les bactéries Gram négative montrant ainsi la capacité des lactobacilles à inhiber des bactéries pathogène en générale et l’Helicobacter pylori en particulier. Mots clés : H. pylori, Lactobacillus, lait de chèvre, antagonisme, acide lactique, agent antimicrobiens. Abstract The aim of the present work is to detect in vitro the inhibitory strains of lactobacilli isolated from goat milk on H. pylori isolated from gastric biopsies and to determine the inhibitory agent. First time, the search for H. pylori was done from gastric biopsies of patients with gastroduodenal diseases (chronic gastritis, peptic ulcer) who underwent upper gastrointestinal endoscopy. The presence of this bacterium has been detected by invasive tests: rapid urease test, cytology, histology, culture and PCR real time. The identification of strains of H. pylori isolates was based on morphological (macroscopic and microscopic) and biochemical (urease test, oxidase test and catalase). However, we have isolated three strains of H. pylori while other invasive tests used sometimes show the presence of H. pylori in the samples with negative culture (false negative). This is probably due to sampling error or the sensitivity of culture. Moreover, the study of the sensitivity of strains of H. pylori to antibiotics commonly used in the therapeutic choice showed excellent activity of most antibiotics tested vis-à-vis H. pylori. No resistance to clarithromycin was observed in all strains of H. pylori, this resistance is the major cause of treatment failure to eradicate H. pylori. In addition, the molecular technique of PCR real-time has detected both H. pylori and possible transfer of resistance to clarithromycin in gastric biopsies or from the colony. Indeed, isolates of H. pylori (HP1, HP2, HP3), treated with this technique have revealed one hand, their compliance with Helicobacter pylori DNA (positive). They are identified as socalled wild strains (Wild type), and secondly, shows that these strains show no mutation of resistance to clarithromycin. Second time, 42 strains of lactobacilli were isolated from raw milk goat, and identified based on criteria morpholological, biochemical and physiological. Lactic strains are attached to the 3 groups (I, II, III). Moreover, this identification has revealed the presence of species diversity in the genus Lactobacillus distributed mainly between Lb. delbrueckii (sp. bulgaricus and sp. lactis), Lb. helveticus, Lb. salivarius, Lb. plantarum, Lb. casei (sp. casei et sp. rahmnosus) Lb. rhamnosus, Lb. paracasei, Lb. pentosus, Lb. brevis and Lb. fermentum. Secondly, we tested the in vitro antimicrobial activity of lactobacilli isolated and the reference strain vis-à-vis the isolated of H. pylori strains (HP1, HP2, HP3) and reference strains (HP4) and (HP5) using the direct method of dissemination (Geis et al., 1983). The strains of Lactobacillus sp. showed an overall antagonist activity vis-à-vis H. pylori, as demonstrated by the appearance of inhibition zone with various diameters from one strain to another. The strain of Lb. rhamnosus (LBR1) showed an inhibitory highest inhibition whose diameter is 19mm. The evaluation of the acidifying power among 14 strains selected for their inhibitory rate was achieved by measuring the degree Dornic. Species with high acidifying power are: Lb. rhamnosus (LBR1) with 69 D °, Lb. delbrueckii sp. bulgaricus (LBDB1, LBDB3) and Lb. plantarum (LBP1) with an acidity of 65 D°. Research on the nature of the inhibitor in 14 strains selected of lactobacilli by the indirect method of wells revealed that the production of lactic acid is the factor responsible for the inhibition of H. pylori in the majority of the lactobacilli tested. While in strain Lb. brevis, the inhibitor is lactic acid and another substance unknown, which is not a bacteriocin or hydrogen peroxyde. The study of the viability of H. pylori in liquid medium in the presence of supernatant of the strain Lb. rhamnosus1, selected for its high inhibitory power, and lactic acid confirmed the inhibitory effect of lactic acid on the growth of H. pylori. Finally, we tested the inhibitory power of our lactic strains vis-à-vis the Gram positive bacteria (St. aureus, B. subtilis) and Gram negative bacteria (E. coli, Kb. pneumoniae, S.entertidis, Ps aeruginosa). The lactobacilli strains tested also exert antimicrobial activity against pathogenic bacteria and present a broad spectrum of activity containing Gram-positive and Gram-negative bacteria showing the ability of lactobacilli to inhibit pathogenic bacteria in generally Helicobacter pylori in particular. Key words: H. pylori, Lactobacillus, goat milk, antagonism, lactic acid antimicrobial agent. ا !" ا#$ % ا!وlactobacilles اف ها ا ه ا ارة ا ت ., ی ا" ا- و ﺕ،!"ت ی+ ا!وH. pylori *((ی" ا$) ا (اض ی ی6 ﺏ$"ﺏ8 *( !"ت اة+ "4 اH. pylori ا0 ﺕ، و1 ا%( ا23 . 29"ر ا:;أﺙ;"ء ا 0$@9) ا!رع و اB) "ر أ+ ا،) "ر ا@ ي+ ا،ری"ز$ E) "ر ا(ی+ اF(یG "(ی$) اHد هJ وK- ا0ﺕ . PCR real- time 2$- اL4 ا23 2;$Bا H. pylori ﺱت3 !ل0 ﺕK$% $O"$$آ$ و ا$J3 ارNO"8@ اH. pylori ی) ا)(ف 23 " )(یS"B) ($T اE) أن ید ها إ ا)زی- ی، ) ا(ق اXO") $ ﺏF3"" م ﺕا$%;" أ:%و . ) ا$;) ا$"ﺱ% ای أو إ$G"@ا 0 ی ا) و$-"دات ا9 ا0: $"3 ی$-"دات ا9 H. pylori $"ﺱ% دراﺱL;$ ﺏ،(ى+ أJ ] اج2$O( ا# ا2 ا"و هH ه، ات اروﺱE$J ; Clarithromycine [ أي "و ل%ی . H. pylori* اوى ﺏ"ل ا!و "ﺏ اﺹ]"تH. pylori "(ی$) أن ااPCR.time-real $; إ ذ^ أآت ﺕ3"*`"ﺏ Clarithromycine ( أي "و: ﺕ0 ( وWT) Wilde type ﺏتL3( وHelicobacter "8O"8+ أﺱ"سL3( K$% !" ا#$ % lactobacilles ﺱ42 !ل0 ﺕ،$" ا%( ا23 اع1 ا23 L ﺕ، (1،2،3) "تB 3 ات إH ه0$ ﺕ0 ﺕ4 و.$J!ی$] و ا$O"$$آ$ ا،$J3ار Lb. delbrueckii, Lb. rhamnosus, Lb. plantanum, Lb. salivarius, Lb. helveticus, :$")ا . Lb.fermentum, Lb. brevis, Lb. casei, Lb. pentosus, Lb. paracasei ا!و وH. pylori * ﺱتlactobacilles (وﺏ"ت ت$ "د9) (" ا;"ط ا+ ا،(ى+ أJ H. pylori - رة4 lactobacilles ﺱت0: (تj أ4 و،(; ﺏ"ﺱ)@ام ا(ی ا "ﺵ(ة$J(ا .019 l آ ( ﺏ( ی1 ا,$ )( اLBR1) Lb. rhamnosus (ت اj و أ،(ى+ﺕ@) ﺱ إ أ (LBR1)Lb. rhamnosus 2 ه$" $9% رة4 " 2)اع ا1ا. lactobacilles ﺱ14 ; *-رت ا4 . D°65 *% E (LBP1) Lb. plantarum, (LBDB3,LBDB1) Lb. delbrueckii sp. bulgaricus. D°69 E n% ( "ﺵ(ة و آ ﺏ^ أن$Tﺏ"ر اo ﺏ(ی اlactobacilles ﺱ14 ; ا"دة ا$ G K- ا0ﺙ Lb. brevis ;" ا$ اروﺱ ﺏlactobacilles ﺱت# p ; أ,$ )ول ها اq^ ه ا" ا$)اآ .$Jرو$ ا$(وآ$ و ﺏ$ ﺏ" )(یﺱL$ (ى+^ و "دة ا$) اآn% ه, "" ا3 , ا" ا$ G ^$) اآn% وLb. rhamnosus rد راﺵJ ﺏO" ﺱ, وﺱ23 H. pylori أآت دراﺱ .H.pylori ^$) اآn- K$% ، (امJ " و اJ(ات ا(* ا$) * اlactobacille ) "ر ارة ا ت+ ا0ﺕ، (ا$+و أ lactobacilles ارة ا ت$ (ات " ی$) اH ه, " اG" ﺕ"رسlactobacilles [ أن% ."ﺹ8+ H.pylori(ات ا(* " و$) * ا . ا، 2(وﺏ$"د ا9 ا;"ط ا،!" ا#$ % lactobacilles, Helicobacter pylori,: ات ا Liste des figures Fig. 1 : Structure de l’estomac Fig. 2 : Schéma général de la muqueuse gastrique Fig. 3 : Structure de la muqueuse fundique Fig. 4 : Structure de la muqueuse pylorique Fig. 5 : Schéma de la régulation physiologique de la sécrétion gastrique Fig. 6: Relation phylogénétique de H.pylori Fig. 7 : Localisation de H. pylori au niveau de la muqueuse gastrique Fig. 8: Helicobacter pylori sous microscope électronique Fig. 9 : Milieux de culture de H. pylori Fig. 10 : Aspect de colonies de H. pylori Fig. 11 : Distribution géographique de l’infection à H. pylori Fig. 12: Mécanismes de colonisation de H. pylori Fig. 13 : Méthodes diagnostiques de H.pylori Fig. 14 : Test à l’uréase Fig. 15: Examen anatomophathologique d’une biopsie gastrique Fig. 16 : Test respiratoire à l’urée marquée Fig. 17 : Test d’ELISA Fig. 18 : Rôle pathogène de H. pylori. Fig. 19 : Aspects endoscopiques des gastrites Fig. 20 : Mécanismes de l’ulcère gastrique et duodénale Fig. 21 : Mécanisme pour la carcinogenèse gastrique Fig. 22 : Détermination de la sensibilité de H. pylori par le E-test Fig . 23 : Arbre phylogénique des bactéries lactiques Fig . 24 : Principaux compartiments de l’appareil digestif Fig. 25: Principaux effets bénéfiques des probiotiques Fig. 26: Propriétés et critères de sélection des probiotiques Fig . 28 : Lactobacillus bulgaricus et Lactobacillus casei Fig. 29 : Arbre phylogénétique du genre lactobacilles Fig. 30 : Schéma d’isolement et identification de H. pylori Fig. 31 : Observation microscopique d’une biopsie biopsique Fig. 32 : Test rapide à l’uréase Fig. 33 : Test rapide à l’urée (CLO test) Fig. 34 : Examen anatomopathologique de la biopsie Fig. 35: Aspect macroscopique de H. pylori sur milieu pylori Fig. 36 : Aspect macroscopique de H. pylori sur gélose au sang Fig. 37 : Aspect macroscopique de H. pylori après purification Fig. 38 : Observation microscopique de H. pylori Fig. 39: Sensibilité de H. pylori à la clarithromycine Fig. 40: Sensibilité de H. pylori à l’amoxicilline Fig. 41: Sensibilité de H. pylori au métronidazole Fig. 42: Sensibilité de H. pylori Tétracycline, Rivampin et Levofloxacin Fig. 43 : Témoins utilisés dans la PCR en temps réel Fig. 44: Cas positif de la PCR à partir de la culture de H. pylori Fig. 45: Cas négatif de la PCR à partir des biopsies gastriques Fig. 46: Cas positif de la PCR à partir des biopsies gastriques Fig. 47: Aspect macroscopique des colonies de lactobacilles Fig. 48: Aspect microscopique des lactobacilles Fig. 49: Utilisation du citrate Fig. 50: tests biochimiques des lactobacilles Fig. 51: Répartition des lactobacilles Fig. 52 : Galeries API 50 CHL Fig. 53 : Répartition des espèces de lactobacilles Fig. 54 : Mise en évidence de l’effet inhibiteur des lactobacilles sur la croissance de H. pylori Fig. 55 : Mise en évidence de l’effet inhibiteur des lactobacilles sur la croissance de H. pylori Fig. 56 : Mise en évidence de l’effet inhibiteur des lactobacilles sur la croissance de H. pylori Fig. 57: Evolution de l’acidité et du pH en fonction du temps chez LBCR1, LBCC1, LBH1, LBH2, Fig. 58 : Evolution de l’acidité et du pH en fonction du temps chez LBP1, LBP3, LBS1, LBS2 Fig. 59: Evolution de l’acidité et du pH en fonction du temps chez LBR1, LBR2, LBDB1, LBDB3 Fig. 60: Effet de surnageant traité de lactobacille sur H. pylori Fig. 61: Viabilité de H. pylori en présence de surnageant de LBR1 et de l’acide lactique Fig. 62: Effet antimicrobien des lactobacilles sur les bactéries pathogènes Liste des tableaux Tab. 1: Classification d’Helicobacter pylori Tab. 2: Quelques espèces du genre Helicobacter Tab. 3: caractéristiques biochimiques et culturales de H. pylori Tab. 4: Facteurs de pathogénécité bactériens Tab. 5 : Différents types de thérapies anti-H. pylori Tab. 6: Principales souches microbiennes probiotiques Tab. 7 : Valeurs de pH limites de la croissance des microorganismes Tab. 8 : Valeurs des antibiotiques Tab. 9 : Caractérisation biochimique de H. pylori Tab. 10 : Détermination de la CMI et du diamètre de la zone d’inhibition Tab. 11: Sensibilité des souches de H. pylori aux antibiotiques Tab. 12 : Code des espèces de lactobacilles isolées à partir du lait de chèvre Tab. 13: Caractéristiques des lactobacilles Tab. 14 : Profils fermentaires des lactobacilles Tab. 15 : Profils fermentaires des lactobacilles par galerie API 50 CHL Tab. 16 : Activité antimicrobienne des Lactobacille sp. sur H. pylori Tab. 17 : Inhibition de H. pylori par lactobacilles Tab. 18: Effet de la production d’acides et du peroxyde d’hydrogène sur H. pylori Tab. 19: Effet de la production de la bactériocine Tab. 20: Activité antimicrobienne des lactobacilles vis-à-vis des bactéries pathogènes. Liste des Abréviation H. pylori : Helicobacter pylori C. pylori : Campylobacter pylori C. jejuni: Campylobacter pylori LBDL : Lactobacillus delbrueckii sp. lactis LBDB : Lactobacillus delbrueckii sp. bulgaricus LBCC : Lactobacillus casei sp. casei LBCR: Lactobacillus casei sp. rhamnosus LBB : Lactobacillus brevis LBR : Lactobacillus plantarum LBP: Lactobacillus rhamnosus LBS: Lactobacilles salivarus LBH: Lactobacillus helveticus Malt : tissu lymphoide associé aux muqueuse DNU : dyspepsie non ulcéreuse ADH: arginine dihydrolase ADN: acide désoxyribonucléique ARN: acide ribonucléique ATP: Adénosine Triphosphate Ara.: Arabinose Cel.: Cellobiose Fru.: Fructose Gal.: Galactose Lac.: Lactose Mal.: Maltose Man: Mannitol Mél.: Mélibiose Raf.: Raffinose Rib.: Ribose Sac.: Saccharose Sor.: Sorbitol Tré.: Tréhalose HES (Hémateine-Eosine-Safran) BHIB : Bouillon Cœur Cervelle BHI-A : Cœur Cervelle Agar Introduction Introduction Depuis sa découverte dans l’estomac humain, Helicobacter pylori, bactérie de la décennie, a bouleversé les concepts concernant certaines maladies gastroduodénales (Fléjou, 1989; Fagniez, 1995 ; Chamouard, 1996; Simsek et al., 2000). H. pylori est un pathogène gastrique humain, spiralé à Gram négatif, qui colonise la muqueuse de l'épithélium gastrique et survit dans l’environnement acide (Lorca et al., 2001). Il est aujourd’hui admis que la bactérie Helicobacter pylori est l’agent étiologique des pathologies gastro-duodénales (Missonier et Dorval, 1994; Simsek et al., 2000 Raymond et al., 2010), elle est responsable des gastrites chroniques, des ulcères duodénaux (Megraud et Lamouliatte, 1992), et joue un rôle important dans la genèse des cancers gastriques (adénocarcinomes et lymphomes) (Blaser, 1993; Parsonnet et al., 1991). Ceci conduit à réviser le traitement de la maladie ulcéreuse désormais considérée comme une maladie infectieuse. En effet, L'infection à H. pylori figure parmi les infections bactériennes chroniques les plus répandues et touche plus de 50% de la population mondiale (Dun et al., 1997 ; Pinchuk et al., 2001 ; Perez-Perez et al., 2004). L'éradication de l'Helicobacter est indispensable lors de sa mise en évidence pour notamment éviter les risques de cancer de l'estomac. Les indications de l’éradication de H. pylori font l’objet de discussions. La trithérapie utilisant un inhibiteur de la pompe à protons associée à deux antibiotiques est actuellement le traitement de référence recommandé pour l'éradication de H. pylori (Malfertheiner et al., 2002; Mignon, 2010). Toutefois, le traitement classique par les antibiotiques n’est pas toujours efficace contre l'infection à H. pylori du fait de la résistance de la bactérie aux antibiotiques, principal facteur d’échec des traitements (Hunt, 2006; Raymond et al., 2010) . 1 Introduction Par conséquent, le développement de méthodes alternatives serait nécessaire et la recherche de nouveaux agents antimicrobiens est recommandée (Pinchuk et al., 2001; Rokka et al., 2006). De nombreuses études scientifiques ont rapporté les propriétés prophylactiques et thérapeutiques de certaines bactéries lactiques particulièrement celles appartenant au genre Lactobacillus (Parker, 1974; Varcoe et al., 2003; Marelli et al., 2004 ; Lin et al., 2005). Ces microorganismes favorables pour la santé de l’homme et de l’animal ont reçu le nom de «Probiotiques». Ce concept a été développé tout particulièrement après l’émergence, ces dernières décennies, des bactéries résistantes aux antibiotiques et l’intérêt suscité par les agents naturels d’inhibition pour le contrôle des germes pathogènes (Ouewhand et al., 1999; Kailasapathy et Chin, 2000). Effectivement, les lactobacilles sont utilisés depuis des années contre les maladies infectieuses et sont largement étudiées pour leur capacité à protéger l’homme contre les bactéries pathogènes (Silva et al., 1987 ; Bernet et al., 1994; Tsai et al., 2003 ; Corr et al., 2007; Ryan et al., 2008). Plusieurs études ont montré que les lactobacilles présentent un pouvoir inhibiteur contre la bactérie pathogène de H. pylori in vitro et in vivo ( Michetti et al., 1995; Kabir et al., 1997; Coconnier et al., 1998). Ce pouvoir exercé par les lactobacilles est généralement due à la production d'acides organiques, le peroxyde d'hydrogène, ainsi que des bactériocines (Silva et al., 1987 ; Vandenbergh, 1993 ; Midolo et al., 1995; Trammer, 1966). Les lactobacilles montrent de manière évidente une meilleure tolérance à la trithérapie classique et semblent avoir un effet de prévention. Par conséquent, l’administration des probiotiques pourrait être exploitée comme un agent thérapeutique potentiel pour l’éradication de Helicobacter pylori. (Armuzzi et al., 2001; Hamilton-Miller, 2003; Midolo et al., 1995). Une alternative de traitement pourrait donc être la consommation de probiotiques. 2 Introduction C’est ainsi que notre présent travail est structuré en 4 volets : Le premier est consacré à une étude bibliographique comprenant deux parties dont la première concerne l’étude des aspects microbiologiques, diagnostiques et thérapeutiques de H. pylori, la deuxième partie traite les caractères des bactéries lactiques et les lactobacilles en particulier, leur application en santé humaine ainsi que leur activité antimicrobienne. L’ensemble du matériel et méthodes mis en œuvre au cours de l’étude est présenté dans un second volet. Les résultats expérimentaux sont abordés dans le troisième volet manuscrit suivi par une discussion générale. 3 de ce Helicobacter pylori Revue bibliographique I- Généralité sur l’Helicobacter pylori I-1 Historique L’intervention d’agents infectieux dans la pathogénie de certaines affections gastroduodénales a été suspectée en 1915 (Berstad, 1993; Vallot, 1994). En 1938, Doengens observa des bactéries spiralées dans l’estomac de singe, retrouvées par la suite dans des estomacs humains obtenue à l’autopsie (Veron et Fauchère, 1989; Megraud, 1994e; Illoul et al., 1995). En 1940, Freedberg et Baron observèrent ces bactéries dans 37% des estomacs réséqués puis un oubli total avant qu’elle ne soit de nouveau observées dans les années 1970 (Megraud, 1994e; 1996b). C’est en effet en 1975 que Steer et Colin Jones, en étudiant la muqueuse gastrique au microscope à balayage, ont noté la présence de ces bactéries spiralées. Cependant, leur tentative de mise en culture, sur milieu standard, ne permit de retrouver que Pseudomonas aeroginosa (Megraud, 1994e, 1996b). En 1979, Robin Warren, un anatomopathologiste australien, après avoir observé de très nombreuses bactéries spiralées ressemblant à des Campylobactéries sur un prélèvement histologique de gastrite aiguë, entreprit avec succès la recherche systématique de cette bactérie sur les biopsies qui fut alors appelée Campylobacter Like Organisms (CLO) (Marshall et Warren, 1984; Avril, 1988; Lee, 1992; Darra, 1994; Megraud, 1996b). Ce n’est qu’en 1982 que son collègue B. Marshall fut le premier à cultiver à partir de biopsies de la muqueuse gastrique cette bactérie spiralée appelée C. pyloridis, dénomination remplacée par C. pylori et aujourd’hui Helicobacter pylori (Marshall et Warren, 1984; Megraud, 1989b; Houdart, 1995; Megraud, 1996b). Et depuis, 1983, de nombreux travaux ont étudié les rapports entre l’infection antrale par H. pylori et les affections gastroduodénales (Dorval, 1992) et un débat s’est établi entre bactériologistes, gastro-entérologues et histologistes pour savoir si ces bactéries sont une cause, un facteur favorisant ou une conséquence 4 Helicobacter pylori Revue bibliographique des maladies gastriques (Veron et Fauchère, 1989) jusqu’à apparaître en 1994 comme le principal agent responsable des maladies gastroduodénales (Cayla, 1995). En 1995, une conférence de consensus de la communauté médicale reconnaît qu’Helicobacter pylori est bien la cause majeure des ulcères gastroduodénaux et non le stress comme il était auparavant admis, désormais classés dans la catégorie des maladies infectieuses. Depuis, les conférences de consensus et les articles sur cette pathologie infectieuse se suivent et le lien entre H. pylori et pathologie gastro-duodénale, est reconnu par tous en médecine. La découverte de la responsabilité de Helicobacter pylori dans les ulcères et les gastrites a été récompensée par le prix Nobel de physiologie et de médecine de 2005, attribué conjointement à Barry J. Marshall et J. Robin Warren qui leur est décerné en 2005. La découverte de Warren et de Marshall a préparé le terrain pour que les ulcères peptiques soient traités par l'éradication de la bactérie avec une combinaison d’antibiotiques et d’inhibiteurs de la sécrétion acide. 5 Helicobacter pylori Revue bibliographique I-2 Anatomie et Histologie I-2-1 Anatomie L’estomac est une vaste poche musculeuse ayant la forme d’un J majuscule et située sous le diaphragme entre l’œsophage et l’intestin grêle (Poilleux, 1943; Frexinos, 1983; Labayle, 1990) et présente une ouverture en haut, le cardia qui permet la jonction avec l’œsophage. Il comprend le sphincter œsophagien inférieur et le pylore à sa sortie vers le duodénum en bas. Il occupe la plus grande partie de la loge phrénique gauche de la cavité abdominale (Poilleux, 1943; Frexinos et al., 1989). Sa capacité est de 1 à 1,5 litres (Frexinos, 1983; Frexinos et al., 1989). Il est séparé de l’œsophage par le cardia et du duodénum par le pylore (Poilleux, 1943; Labayle, 1990) et il comprend schématiquement 2 parties, une partie verticale (fundus) occupant le 2/3 de l’estomac et une partie horizontale (l’antre) (fig. 1) (Poilleux, 1943; Frexinos, 1983; Frexinos et al., 1989). Fig. 1 : Structure de l’estomac (Frexinos, 1983) 6 Helicobacter pylori Revue bibliographique I-2-2 Histologie D’une épaisseur de 5mm, la paroi gastrique est formée par les quatre tuniques caractéristiques du tube digestif : muqueuse, sous muqueuse, musculeuse, et séreuse. La muqueuse est recouverte par un épithélium revêtu par un mucus la protégeant contre l’acidité gastrique (fig. 2) (Frexinos, 1983; Frexinos et al.,1989). L’épithélium reposant sur un chorion, la lamina propria, dessine à la surface luminale des cryptes qui s’invaginent profondément dans la lamina propria pour former des glandes dont l’aspect varie avec la région considérée au niveau du fundus et au niveau de l’antre (Czyba et Girod, 1967; Frexinos et al., 1989). Au niveau du fundus Les cryptes sont courtes et étroites. Les glandes sont tubulaires et rectilignes (fig. 3) (Czyba et Girod, 1967; Frexinos, 1983; Frexinos et al., 1989). Elles sont surtout exocrines en produisant la majeure partie du suc gastrique. Deux types cellulaires principaux sont représentés dans les glandes fundiques. Les cellules pariétales responsables de la sécrétion d’acide chlorhydrique et Les cellules principales sécrétant la pepsine sous forme de précurseur, le pepsinogène inactif, qui sera activé lors de l’abaissement du pH gastrique (Frexinos, 1983; Frexinos et al., 1989). Au niveau de l’antre Les cryptes sont hautes et étroites. Les glandes antrales sont courtes et fréquemment tubulo-ramifiées (fig. 4). La plupart des cellules sont de type muqueux (Czyba et Girod, 1969; Frexinos, 1983; Frexinos et al., 1989). La caractéristique cytologique la plus remarquable est la présence d’un très grand nombre de cellules endocrines comme la cellule G, la plus connue, qui synthétise et sécrète la gastrine. D’autres types cellulaires endocrines sont également présentes dans la muqueuse antrale et la muqueuse fundique comme les cellules D sécrétant la somatostatine (Frexinos, 1983; Frexinos et al., 1989). 7 Helicobacter pylori Revue bibliographique Fig. 2 : Schéma général de la muqueuse gastrique (Frexinos et al., 1989) Fig. 3 : Structure de la muqueuse fundique ((Frexinos et al., 1989) Fig. 4 : Structure de la muqueuse pylorique (Frexinos et al., 1989) 8 Helicobacter pylori Revue bibliographique I-3-Physiologie de l’estomac : L’estomac possède une double fonction : mécanique et chimique (Lambo et al., 1990). I-3-1 Fonction mécanique : L’estomac permet d’assurer la digestion par sa fonction mécanique (brassage). Il reçoit un mélange d’aliments solides et liquides provenant de la déglutition, les évacue vers l’intestin sous une forme fluide « le chyme ». Le brassage alimentaire est réalisé par des ondes péristaltiques mettant en cause les couches musculaires de l’organe. Elles débutent à la partie supérieure du corps et se dirigeant vers le pylore à raison de trois contraction par minute. L’évacuation du chyme vers le duodénum débute lorsque le bol alimentaire est suffisamment liquide, la vitesse de cette vidange dépend à la fois du volume et de la composition chimique du contenue gastrique. I-3-2 Fonction chimique : Elle correspond à la sécrétion gastrique dont le volume atteint entre 1 à 2litres par jour. Cette sécrétion gastrique est réalisée par les multiples glandes gastriques dont l’activité est stimulée lors du repas. La sécrétion est principalement composée d’eau, d’acide chloridrique et d’enzyme protéolytiques. L’estomac sécrète également un mucus qui protège sa paroi de l’action des sécrétions acides. La protection de la paroi gastrique contre l’acidité (PH 1.5 à 3.5) est assurée par trois facteurs : une couche épaisse de mucus, la présence de jonctions serrées entre les cellules empêchant la pénétration du suc gastrique dans la paroi et le remplacement cellulaire rapide. 9 Helicobacter pylori Revue bibliographique I-4 Mécanisme de régulation : L’état de jeûne inhibe la sécrétion de la gastrine et la prise alimentaire la stimule La cellule G antrale libère de la gastrine qui stimule la sécrétion acide. Elle est dans l’antre en contact étroit avec les cellules D qui synthétisent et sécrètent la somatostatine qui à son tour, inhibe la cellule G (Sobhani et al., 1994,1995). H. pylori se trouve au contact de ces cellules (Sobhani et al., 1994). La sécrétion gastrique acide stimulée exerce un effet de rétrocontrôle négatif sur la production et la libération de gastrine en stimulant la sécrétion de somatostatine par les cellules D antrales. Celles-ci inhibent la synthèse de gastrine par la cellule G antrale. La somatostatine peut agir aussi en amont de la gastrine en inhibant la libération du GRP appelé encore bombésine, l’un des stimulants majeures de la cellule à gastrine. La somatostatine fundique inhibe la sécrétion acide et module la réponse des cellules pariétales aux stimulations gastriniques et vagales (fig. 5) (Sobhani et al., 1994, 1995). L’infection chronique par H. pylori est directement responsable d’une hypergastrinémie modérée (Vallot et Merrouche, 1992; Ruszniewski, 1994; Sobhani et al., 1995) qui se traduit par un hyperfonctionnement des cellules G antrales et ceci peut s’expliquer par la baisse de la somatostatine antrale, secondaire à la réduction du fonctionnement des cellules à somatostatine (cellules D antrales) (Gotz et al., 1994; Delchier, 1995; Sobhani et al., 1995). I-5 Taxonomie Helicobacter pylori peut être considéré comme le chef de file d’un nouveau groupe de bactéries appelé superfamille VI de bacilles Gram négatifs. Le genre Helicobacter a été créé en 1989. bactéries préalablement placées dans le genre Campylobacter (Goodwin et al., 1989). H. pylori fait partie d’un grand groupe de bactéries qui phylogénétiquement sont éloignées des autres bactéries à Gram négatif (fig. 6) (Lamouliatte et al., 1992; Minor et Veron, 1990). Ce groupe réunit les genres Campylobacters, Hélicobacter, Aerobacter et Wolinella 10 Helicobacter pylori Revue bibliographique Fig. 5: Schéma de la régulation physiologique de la sécrétion gastrique acide chez l’homme (Sobhani et al., 1995) Escherichia coli Rocchalimaea quintana Agrobacterium tumefaciens Wolinella succinogenes Campylobacter pylori Campylobacter sputorum Campylobacter laridis Campylobacter Campylobacter coli Campylobacter fetus fetus Thiovulum sp. Anacystis nidulans Fig. 6: Relation phylogénétique de H.pylori avec certaines bactéries à Gram négatives (Romaniuk et al., 1987) 11 Helicobacter pylori Revue bibliographique ayant la particularité d’être adapté aux mucus du tube digestif de l’homme et des animaux (Sobhani et al., 1995; Lamouliatte et al., 1992). Cette particularité s’accompagne de caractéristiques morphologiques (forme spiralée, flagelles polaires) et physiologiques (métabolisme microaérobie et absence d’utilisation des carbohydrates) (Lamouliatte et al., 1992). Il a initialement été dénommé C. pyloridis en raison de certaines similitudes morphologiques avec les espèces du genre Campylobacter et de sa nature gastrique (pylore) (Chamouard, 1996, Fennerty, 1994 ; Sobhani et al., 1991; Goodwin et al., 1989). il a ensuite été renommé C. pylori en accordance avec le code international de la nomenclature des bactéries puis classé au sein d’un nouveau genre appelé Helicobacter pylori (Fennerty, 1994 ; Marshall et Goodwin, 1987 ; Goodwin et al., 1989). Le nom pylori tire son origine du latin « pylorus », qui signifie « gardien de l'ouverture », et qui fait référence à l'ouverture circulaire (pylore) menant de l'estomac au duodénum. Le genre Helicobacter appartient à la famille des Helicobacteraceae (ordre des Campylobacterales, classe des Epsilonproteobacteria, phylum des "Proteobacteria", domaine ou empire des "Bacteria" ou "Eubacteria"(tableau 1) Depuis une dizaine d’années, d’autres espèces ont été découvertes ou reclassées dans ce genre (tableau 2), la plupart colonisent l’estomac de différents animaux. Les autres Helicobacter sont rencontrés rarement chez l’homme. H pylori est l’espèce type la plus importante en médecine (Goodwin et al., 1989). I-6 Ecologie L’estomac a longtemps été considéré comme étant stérile du fait du caractère acide du liquide gastrique (pH 2-3), qui lui confère un rôle bactéricide majeur (Dubois, 1996; Drasar, 1989; Foliguet et al., 1989; Vincent et Leclerc, 1991). 12 Helicobacter pylori Revue bibliographique Tableau 1: Classification d’Helicobacter pylori (Goodwin et al., 1989) Classification classique Règne Bacteria Division Proteobacteria Classe Epsilon Proteobacteria Ordre Campylobacterales Famille Helicobacteraceae Genre Helicobacter Espèce Pylori Tableau 2: Quelques espèces du genre Helicobacter (Goodwin et al., 1989) Espèces Niche écologique Site d’infection Helicobacter pylori Homme Estomac Helicobacter cinaedi Hamster, homme Intestin Helicobacter fennelliae Homme Intestin Helicobacter mustelae Furet Estomac Helicobacter felis Chien, chat Estomac Helicobacter muridarum Souris Intestin Helicobacter nemestrinase Singe macaque Estomac Helicobacter acinonyx Léopard Estomac Helicobacter heilmanu Chien, chat, homme Estomac Helicobacter canis Chien Intestin Helicobacter hepaticum Souris Intestin, foie Flexispira rappini Souris Intestin 13 Helicobacter pylori Revue bibliographique Les bactéries ingérées au cours des repas ont une survie limitée à l’estomac (Vincent et Leclerc, 1991) à l’exception de celles qui traversent rapidement l’estomac ou qui résiste au pH gastrique (Savage, 1977). En effet, les cas de colonisation bactérienne de l’estomac par des espèces d’origine aérodigestive (Streptococcus, Lactobacillus, Staphylococcus, Bactéroïdes, Bifidobactéries…) et occasionnellement les entérobactéries, les bacilles pyocyaniques et les levures (candida) peuvent être dus à l’hypochloridrie liée à l’âge, au traitement antisecrétoire ou à la chirurgie (Vagotomie, gastrectomie) (Savage, 1977; Drasar, 1989; Vincent et Leclerc, 1991). L’isolement en 1983 d’une bactérie spiralée désignée H. pylori de la muqueuse gastrique a changé les concepts concernant la stérilité de l’estomac, pouvant être le siège d’une croissance bactérienne (Vincent et Leclerc, 1991; Conférence de consensus, 1995; Conclusions et recommandations du jury, 1996a ). H. pylori est retrouvé dans l’estomac humain essentiellement dans l’antre mais également dans le fundus (Moris et Nicholson, 1987; Foliguet et al., 1989; Megraud, 1996b) ainsi que dans le liquide gastrique (Vincent et Leclerc, 1991; Lamouliatte et al., 1992). L’adaptation à l’estomac humain, site généralement hostile aux bactéries, est une caractéristique essentielle de H. pylori liée à la microaérophilie et à la résistance à l’acidité gastrique en produisant une uréase permettant l’alcalinisation de son environnement (Goodwin et al., 1986; Vincent, 1995). De plus, cette acidité gastrique évite une alcalinisation létale pour H. pylori lors de la dégradation de l’urée (Clyne et Dramm, 1994). H. pylori fait partie des bactéries de mucus (Lamouliatte et al., 1992; Missonier et Dorval, 1994 ). Il vit sous la couche de mucus de l’épithélium de surface de la muqueuse gastrique (fig. 7) (Vallot, 1994; Vincent, 1994a) ou occupant la lumière des cryptes gastriques (De Mascarel et Merlio, 1989; 14 Helicobacter pylori Revue bibliographique Sobhani et al., 1991), et tendent à se regrouper en amas dans les espaces intercellulaires (Hazell et al., 1986; Vallot, 1994). Cependant, il n’est pas retrouvé en situation intracellulaire (Le Minor et Veron, 1990; Vallot et Merrouche, 1992; Vallot, 1994). H. pylori est également présent dans les zones métaplasiques gastriques du duodénum, de l’œsophage voire du rectum (Missonier et Dorval, 1994 ; Vallot, 1994 ; Vincent, 1994a). Il a aussi été isolé à partir de la plaque dentaire, la salive et les selles (Kelly et al., 1993; Missonier et Dorval, 1994; Vincent, 1995 ). Chez les animaux, la présence de H. pylori a été démontrée dans l’estomac des chats et du porc (Handt et al., 1994; Vincent et al., 1996; Weeb et al., 1997) et des singes (macaques, babouins et les chimpanzés) (Marshall, 1989; Hazell et al., 1992; Vincent, 1994 ; Dubois, 1996). Le réservoir environnemental est controversé. L’eau semble être un milieu mieux adapté (Vincent, 1994a; Megraud, 1996b; Vincent et al., 1996). Des études ont montré que l’eau peut être une source possible de transmission d’Hélicobacter pylori et que H.pylori pouvait subsister sous une forme coccoide dans l’eau pendant une longue période. Les formes cultivables de H. pylori ne survivent pas plus de 48 heures dans l’eau (Benallal, 2009; de Korwin, 1993). Fig. 7: Localisation de H. pylori au niveau de la muqueuse gastrique (Bigard, 1991) 15 Helicobacter pylori Revue bibliographique I-7 Caractères morphologiques C’est un bacille à Gram négatif de 3 à 5 µm de long et 0,5 à 1 µm de large (Fléjou, 1989 ; De Mascarel et Merlio, 1989 ; Avril, 1988). Il se présente sous forme spiralée, incurvée ou en forme de U ou O dans les jeunes cultures (fig. 8) (Sobhani et al., 1995; Fauchère, 1994; Fauchère et Rosenau, 1991) pouvant évoluer vers des formes coccoïdes non cultivables dans les vielles cultures et en milieu défavorable, seraient pour certains des formes de dégénérescence, pour d’autres des formes de résistance (Cellini et al., 1994; Sobhani et al., 1995 ; Megraud, 1994 ; Fauchère, 1994 ; Fauchère sporulé et Rosenau, 1991). Il est non et dépourvu de capsule. Il est mobile par un système flagellaire composé de 4 à 6 flagelles unipolaires engainés (fig. 8) lui permettant de se mouvoir par frétillement et par des mouvements de rotation caractéristiques (Sobhani et al., 1995 ; Vallot, 1994). Chaque flagelle possédant un bulbe terminal le distingue des autres campylobacters (Fléjou, 1989; De Mascarel et Merlio, 1989). Fig. 8: Helicobacter pylori sous microscope électronique 16 Helicobacter pylori Revue bibliographique I-8 Caractères culturaux H. pylori est une bactérie relativement fragile, sensible à la dessiccation et exigeante sur le plan métabolique (Lamouliatte et al., 1992; Megraud, 1992; Loziniewski, 1996 c’est. Elle ne peut pousser que dans une atmosphère microaérophile humide contenant 5% d’O2, 10% CO2, 85% d’N2, une des particularités que l’on utilise pour la mise en culture (Avril, 1988; Cellini et al., 1994, 1995a; Yousfi et al., 1997). De plus, sa culture exige des milieux enrichis tels que des milieux gélosés additionnés de sang, lysé ou cuit, d’hémines, du sérum du charbon ou d’amidon (fig. 9) (Megraud, 1989a ; Fauchère et Rosenau, 1991; Fauchère, 1994a; Sobhani et al., 1995). Ces milieux sont rendus sélectifs par addition d’antibiotiques spécifiques visant à éliminer les contaminants (Le Minor et Veron, 1990; Lozniewski, 1996). La température optimale de sa croissance est de 37°C. Par contre, H. pylori perd sa viabilité à température ambiante et à l’air (Belblidia et al., 1995; Cellini et al., 1995b; Lamouliatte et al., 1992). Dans ces conditions, les colonies apparaissent en 3 à 7 jours voire 10 jours pour une primoculture, ou en 2 à 4 jours pour un repiquage (Cellini et al., 1995b) H. pylori développe de petites colonies de 1 mm de diamètre, transparentes ou grisâtres, luisantes, discrètement bombées, rondes et régulières (fig. 10) (Cellini et al., 1995b; Sobhani et al., 1995). I-9 caractères phénotypiques : H. pylori ont un métabolisme respiratoire comme les Campylobacters et tirent principalement leur énergie des réactions de phosphorylation oxydative. Le caractère microaérophilique dépend de l’inhibition d’enzymes comme la lactate déshydrogénase plutôt que celle de la chaîne de cytochrome (Sobhani et al., 1991). 17 Helicobacter pylori Revue bibliographique Fig. 9 : Milieux utilisés pour la culture de H. pylori Fig. 10: A²spect des colonies de H. pylori sur gélose au sang et sur gélose selective 18 Helicobacter pylori Revue bibliographique Le capital enzymatique de H. pylori est important puisqu’il possède une catalase, phosphatase alcaline, phosphatase acide, cytochrome oxydase, superoxyde dismutase, DNAse, gamma glutamyl transpeptidase, leucine aminopeptidase, des amidases, des protéases, des lipases, des phospholipases et surtout une uréase extracellulaire en quantité extrêmement importante, Ce qui permet de la différencier des Campylobacters (tableau 3). Cette puissante uréase hydrolyse l’urée du liquide gastrique, en libérant de l’ammoniaque, permettant ainsi l’alcalinisation du milieu et la survie de la bactérie dans l’estomac acide. H. pylori ne réduit pas les nitrates et n’hydrolyse pas l’hippurate (Megraud, 1989; Veron, 1989). Il n’utilise pas les sucres (asaccharolytiques) ni par fermentation, ni par oxydation, c’est à dire qu’il tire son énergie d’autres sources : les acides aminés et les acides organiques (Monterio, 1994; Megraud, 1994; Sobhani et al., 1991). I-10 Caractères génétiques Le génome de H. pylori est trois fois plus petit que celui de E.coli, et codé pour environ 27000 protéines dont 500 sont reconnues spécifiques à la bactérie, soulignant le particularisme de l’Helicobacter pylori (Lamarque, 1998). Cependant, les découvertes faites sur le génome permettent d’élaborer des mutants dont les facteurs pathogènes ou les voies métaboliques sont inactivés (Lamarque, 1998). D’autre part, l’espèce de H.pylori se distingue par la valeur plus base de (G+C) de son ADN qui varie entre 36 et 37%, valeur différente de celle du genre Vibrio (G + C = 38-51%) et du genre Wolinella (G + C = 4649%) (Leclerc et al., 1989; Sobhani et al., 1991a). De plus, H.pylori se révèle d’une grande homogénéité sur le plan phénotypique mais d’une extrême diversité génomique par les mesures d’hybridation ADN-ADN (Megraud et Labigne, 1998). Les travaux d’hybridation ADN-ADN et ADN-ARN montrent également que H.pylori a un profil éloigné des Campylobacter (C.jejuni, C.fetus), 19 Helicobacter pylori Revue bibliographique Tableau 3: Caractéristiques biochimiques et culturales de H. pylori (Goodwin et al., 1989). Caractéristiques H. pylori NCTC 11637 Oxydase + Catalase + Uréase + Hydrolyse de l’hippurate - Réduction de nitrate - Production de H2S dans TSI - Gamma-glutmyltranspaspeptidase + Alcaline phosphatase + Motilité dans le bouillon cœur –cervelle + Motilité sur les milieux gélosés - Croissance en anaérobiose à 37°c - Croissance sur la gélose au sang contenant 3.5% NaCl - Croissance sur 0.5% de glycine + Croissance sur 1% de glycine - Croissance sur 1% de bile - Sensibilité à l’acide nalidixique(30 g) R Sensibilité à la céphalothine (30 g) S Sensibilité au métronidazole( 5 g) S 20 Helicobacter pylori Revue bibliographique ce qui explique le changement récent de dénomination (Sobhani et al., 1991a). La présence de plasmide a été observée chez plusieurs isolats de H.pylori (Minnis et al., 1995). En effet, des études récentes ont reporté que 58% d’isolats de H.pylori contiennent des plasmides dont la taille varie de1,8 à 40 kbp (Tijia et al., 1987; Penfold et al., 1988). A ce jour, la composition génomique complète de deux souches de H.pylori est connue : « H. pylori 26695 » isolée en Angleterre en 1987 et « H.pylori J99 » isolée au USA en 1994 (Flejou, 2001). Leur génome consiste en une structure chromosome circulaire dont 91% sont constitués de régions codantes (1,7×106pb ,1590 séquences codantes). Ils ont été entièrement séquencés en 1997(Lee , 1996). I-11 Transmission La transmission interhumaine directe de H. pylori est la plus probable. On peut distinguer deux modes de transmissions : a- Oro-orale C’est le mode prédominant de transmission de H. pylori (Fauchère et Rosenau, 1991; Vincent, 1994b; Chow et al., 1995) qui se fait par l’intermédiaire du liquide gastrique ou par la salive (Conférence de consensus, 1995; Riachi et Colin, 1995; Conclusions et recommandations du jury, 1996). La contamination par le liquide gastrique infectant (vomissement-régurgitation) s’observe surtout chez l’enfant. L’origine salivaire (régurgitations physiologiques) est incriminée chez l’adulte (Riachi et Colin, 1995 ; Vincent et al., 1996). Le risque d’infection est accru chez les enfants nés de mères H. pylori positives (Lamouliatte et al., 1992; Vincent, 1994b; Megraud, 1996b) ainsi que chez les adolescents (Lamouliatte et al., 1992; Schultze et al., 1995; Megraud, 1996b ). 21 Helicobacter pylori Revue bibliographique b- Féco-orale La transmission d’origine fécale intervient en cas de mauvaises conditions d’hygiène (Vincent, 1994b; Vincent et al., 1996). Les eaux de surface pourraient jouer le rôle de vecteur (Conférence de consensus, 1995; Conclusions et recommandations du jury, 1996; Vincent et al., 1996 ), mais le mode de transmission à partir de l’environnement (alimentation, animaux…) est peu vraisemblable (Riachi et Colin, 1995; Vincent et al., 1996) compte tenu de la grande fragilité du germe (Conclusions et recommandations du jury, 1996; Conférence de consensus, 1995). Enfin la transmission par le matériel endoscopique contaminé est probable (Fauchère et Rosenau, 1991; Conférence de consensus, 1995; Conclusions et recommandations du jury, 1996; Megraud, 1996b). Les endoscopistes pourraient être un groupe de risque en raison du contact fréquent avec les malades (Fauchère, 1994a; Riachi et Colin, 1995; Sobhani et al., 1995). Ceci souligne l’importance des mesures de désinfection du matériel ainsi que du port des gants par les endoscopistes (Conférence de consensus, 1995; Conclusions et recommandations du jury, 1996; Megraud, 1996b). I-12 Prévalence Environ deux tiers de la population mondiale sont infectés par cette bactérie. Le taux d'infection varie d'un pays à l'autre. En effet, cette infection est plus élevée dans les pays en développement que dans les pays développés, environ 25 % dans les pays occidentaux avec d'importantes disparités et de 90% dans les pays du Tiers-Monde (Fig. 11). La distribution géographique de l’infection à H. pylori est associée principalement à l’état de développement économique. Le taux d’infection décroît généralement avec l’amélioration des conditions socio-économiques (Benallal, 2009; Sobhani et al., 1991; al., 1992 ; Vincent, 1994b; Illoul et al., 1995 ). 22 Lamouliatte et Helicobacter pylori Revue bibliographique De plus, l’infection par H. pylori est souvent acquise dans l’enfance et en particulier au cours des cinq premières années de la vie (Lamouliatte et al., 1992; Guerre, 1996; Vincent et al., 1996). Sa prévalence augmente avec l’âge pour atteindre 50% voire plus pour les sujets de plus de 60 ans (Vincent, 1995; Veldhuyzen van Zanten et al., 1994; Megraud, 1994 f; Sobhani et al., 1995). Les facteurs suivants favorisent l’infection : le niveau socio-économique, l’ethnie (plus fréquent chez les noirs que chez les blancs), la promiscuité (nombre d’enfant par pièce, la taille de la famille, la taille des logements…) et les conditions d’hygiène (Nowottny et Heilman, 1989; Colin et al., 1995; Sobhani et al., 1995). Fig. 11 : Distribution géographique de l’infection à H. pylori dans les différentes régions du monde . 23 Helicobacter pylori Revue bibliographique I-13 Facteurs de colonisation Helicobacter pylori, comme toutes les autres bactéries, est sensible à l’acidité gastrique. Pour pouvoir coloniser et survivre dans la muqueuse gastrique, il va devoir mettre en jeu un certain nombre de propriétés. En effet, H. pylori possède 3 principales propriétés lui permettant de coloniser l’estomac malgré la barrière constituée par le mucus visqueux et malgré l’acidité gastrique qui tue la plupart des bactéries : la mobilité, l’uréase et l’adhérence (fig. 12) (Fauchère et Rosenau, 1991; Lamouliatte et al., 1992; Fauchère, 1994b ; Monterio, 1995 ; Bretagne, 1996). Fig. 12 : Mécanismes de colonisation de H. pylori de la muqueuse gastrique 24 Helicobacter pylori Revue bibliographique I-13-1 Mobilité Elle permet à H. pylori de se mouvoir dans le mucus mieux que d’autres bactéries. Elle est non seulement due à sa forme spiralée mais aussi à la présence des flagelles engainés. En effet, H. pylori possède un système flagellaire adapté à cet environnement particulièrement visqueux. De plus, la morphologie spiralée s’accentue quand la viscosité augmente. Ces deux particularités permettent à la bactérie d’avoir une plus grande mobilité et de traverser ainsi les mucus avec une vélocité plus importante (Fauchère et Rosenau, 1991; Lamouliatte et al., 1994; Labigne, 1994; Monterio, 1995; Bretagne, 1996). I-13-2 Uréase Lors de l’infestation, H. pylori va se retrouver dans le lac gastrique extrêmement acide. Pour se protéger de cette acidité gastrique, H. pylori produit une uréase très active capable d’hydrolyser l’urée normalement présente dans l’estomac en libérant de l’ammoniac . Cet ammoniac neutralise le micro-environnement de la bactérie, ce qui rendra le milieu plus accueillant à cette bactérie (Fauchère et Rosenau, 1991 ; Lamouliatte et al., 1992 ; Labigne, 1994 ; Wadstrom, 1996 ). I-13-3 Adhérence H. pylori est étroitement adhérente aux membranes de cellules épithéliales gastriques mais reste extracellulaire (Fauchère et Rosenau, 1991 ; Fauchère, 1994a, 1994b). Cette adhérence est due à la présence des antigènes bactériens (désignés adhésines) comme l’hémagglutinine capable de se fixer sur les récepteurs de l’épithélium comme le N-acétyl-neuraminyl lactose. Il en résulte la formation d’une lésion d’attachement et rupture membranaire. Cette capacité d’adhérence permet aux bactéries de résister aux mouvements péristaltismes gastriques et à la mobilité de l’extrémité apicale des cellules épithéliales (Evans et al., 1999; Labigne, 1994). 25 Helicobacter pylori Revue bibliographique 1-14 Mécanisme de persistance Après la phase de contamination, H. pylori va coloniser la muqueuse gastrique et persister au site d’infection pendant un temps plus au moins long, puis le pouvoir pathogène d’Helicobacter pylori commencera. De plus, l’adhésion cellulaire favorise et multiplie la toxicité des facteurs intrinsèquement responsables des lésions de la muqueuse épithéliale gastrique (tableau 4). L’agression de la muqueuse gastrique va stimuler le système immunitaire et malgré une réponse humorale spécifique et locale, H. pylori échappe à la phagocytose. Pour se défendre, la bactérie synthétise deux enzymes : la catalase et la superoxide dismutase. Mais aussi grâce à l’activité uréasique et la libération d’ammoniaque, elle est capable de neutraliser le contenu du phagolysosome diminuant ainsi la bactéricide. De plus, la grande quantité d’antigènes relargués par la bactérie, pourrait saturer les anticorps et rendre inefficace la réponse immunitaire locale. Ces différents processus permettent d’expliquer la colonisation à long terme de la muqueuse gastrique (Fauchère, 1994c; Lamouliatte et al., 1992; Monteiro, 1995; Sobhani et al., 1995). I-15 Réactions inflammatoires L’inflammation se définit, entre autre, par un infiltrat cellulaire, constitué de polynucléaires neutrophiles, de lymphocytes et de macrophages. H. pylori, qui n’a pas de caractère invasif, peut produire des facteurs de chimiotactismes et d’activateurs des polynucléaires neutrophiles. Ces polynucléaires sécrètent à leur tour, des enzymes protéolytiques et des radicaux libres. Ce qui permettra à la bactérie de perpétuer l’inflammation et de provoquer, à long terme, une lyse des cellules de la muqueuse gastrique (Beil, 1995; Labigne, 1994). Certaines souches de H. pylori, possédant le marqueur Cag A, stimulent activement la production d’interleukine -8 (II-8). Cette cytokine, puissant médiateur de l’inflammation, est responsable du recrutement par chimiotactisme des polynucléaires neutrophiles et de leur activation (Fauchère, 1994c; Sobhanie et al., 1991; De Korwin, 1994a). 26 Helicobacter pylori Revue bibliographique Tableau 4: Facteurs de pathogénécité bactériens (Lamouliatte et al., 1992 ; Monteiro, 1995 ; Sobhani et al., 1995) Facteur Uréase Action L’ammoniac produit est responsable de perturbation de la sécrétion de mucus, action cytotoxique sur les cellules épithéliales et effet toxique sur les polynucléaires. Lipopolysaccharide sialidase Altération du mucus gastrique. Oxydase-catalasesuperoxydedismutase (SOD) Protection contre les défenses de l’hôte Protéase phospholipase Facilité de migration de la bactérie. Altération du mucus, altération de la perméabilité des membranes cellulaires Production des médiateurs pro-inflammatoires. N-alpha methyl histamine. Inhibition de la production de somatostatine. Cytotoxine Vac vacuolisante Formation de vacuoles au niveau des cellules épithéliales et endommagement de la muqueuse. Système de captation du Elaboration des systèmes pour capter le fer chez l’hôte. fer. 27 Helicobacter pylori Revue bibliographique I-16 Méthodes de recherche de H. pylori Les méthodes diagnostiques de l’infection à H. pylori sont nombreuses mais aucune d’entres-elle ne peut aujourd’hui être considérée comme un test de référence (Bruley Des Varannes, 1996 ; Riachi et Colin, 1995 ; Souquet, 1995). Leur utilisation varie en fonction des buts recherchés et des populations ou individus étudiés (Souquet, 1995). On distingue en pratique deux grands types de méthodes, méthodes dites invasives nécessitant une endoscopie digestive et des biopsies (test rapide à l’uréase, examen histologique « anatomopathologique », examen cytologique, culture et amplification génique par PCR) et méthodes non invasives (test respiratoire à l’urée et sérologique) (fig. 13) (Yousfi et al., 1997 ; Bruley Des Varannes, 1996 ; Conclusions et recommandations du jury, 1996 ; Conférence de consensus, 1995 ; Riachi et Colin, 1995 ; Sobhani et al., 1995 ; Lamouliatte et al., 1992 ; Megraud, 1992 ; Faniez, 1995). I-16-1 Méthodes invasives I-16-1-1 Test à l’uréase : Ce test est basé sur l’existence d’une uréase très intense chez H. pylori dans un prélèvement gastrique qui va hydrolyser l’urée pour libérer de l’ammoniac et du CO2, augmentant ainsi le pH du milieu et faire virer la couleur de l’indicateur du pH (Megraud, 1994a, 1996a; Riachi et Colin, 1995 ; Lamouliatte et al., 1992). Ce test a beaucoup de succès car il est simple, rapide, peu coûteux et surtout réalisable par l’endoscopiste lui-même (Megraud, 1996a ; Sobhani et al., 1995; Bruley Des Varannes, 1996). Actuellement différents tests sont commercialisés. Ils varient en fonction de leurs milieux (gélosés, liquides, semi-gélosés comme le CLO test). 28 Helicobacter pylori Revue bibliographique Sujet gastralgique Méthode invasive (endoscopie) Biopsie Amplification génique par PCR Au laboratoire. Méthode non invasive (pas d’endoscopie) Sérodiagnostic (sérologie) Sur 1 mg de sang Test Elisa délai de réponse 4h Test Uréase En salle d’endoscopie Test commercialisé (CLO ou CU test) délai de réponse 20 minutes Bactériologie Au Laboratoire Culture Méthode de référence Milieu commercialisé délai de réponse 5 jours Test respiratoire à C13 ou C14 urée sur l’air expiré mesuré de CO2 Histologie Au laboratoire, coloration HES ou Giemsa, délai de réponse 2jours. Cytologie Coloration de Gram Délai de réponse 30 minutes Antibiogramme Fig. 13: Méthodes diagnostiques de H.pylori (Megraud, 1992 ; Sobhani et al., 1995) 29 Helicobacter pylori Revue bibliographique La lecture s'effectuera en moins d'une heure (20 à 30 min), directement en salle d'endoscopie (fig. 14). La sensibilité du test est augmentée en utilisant deux biopsies pour une spécificité excellente (supérieure à 95%) (Bruley Des Varannes, 1996; Conférence de consensus, 1995 ; Riachi et Colin, 1995 ; Megraud, 1994a; Souquet, 1995). Car il faut en effet un nombre de bactéries important (> 105 bactéries) pour faire virer le test, ce qui limite son utilité pour le contrôle de l’éradication du germe. Toutefois, au-delà de 18 heures, outre la perte de l’intérêt d’un diagnostic rapide, sa spécificité décroît en raison de l’apparition de faux positifs, dus à la présence de bactéries contaminantes uréase positive d’origine buccale comme Staphylococcus. sp, Streptococcus. Sp voire Klebsiella, Proteus ou même gastrique tel que Gastrospirillum hominis, bactérie rarement rencontrée mais pouvant être à l’origine de gastrites (Delchier, 1994 ; Megraud, 1992 ; Megraud, 1994a; Lamouliatte et al., 1992). Fig. 14 : Test à l’uréase sur milieu urée-indole (a), avec le kit CLO test (b) 30 Helicobacter pylori Revue bibliographique I-16-1-2 Examen cytologique L’examen cytologique d’une empreinte biopsique après simple coloration de Gram permet de repérer les Helicobacters par leur morphologie caractéristique (Sobhani et al., 1995 ; Megraud, 1994a , 1996a; Lozniewski, 1996). Le prélèvement peut être coloré au Gram, au Giemsa modifiée ou à l'orange d'acridine fluorescent. Des formes coccoïdes peuvent être présentes qui évoquent la présence d’H.pylori mais ne permet de conclure sans l’utilisation de tests immunologiques avec des anticorps spécifiques marqués (Megraud, 1992, 1994 ; Lamouliatte et al., 1992 ; Sobhani et al., 1991). Cet examen est simple, rapide, reproductible, relativement sensible mais spécifique (Sobhani et al., 1991, 1995). I-16-1-3 Examen anatomopathologique Il s’agit du moyen de détection le plus répandu. Il permet à la fois de mettre en évidence H. pylori à partir des coupes histologiques de la biopsie gastrique et d'identifier les lésions de la muqueuse gastrique (fig. 15). Il n’est satisfaisant que s’il est pratiqué par un praticien spécialisé, La sensibilité et la spécificité de cet examen sont supérieures à 90%. La méthode doit comporter une fixation des biopsies dans le formol et adopter des colorations facilitant la reconnaissance de la bactérie au microscope (Giemsa modifié, HES, Warthin- Starry ou crésyl violet) (Lozniewski , 1996; Megraud 1994a; Sobhani et al., 1995). Fig. 15: Examen anatomopathologique d’une biopsie gastrique (Lynch, 1997). 31 Helicobacter pylori Revue bibliographique I-16-1-4 Culture: C'est la méthode de diagnostic de référence car la seule permettant d’une part l’isolement et l’identification de H. pylori et d’autre part l’étude de la sensibilité aux antibiotiques et le typage moléculaire des souches (Megraud, 1994a; Fagniez, 1995 ; Conférence de consensus, 1995 ; Riachi et Colin, 1995). Elle est d’une spécificité absolue car elle permet une identification précise de la bactérie (Megraud, 1989; Souquet, 1995 ; Bruley Des Varannes, 1996). Elle est aussi d’une sensibilité assez importante car il suffit, théoriquement qu’il y’ ait une bactérie dans la biopsie pour obtenir une colonie et donc un résultat positif. Cependant, quelques difficultés techniques peuvent influencer la sensibilité de la culture, qui est extrêmement dépendante des performances du laboratoire et des conditions techniques (transport, nombre de biopsies, laboratoire…). En effet, le transport de biopsie gastrique au laboratoire dans de bonnes conditions reste un élément très important pour la réussite de la culture. Il est donc nécessaire de ne pas exposer les fragments biopsiques à l’air, et de les placer dans une solution saline pour un transport de courte durée d’un maximum de 4 h, ou au mieux dans un milieu de transport comme le Portagerm qui permet à la culture d’être retardée de 24 h (Benallal, 2009; Lozniewski, 1996 ; Megraud, 1994g). I-16-1-5 PCR en temps réel ou PCR quantitative : La nouvelle technique PCR en temps réel (Real-time PCR) est une innovation dans le diagnostic de H. pylori parce qu'elle permet non seulement une détection rapide et précise de H. pylori mais également sa quantification ainsi que la détection des mutations qui sont associées à la résistance aux antibiotiques. Effectivement, la PCR en temps réel est une révolution dans l’utilisation de la PCR, cette technique consiste à mesurer la quantité d’ADN polymérisé à chaque cycle (temps réel) (expliquant l'appellation PCR quantitative), grâce à un marqueur fluorescent, mais elle nécessite des thermocycleurs particuliers. 32 Helicobacter pylori Revue bibliographique Elle utilise le principe de base de la PCR classique avec pour différence une amplification mesurée non pas en final mais tout au long de la réaction, donc en temps réel. Plusieurs systèmes de détection sont utilisés pour la détection ou la quantification du signal fluorescent en temps réel. Ils sont généralement divisés en 2 groupes les agents intercalants et les sondes (Wittwer et al., 1997; Vaira et al., 2000). De plus, la PCR en temps réel est utilisée pour de nombreuses applications notamment à des fins diagnostiques et/ou de recherche pour la détection et/ou la quantification rapide d’agents pathogènes. Cependant, cet examen n'est pas encore passé dans la pratique courante. La disponibilité de ces tests est encore limitée. Il s'agit d'une technique d'avenir qui permet le diagnostic rapide de l'infection de H. pylori avec des conditions de prélèvement ou de transport moins contraignantes que celles de la culture. Elle peut servir à la détection de H. pylori même en cas de dégradation des prélèvements (Benallal, 2009 ; Ho et al., 2000). I-16-2 Méthodes non invasives : I-16-2-1 Test respiratoire à l’urée marquée (Urea breath test C 13 ) Comme pour le test rapide à l'urée, on utilise la propriété d'H. pylori à posséder une activité uréasique en utilisant une solution d'urée marquée au carbone 13 (isotope naturel, stable, et non radioactif) que l'on fait ingérer au patient. Dans l'estomac cette urée 'isotopique" est hydrolysée par l'uréase de la bactérie provoquant ainsi la libération d'ammoniac et CO2 marqué. Ce 13CO2 passe la barrière intestinale, se retrouve dans la circulation sanguine puis dans l'air expiré par le poumon (Fig.16). L'analyse est effectuée à l'aide d'un spectromètre de masse. On peut également utiliser l'urée marquée au carbone 14. Les performances du test respiratoire sont excellentes, avec des sensibilités et des spécificités de 90-95 %, aussi bien avant qu’après traitement d’éradication de H. pylori. Ce test est actuellement considéré comme la meilleure méthode 33 Helicobacter pylori Revue bibliographique de diagnostic et de contrôle de l’éradication de H. pylori, lorsque l’endoscopie n’est pas nécessaire (Graham et al., 2000 ; Logan et al., 1998 ; Vincent et al., 1999) Fig. 16: Etapes du test respiratoire à l’urée marquée au c13 (Logan et al., 1998) I-16-2-2 Sérologie: Helicobacter pylori stimule le système immunitaire de l'hôte, provoquant ainsi l'apparition d'anticorps sériques spécifiques de type lgG, parfois d'IgA. La détection d’anticorps contre l’ H. pylori permet le diagnostic d’infection à H. pylori avec une sensibilité et une spécificité de l’ordre de 85 à 95%. La technique la plus utilisée est l’Elisa de type IgG (Fig. 17).Cet anticorps sérique lgG diminue très lentement après éradication de la bactérie (6 à 8 mois), ce qui limite son utilisation pour le contrôle précoce après traitement. Il trouve cependant sa place dans les études épidémiologiques. Cette technique est avantageuse parce qu’elle permet de diagnostiquer plusieurs personnes, rapidement et à coûts réduits. De plus, elle a l’avantage de ne pas être trop invasive en comparaison à la biopsie par endoscopie. Elle est la méthode la plus recommandée pour un test initial non seulement parce qu’elle est non-invasive 34 Helicobacter pylori Revue bibliographique mais aussi parce qu’elle est précise, moins dispendieuse et reproductible (Kosunen et al., 1992 ; Leodolter et al., 2003). Fig. 17: Test d’ELISA I-17 Pathologies associées à H. pylori L’infection à H. pylori une fois acquise persiste en l’absence d’éradication thérapeutique. Elle provoque dans un premier temps une gastrite aiguë suivie le plus souvent d’une gastrite chronique. Cette gastrite peut rester superficielle ou évoluer vers un ulcère duodénal ou gastrique et à long terme un risque de cancer gastrique ou lymphome de Malt (fig. 18) (Bretagne, 1996; Buckley et O’Morain, 1996). I-17-1 Gastrites Le terme de gastrite désigne toute lésion inflammatoire de la muqueuse gastrique en réponse à une agression de l'estomac. La muqueuse agit comme une barrière protectrice de la paroi de l’estomac. Sans cette protection, la paroi de l’estomac devient plus sensible et serait vite attaquée par les acides ou par d’autres substances irritantes qui provoqueraient des ulcères, c’est ce qui se produit dans le cas de l’ulcère gastro-duodénale, mais il arrive aussi que la muqueuse soit elle même irritée, sans que la paroi soit touchée : on parle alors de gastrite. La gastrite peut être aigue et se manifester soudainement ou être chronique et évoluer lentement sur plusieurs années (Stanghellini et al., 2001). 35 Helicobacter pylori Revue bibliographique Ulcère duodénal Métaplasie duodénal Hypersécrétion acide Gastrite aïgue Guérison Gastrite chronique Lymphomes gastriques Atrophie muqueuse et métaplasie Tumeurs carcinoïdes Ulcère Adénocarcinome gastrique Fig. 18 : Représentation schématique du rôle pathogène de Helicobacter pylori (Schilio, 1996). 36 Helicobacter pylori Revue bibliographique I-17-1-1 Gastrite aigue C’est une inflammation aiguë de la muqueuse gastrique (Burley Des Varannes et Scarpignato, 1996). Elle est caractérisée par la présence d’un infiltrat inflammatoire polynucléaire neutrophile venant phagocyter les bactéries (Burley Des Varannes et Scarpignato, 1996; Chamouard, 1996). Cette phase aiguë de l’infection est courte, symptomatique, habituellement accompagnée d’une diminution de la sécrétion gastrique acide (hypochlorhydrie) et une légère augmentation de la gastrine (Sobhani et al., 1991, 1995; Buckley et O’Morain, 1996 ). La gastrite aiguë peut disparaître si la bactérie n’est pas retenue par la muqueuse gastrique (Sobhani et al., 1995). Elle évolue le plus souvent vers la gastrite chronique (Sobhani et al., 1995; Buckley et O’Morain, 1996). I-17-1-2 Gastrite chronique L'installation de la gastrite chronique constitue alors la deuxième phase de l'infection à H. pylori (fig.19). C’est une inflammation chronique de la muqueuse gastrique, caractérisée par l’infiltration de plasmocytes et de lymphocytes avec la présence de polynucléaires et de monocytes signe d’activité constamment associée à la présence de la bactérie. Elle est souvent asymptomatique (Chamouard, 1996; Fléjou, 1996; Riachi et al., 1995). Le rôle de H. pylori dans son étiologie est maintenant bien admis par la communauté scientifique. Effectivement, H. pylori est le principal agent étiologique de la gastrite chronique antrale de type B ou bactérienne (Vallot, 1994; Sobhani et al., 1995; Chamouard, 1996 ), gastrite qui touche principalement l’antre gastrique mais elle peut parfois s'étendre vers le fundus (gastrite antrofundique) (Colin et al., 1995; Chamouard, 1996). Cette gastrite peut rester superficielle ou évoluer vers un ulcère duodénal ou gastrique et à long terme un risque de cancer gastrique ou lymphome de Malt (Bretagne, 1996; Bommelaer, 1996; Colin, 1996). La gastrite antrale (gastrite B) augmente 37 Helicobacter pylori Revue bibliographique le risque d’ulcère duodénal, la gastrite antrofundique (gastrite AB) augmente celui de l’ulcère gastrique (Colin et al., 1995 ; Dorval, 1992). L’éradication de l’infection entraîne la disparition de la gastrite de type B (Kuipers, 1995; Sobhani et al., 1995; Buckley et O’Morain, 1996). Fig. 19: Aspects endoscopiques des gastrites (Burley Des Varannes et Scarpignato, 1996). I-17-2 Ulcère duodénal H. pylori joue un rôle important dans le déclenchement de l’ulcère duodénal qui est presque toujours associé à une gastrite à H. pylori. Cette association est retrouvée chez près de 90% des patients (Fennerty, 1994; de Korwin, 1994b; Sobhani et al., 1995). L’infection par H. pylori apparaît comme une condition nécessaire à la survenue d’une récidive ulcéreuse du fait de la quasi-disparition des rechutes ulcéreuses en cas d’éradication de H. pylori (Vallot, 1994; de Korwin, 1994b; Curel et al., 1999). L’un des mécanismes pathogènes avancés expliquant l’ulcérogénèse duodénale par l’infection à H. pylori est l’hypersécrétion postprandiale de la gastrine (Hypergastrinémie) responsable d’une hypersécrétion d’acide 38 Helicobacter pylori Revue bibliographique (Fennerty, 1994; Missonier et Dorval, 1994; Gouyon et al., 1996). Ces deux anomalies peuvent être liées aux effets de H. pylori sur les cellules D antrales sécrétant la somatostatine, qui a un effet inhibiteur sur la libération de la gastrine et donc sur la production d’acide (Fennerty, 1994; Missonier et Dorval, 1994; Dorval , 1992,1995; Buckley et O’Morain, 1996 ) . Dans le duodénum, cet apport excessif d’acide favorise l’apparition de zones de métaplasie gastrique duodénale (essentiellement bulbaire). H. pylori présent au niveau antrale colonise ces zones métaplasiques (Vallot, 1994; Bretagne, 1996; Futami el al., 1999) et provoque localement une réponse inflammatoire chronique active par la libération éventuelle de cytotoxine produite par des souches dites ulcérogènes de H. pylori, qui diminue la résistance muqueuse duodénale (de Korwin, 1994b; Dorval, 1995 ; Missonier et Dorval, 1994). Ceci favorise l’apparition d’une duodénite (bulbite), érosion bulbaire puis d’un ulcère (fig. 20) (de Korwin, 1994b; Missonier et Dorval, 1994 ; Sobhani et al., 1995). I-17-3 Ulcère gastrique La prévalence de l’infection par H. pylori dans l’ulcère gastrique est moins fréquente que celle observée dans l’ulcère duodénal (Lamouliatte et al., 1992). Elle varie de 59 à 86% (Buckley et O’Morain, 1996). L’ulcère gastrique s’accompagne souvent de gastrite chronique à H. pylori qui prédomine nettement dans l’antre et s’étend vers le fundus en réalisant une pangastrite antrale (Conférence de consensus, 1995; Buckley et O’Morain, 1996; Fléjou, 1996). Le schéma physiopathologique de l’ulcère gastrique ressemble à celui de l’ulcère duodénal avec toutefois une plus grande importance des lésions cellulaires locales (fig. 20). L’éradication de H. pylori améliore la guérison des ulcères et diminue significativement la fréquence des rechutes ulcéreuses gastriques (Buckley et O’Morain, 1996; Chamouard, 1996; Curel et al., 1999). 39 Helicobacter pylori Revue bibliographique Fig. 20: Mécanisme de l’ulcère gastrique et duodénale (Megraud et al., 2001) I-17-4 Cancer gastrique Le cancer gastrique est la deuxième cause mondiale de mortalité par le cancer. Le rôle de H. pylori dans la genèse de l’adénocarcinome gastrique, tumeur maligne de l’estomac la plus fréquente, est bien établi (Correa, 1988, 1991 ; Flejou, 1994 ; Munoz et Pisani, 1994 ; Uemura et al., 2001). H. pylori est en effet mis en évidence chez plus de 90% des patients ayant un cancer gastrique (Bretagne, 1996; Uemura et al., 2001). Cette bactérie a été classée, en 1994, par l’O.M.S. comme facteur carcinogène de grade I (Sobhani et al., 1995; Bretagne, 1996; Buckley et O’Morain, 1996). L’infection chronique par H. pylori précède le développement du cancer d’une période supérieure à 15 ans (Correa, 1988, 1991; Deltenne et al., 1995; Bretagne, 1996) et constitue la première étape de ce processus par l’intermédiaire de la gastrite chronique (Fuccio et al., 2007; Nomura et al., 1991; Parsonnet et al., 1991; O’Morain et al., 1994; Sobhani et al., 1995). 40 Helicobacter pylori Revue bibliographique Le cancer gastrique est donc la conséquence de transformation successive de la muqueuse gastrique, de la gastrite chronique superficielle en gastrite chronique atrophiante. Cette dernière aboutit à des lésions de métaplasies intestinales puis de dysplasie et enfin de l’adénocarcinome (fig. 21) (Correa, 1988, 1991; Fléjou, 1994; Dobrilla et al., 1994; O’Morain et al., 1994; Deltenre et al., 1995). I-17-5 Lymphome gastrique de MALT Les lymphomes gastriques ne constitue que 1 à 5% des tumeurs malignes dont la presque totalité sont des lymphomes B de type Malt (Tissu Lymphoïde Associé aux Muqueuses ou Malt) (Deltenne et al., 1995; Fléjou,1995 ; François, 1995). L’infection par H. pylori est associée à ce type de lymphome (Buckley and O’Morain, 1996 ; Fourmestraux, 1996 ; François, 1995 ; Fléjou, 1995). Elle est, en effet présente chez plus de 90% des patients ayant un lymphome de type Malt (Bretagne, 1996 ; Buckley et O’Morain, 1996 ; Vallot, 1994). H. pylori joue un rôle prolifératif dans les lymphomes gastriques par la stimulation durable qu’il impose (François, 1995 ; Sobhani, 1994 ; Hussel, 1993). Il provoque un infiltrat lymphocytaire de la muqueuse gastrique, qui aboutit parfois à une gastrite folliculaire. Cette gastrite folliculaire peut dans de rares cas, aboutir à la prolifération des lymphocytes B, caractéristique du Lymphome de MALT (tissu lymphoïde associé aux muqueuses) (Hussel, 1993 ; Sobhani, 1994). La plupart des lymphomes de Malt sont associés à la gastrite chronique à H. pylori en particulier la gastrite folliculaire (Fléjou, 1994, 1995; Fourmestraux, 1996). 41 Helicobacter pylori Revue bibliographique Normal H. pylori Gastrite superficielle Gastrite atrophique Métaplasie intestinale I-II Métaplasie intestinale III Dysplasie Cancer Fig. 21: Mécanisme proposé pour la carcinogenèse gastrique (Correa, 1991). 42 Helicobacter pylori Revue bibliographique I-18 Sensibilité aux antibiotiques L’étude de la sensibilité in vitro de H. pylori aux antibiotiques, utile dans le choix thérapeutique, a montré l’excellente activité de la plupart des antibiotiques à l’exception de la vancomycine, de la cefsulodine, du triméthoprine, des sulfamides, du cotrimoxazole et de l’acide nalidixique (Avril, 1988 ; Fauchère et Rosenau, 1991; Sobhani et al., 1995). Les antibiotiques les plus actifs sont des fluoroquinolones, les furanes, les rifamycines, les tétracyclines, les β-lactamines (en particulier l’amoxicilline) et les macrolides (en particulier la clarithromycine) et les nitroimidazolés (metronidazole, tinidazole) (Lamouliatte, 1989, Fauchère et Rosenau, 1991; Megraud, 1994a ; Cayla, 1996). Ces trois dernières classes d’antibiotiques sont très utilisées dans les thérapeutiques (Burucoa, 2009 ; Conférence de consensus, 1995). Cependant, H. pylori peut développer rapidement des résistances prédictives de l’échec thérapeutique (Burucoa, 2009 ; Fellous, 2009 ; Tankovic et al., 2001 ; Lamouliatte et al., 1992 ; Megraud, 1992, 1994c ; Colin, 1995). Seules les β-lactamines en particulier l’amoxicilline et les tétracyclines ne sélectionnent pas des souches résistantes (Fauchère and Rosenau, 1991; Lamouliatte, 1992 ; Megraud, 1994c). Il faut donc étudier le métronidazole (30% de souches résistantes), la clarithromycine (20% de souches résistantes), les tétracyclines et l’ampicilline qui sont les antibiotiques habituellement utilisés dans le traitement d’éradication de H. pylori. La méthode d'antibiogramme par la technique E-test est la plus adaptée à H. pylori, donnant les résultats les plus reproductibles (Benallal, 2009 ; Burucoa, 2009) (fig. 22). I-19 Traitement Le traitement d’éradication de H. pylori repose actuellement sur l’utilisation d’associations thérapeutiques entre antisécrétoire et antibiotiques (Burucoa, 2009 ; Fellous, 2009 ; Cayla, 1995, 1996; Catalono et al., 1999). 43 Helicobacter pylori Revue bibliographique La bithérapie (associant un antisécrétoire à un antibiotique ATB) donne des taux d’éradication maximum de 60% (Colin, 1995; Conférence de consensus, 1995; Vincent et al., 1996) mais la trithérapie (association d’un antisécrétoire et de deux antibiotiques ATB) dont le taux d’éradication supérieur à 85% constitue le traitement actuel le plus performant et le plus efficace en terme d’éradication (tableau 7) (Khurana et al., 2007; Lamouliatte, 1994 a, 1994c; Vincent et al., 1996; Chiba et al., 2000; Wong et al., 2000). Les antibiotiques dont l’efficacité est démontrée sont : - L’amoxicilline, pour lequel le taux de résistance est pratiquement nul, mais qui n’a qu’une faible diffusion dans la muqueuse gastrique. - La clarithromycine, macrolide le plus efficace sur H. pylori, mais qui peut favoriser l’émergence de souches résistantes. - Les nitro-imidazolés, métronidazole ou tinidazole, qui ont une excellente diffusion, mais induisent rapidement une résistance bactérienne Les anti-sécrétoires jouent un rôle majeur dans les trithérapies d’éradication non seulement pour leur effet antalgique rapide et cicatrisant, mais surtout pour leur capacité à augmenter le PH intragastrique permettant ainsi de potentialiser l’effet des antibiotiques et leur diffusion. L’inhibiteur de pompe à protons (IPP) utilisé est généralement l’oméprazole (tableau 5) (Colin, 1995; Conférence de consensus, 1995; Gouyon et al., 1996). Par ailleurs, le traitement idéal devra répondre aux critères de simplicité, d’efficacité, de courtes durées, de faible coût et de tolérance (Lamouliatte, 1994b; Cayla, 1995; Colin, 1995; Van der Huls et al., 1997). Cependant, H. pylori est une bactérie difficile à éradiquer (Megraud, 1994c; Conférence de consensus, 1995), les facteurs limitant son éradication sont : résistance aux antibiotiques, compliance du patient, durée de traitement, récidive de l’infection et effet secondaires (Lamouliatte et al., 1992; Lamouliatte, 1994a, 1994b, 1994c; Sobhani et al., 1995; Colin, 1996 ). 44 Helicobacter pylori Revue bibliographique Fig. 22 : Détermination de la résistance et la sensibilité de H. pylori par E-test Tableau 5: Les différents types de thérapies anti-H. pylori (Cayla, 1995) Type de Thérapie Trithérapie Bithérapie Composition Efficacité IPP + Amox + Clarit 60 à 90% Mode de Consommation Per os IPP + Metro + Clarit 60 à 90% Per os IPP + Metro + Amox 60 à 90% Per os IPP + Amox 50 à 80% Per os IPP + Clarit 50 à 80% Per os 45 Helicobacter pylori Revue bibliographique I-20 Traitement par les probiotiques La colonisation de la muqueuse gastrique par H. pylori est fréquente et souvent associée à une gastrite, un ulcère, un cancer ou un lymphome. L’introduction des probiotiques, espèces bactériennes bénéfiques pour le tractus gastrointestinal pourrait être une option très intéressante pour rétablir l’équilibre microbien et prévenir les maladies. Il a été prouvé que différentes souches de probiotiques et, en particulier, les lactobacilles développent une activité inhibitrice contre H. pylori. Elles agissent sur la viabilité de la bactérie et sur son adhérence aux cellules épithéliales et stabiliser la fonction gastrique en diminuant l’inflammation par leur action anti-oxydante et anti-inflammatoire. Or, les probiotiques ne permettent pas l’éradication mais ils maintiennent un taux diminué de bactéries pathogènes dans l’estomac, et combinés aux antibiotiques, ils augmentent le taux d’éradication. Dans une revue de 13 études cliniques, les patients de 6 d’entre elles ne prenant que des probiotiques et ceux des 7 autres des probiotiques et une antibiothérapie, des effets des probiotiques sur la bactérie ont été démontrés. L'administration des souches de Lactobacillus à des souris infectées par la bactérie H. pylori a permis d'observer une réduction de la quantité de la bactérie infectieuse de H. pylori dans l'estomac et un recul des gastrites engendrées par cette bactérie. Ces résultats suggèrent que l'utilisation de souches de bactéries lactiques sélectionnées avec soin permettrait de mieux protéger l'homme contre les bactéries pathogènes. Les recherches menées dans ce cadre se poursuivront par l'analyse de la composition chimique des composés antimicrobiens bénéfiques et par des essais cliniques destinés à tester l'effet des souches lactiques probiotiques les plus prometteuses sur H. pylori (Gotteland et al., 2006). 46 Helicobacter pylori Revue bibliographique I-21 Vaccination comme perspective Le traitement actuel, basé sur l'utilisation d'un inhibiteur de pompe à protons et les antibiotiques, pose des problèmes d’efficacité par rapport à l’observance au traitement, la résistance aux antibiotiques, et la répétition possible de l'infection. Le développement d’un vaccin efficace contre H. pylori offrirait ainsi plusieurs avantages. Diverses approches ont été suivies dans le développement des vaccins contre H. pylori. Pour la plupart, elles ont été basées sur l'utilisation des antigènes connus pour être impliqués dans la pathogénie de l'infection, comme l'uréase, la cytotoxine vacuolating (VacA), l’antigène cytotoxine-associé (CagA), antigenes les plus promotteurs pour le développement d’un vaccin humain. Plusieurs études menées sur des modèles animaux ont démontré qu'une approche immunologique permettait de prévenir et même de traiter l’infection à H. pylori. Les premières études cliniques ont indiqué qu'une immunisation fondée sur l'utilisation de l'uréase de H. pylori était sûre, immunogène, et pouvait amener à une diminution du nombre de bactéries dans la muqueuse gastrique. Cependant, les mécanismes exacts de la protection induite par l'immunisation sont encore mal compris. Une protection complète contre H. pylori devra faire appel à des vaccins plus puissants. Plusieurs essais sont prévus chez l'homme, avec l’espoir que la plupart des questions posées actuellement sur le germe seront résolues. Les efforts actuels s'orientent donc vers trois axes principaux : une définition des marqueurs de l'immunité liés à la protection, la caractérisation de nouveaux antigènes protecteurs et la recherche de la meilleure voie d'immunisation. (CorthesyTheulaz et Michetti, 2000 ; Giuseppe et al., 2001). 47 Bactéries lactiques Revue bibliographique II- Généralités sur les bactéries lactiques II-1 Historique Les bactéries lactiques sont utilisées depuis des millénaires dans l’alimentation humaine. L’utilisation de la fermentation par l’homme remonte à des temps très anciens. Les premiers produits fermentés ont certainement été obtenus par acidification spontanée des jus végétaux (vins, bières…) ou par contamination naturelle du lait (yaourts, fromages…). La fermentation est réalisée à partir de différents types d’aliments : des végétaux (concombres, betteraves, dattes, jus de fruits, soja, etc...), des produits animaux (viande, lait) ou du poisson. Elle permet de conserver les aliments mais aussi de leur donner une saveur différente du produit original. Il faudra attendre Pasteur et ses travaux sur la fermentation en 1857 (Pasteur, 1857) pour établir un lien entre la fermentation lactique et les bactéries. Metchnikoff isole en 1904 le « bacille bulgare » (Lactobacillus delbrueckii sp. bulgaricus) présent dans le yaourt. Il étudie les propriétés acidifiantes des bactéries du yaourt et il développera l’idée que les bactéries contenues dans les laits fermentés ont un effet bénéfique sur la santé (Metchnikoff, 1907). Il plaidera en faveur de l’introduction de produits laitiers fermentés dans le régime alimentaire et en 1905, les premières entreprises fabricant du yaourt à partir des souches de l’Institut Pasteur voient le jour (Bibel, 1988). Depuis 1960, la production industrielle de yaourt connaît un développement international considérable et le yaourt est devenu aujourd’hui un produit de consommation courante. II-2 Caractères généraux Orla-Jensen (1919) a été le premier auteur à définir les bactéries lactiques ou bactéries de l’acide lactique. Les bactéries lactiques ont été isolées pour la première fois à partir du lait (Metchnikoff, 1907; Sandine et al., 1972; Carr et al., 2002). Elles forment un groupe de bactéries relativement divers, mais reliées 48 Bactéries lactiques Revue bibliographique entre elles par un certain nombre de fonctions métaboliques et physiologiques typiques (Schleifer et Ludwig, 1995; Stiles et Holzapfel, 1997). Les bactéries lactiques sont des cellules vivantes, procaryotes, hetérotrophes et chimioorganotrophes. Elles sont Gram positive, immobiles, asporulées, de formes coccoide ou bâtonnet et produisent l'acide lactique comme produit final principal pendant la fermentation des carbohydrates (Kandler, 1983). Elles sont anaérobies mais aérotolérantes et ne possèdent ni catalase (certaines possédent une pseudocatalase), ni nitrate réductase, ni cytochrome-oxydase. Elles ne liquéfient pas la gélatine, ne produisant pas d’indole, ni d’hydrogène sulfureux. De plus, elles sont caractérisées par un métabolisme fermentaire qui, en utilisant des glucides, produisent soit exclusivement de l’acide lactique (bactéries homolacticques), soit de l’acide lactique, de l’acide acétique, de l’éthanol ou de CO2 (bactéries hétérolactiques). Elles ont une capacité de biosynthèse faible. Les bactéries lactiques sont également caractérisées par des exigences nutritionnelles nombreuses complexes en acides aminés, acides organiques, bases nucléiques, sels, vitamines et les carbohydrates fermentescibles pour leur croissance (Stamer, 1976 Hammes et Hertel, 1998, 2003). Les souches sont généralement faiblement protéolytiques et lipolytiques (Law et Haandrikman, 1997; Shihata et Shah, 2000). Les bactéries lactiques utilisées dans les fermentations laitières peuvent être divisées en deux groupes sur la base de leur croissance optimale. Les bactéries mésophiles avec une température optimum de croissance entre 20° C et 30°C et les thermophiles entre 30°C et 45°C (Bissonnette et al., 2000). Elles se développent majoritairement à des pH compris entre 4 et 6,5 majorité de souches se développent à pH 4,0-4,5, et certaines sont encore actives à pH 9,6 et d'autres à pH 3,2 (Hammes et Hertel, 1998, 2003). L'acide lactique produit peut être sous deux formes stéréoisomèriques, L ou, moins fréquemment, D ou un mélange des deux. Il convient de noter que l'acide 49 Bactéries lactiques Revue bibliographique lactique (forme D) n'est pas métabolisé par des humains et n'est pas recommandé pour les enfants à bas âge (Who, 1974). II-3 Taxonomie La première classification des bactéries lactiques a été établie en 1919 par OrlaJensen sur divers critères morphologiques et physiologiques (Stiles et Holzapfel, 1997). En effet, les bactéries lactiques est subdivisé en 11 genres différents partagés entre les coques et les bâtonnets : Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus , Streptococcus, Aerococcus, Carnobacterium, Lactococcus, Oenococcus,Tetragenococcus, Vagococcus et Weissella (Stiles et Holzapfel, 1997; Klein et al., 1998; Axelsson, 2004) (Fig. 23). Les bactéries du genre Bifidobacterium ne sont pas considérées comme des bactéries lactiques typiques, mais leur usage se répand en industrie laitière. D’autres bactéries Gram positive non sporulées et productrices d’acide lactique appartenant à la famille des actinobacteriacée et au genre, Aerococcus, Microbacterium, et Propionibacterium sont aussi impliquées dans l’industrie agro-alimentaire (Sneath et Holt, 2001). Cependant les méthodes phénotypiques ne rendent pas compte des relations phylogénétiques entre les groupes. En 1977, Woese et Fox introduisent la phylogénie moléculaire basée sur la séquence des ARN ribosomiques. La taxonomie bactérienne moderne basée sur les caractéristiques phénotypiques et génotypiques a eu comme conséquence la reclassification de beaucoup d’espèces de bactéries lactiques. La composition d’ADN mesuré par le pourcentage en base Guanine et cytosine (GC) est le premier critère de parenté qui permet de connaitre l’homogénéité des espèces constituantes. Les bactéries lactiques sont un groupe phylogénétique divers avec un GC de 50% (guanine et cytosine) en leur ADN. 50 Bactéries lactiques Revue bibliographique Fig. 23: Arbre phylogénique basée sur la comparaison du gène de l’ARN 16 S (Holzapfel et al., 2001). 51 Bactéries lactiques Revue bibliographique Le pourcentage G+C (GC%) de leur ADN donne une composition assez proche pour le genre Lactococcus (34,46%), Leuconostoc (36,43%), Pediococcus (34,42%) et Bifidobacterium (67%) alors que le genre Lactobacillus est caractérisée par une grande hétérogénéité (32, 53 %) (Novel, 1993). Les bactéries lactiques possèdent un pourcentage (GC%) au dessous de 50%, cependant certaines espèces de Lactobacillus ont des valeurs pouvant atteindre 55% (Axelsson, 2004). La classification est également possible avec des méthodes génotypiques (RAPD-PCR, ribotyping) ou d’autres techniques semblables. Les révisions taxonomiques des bactéries lactiques indiquent que ces micro-organismes peuvent comprendre environ une quarantaine de genres. Les révisions récentes de la taxonomie des bactéries lactiques sont présentées dans le manuel Bergey –Trust (Garrity et al., 2008). II-4 Habitat Les caractéristiques métaboliques d’un microorganisme jouent un rôle important dans le choix de son habitat. Etant donné que les bactéries lactiques sont des bactéries exigeantes, elles colonisent des milieux riches très différents. Elles sont trouvées dans diverses niches écologiques, telles que les végétaux, les animaux, les produits laitiers et carnés ainsi que la cavités buccale, les tractus gastro-intestinaux et urogénitaux des humains et des animaux (El Shafei et al., 2000; Mathara et al., 2004 ; Dortu et Thonart, 2009 ). Elles constituent aussi la flore microbienne dominante responsable de la fermentation des céréales et des plantes fourragères ensilées (Carr et al., 2002; Dalié, 2010). II-5 Ecosystème et microflore gastro-intestinaux Le tractus gastro-intestinal est un écosystème complexe et ouvert aux microorganismes exogènes. Il est généré par une alliance stable entre l’épithélium gastro-intestinal, le système immunitaire et une importante flore microbienne. Les interactions entre les microorganismes et l’hôte peuvent être 52 Bactéries lactiques Revue bibliographique de trois types: symbiose, commensalisme et pathogénicité (Hooper et Gordon, 2001). Le tractus gastro-intestinal de l’homme et des animaux constitue le principal habitat naturel des bactéries lactiques, du fait qu’ils fournissent un environnement stable et un approvisionnement continu en éléments nutritifs, sous forme d’aliments ingérés ou sécrétés par l’hôte. On y retrouve plus communément les genres Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus et Bifidobacterium. Généralement les espèces de Lactobacillus isolées du tube digestif de l'homme comprennent L. acidophilus, L. salivarius, L. casei, L. plantarum, L. fermentum, L. brevis et L. reuteri (Mikelsaar et al., 1987). La microflore du tractus gastro-intestinal a été estimée à près de 1013-1014 cellules microbiennes représentant 400 à 500 espèces et sous espèces (Moore et Holdeman, 1974; Bjorksten, 2004) (fig. 24). En effet, Le tractus digestif humain est l’écosystème présentant la plus grande densité cellulaire décrite jusqu’à aujourd’hui dont le nombre de bactéries présentes est supérieur au nombre total de cellules humaines constituant l’organisme. Les lactobacilles comptent parmi la flore dominante du microbiote intestinal et sont présents tout au long du tractus gastro-intestinal en quantités variables. Ils représentent environ 1% des micro-organismes, soit approximativement 103 à 107 bactéries/g de contenu intestinal (Dal Bello et al., 2003; Tannock, 2005). L’environnement gastro-intestinal comprend trois régions principales qui offrent des conditions très différentes pour la survie des différents microorganismes. Dans le premier compartiment, l’estomac, la prolifération microbienne est fortement réduite par la présence d’oxygène apporté par la déglutition et d’une forte acidité. De ce fait, l’estomac héberge sélectivement les microorganismes acidotolérants et anaérobies facultatifs comme les lactobacilles, streptocoques, levures, etc. Dans le deuxième compartiment qui est le petit intestin, la microflore est constituée essentiellement de bactéries anaérobies facultatives 53 Bactéries lactiques Revue bibliographique Œsophage : mucus, péristaltisme. Seuls les microorganismes provenant des aliments ou de la cavité orale sont présents Duodénum: Secrétions pancréatiques et biliaires, mucus, faible O2. Microflore: 103-104 cfu/g Bacteroides Candida albicans Estomac: pH acide (HCl), O2, enzymes (pepsines, lipases…), mucus. Microflore: 104 cfu/g Candida albicans, Helicobacter pylori Lactobacillus Lactobacillus Streptococcus Jéjunum: Secrétions pancréatiques et biliaires, mucus, péristaltisme. Microflore: 105-107 cfu/g Bacteroides, Candida albicans Lactobacillus, Streptococcus Colon: Anaérobiose, motricité, enzymes bactériennes, acides gras volatiles, ammoniaque Microflore: 1010-1011 cfu/g Bacteroides, Bacillus, Bifidobacterium Clostridium, Enterococcus, Eubacterium Fusobacterium, Peptostreptococcus Ruminococcus , Streptococcus Iléon : Anaérobiose, sels biliaires, enzymes. Microflore : 107-108 cfu/g Bacteroides, Clostridium Enterobacteriacea, Enterococcus Lactobacillus, Veillonella Fig. 24 : Principaux compartiments du tractus digestif de l’homme et leurs microflores (Isolauri et al., 2004). 54 Bactéries lactiques Revue bibliographique tels que les lactobacilles, les streptocoques et les entérobactéries, et anaérobies strictes notamment les bifidobactéries, les bactéroides et les clostridies. Dans le dernier compartiment qui est le colon (dépourvu d’oxygène), le transit digestif est plus lent et la flore microbienne est plus abondante, représentant 35 à 50 % du volume du contenu du colon humain. La microflore du colon est très complexe et dominée par les bactéries anaérobies strictes (Bacteroides spp., Clostridium spp, Bifidobacterium spp., Atopobium spp…). Tandis que les bactéries anaérobies facultatives sont moins nombreuses et représentées par les lactobacilles, les entérocoques, les streptocoques et les Enterobacteriaceae (Cummings et al., 1989; Gounier-Château,1994). Les bifidobactéries et les lactobacilles, ainsi que certains entérocoques, E. coli, streptocoques et bactéroides, se distinguent par leurs effets bénéfiques sur la santé de l’hôte, comme l’amélioration de la maturation et de l’intégrité de l’intestin, l’antagonisme contre les pathogènes et la modulation de la fonction immunitaire (Gibson et Roberfroid, 1995; Schiffrin et Blum, 2002). Les rôles principaux de la flore digestive portent sur des aspects métaboliques, trophiques et immunitaires (Guarner et Malagelada, 2003). Elle protègeraient l’hôte des infections bactériennes à deux niveaux : elles stimuleraient le système immunitaire de l’hôte et le protègeraient des pathogènes par «l’effet barrière». La fonction protectrice de la flore sur les bactéries pathogènes porte sur deux aspects : la compétition pour l’habitat et la production d’agents anti-microbiens. Cette protection impliquerait notamment les bactéries lactiques commensales particulièrement les genres Lactobacillus et Bifidobacterium (Servin, 2004). II-6 Utilisation des bactéries lactiques dans le domaine agro-alimentaire Les bactéries lactiques sont largement utilisées dans les procédés industriels de fabrication agro-alimentaire tels que l’industrie laitière et fromagère, la brasserie, la boulangerie, la charcuterie, l’œnologie, la cidrerie, la vinaigrerie, la fabrication d’alcool…..etc. L’exemple le plus connu est probablement le plus 55 Bactéries lactiques Revue bibliographique stable reste la fabrication du yaourt par S.thermophilus et Lb. bulgaricus. Les bactéries lactiques contribuent aux caractéristiques organoleptiques et assurent une meilleure conservation des aliments elles contribuent à la saveur de l’aliment et sa texture. Ceci est dû notamment à l’acide lactique produit au cours de la croissance. D’autre part, les bactéries lactiques produisent des peptides et des molécules comme l’acétoine, l’acétaldéhyde, le diacétyle ou l’éthanol qui sont importants pour la flaveur des aliments. Les levains se composent de microorganismes choisis sur la base de leurs caractéristiques propriétés technologiques (acidifiante, aromatisante, texturante et antagoniste) (Bigret, 1989; Stiles, 1996). Certaines bactéries lactiques comme L. helveticus sont utilisées pour produire industriellement de l’acide lactique employé comme additif en alimentation et dans les produits cosmétiques ou pharmaceutiques (Penaud, 2006). II-7 Intérêts des bactéries lactiques en santé humaine Si les bactéries lactiques sont importantes pour l’alimentation humaine, elles le sont aussi pour sa santé. En effet, les bactéries lactiques sont aussi nommées « agents de la vie » vu toutes les fonctions qu’on leur attribue. Elles sont de plus en plus utilisées sous forme de probiotiques qui sont par définition des microorganismes vivants administrés en quantités adéquates et qui sont bénéfiques pour la santé de l’hôte (Metchnikoff, 1907; Parker, 1974; Gibson et Roberfroid 1995). Parmi les effets bénéfiques de ces probiotiques, nous pouvons citer : Amélioration de la digestion du lactose, production de vitamines, effet prophylactique et thérapeutique vis-à-vis des diarrhées, prévention des infections gastro-intestinales (virus, H. pylori…) et urogénitales, régulation de la motilité intestinale (constipation,syndrome d’irritation intestinale), diminution du taux de cholestérol sanguin, stimulation du système immunitaire et activité anticarcinogène (Mercennier et al., 2002) (fig. 25). 56 Bactéries lactiques Revue bibliographique De façon plus spécifique, pour qu’un organisme soit considéré comme étant potentiellement probiotique, il doit présenter les caractéristiques suivantes (Salminen et al.,1996, 1998; Stanton et al., 2001)(fig. 26) - être un habitant naturel de l’intestin. - être capable de coloniser, persister et se multiplier dans le milieu intestinal - adhérer aux cellules intestinales et exclue ou réduit l’adhérence des pathogènes - avoir un métabolisme actif et produire des substances inhibant les pathogènes (acides, H2O2, bactériocines…) - non invasif, non carcinogène et non pathogène - être capable de co-agréger pour former une flore normale équilibrée - survivre aux différents procédés technologiques de production - garder sa viabilité dans l'aliment et durant le transit intestinal 57 Bactéries lactiques Revue bibliographique Fig. 25: Schéma simplifié montre les principaux effets bénéfiques attribués aux probiotiques (Mercenier et al., 2002). Fig. 26: Propriétés et critères de sélection des probiotiques (Salminen et al., 1998). 58 Bactéries lactiques Revue bibliographique II-8 Souches microbiennes probiotiques utilisées En générale, les souches probiotiques sont sélectionnées prioritairement pour leurs effets bénéfiques et leur innocuité. Les souches ou espèces probiotiques sont des composants normaux de la flore intestinale (Dunne et al., 2001). En alimentation humaine, les microorganismes probiotiques sélectionnés sont représentés essentiellement par les bactéries lactiques, particulièrement celles appartenant au genre Lactobacillus et Bifidobacterium (Borriello et al., 2003; Saito, 2004). Aujourd’hui, ces deux genres bactériens sont largement utilisés dans la fabrication de produits laitiers fermentés. Par contre, en alimentation animale de nombreux genres bactériens et fongiques sont utilisés, comme Lactobacillus, Bifidobacterium, Bacillus, Streptococcus, Pediococcus, Enterococcus, Propionibacterium, Saccharomyces, Aspergillus et Torulopsis (tableau 6) (Gournier-château et al., 1994; Tannock, 1997; Holzapfel et al., 2001). Tableau 6: Principales souches microbiennes probiotiques (Holzapfel et al., 2001) 59 Bactéries lactiques Revue bibliographique II-9 Probiotiques et les infections gastro-intestinales Plusieurs études cliniques ont évalué l'efficacité des probiotiques dans la prévention et le traitement des maladies gastro-intestinales. En effet, il a été démontré que certaines infections gastro-intestinales telles que l’infection à H. pylori, les diarrhées et les allergies alimentaires peuvent être contrecarrées avec succès par l’utilisation de probiotiques (Mercenier et al., 2002, Turchet et al., 2003; Rosenfeldt et al., 2004). A titre d’exemple, Wang et al. (2004) ont rapporté que la consommation régulière de yogourt additionné de Lactobacillus acidophilus La5 ou de Bifidobacterium lactis Bb12 induit une suppression effective de l’infection due à H. pylori. D’autre part, Michetti et al. (1999) ont démontré une efficacité partielle liée à l’administration de surnageants de culture de L. acidophilus La1 à des volontaires. Tandis que Rosenfeldt et al. (2002) ont mentionné que des souches de L. rhamnosus et L. reuteri ont permis de traiter des gastro-entérites à rotavirus chez des enfants hospitalisés. Dans une autre étude menée, Hickson et al., (2007) signalent que la consommation d'une boisson contenant les souches probiotiques L. casei, L. bulgaricus et S. thermophilus peut réduire l'incidence de la diarrhée associée aux antibiotiques et de la diarrhée associée à C. difficile. De plus, des entérites induites par Campylobacter peuvent être traitées par Bifidobacterium longum. II-10 Interaction entre les bactéries lactiques Les interactions entre deux populations microbiennes constituent un ensemble complexe de phénomène biologique hétérogène. Elles sont définies selon leurs effets avantageux ou désavantageux. Des bactéries appartenant au même système taxonomique peuvent montrer des attitudes différentes. Qui dit association de souches, dit possibilité d’interaction. Si ces interactions sont bénéfiques pour une ou pour plusieurs souches, on parlera de coopération, si elles sont néfastes pour une ou plusieurs souches, on parlera d’inhibition. 60 Bactéries lactiques Revue bibliographique II-10-1 Inhibition des bactéries lactiques Les bactéries lactiques sont connues pour leur aptitude à produire des composés antibactériens leur permettant de se développer préférentiellement dans divers écosystèmes. La découverte des substances inhibitrices actives contre les germes pathogènes est devenue d’un grand intérêt au cours des dernières années et ceci à cause de la propagation des maladies véhiculées généralement par les aliments (Bibek et Daeschel, 1992; Jack et al., 1995). Les milieux permettant le développement des bactéries lactiques sont complexes du point de vue nutritionnel. Ils présentent soit des substrats de fermentation, soit des écosystèmes digestifs comme c’est le cas pour les bactéries lactiques séjournant dans le tractus intestinal de l’homme ou des animaux. Ces écosystèmes sont également peuplés par de nombreux autres microorganismes comprenant des espèces pathogènes ou d’altération. La capacité de survie des bactéries lactiques dans de tels environnement résulte de leur activité fermentaire associé à la production de divers composés antimicrobiens tels que les acides organiques, le peroxyde d’hydrogène, des bactériocines (Lewus et al., 1991; Van De Guchte et al., 2001). . II-10-1-1 Acides organiques L'acide lactique est le métabolite principal des bactéries lactiques causant la réduction du pH qui inhibe la plupart de microorganismes (Eklund, 1989; Schnürer et Magnusson, 2005). Les bactéries lactiques hétérofermentaires produisent des quantités d'acide organique autre que l'acide lactique tel que l’acide acétique et l’acide propionique. Ces acides organiques traversent passivement la membrane cytoplasmique et se dissocie à l'intérieur de la cellule, libérant les ions H+ qui acidifient le cytoplasme à un point tel que les fonctions cellulaires sont inhibées (Kashet, 1987; Piard et Desmazeaud, 1991). En plus, l'acide fait chuter le gradient électrochimique de proton entraînant la bactériolyse et finalement la mort des bactéries sensibles (Eklund, 1989). 61 Bactéries lactiques L’accumulation Revue bibliographique d’acide organique est directement inhibitrice pour les microorganismes nuisibles qui présentent un seuil bas de résistance aux changements de pH intracellulaire tels que Salmonella, E. coli, Pseudomonas et Clostridium. L’acide lactique est toxique pour beaucoup de bactéries (Tableau 7) mais aussi pour des champignons et moisissures (Geis, 1989 ; Piard et Desmazeaud, 1991). Adams et Hall (1988) ont démontré que les acides lactique et acétique peuvent avoir des effets synergiques sur certaines espèces tel que E. coli et Salmonella enteritidis. L’acide lactique diminue le pH du milieu, augmentant ainsi la toxicité de l’acide acétique. L'effet inhibiteur spécifique des acides organiques est généralement attribué à leur forme dissociée et non dissociée. L’ampleur de la dissociation dépend du pH. A pH bas, une grande quantité d'acide est sous la forme non dissociée, et elle est toxique à beaucoup de bactéries, champignons et levures (Podolak et al., 1996). En général, la forme moléculaire (non dissociée) de l’acide lactique est le facteur inhibiteur pour les bactéries lactiques. Les concentrations en acide lactique non dissocié nécessaire pour provoquer une inhibition sont pour les levures, les Enterobacteriaceae et les Microccocaceae de l'ordre 1 mM; pour les moisissures de 3 mM; et pour les Bacillaceae de 4 Mm (Baird-Parker, 1980; Adams et Hall, 1988). Cependant, le comportement des différents microorganismes vis-à-vis de l'acide lactique varient considérablement. L’acide lactique à pH 5,0 a un effet inhibiteur contre les bactéries sporulantes mais il est inefficace contre les levures et les champignons (Woolford,1975). Les stéréoisomères de l'acide lactique diffèrent également dans l'activité antimicrobienne, l’acide lactique (L) étant plus inhibiteur que l’isomère D (Benthin et Villadsen, 1995). Les acides acétiques et propioniques produits par les bactéries lactiques par les voies hétérofermentaires peuvent agir sur les membranes, et causent l'acidification intracellulaire et la dénaturation des protéines (Huang et al., 1986). 62 Bactéries lactiques Revue bibliographique Tableau 7: Valeurs de pH limites permettant l’initiation de la croissance de divers microorganismes (Piard et Desmazeaud, 1991) Bactéries à Gram négatif Valeurs de pH limite Escherichia coli 4,4 Klebsiella pneumoniae 4,4 Proteus vulgaris 4,4 Pseudomonas aeruginosa 5,6 Salmonella paratyphi 4,5 Salmonella typhi 4,0 – 4,5 Vibrio parahaemolyticus 4,8 Bactéries à Gram positif Valeurs de pH limite Bacillus cereus 4,9 Clostridium botulinum 4,7 Enterococcus sp 4,8 Lactobacillus sp 3,8 – 4,4 Micrococcus sp 5,6 Staphylococcus aureus 4 Lactococcus lactis 4,3 – 4,8 Brevibacterium linens 5,6 Listeria monocytogenes 5,5 63 Bactéries lactiques Revue bibliographique Ils ont un effet antimicrobien plus fort que l'acide lactique dus à leurs valeurs plus élevées de pKa (acide lactique 3,08, acide acétique 4,75, et acide propionique 4,87), et un pourcentage plus élevé d'acides non dissociés à un pH donné (Earnshaw, 1992). II-10-1-2 Peroxyde d'hydrogène En présence d’oxygène, les bactéries lactiques peuvent produire du peroxyde d’hydrogène, toxique pour d’autres bactéries. Il est formé par des peroxydases ou par la superoxyde-dismutase ou encore quand la concentration intracellulaire en ions manganèse est élevée (Piard et Desmazeaud, 1991). Les lactocoques lactiques produisent suffisamment de peroxyde d’hydrogène pour entraîner une auto-inhibition (Subramanian et Olson., 1968). Le peroxyde d’hydrogène est capable d’endommager les membranes bactériennes par la peroxydation des lipides entrainant ainsi l'augmentation de la perméabilité membranaire, mais il peut aussi inhiber les enzymes de la glycolyse, perturber les systèmes de transport des sucres et des acides aminés ainsi que la synthèse des protéines et des acides nucléiques (Kong et Davison, 1980). Il peut également agir comme précurseur pour la production de radicaux libres bactéricides tels que les radicaux du superoxyde (O2-) et de l’hydroxyle OH- qui peuvent endommager l’ADN des bactéries (Byczkowski et Gessner, 1998). En plus de son effet bactéricide, le peroxyde d’hydrogène active le système lactoperoxydase présent dans le lait en produisant deux puissants inhibiteurs microbiens à savoir l’hypothiocyanate (OSCN) et l’acide hypothiocyaneux (HOSCN). Ce système agit contre les germes psychrotrophes en permettant un report appréciable de la date limite de vente du lait cru (Condon, 1987 ; Adams et Nicolaides, 1997). 64 Bactéries lactiques Revue bibliographique La catalase constitue le système le plus efficace contre ce produit, cependant les bactéries lactiques en sont dépourvues et à la place elles sont dotées d’une peroxydase qui est moins efficace (Doleyres, 2003). La production de H2O2 par Lactobacillus et Lactococcus inhibe la croissance de Staphylococcus aureus, de Pseudomonas sp. Et divers microorganismes psychrotrophes (Davidson et al., 1983). L'inhibition est négociée par l'effet d'oxydation fort sur des lipides de membrane et des protéines cellulaires (Morris, 1976; Lindgren et Dobrogosz, 1990). La quantité de peroxyde d'hydrogène produite par les bactéries lactiques dépend en grande partie de la souche et la disponibilité de l'oxygène (Helander et al., 1997). II-10-1-3 Dioxyde de carbone Il est produit par les bactéries lactiques hétérofermentaires. Le mécanisme précis de son action antimicrobienne reste indéterminé. Cependant, le CO2 peut jouer un rôle antimicrobien en créant un environnement anaérobique qui inhibe la décarboxylation enzymatique et l'accumulation de CO2 dans la bicouche lipidique de la membrane peut aussi causer un dysfonctionnement de la perméabilité membranaire (Eklund, 1984). Le CO2 inhibe la croissance de beaucoup de microorganismes d’altération, particulièrement les bactéries psychrotrophes à Gram négatif (Farber, 1991; Hotchkiss et al., 1999). Le degré d'inhibition varie considérablement selon les espèces (Ammor et al., 2005). II-10-1-4 Diacétyle Il est généralement produit par des souches de Lc. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis par la fermentation du citrate (Lindgren et Dobrogosz, 1990; Cogan et Hill, 1993). Il est responsable de L’arome et de la saveur du beurre et de quelques autres produits laitiers fermentés (Earnshaw, 1992). Beaucoup de bactéries lactiques comprenant des souches de Leuconostoc, 65 Bactéries lactiques Revue bibliographique de Lactococcus, de Pediococcus et de Lactobacillus peuvent produire le diacétyle (Cogan, 1986 ; Budde et al., 2003). Son utilisation pratique comme conservateur est limitée. Cependant, le diacétyle peut agir synergiquement avec d'autres facteurs antimicrobiens et contribuer aux systèmes combinés de conservation en nourritures fermentées. Les bactéries Gram négatives, les levures et les champignons sont plus sensibles au diacétyle que les bactéries Gram positives (Jay, 1982). 1I-10-1-5 Acétaldéhyde Chez Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus, l'action d'une thréonine aldolase, clive la thréonine en acétaldéhyde et en glycine. L'acétaldéhyde à une concentration de 10 à 100 ppm empêche la croissance de Staphylococcus aureus, de Salmonella typhimurium et d’E. coli dans les produits laitiers (Piard et Desmazeaud, 1991). La contribution de l'acétaldéhyde à la biopréservation est mineure puisque le seuil de saveur est beaucoup inférieur aux niveaux qui sont considérés nécessaires à l'inhibition des microorganismes (Kulshrestha et Marth, 1974). II-10-1-6 Reutérine La reutérine est produite par Lactobacillus reuteri, une espèce hétérofermentaire qui niche dans l'appareil gastro-intestinal des humains et des animaux (Axelsson et al., 1989). La reutérine est formée pendant la croissance anaérobique de Lb. reuteri par l'action du glycérol déhydratase qui catalyse la conversion du glycérol en reutérine. Elle est produite pendant la phase stationnaire de Lactobacillus reuteri dans un milieu contenant du glucose et du glycérol ou du glycéraldéhyde (Talarico et al.,1988, 1989). La reutérine montre un large spectre d'activité antimicrobienne contre certaines bactéries à Gram+ et à Gram-. Les microorganismes de détérioration sensibles à la reutérine comprennent 66 Bactéries lactiques Revue bibliographique Salmonella, Shigella, Clostridium, Staphylococcus, Listeria, Candida, et Trypanosoma (Axelsson et al., 1989). II-10-1-7 Bactériocines La découverte de la première bactériocine remonte à 1925. Cette dernière, isolée de E. coli, possédait une activité bactéricide envers une autre souche de E. coli. Elle fut nommée colicine V (Gratia, 1925). À cette époque, le concept de compétition entre diverses bactéries était instauré et bien accepté. Les bactériocines produites par les bactéries sont généralement définies en tant que parties protéiques biologiquement actives, possédant une activité bactéricide contre des espèces proches de la souche productrice (Tagg et al., 1976; Klaenhammer, 1988; James et al., 1991). Les bactériocines sont synthétisées par les ribosomes, se composent de 51 à 113 acides aminés, avec une structure hélicoïdale (van Belkum et al., 1991, 1992). La classification actuelle des bactériocines est fondée sur leur taille, leur résistance à la chaleur, certaines propriétés physicochimiques, leur spectre d'activité et la présence ou non d'acides aminés modifiés. Quatre classes distinctes de bactériocines ont été définies (Cenatiempo et al., 1996 ; Klaenhammer, 1988 ; Dortu et Thonart, 2009). Elles ont en général des spectres d’activités étroits mais ils sont surtout spécifiques aux bactéries à Gram positive. En effet, toutes les bactériocines produites par des bactéries lactiques décrites jusqu’à présent ont une activité dirigée contre les bactéries Gram+, la membrane externe des bactéries Gram- ne permettant pas aux bactériocines d’atteindre la membrane interne, siège de leur activité. En plus, les bactériocines sont produites pendant ou à la fin de la phase exponentielle de croissance, puis exportées à l’extérieur des cellules productrices (Tagg et al., 1976; Van De Guchte et al., 2001; Dortu et Thonart, 2009). La production d’une bactériocine peut être considérée comme un moyen pour éliminer des bactéries envahissantes concurrentes (Lachance, 2000). 67 Bactéries lactiques Revue bibliographique En effet, les bactériocines sont caractérisées et sélectionnées pour être utilisées en tant qu’antagoniste vis-à-vis des bactéries de contaminations et pathogènes Elles sont largement répandues chez les bactéries alimentaires telles que les bactéries lactiques ayant pour cible des bactéries du genre Listeria, Clostridium, Staphylococcus aureus et d’autres bactéries à Gram positif comme les bactéries lactiques (Cintas et al., 2001). Une attention particulière, ces dernières années est accordée aux bactériocines produites par les bactéries lactiques et ceci est due en grande partie à leur éventuelle application dans l'industrie alimentaire en tant que biopréservateurs (Rodriguez et al., 2002). Les bactériocines occupent un rôle prometteur dans la conservation naturel des produits fermentés, ce qui est un atout supplémentaire pour les industriels (Daeschel, 1993; Ray et Daeschel, 1994). II-11 Les lactobacilles Les lactobacilles représentent le groupe le plus important des bactéries lactiques tant au niveau industriel qu’au niveau de la flore commensale (Penaud, 2006). Ils contiennent plus de 120 espèces et 20 sous espèces. Ce nombre évolue régulièrement, 13 nouvelles espèces ont été proposées en 2005, 9 en 2006 et 7 autres en 2007 (Lee et Salminen, 2009). Cependant, ce genre est très hétérogène, aussi bien sur le plan génétique que sur le plan de la distribution des habitats (Penaud, 2006). II-11-1 Caractères généraux Le genre Lactobacillus a été décrit par Beijerinck en 1901 pour regrouper des bactéries à Gram positif isolées de produits laitiers et à métabolisme fermentaire. Les lactobacilles appartiennent au groupe des Firmicutes, à la classe des Bacilli, à l’ordre des Lactobacillales et à la famille des Lactobacilliaceae (Schleifer et Ludwig, 1995). Il s’agit de bacilles souvent allongés parfois isolés ou groupé en paires ou en chaînes (fig. 28), non sporulés généralement immobiles avec 68 Bactéries lactiques Revue bibliographique un pourcentage G+C inferieur à 50%. Ils sont dépourvus de catalase (certains ont une pseudo-catalase) et d’oxydase. Ils sont micro-aérophiles ou anaérobies. Ces bactéries peuvent se développer à des températures basses ou extrêmes comprises entre 2 et 50°C, avec un optimum compris entre 30 et 40°C (Kandler et Weiss, 1986). Fig. 28: Lactobacillus bulgaricus et Lactobacillus casei observés au microscope électronique (G x 10 000) Les lactobacilles sont acidophiles, avec un optimum de pH entre 5,5 et 6,2. Ils se montrent généralement plus résistants au stress acide que les lactocoques . De plus, ces microorganismes sont auxotrophes avec de fortes exigences en facteurs de croissance (Morishita et al., 1981). Les critères phénotypiques restent encore très importants aujourd’hui pour la classification des lactobacilles. D’autre part, Les études basées sur les ARN 16S ont permis de mettre en évidence l’existence de différents groupes phylogénétiques au sein des lactobacilles (Schleifer et Ludwig, 1995) (fig. 29). 69 Bactéries lactiques Revue bibliographique Fig. 29: Arbre phylogénétique des groupes principaux du genre Lactobacillus basé sur les ARNr 16S (Schleifer et Ludwig, 1995) Les lactobacilles ont un métabolisme fermentaire produisant de l’acide lactique Certaines espèces sont homolactiques, d’autres hétérolactiques produisant des acides volatils, de l’éthanol et du CO2 en plus de l’acide lactique. Stiles et Holzapfel (1997) rapportent que les lactobacilles peuvent être classés en trois groupes selon leur métabolisme fermentaire Le groupe 1 représente les lactobacilles homofermentaires, ou “Thermobacterium” qui produise exclusivement de l’acide lactique à partir de la fermentation du glucose alors que le groupe 2 représentant les lactobacilles hétérofermentaires facultatives ou “Streptobacterium” produisent en plus de l’acide lactique, de l’éthanol, du CO2, de l’acide acétique à partir de la fermentation des hexoses tandis que le groupe 3 représenté par les lactobacilles hétérofermentaires strictes ou “Betabacterium” fermentent les hexoses et les pentoses en acide lactique, acide acétique et/ou éthanol et CO2. 70 Bactéries lactiques Revue bibliographique II-11-2 Habitat Les lactobacilles colonisent un nombre important de niches écologiques et représentent le groupe de bactéries lactiques le plus ubiquitaire dans l’environnement (de Roissart et Luquet, 1994). Ils appartiennent à la flore normale de la cavité buccale, urogénitale et du tractus gastro-intestinal de l’homme et de l’animal. Ces bactéries sont importantes pour le maintien de l’équilibre de la flore commensale et donc pour la santé de l’hôte (Saad, 2010). Les lactobacilles sont également isolés d’autres niches telles que les plantes, le sol, l’eau, les produits laitiers, carnés ou végétaux fermentés ou en décomposition. Les lactobacilles sont très utilisés dans l’industrie agroalimentaire (en laiterie, fromagerie, charcuterie, dans la fabrication de la choucroute, ...). Ils sont notamment utilisés pour les fermentations lactiques du lait (L. bulgaricus), de la viande (L. sakei) ou de produits végétaux (L. plantarum). Cependant, les lactobacilles peuvent aussi être des contaminants indésirables de produits alimentaires. Ils sont notamment à l’origine de la détérioration de produits tels que la bière (L. casei, L. plantarum), le lait (L. maltaromicus), la viande et les produits carnés (L. sakei, L. curvatus) (Stiles et Holzapfel, 1997 ; de Roissart et Luquet, 1994). Ils sont utilisés industriellement dans trois domaines en tant que probiotiques dans l’alimentation animale, dans les préparations pharmaceutiques destinées à l’homme, et en tant que ferments lactiques pour les produits fermentés (dans les domaines laitiers et carnés) (Saad, 2010). II-11-3 Effets des lactobacilles sur la santé L’effet probiotique des lactobacilles a été et est encore largement étudié. Les lactobacilles font partie de la flore digestive et participent aux effets bénéfiques de la microflore sur l’hôte, que ce soit au niveau métabolique, trophique ou immunitaire. Un des effets majeurs des lactobacilles sur la santé humaine décrits dans la littérature est leur rôle antagoniste vis à vis des bactéries 71 Bactéries lactiques Revue bibliographique pathogènes (Silva et al., 1987 ; Dambélé et al., 1998 ; Servin, 2004; Saad, 2010). Les effets des lactobacilles sur les bactéries pathogènes reposent sur différentes propriétés telles que la capacité à adhérer aux cellules en inhibant ainsi l’adhésion des pathogènes, l’inhibition de la croissance des pathogènes, la capacité d’entrer en compétition avec les pathogènes pour les ressources nutritives et la modulation de la réponse immunitaire de l’hôte (Reid et Burton, 2002). Effectivement, certains lactobacilles sont capables d’induire la réponse immunitaire de l’hôte. Cet effet a été observé par plusieurs souches de lactobacilles comme L. johnsonii La1, L. casei rhamnosus GG ou L. casei Shirota. L’adhésion des lactobacilles aux cellules humaines permettrait d’une part aux lactobacilles de se maintenir dans l’hôte et d’autre part, d’inhiber l’adhésion des pathogènes (Grangette et al., 2005). En outre, La capacité des lactobacilles à inhiber la croissance de bactéries pathogènes repose sur plusieurs propriétés (Silva et al., 1987). La production de peroxyde d’hydrogène (H2O2), facteur inhibiteur de la croissance des pathogènes a surtout été étudiée pour les lactobacilles commensaux du tractus urogénital (Marelli et al., 2004). La microflore vaginale des femmes souffrant d’infections vaginales bactériennes est constituée en majorité de lactobacilles commensaux ne produisant pas d’H2O2 (seuls 14% des lactobacilles en produisent) alors que pour les femmes « saines », les lactobacilles producteurs d’H2O2 représentent 75% de la flore (Al-Mushrif et Jones, 1998). Un autre facteur permettant l’inhibition de la croissance des pathogènes est la production d’acides organiques (lactique ou acétique), et par là-même l’acidification du milieu. Ces effets ont été étudiés in vitro pour plusieurs lactobacilles probiotiques. L. casei rhamnosus GG inhibe l’adhésion de Salmonella typhimurium par un effet dépendant du pH, l’inhibition étant levée à pH neutre (Lehto et Salminen, 1997). L. casei Shirota et L. acidophilus YIT0070 inhibent la croissance de E. coli O157:H7 par la production d’acide lactique 72 Bactéries lactiques Revue bibliographique (Ogawa et al., 2001). Fayol-Messaoudi et al. (2005) ont montré que l’activité antagoniste de L.johnsonii La1, L. casei rhamnosus GG, L. rhamnosus GR1, L. casei Shirota et L. casei DN-114 sur S. enterica est principalement due à l’effet de l’acide. Cependant, il semble que l’acide lactique joue un rôle dans l’inhibition de la croissance des bactéries à Gram négatif (auxquelles appartiennent un grand nombre de pathogènes) par perméabilisation de la membrane externe, ce qui faciliterait l’entrée de molécules antibactériennes dans les cellules et augmenterait ainsi leur efficacité (Alakomi et al., 2000). De plus, l’accumulation de lactate dans la cellule induit aussi des effets délétères pour la cellule (Presser et al., 1997). D’autre part, Certains lactobacilles produisent des molécules protéiques bactéricides appelées bactériocines dont le rôle dans l’inhibition de pathogènes en conditions technologiques a été largement étudié. Les bactériocines ont un spectre d’action variable, plus souvent limité à certaines espèces à Gram positif. Certaines bactériocines peuvent éventuellement être utiles pour limiter les contaminations alimentaires par des pathogènes comme Listeria monocytogenes ou Clostridium botulinum (Ross et al., 2002). L’usage des bactériocines pour le traitement de troubles intestinaux est limité car elles sont peu ou pas actives sur des bactéries à Gram négatif, principaux agents de ces troubles. Cependant, quelques bactériocines de lactobacilles sont actives sur des bactéries à Gram négatif comme l’acidophiline 801 active contre E. coli Raw et S. panama. (Zamfir et al., 1999). Différentes espèces de lactobacilles sont largement étudiées pour leurs effets bénéfiques sur la santé. Cependant, certaines de ces bactéries ont été impliquées dans des cas de bactériémies, d’endocardites ou d’infections localisées (Cannon et al., 2005). Les infections dues aux lactobacilles sont rares mais, comme tout micro-organisme, les lactobacilles peuvent être associés à des infections, dans certaines conditions, notamment dans le cas de sujets immunodéprimés ou déjà malades (Salminen et Arvilommi, 2002). 73 Objectif du travail Les lactobacilles sont connus pour leur pouvoir inhibiteur contre les bactéries pathogènes y compris Helicobacter pylori. C’est dans ce contexte que s’inscrit notre étude qui consiste à : Mettre en évidence H. pylori à partir des biopsies gastriques. Isoler et identifier H. pylori des biopsies gastriques Isoler et caractériser les lactobacilles du lait cru de chèvre. Mettre en évidence l’inhibition des lactobacilles vis-à-vis de H. pylori, et d’autres bactéries pathogènes. Enfin, déterminer la nature de l’agent inhibiteur impliqué dans cet antagonisme. 74 Matériels et Méthodes I- Isolement et identification de Helicobacter pylori I-1 Echantillon et origine du matériel La recherche de H. pylori a été basée sur des méthodes directes invasives, nécessitant une fibroscopie. En effet, l’étude a été réalisée sur des biopsies antrales gastriques, prélevées chez des patients atteints de maladies gastroduodénales (gastrite chronique, ulcère duodénal ou ulcère gastrique). Ces patients se présentaient à jeun et ayant subit une endoscopie gastroduodénale au niveau du service gastro-entérologie à l’hôpital militaire d’Oran. Deux souches de H. pylori de référence ont aimablement été fournies par le Pr. F. Megraud du Laboratoire de Bactériologie (Bordeaux, France). Les souches sont H. pylori J 99, H. pylori 26695. I-2 Prélèvement Les prélèvements biopsiques doivent être effectués à distance d’un traitement par des antibiotiques ou des antisecrétoires (Lamouliatte et al., 1992; Megraud, 1992; Megraud,1994a). Les conditions de stérilité doivent être respectées au moment du prélèvement (Megraud, 1989). Les prélèvements ont été effectués sous endoscopie dans la région antrale à environ de 2 cm du pylore à l’aide d’un endoscope type (Olympus GIFXQ 10) et d’une pince à biopsie, préalablement désinfectés au glutaraldhyde et bien rincés en raison du pouvoir inhibiteur de ce produit sur H. pylori (Lozniewski, 1996; Lamouliatte et al., 1992; Megraud,1992). Le port des gants lors de la fibroscopie est recommandé pour éviter une éventuelle contamination (Megraud, 1994a). L’endoscopiste prélève 4 biopsies antrales qui serviront à pratiquer respectivement un test rapide à l’urée, un examen cytologique, un examen anatomopathologique et une culture (Lamouliatte et al.,1992; 1994b). 75 Megraud, Matériels et Méthodes I-3 Conservation des biopsies La biopsie destinée à l’examen anatomopathologique est déposée dans un fixateur, le liquide de Bouin (Lamouliatte et al., 1992; Megraud, 1992). Pour la bactériologie, les trois autres biopsies sont placées, dans un pot stérile contenant 1 ml du sérum ou eau physiologique stérile où la biopsie sera protégée de l’oxygène de l’air et de la dessiccation (Megraud, 1994a, 1994g), puis acheminées au laboratoire à 4 °C et ceci pour un délai de transport n’excédant pas les 4 heures de temps (Lamouliatte et al,1992; Megraud, 1992, 1994g). Le milieu de transport « Portagem pylori » est utilisé pour le transport des biopsies durant 24h. Il est à noter que le test rapide à l’urée peut être pratiqué directement dans la salle d’endoscopie en utilisant le CLO test (Megraud, 1994b). I-4 Examen anatomopathologique Cet examen est réalisé par l’anatomopathologiste (Megraud, 1996a). Il permet d’une part, d’étudier la muqueuse gastrique et ses modifications histologiques, et d’autre part de visualiser les bactéries spiralées (Lamouliatte et al,1992; Sobhani et al, 1995). Il s’effectue sur des coupes histologiques préparées à partir des biopsies gastriques, colorées à la coloration de Giemsa modifiée, puis observées au fort grossissement (Megraud, 1994a). I-5 Examens microbiologiques I-5-1 Examen cytologique Cet examen consiste en la mise en évidence de bactéries spiralées par une coloration de Gram de l’empreinte biopsique (Megraud, 1994a; Sobhani et al., 1995). Pour cela, une biopsie est déposée sur une lame porte-objet, puis écrasée à l’aide d’une seconde lame afin d’obtenir un frottis fin et régulier (Lamouliatte et al., 1992; Megraud, 1994a, 1994b). Le frottis préparé est ensuite 76 Matériels et Méthodes séché, fixé, puis coloré à la coloration de Gram (Sobhani et al., 1991; Megraud, 1994b; Cellini et al., 1995b). L’ensemble de la préparation est observé attentivement au microscope optique au faible grossissement, pour repérer les zones plus riches en cellules puis au fort grossissement pour bien observer les bactéries spiralés à Gram négative (Megraud, 1994b). Il est nécessaire d’observer un grand nombre de champs microscopiques du fait de la répartition parfois non homogène des bactéries dans la biopsie gastrique (Megraud, 1989; Lamouliatte et al, 1992). I-5-2 Test rapide à l’Urée Helicobacter pylori a la particularité de posséder une uréase très active. Cette propriété est utilisée pour le diagnostic de l’infection à H. pylori par un test rapide à l’urée (Delchier, 1994). Ce dernier est basé sur la recherche directement au niveau de la biopsie gastrique, de l’activité uréasique chez H. pylori, qui va alcaliniser un milieu riche en urée et faire virer l’indicateur du pH par la libération de l’ammoniac (Lamouliatte et al, 1992 ; Megraud, 1994a ; Lozniewski, 1996 ; Megraud, 1996a). Pour cela, nous avons effectué cette recherche en salle d’endoscopie et au laboratoire (Megraud, 1989, 1994a). En salle d’endoscopie, nous avons utilisé le CLO test: c’est un dispositif en plastique, constitué d’un gel d’agar contenant de l’urée, d’un indicateur de pH coloré (rouge de phénol), de tampon et d’un agent bactériostatique n’ayant pas d’effet sur H. pylori. La biopsie gastrique est déposée à la surface du gel aussitôt que le prélèvement est effectué. Ensuite, le dispositif est incubé à 37°C (Delchier, 1994; Riachi et Colin, 1995; Delchier, 1996b). La lecture des résultats (virage de l’indicateur de sa couleur jaune initiale à une couleur rouge) s’effectue au bout de 30 min. et 3h, voire au maximum 24h (Megraud, 1989). Au laboratoire, nous n’avons qu’a déposé un fragment biopsique à l’aide d’une anse stérile dans un tube contenant 0,5 ml de milieu urée-indole (annexe). 77 Matériels et Méthodes L’incubation se fait à 37°C. La lecture des résultats (virage de l’indicateur vers le rouge) s’effectue au bout de 20 min et 24 h (Megraud, 1989a; Sobhani et al, 1991; Megraud, 1994b). I-5-3 Culture et isolement I-5-3-1 Condition de culture Helicobacter pylori est une bactérie fragile et microaérophile. La composition gazeuse idéale pour sa croissance est de 5 % d’O2, 10 % de CO2 et 85% de N2 (Leclerc et al., 1989; Cellini et al., 1994). Il est donc essentiel d’utiliser un générateur d’atmosphère microaérophile placé dans une jarre d’anaérobiose. Dans notre présent travail, l’atmosphère microaérophile est obtenue en utilisant le système de Campy pack (BioMerieux) (Sobhani et al, 1991). I-5-3-2 Milieux de culture Helicobacter pylori est une bactérie exigeante sur le plan métabolique (Lamouliatte et al., 1992; Megraud, 1992). Sa culture exige des milieux de cultures enrichis additionné de sang ou de sérum (Fauchère et Rosenau, 1991; Sobhani et al., 1995). Pour son isolement, nous avons utilisé un milieu au sang non sélectif à base de la gélose Columbia (annexe) et un milieu sélectif à base de Wilkins Chalgren (annexe ) (Megraud, 1994a , 1994b). Ce dernier contient un mélange spécifique d’antibiotique destiné à inhiber la croissance d’éventuel contaminants (Fauchère et Rosenau, 1991; Lozniewski, 1996). Le milieu sélectif « la gélose pylo bioMerieux » prêt à l’emploi et présenté en boites de Petri a également été utilisé dans certains cas selon sa disponibilité. 78 Matériels et Méthodes I-5-3-3 Isolement La biopsie est broyée dans 1 ml de bouillon cœur- cervelle (BHIB) (annexe) ou bouillon Brucella (annexe) à l’aide d’un mortier stérile ou d’un disperseurhomogénéiseur type Ultra-TURRAX (à l’aide d’un micro-pilon) pendant quelques secondes de manière à libérer les bactéries. Le broyage ne doit pas durer trop longtemps, sous peine de détruire les bactéries, mais la suspension doit tout de même être homogène. Ensuite, le broyat est ensemencée sur 2 boites Pétri contenant respectivement milieu non sélectif la gélose au chocolat et milieu sélectif le milieu pylori (bioMerieux) ou le milieu à base de Wilkins Chalgren. Les boites sont incubées aussitôt ensemencées dans une jarre en atmosphère microaérobie à 37°C pendant 3 à 7 jours, voire 10 jours (Lamouliatte et al, 1992; Megraud, 1994a, 1994b, 1996a). L’atmosphère est renouvelée au moins tous les deux jours pour avoir une croissance optimale (Megraud, 19890; Fauchère et Rosenau, 1991; Megraud, 1994b). Les primocultures doivent être examinées à partir du 3 ème jour. Toutefois, certaines cultures dégénèrent rapidement, il convient donc de démarrer les subcultures des que les colonies sont visibles. La croissance est plus rapide en subculture (2 à 4 jours). Il est à signaler que l’on peut conserver le reste du broyat dans un microtube à congélation et le stocker à – 20 °C pour la PCR. I-5-3-4 Identification L’identification est basée sur la détermination des caractères morphologiques et biochimiques (Megraud, 1994a; Lamouliatte et al, 1992; Megraud, 1996a). I-5-3-4-1 Examen macroscopique L’aspect des colonies et leur dimensions sont étudiées à partir des cultures bactériennes obtenues sur les milieux de culture (Lamouliatte et al, 1992; Fauchère et Rosenau, 1991). 79 Matériels et Méthodes I-5-3-4-2 Examen microscopique Il a été effectué sur un frottis bactérien, préparé à partir des colonies suspectes en cultures pures, puis fixé et coloré par la méthode de Gram (Megraud, 1994b). I-5-3-4-3 Etat frais Il consiste à déposer sur une lame, une goutte de la suspension bactérienne, préalablement préparée, qui sera par la suite recouverte par une lamelle. La préparation est observée au grossissement (x 40) (Marchal et al., 1991) I-5-3-4-4 Tests Biochimiques L’étude des caractères biochimiques est basée essentiellement sur la recherche de l’oxydase, de la catalase et de l’uréase. Car leurs positivités confirment qu’il s’agit bien de H. pylori (Fauchère et Rosenau, 1991; Lamouliatte et al., 1992 ; Sobhani et al., 1995). Les trois tests biochimiques (oxydase, catalase, uréase) s’effectuent sur une lame porte-objet à partir des colonies suspectes apparues sur les milieux en utilisant respectivement le disque d’oxydase, eau oxygénée (H2O2) et le milieu Urée-indole (annexe). La lecture des résultats se fait immédiatement. Toutes les souches de H. pylori ainsi isolées et identifiées seront antibiogrammées et conservées à long terme à – 80°C. I-5-4 Antibiogramme La sensibilité des souches de H. pylori isolées aux antibiotiques habituellement utilisés dans la thérapie a été testée par deux techniques, la méthode de disques en utilisant les antibiotiques suivants : (tétracycline TE, Rivampin RA, Levofloxacin LVX) et le E-test en utilisant la clarithromycine (CH), le métronidazole (MZ) et l’amoxicilline (AMX). 80 Matériels et Méthodes A partir d’une culture de 48 h sur les milieux d’isolement, une suspension bactérienne dense contenant (109 CFU/ml) est préparée en bouillon Brucella (4 ml). Ensuite, le milieu Muller-Hinton additionné de 10% de sang de mouton (annexe) est ensemencé par inondation de la suspension bactérienne. L’excès de la suspension est ensuite éliminé en respectant les mesures de sécurité nécessaires et les boites sont mises à sécher environ 10 mn. Puis, on dépose sur chaque boite les disques ou les bandelettes E-test correspondants aux antibiotiques à tester. Après 72 h d’incubation à 37° C en microaérobiose. La lecture des résultats s’effectue par la mesure des diamètres de zone d’inhibition autour des disques d’antibiotiques ou par la détermination de la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) (Amhis et al., 2001). En cas de E-test, on observe une ellipse d'inhibition. Au point d'intersection entre la zone d'inhibition et la bandelette, la concentration en antibiotique correspond à la CMI de la souche étudiée. Les antibiotiques testés ainsi que leurs valeurs de sensibilité et résistance sont illustrés dans le tableau 8. I-5-5 Conservation La conservation à long terme se fait dans 0.5 ml de milieu glycérol peptonée (annexe) dans des microtubes. A l’aide d’un écouvillon, on prépare une suspension bactérienne très riche de la souche de H. pylori dans 0.5 ml de milieu glycérol peptonée. Les microtubes ou les eppendorfs ainsi préparés sont conservés dans des boites à congélation dans le congélateur à – 80 °C. 81 Matériels et Méthodes Tableau 8 : Valeurs des antibiotiques utilisés (Institut Pasteur) Antibiotiques Clarithromycine CH E-Test (mg/l) Disque (mm) ≥ 1 Résistant Résistant < 17 0,5 et 1 Intermédiaire Sensible ≥ 19 < 0,5 Sensible Amoxicilline AMX ≥ 1 Résistant 0,25 et 0,5 Intermédiaire Résistant < 17 Sensible ≥ 20 < 1 Sensible Métroridazole MZ Tétracycline TE Levofloxacin LVX Rivampin RA > 8 Résistant Résistant < 17 ≤ 8 Sensible Sensible ≥ 19 > 8 Résistant Résistant < 17 ≤ 4 Sensible Sensible ≥ 19 > 2 Résistant Résistant < 17 ≤ 1 Sensible Sensible ≥ 20 > 16 Résistant Résistant < 14 ≤ 4 Sensible Sensible ≥ 19 82 Matériels et Méthodes I-5-6 Application de la technique PCR en temps réel La PCR en temps réel sur biopsies gastriques ou sur les colonies permettrait de façon fiable de détecter à la fois Helicobacter pylori et d’éventuelles mutations de résistance à la clarithromycine (Raymond et al., 2010). Effectivement, la mise en évidence de H. pylori à partir des biopsies gastriques a été confirmée par la technique moléculaire « PCR en temps réel ». D’autre part, cette technique a été utilisée pour identifier les souches de H. pylori isolées et détecter d’éventuelle mutation à la clarithromycine. Cette technique a été pratiquée au niveau de la faculté de Bordeaux (France). Pour réaliser cette technique, l’ADN bactérien est extrait soit de la culture bactérienne, soit directement des biopsies gastriques. La biopsie gastrique doit alors passer par deux étapes importantes: la digestion et l’extraction de l’ADN. a- Digestion La digestion se fait à partir de broyat de la biopsie gastrique congelée à -20°C de la manière suivante : Transférer dans un tube conique à bouchon les ¾ de broyat de la biopsie décongelée. Centrifuger 30 min à 14000 rpm. Enlever le surnageant et traiter le culot avec le kit Qiagen 180ul de tampon de lyse ATL et 20ul de protéinase K. Votrexer. Incuber 3h ou Overnight à 56°C, sous agitation dans un appareil thermomixer compact. Quant il s’agit d’une culture bactérienne, récupérer les bactéries de H.pylori cultivées à l’aide d’un écouvillon stérile et les déposer dans un tube de 1.5ml contenant 1ml d’eau physiologique stérile. Centrifuger 5 min à 6000 rpm afin de culotter les bactéries. Enlever le surnageant et traiter le culot avec 180ul de tampon ATL et vortexer. Ajouter 20ul de protéinase K et vortexer. Incuber 3h ou overnight à 56°C, sous agitation. Après l’incubation, faire un pulse de centrifugation de 10 secondes. 83 Matériels et Méthodes b- Extraction d’ADN Ajouter 200 ul de tampon AL (DNA stool) et vortexer 15 secondes. Incuber 10 min à 70°C. Faire un pulse de centrifugation de 10 sec. Ajouter 200 ul d’éthanol absolu au lysat. Vortexer 15. Faire un pulse de centrifugation. Marquer la colonne (+bouchon) et la placer dans un tube de 2ml. Transférer la solution dans la colonne du kit. Centrifuger 1min à 14 000 rpm. Conserver la colonne et la placer dans un nouveau tube collecteur du kit et jeter le filtrat. -Ajouter 500 ul de tampon AW1 sur la colonne et centrifuger 1min à 14000 rpm. -Conserver la colonne et la mettre dans un nouveau tube collecteur. -Ajouter 500 ul de tampon AW2 et centrifuger 3min à 14000 rpm. -Placer la colonne dans un tube de 1.5ml. -Ajouter 100 ul d’eau chauffée à 70°C. Laisser 5min à température ambiante. -Centrifuger 2min à 14000 rpm. Récupérer l’ADN dans le tube de 1.5 ml étiqueté. c- Technique de la PCR en temps réel Une fois l’ADN de H. pylori est extrait, nous passons à la réalisation de la technique PCR en temps réel. Les différentes étapes de la PCR sont : la dénaturation de l’ADN, l’hybridation et l’élongation. Ces étapes se font simultanément de la manière suivante : -Pré-PCR Préparation du mélange réactionnel qui contient les amorces 23S, les sondes fluorescentes et l’enzyme polymérase (annexe). Cette opération se fait sous l’hôte. 84 Matériels et Méthodes Pré-PCR- Dépôt La répartition du mélange préparé dans des capillaires (7.2 µl dans chaque capillaire) (annexe). L’addition de 0.8 µl d’ADN (test ou témoin) dans chaque capillaire (annexe) puis vortexer. Les capillaires sont ensuite bouchés, placé dans un centrifuge appelé Carousel puis centrifugé à 3000 rpm pendant 1 mn. Enfin, Les capillaires sont placés dans un appareil appelé LightCycler, combiné à un système optique de précision et un ordinateur puis analysés. d- Expression des résultats Après validation technique, les résultats sont enregistrés dans la base de données du système informatique et interprété par un thermocycleur L’utilisation de l’appareil de PCR quantitative le LightCycler permet de développer un test où la présence de H. pylori et sa sensibilité à la clarithromycine peuvent être détectées en 3-4 heures. 85 Matériels et Méthodes II- Isolement et caractérisation des lactobacilles II-1 Provenances des échantillons du lait Les échantillons de lait cru de chèvre ont été collectés auprès d’une ferme d’élevage privé localisé dans la région d’Es-Senia à ORAN. Les prélèvements ont été effectués dans des conditions d’hygiène parfaites. Après lavage du pis de la chèvre à l’eau savonneuse, rinçage à l’eau javellisée puis séchage avec une lingette stérile, le lait a été recueilli dans des flacons stériles (100 ml / flacon) dés les premiers jets puis placés dans une glacière (+ 4°C), ensuite transportés immédiatement au laboratoire pour analyse microbiologique. La souche de référence Lactobacillus delbrueckii sp. bulgaricus CNRZ 449 (LBDB CNRZ) est fourni par l’INRA (France). II-2 Milieux de culture Les bactéries lactiques sont relativement exigeantes sur le plan nutritionnel et ces exigences varient d’une souche à l’autre. Pour la culture des lactobacilles, nous avons utilisé le milieu de culture MRS acidifié (pH 5,4) liquide ou solide présentés en annexe. II-3 Isolement et identification des lactobacilles II- 3-1 Isolement Les analyses microbiologiques sont faites après enrichissement des échantillons du lait par incubation à 30°C et à 45°C, jusqu’à coagulation pour activer la flore endogène mésophile et thermophile. L’isolement sélectif des lactobacilles par culture sur MRS gélosé acidifié (pH 5.4) (De Man et al., 1960) a été réalisé selon les méthodes décrites par la Fédération Internationale du Lait (FIL, 1996). Après dilution décimales (10-1 à 10-9) des échantillons dans une solution de Ringer au ¼ stérile, 100 µl de 86 Matériels et Méthodes la dilution est ensemencé en profondeur dans le milieu. Les boites de Petrie sont ensuite incubées en microaérobiose dans une jarre d’anaérobiose à 30 et à 45°C pendant 48h pour l'isolement des lactobacilles mésophiles et thermophiles respectivement. II-3-2 Identification des lactobacilles II-3-2-1 Caractérisation morphologique Des colonies typiques de lactobacilles à savoir leur apparence macroscopique (aspect de la colonie: forme, taille, couleur, contour) sont prises au hasard, à partir de boites de MRS contenant entre 30 et 300 colonies et sont ensuite repiquées dans le bouillon MRS acidifié et incubées à 30+ °C. Après incubation, les colonies sont réensemencées et purifiées dans du MRS solide. Les souches seront examinées pour leur coloration de Gram et le test de catalase. Les bactéries Gram positives et catalase négatives, de forme bacillaire sont présumées des lactobacilles et seront conservées sur MRS incliné à 4°C pour une identification ultérieure. La conservation à long terme est effectuée à -20°C dans du lait écrémé à l’extrait de levure (LEY) supplémenté de 30% de glycérol (Schillinger et Lucke, 1987; Samelis et al., 1994). II-3-2-2 Détermination des isolats Les isolats sont identifiés en genres par des tests préliminaires morphologiques (macroscopique et microscopique) et physiologiques en se basant sur les tests décrits par Harrigan et McCance (1976), Sharpe (1979), Kandler et Weiss (1986), Falsen et al., (1999) et Klein (2001). Pour une identification au niveau de l’espèce et sous espèces, l’étude du profile fermentaire des souches s’avère nécessaire. 87 Matériels et Méthodes II-3-2-3 Détermination du genre II-3-2-3-1 Température Ce test permet de distinguer les bactéries lactiques (lactobacilles) mésophiles des bactéries lactiques (lactobacilles) thermophiles. Après inoculation de la souche bactérienne isolée en bouillon MRS, les tubes sont incubés pendant sept à dix jours à 15 °C et pendant 24 à 48 heures à 45 °C. La croissance bactérienne est évaluée par une turbidité dans le bouillon MRS. Les bactéries pouvant croître à 45°C et non pas à 15°C, sont considérées comme étant des lactobacilles thermophiles, celles ne pouvant pas pousser à 45°C mais croitre à 15°C sont considérées comme étant des lactobacilles mésophiles (Bourgeois et Larpent, 1996). II-3-2-3-2 Type fermentaire Ce test permet d’apprécier le type de métabolisme par lequel le substrat carboné est transformé, il consiste à mettre en évidence la production du CO2 et de savoir ainsi le type fermentaire des souches isolées (hétéro ou homolactiques). L’ensemencement des souches s’effectue dans le bouillon MRSG (Bouillon MRS +glucose) contenant au préalable une cloche de Durham, suivi par une incubation à 30°C pendant 24 à 48 h, La production du gaz dans la cloche indique que la souche est hétérofermentaire, dans le cas contraire elle est homofermentaire (Harrigan et Mc Cance, 1976). II-3-2-3-3 Hydrolyse de l’arginine La recherche de l’arginine dihydrolase (ADH) est étudiée sur le milieu Moeller, qui renferme l’arginine, le glucose et un indicateur de pH (pourpre de Bromocresol) (annexe). L’ensemencement de la suspension bactérienne dans le milieu est réalisé en anaérobiose en recouvrant la surface du milieu d’huile de paraffine stérile. Le milieu Moeller sans arginine sert comme témoin. L’incubation se fait à 37°C pendant 48h. Les lactobacilles fermente le glucose et 88 Matériels et Méthodes les milieux s’acidifient provoquant ainsi le virage de l’indicateur au jaune (réaction négative). Dans le deuxième cas, la production éventuelle de l’enzyme (ADH) conduit à l’alcalinisation du milieu, ce qui provoque le virage de l’indicateur du jaune au violet (réaction positive) (Moeller, 1955). II-3-2-3-4 Utilisation du citrate L’utilisation du citrate en présence de glucose est étudiée sur milieu KMK (annexe) (Kempler et Mc Kay, 1980). Ce milieu contient une solution de ferricyanide de potassium et une solution de citrate ferrique. La présence du citrate dans le milieu inhibe la réaction entre l’ion ferrique et le potassium ferricyanide. Après 18 h à 72 h d’incubation, Les colonies qui fermentent le citrate permettent la réaction entre ces ions il en résulte la formation de colonies bleues ou ayant un centre bleu (cit+). Les colonies incapables de fermenter le citrate restent blanches (cit-). II-3-2-3-5 Hydrolyse de l’esculine L’hydrolyse de l’esculine a été effectuée selon la méthode de Milliere et al., (1989). Elle se traduit par le noircissement du milieu MRS gélosé modifié contenant 0,5 % d’esculine et 0,05 % de citrate ferrique ammoniacal (annexe). Après une incubation à 30°C pendant 24 h à 48 h, La lecture se fait, par rapport à un témoin non ensemencé. Les tubes sont examinés jusqu’a une semaine. L’hydrolyse de l’esculine libère du glucose et l’esculétine. La fonction phénol de cette dernière réagit avec les sels de fer donnant une coloration noire dans le milieu due à la formation d’un complexe métallique. II-3-2-4 Détermination de l’espèce Afin de déterminer les espèces, nous avons recours à l’étude du profil fermentaire des souches isolées. Ce test est basé sur la fermentation des sucres en utilisant le bouillon MRS (sans le glucose et l’extrait de viande) additionné 89 Matériels et Méthodes de 40 mg/l de pourpre de bromocrésol comme indicateur de pH (MRS-BCP) et supplémenté de 1% des sucres suivants : arabinose, cellobiose, gluconate, lactose, mannitol, mélézitose, mélibiose, raffinose, rhamnose, ribose, sucrose, tréhalose, sorbitol, xylose (Samelis et al., 1994). La culture bactérienne de 18 heures de la souche à tester est centrifugée à 4000 tr/mn pendant 10 min. Le culot ainsi récupéré est additionné de 2 ml de tampon phosphate puis recentrifugé aux mêmes conditions pour obtenir un culot cellulaire, qui est ensuite additionné au milieu MRS-BCP. Les conditions d’anaérobiose sont assurées par l’addition d’une couche mince d’huile de paraffine stérile à la surface du milieu de culture. La fermentation des sucres est appréciée après 24 à 48h d’incubation à 30°C par le virage du milieu du pourpre au jaune au jaune. II-3-2-4-1 Identification des espèces en utilisant le système API 50 CHL Les profils biochimiques ont également été étudiés en utilisant le système API 50 CHL (Ref 50410, BioMérieux, France). API 50 CHL est un système standardisé associant 50 tests biochimiques permettant l’étude du métabolisme des hydrates de carbone des lactobacilles. La galerie est formée de 50 microtubes, permettant l’étude de la fermentation des substrats correspondant à la famille des glucides et leurs dérivés (hétérosides, polyalcools, acides uroniques). Le premier tube sans principe actif sert de témoin négatif. La fermentation des 49 sucres se traduit par un virage de la couleur du milieu au jaune. L’utilisation de cette galerie API 50 CHL consiste à la préparation de l’inoculum, la préparation et l’inoculation des galeries puis l’incubation à 30 C°. 90 Matériels et Méthodes a- Préparation de l’inoculum Le culot obtenu de la culture bactérienne de 18 h (expliqué précédemment) est suspendu dans 1 ml d’eau physiologique stérile. Un nombre de gouttes (n) de cette suspension est introduit dans 5 ml d’eau physiologique stérile de façon à obtenir une opacité de 2 sur l’échelle de Mc Farland. On prélève alors à l’aide d’une pipette Pasteur 2n gouttes de la suspension initiale (1ml) dans 10 ml de milieu API 50 CHL (Ref 50410, BioMérieux). b- Préparation des galeries 10 ml d’eau distillée sont réparties dans les alvéoles du fond de la boîte de la galerie formée de 5 bandes comprenant chacune 10 tubes numérotés (0-9, 1019, 20-29, 30-39, 40-49). La galerie est inoculée par la suspension bactérienne à l’aide d’une pipette Pasteur. Les cupules sont remplies avec de l’huile de paraffine stérile, puis, la galerie est incubée à 30 C°. c- Lecture et interprétation La lecture des résultats des galeries est réalisée après 24 et 48 h en les comparant aux profiles standards en utilisant le logiciel PIBWIN. La fermentation des sucres se traduit par le virage de l’indicateur du pH au jaune. II-3-3 Conservation des souches : La conservation des souches des lactobacilles est faite à court et à long terme. La conservation à court terme est effectuée sur milieu MRS incliné à +4°C et leur renouvellement se fait par repiquage toute les 4 semaines. Par ailleurs, La conservation à long terme des souches est réalisée à -20°C ou à 80°C dans une solution contenant 70% de lait écrémé (enrichie par 0.5g/l d'extrait de levure et 0.5g/l de glucose) et 30% de glycérol (Samelis et al., 1994). A partir d’une culture jeune (18-24h) sur bouillon MRS, les cellules sont récupérées par centrifugation à 4000 t / min pendant 10 min, ensuite le milieu de 91 Matériels et Méthodes conservation est rajouté sur le culot obtenu. Avant leur utilisation, les bactéries sont revivifiées par une ou deux subcultures dans des bouillons MRS à 30 °C pendant 18 à 24 h. III- Mise en évidence des inhibitions des lactobacilles et H. pylori La mise en évidence d’éventuel antagonisme, existant entre les lactobacilles vis à vis de H. pylori est réalisée selon deux méthodes directes et indirectes. Les souches de lactobacilles isolées du lait de chèvre ainsi que la souche de référence Lb. delbrueckii sp. bulgaricus CNRZ 449 (LBDB CNRZ) ont été testées pour leur activité antimicrobienne vis à vis des souches pathogènes de H. pylori isolés des biopsies gastriques ainsi que et les souches de références H. pylori J99 (HP4) et H.pylori 26695 (HP5). La culture des souches de lactobacilles est faite sur milieu MRS acidifié (annexe) alors que la culture des souches de H. pylori est préparée dans le milieu cœur cervelle que ce soit liquide (bouillon BHIB) (annexe) additionné de 10% sérum de cheval ou solide BHI-agar (annexe) (Sgouras et al., 2004). III-1 Méthode directe L’inhibition de la croissance de H. pylori par les lactobacilles est déterminée suivant la méthode décrite par Geis et al. (1983), qui consiste à ensemencer les souches de lactobacilles testées (culture de 16 h) (supposées être inhibitrices) en touches (5µl) sur milieu MRS gélosé. Après séchage à température ambiante, les boites de Pétri ainsi ensemencées sont incubées pendant 18h à 37°C en microaérobiose. Ensuite, les souches pathogènes de H. pylori (indicatrices) sont ensemencées en masse en couvrant la culture des lactobacilles avec 7 ml de la gélose cœur cervelle BHI-agar molle (0,7 % agar) préalablement ensemencé par 0.1 ml d’une culture jeune de la souche de H. pylori (10 7 ufc.ml-1) . Après solidification du milieu, les boites de Pétri sont réincubées en microaérobiose (sachet Campy pak) pendant 72 h à 37°C. L’inhibition se 92 Matériels et Méthodes révèlera par la présence d’un halo clair autour des souches ensemencées en touche. La lecture des résultats est faite par la mesure du diamètre des zones d’inhibitions apparues autour des colonies exprimées en mm (ayant un diamètre égale ou supérieure à 2 mm sont considérées comme positive) (Gonzalez et al., 2007; Pulsani et al., 1979). III-2 Méthode indirecte L’inhibition de la croissance de H. pylori par le surnageant des lactobacilles a été testée par la méthode dite la méthode de puits, décrite par Wendakoon et al. (1998), qui permet de mettre en contacte le surnageant de la souche lactique productrice de substance antimicrobienne avec la souche test (H. pylori). Le choix des souches indicatrices et inhibitrices est basé sur les résultats du test de la mise en évidence des inhibitions en milieu solide par la méthode directe. Les souches de lactobacilles testées sont cultivées dans le bouillon MRS et incubées à 30°C pendant 18h. Après incubation, le milieu est centrifugé (4000 tr/mn pendant 10 min) à 4 °C. Le surnageant est récupéré, puis filtré avec des filtres Millipore 0,45µm. Dans une boite de Pétri contenant le milieu gélosé BHI-agar et préalablement ensemencé en masse par la suspension bactérienne de la souche test de H. pylori (108 cfu /ml), des puits sont réalisés à l’aide d’une cloche de Durham stérile, remplis par la suite avec 70 µl du surnageant de la souche lactique. Les boites de Pétri ainsi préparées sont pré-incubées pendant 2 à 4 heures à + 4 °C, afin de permettre la diffusion radiale de l’agent inhibiteur (Simova et al., 2008 ; Allouche et al., 2010), suivit par une incubation à 37°C pendant 72 h en microaérobiose (sachet de Campy pak). La lecture de l’activité inhibitrice se fait par la mesure du diamètre des zones d’inhibitions apparues autour des puits. Le milieu MRS est utilisé comme témoin négatif. L’amoxicilline (1mg/ml) est utilisé comme témoin positif. 93 Matériels et Méthodes III-3 Détermination de la nature de l’agent inhibiteur. Les lactobacilles sont connus par leur capacité à produire des substances antibactériennes particulièrement l’acide lactique et les bactériocines. Afin de déterminer la nature de la substance inhibitrice produite, Un certain nombre de tests doit donc être réalisé pour les souches bactériennes lactiques présentant les plus grands halos d’inhibition. La recherche de la nature de l’agent inhibiteur a été réalisée en milieu solide en se basant sur l’élimination d’un constituant au profit de l’autre par la méthode indirecte des puits expliqué précédemment. La lecture des résultats consiste à mesurer le diamètre des halos d’inhibition apparue autour des puits. III-3-1 Inhibition due au peroxyde d’hydrogène Certaines bactéries lactiques produisent du peroxyde d’hydrogène (H2O2) au cours de leur métabolisme, qui est considéré comme un inhibiteur de la croissance bactérienne. Cet agent peut être dégradé par la catalase, présente chez certaines bactéries (Cogan et al., 1981 ; Juillard et al., 1987). Pour détecter l’effet éventuel du peroxyde d’hydrogène sur l’inhibition de H. pylori, les surnageants de Lactobacillus sp. obtenus sont traités par 1mg/ml de catalase (Sigma) (0.2 M tampon phosphate, pH 6.5), filtrés, puis incubée à 37°C pendant 2 heure. Le filtrat est ensuite testé sur H. pylori par la méthode des puits. Les filtrats non traités à la catalase ont été utilisés comme témoin (Simova et al., 2008). III- 3-2 Inhibition due à l’acide lactique L’acide lactique produit par les bactéries lactiques est un facteur majeur dans les inhibitions bactériennes. Ce test a pour but d’étudier l’effet de l’abaissement du pH sur le développement des souches indicatrices (H. pylori). Cette méthode a été réalisée en neutralisant le surnageant des lactobacilles par la soude NaOH 1N de façon à obtenir un pH de 6,5. Le surnageant est ensuite filtré, puis testé vis-à-vis des souches de H. pylori par la méthode de puits (Noonpakdee et al., 2009 ; Allouche et al., 2010). 94 Matériels et Méthodes III-3-3 Inhibition due aux bactériophages Les phages peuvent être l'origine des inhibitions de la croissance bactérienne. Pour détecter une éventuelle activité inhibitrice due à la présence de bactériophages virulents, une portion de la gélose prise dans la zone d'inhibition est découpée avec une pipette Pasteur, puis suspendu dans 1 ml du bouillon MRS contenant 20 µl de chloroforme. Après agitation, on laisse décanter 5 min, puis 0,5 ml du milieu est prélevé, ensuite centrifugé à 6000 trs/mn (pour éliminer les débris cellulaires ou la gélose). 300 µl de surnageant est ajouté à 7 ml de gélose molle de BHI-agar contenant la souche indicatrice (H. pylori). Le mélange est coulé dans une boite de Pétri puis incubé à 48 h à 37°C sous les conditions de la microaérobiose. La présence de plages de lyse indique la présence de phages (Lewis et al., 1991). III- 3-4 Inhibition due aux bactériocines La recherche des bactériocines comme étant substance inhibitrice nécessitent la détermination de la nature protéique de ces substances éventuellement élaborées par les lactobacilles. La sensibilité aux enzymes protéolytiques est un critère principal dans leur caractérisation. Pour ce faire, nous avons utilisé les enzymes protéolytiques suivantes: la pepsine (Sigma), l’alpha-chymotrypsine (Sigma ) et la trypsine (Sigma). Chaque enzyme est dissoute dans du tampon phosphate (0,2 M/L, pH 7.0) et stérilisée par filtration sur filtre millipore de 0,45 µm. Ainsi, 200 ul de filtrat obtenu des lactobacilles est traité par 20 ul d’enzyme à une concentration finale de 1 mg/ml, puis incubé à 37°C pendant 2 heure (Coventry et al., 1997 ; Noonpakdee et al., 2003, Ten brink et al., 1994).. L’action de ce filtrat est testée par la méthode des puits sur le milieu BHI-agar préalablement ensemencé par H. pylori et incubé à 37°C pour 48 h à 72h en microaérobiose (sachet Campy pak). 95 Matériels et Méthodes III-3-5 Effet de la température Les substances antimicrobiennes ont été testées pour leur résistance à la température et la conservation de leur activité vis-à-vis de H. pylori après le traitement thermique. Les filtrats de culture des souches lactiques sont traités par différentes températures à 100°C pendant 10 mn et 120°C pendant 20 mn, Après refroidissement, l’activité des filtrats est vérifiée vis-à-vis de H. pylori par la méthode des puits. Des filtrats non traités sont utilisés comme contrôle (Casla et al., 1996 ; Coventry et al., 1997, Noonpakdee et al., 2003). La levée de l’inhibition désigne la sensibilité de l’agent inhibiteur au traitement thermique effectué. III-4 Mesure de l’acidité titrable L’évaluation de l’acidité produite par les souches de lactobacilles sélectionnées pour leur pouvoir inhibiteur élevé est réalisée par titrimétrie et pH-métrie. Le pH est mesuré à l’aide d’un pH mètre type Orion Research à électrode combinée. Le titrage de l’acidité est effectué selon la méthode Dornic, à l'aide d'une solution de soude NaOH à N/9 et de phénolphtaléine en solution alcoolique à 1% employée comme indicateur. Les souches de lactobacille sont ensemencées dans 10ml de lait écrémé stérile (10% p/v). Après incubation à 30°C pendant 24 h, 1% d’inoculum est transvasé stérilement dans des tubes contenant 10 ml de lait écrémé stérile. La cinétique d’acidification et du pH sont réalisées simultanément aux intervalles de temps réguliers suivants : 0h, 1h, 2, 3h, 4h, 5h, 6h, 7h et 24h. III-4-1 Dosage de l’acidité On prélève 10 ml de lait en le transférant dans une fiole conique de100 ml. On y ajoute cinq gouttes de phénolphtaléine et on verse la soude goutte à goutte jusqu'à obtenir une couleur rose pale persistante. On note alors le volume de la soude en ml utilisé en dixièmes de millilitres, correspondant au degré Dornic. 96 Matériels et Méthodes (Acidité en degré Dornic = n x 10) c'est-à-dire 1 °D correspond à 0,1 g d’acide lactique par litre de lait (0,1 g/l) n est le volume de la solution sodique utilisée pour titrer 10 ml de lait (Guiraud, 1998). III-5 Mise en évidence des inhibitions en milieu liquide Ce test permet d’étudier le comportement des souches indicatrices (H. pylori) en présence de filtrat de la souche lactique inhibitrice (lactobacille) en milieu liquide, et de déterminer également l’effet inhibiteur de l’acide lactique sur la croissance de H. pylori. Dans cette partie expérimentale, nous nous sommes basés sur les résultats obtenus par les tests de la mise en évidence des inhibitions en milieu solide, c'est-à-dire que nous avons retenus dans les cas où l’inhibition a été nettement observée en milieu solide raison pour laquelle la souche Lb. rhamnosus (LBR1) a été sélectionnée et testée vis-à-vis de la souche H. pylori1 (HP1) et H. pylori2 (HP2). En premier temps, la culture de H. pylori suspendue dans le bouillon BHIB est ensemencée avec un volume de 50% de filtrat de Lb. rhamnosus à son pH native (4.5) (Sgouras et al., 2004), et en deuxième temps, la croissance de H. pylori est suivie en présence de l’acide lactique (60 mM) dans le tampon phosphate (PBS) à un pH 3.5 (Midolo et al., 1995 ; Tsai et al., 2004). Les cultures de H. pylori en milieu BHIB ont été utilisées comme contrôle. Après incubation à 37°C sous les conditions de la microaérobiose, la viabilité de H. pylori est évaluée toute les 12 heures pendant 72h par la détermination des cellules viables de H. pylori (CFU) sur le milieu BHI-agar (Sgouras et al., 2004). 97 Matériels et Méthodes III-6 Effet inhibiteur des lactobacilles sur les bactéries pathogènes Les souches lactiques sont également testées pour leur pouvoir inhibiteur à l’égard de certaines bactéries pathogènes, permettant ainsi de déterminer leur spectre d’activité en utilisant la méthode directe précédemment expliquée (Geis et al., 1983). En effet, nous avons testé l’effet inhibiteur des Lactobacillus sp. sélectionnés vis-à-vis des bactéries Gram positive et Gram négative, qui sont représentées dans les espèces suivantes : Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli ATCC 25921, Pseudomonas aeruginosa ATCC 2785, Klebsiella pneumoniae, Salmonella enteritidis, provenant du laboratoire médical du CHU Oran et Bacillus subtilis obtenu du laboratoire de recherche Mascara. Pour cette étude, nous avons suivi les mêmes étapes que celles utilisées dans le cas de la mise en évidence des inhibitions entre les lactobacilles et H. pylori, sauf que les souches pathogènes sont incubées en aérobiose à 37°C pendant 24h. L’inhibition se traduit par la formation d’une zone autour de la souche de lactobacille ensemencée en touche (considérée inhibitrice), témoignant la présence d’une activité antagoniste vis-à-vis des bactéries pathogènes testées (considérées indicatrices). La lecture des résultats consiste à mesurer le diamètre de la zone d’inhibition apparue autour de la colonie de lactobacille. 98 Résultats I-Mise en évidence de H.pylori La démonstration du rôle pathogène de H.pylori dans les maladies gastroduodénales rend la recherche de cette bactérie nécessaire (Bruley des Varannes, 1996). Cette recherche a été réalisée par des tests invasifs, en identifiant la bactérie par un examen anotomopathologique, un examen cytologique et une culture, en exploitant sa production importante de l’uréase par un test rapide à l’urée , ou par la tecchnique moléculaire PCR en temps réel (Lozniewski, 1996; Megraud, 1996a). I-1 Examen cytologique La coloration de Gram du frottis gastrique montre la présence des formes de bacilles souvent incurvées ou spiralées. Elles apparaissent Gram négatif et ont tendance à se trouver nombreuses dans certaines zones du frottis (fig. 31). I-2 Test rapide à l’urée La recherche, directement au niveau de la biopsie, d’une activité uréasique rapide et intense est un argument majeur en faveur de la présence de H. pylori. Le test a l’urée, réalisé à partir de la biopsie gastrique, utilisant le milieu uréeindole donne une réaction positive qui est traduite par un virage de l’indicateur du pH vers le rose (fig. 32). Le virage survient le plus souvent au moins de 20 minutes. Pour le CLO test, il se révèle positif par virage de l’indicateur de sa couleur jaune initiale a une couleur rouge (fig. 33). Le changement de la couleur du milieu est dû à l’alcalinisation du milieu par la transformation de l’urée en ammoniac sous l’influence de l’uréase. Le test à l’urée donne parfois une réaction négative car le nombre de bactéries est trop faible dans le fragment biopsique (il faut un nombre supérieur a 105 dans la biopsie pour faire virer l’indicateur). 98 Résultats H. pylori Fig. 31: Observation microscopique d’une empreinte biopsique après coloration de Gram (x 1000) 1 2 Fig. 32: Test rapide à l’uréase Fig. 33: Test rapide à l’urée en utilisant le CLO test 99 Résultats I-3 Examen anatomopathologique L’observation microscopique des coupes histologiques des biopsies gastriques par l’anatomopathologiste , a montré la présence de bacilles incurvés ou en S dans les cryptes et à la surface de la muqueuse gastrique. Cette observation renseigne également sur l’état de la muqueuse gastrique (fig. 34). I-4 Isolement et identification L’isolement de H. pylori à partir des biopsies gastriques a permis d’obtenir des colonies. Leur identification est basée sur la détermination des caractères morphologiques (macroscopique et microscopique) et biochimiques. I-4-1 Aspect macroscopique La culture de la biopsie gastrique sur les milieux d’isolement a révélé l’apparition de petites colonies, de 1 mm de diamètre. Elles sont grisâtres ou transparentes, luisantes, discrètement bombées, rondes et de contour régulier (fig. 35, 36,37). Cet aspect est rencontré chez H. pylori. I-4-2 Aspect microscopique La coloration de Gram, réalisée a partir des colonies apparues, montre la présence de bactéries Gram négatif. Elles se présentent sous la forme de bacille qui peut être droit, incurvé, en virgule, en forme de C, de V ou de S, aux contours réguliers (fig. 38). Cette morphologie est différente de celle observée sur le frottis de la biopsie. Les bactéries apparaissent plus grosses et moins spiralées. Les bactéries évoluent rapidement au cours des repiquages vers des formes d’aspect coccoïde . 100 Résultats H. pylori Fig. 34 : Examen anatomopathologique de la biopsie gastrique (x 1000) Colonies H. pylori Fig. 35 : Aspect macroscopique de H. pylori sur milieu pylori 101 Résultats colonies H. pylori contaminant Fig. 36: Aspect macroscopique de H. pylori sur milieu au sang non sélectif Fig. 37 : Aspect macroscopique de H. pylori sur milieu au sang après purification 102 Résultats Fig. 38 : Observation microscopique de H.pylori après coloration de Gram (x 1000) 103 Résultats I-4-3 Etat frais Les bactéries examinées à l’état frais apparaissent très mobiles par des mouvements spiralés et de rotation. I-4-4 Etude biochimique L’identification est complétée par la recherche des caractères biochimiques (catalase, oxydase et uréase). Nous avons noté la présence d’une oxydase, d’une catalase et d’une uréase très puissantes (fortement positive). Les résultats sont représentés dans le tableau 9. La positivité de ces trois tests confirme qu’il s’agit bien de H. pylori. Sur la base des résultats obtenus, nous avons pu isoler et identifier trois souches de H. pylori (Hp1, Hp2, Hp3). Tableau 9 : Caractérisation biochimique des différentes souches de H.pylori isolées des biopsies gastriques (Hp1, Hp2, Hp3) Souches Uréase Catalase Oxydase Hp1 + + + Hp2 + + + Hp3 + + + 104 Résultats I-5 Antibiogramme L’étude de la sensibilité des souches de H.pylori testés aux antibiotiques habituellement utilisés dans le choix thérapeutique, par la technique du E-test et la méthode de diffusion (disque) a montré l’excellente activité de la plupart des antibiotiques utilisés vis-à-vis de H. pylori. En effet, toute les souches de H.pylori (HP1, HP2, HP3) sont sensible à la clarithromycine (fig. 39) et l’amoxicilline (fig. 40) dont la concentration Minimale Inhibitrice CMI est inférieure à 0.5 mg/et 1 mg/l respectivement, De même, les souches testées ont montré une sensibilité à la tétracyline, à la rifampicine et levofloxacine dont le diamètre de la zone d’inhibition est supérieur ou égale à 19 mm (fig. 42). La résistance à la levofloxacine n’a été observée que chez la souche HP1 (DI inférieur à 17 mm). Toutefois, les souches de H. pylori (HP1, HP3) ont montré une résistance remarquable au métronidazole ou la CMI est supérieur à 8mg/l alors que la souche HP2 est sensible à l’antibiotique (fig. 41). Les résultats cités sont illustrés dans les tableaux 10 et 11 105 Résultats Fig. 39: Sensibilité de H. pylori à la clarithromycine Fig. 40: Sensibilité de H. pylori à l’amoxicilline 106 Résultats Fig. 41: Sensibilité de H. pylori au métronidazole 1 2 3 1 : Tétracycline 2 : Rivampin 3 : Levofloxacin Fig. 42: Sensibilité de H. pylori à la Tétracycline, Rivampin et Levofloxacin par la méthode de diffusion 107 Résultats Tableau 10: Détermination de la CMI (E-test), et du diamètre de la zone d’inhibition (méthode de disques) des souches de H. pylori Souches Abréviation HP1 HP2 HP3 Antibiotiques Clarithromycine (mg/l) CH 0,016 0,19 0,023 Amoxicilline (mg/l) AMX 0,25 0,125 0,047 Metronidazole (mg/l) MZ 32 4 64 Tétracycline (mm) TE 38 46 32 Rivampin (mm) RA 22 26 32 LVX 06 26 32 Levofloxacin(mm) Tableau 11: Sensibilité et résistance des souches de H. pylori vis à vis des antibiotiques Souches Abréviation HP1 HP2 HP3 CH S S S Amoxicilline (mg/l) AMX S S S Metronidazole (mg/l) MZ R S R Tétracycline (mm) TE S S S Rivampin (mm) RA S S S LVX R S S Antibiotiques Clarithromycine (mg/l) Levofloxacin(mm) S : sensible; R : resistant 108 Résultats I-6 Mise en évidence de H. pylori par la PCR en temps réel La technique moléculaire de la PCR en temps réel permet de façon fiable de détecter à la fois H. pylori et d’éventuelle mutation de résistance à la clarithromycine à partir des biopsies gastriques ou de la colonie (PCRcolonie). Le système de la PCR en temps réel est basé sur l’émission de la fluorescence à partir des sondes (marqueur) fluorescentes spécifiques. Des thermocycleurs particulier sont nécessaires pour la lecture continue de la fluorescence émise. Les résultats obtenus de la détection de H. pylori par ce type de PCR sont représentés graphiquement sous formes de courbes. Chaque courbe correspond à un échantillon. La lecture de la PCR en temps réel correspond à la variation de la fluorescence en fonction de la température. Cette température appelée température de fusion (Tm) est représenté par un pic unique sur la dérivé. Les courbes de fusion obtenues sont comparées par celles du témoin négatif (absence d’ADN) et des témoins positifs comprenant ADN sauvage, ADN muté en position A21422C (dite position C) et ADN muté en position A2412/2143G (dite position G) qui correspond à la résistance à la clarithromycine (fig. 43). En effet, les souches isolées de H. pylori (HP1, HP2, HP3), traitées par la technique de la PCR en temps réel ont révélé une conformité à l’Helicobacter pylori (ADN positif) où la température de fusion (Tm) correspond à celle d’ADN sauvage (témoin positif) (fig. 44). Il s’agit donc de souche de H. pylori dite sauvage. Ces souches de H. pylori testées ne présentent donc aucune mutation de résistance à la clarithromycine (position G), ni mutation en position C. Alors que la souche de référence possède un ADN muté resistant à la clarithromycine (séquence d’ADN muté en position A2412/2143G ou dite en position G) où la Tm est moins faible par rapport à celle de l’ADN sauvage (fig. 44) 109 Résultats . Témoin négatif (T. NEG) G (sequence mutée en position A 2412/2143G) C (sequence mutée en position 2142C) WT (séquence d’ADN sauvage) Fig. 43 : Témoins (négatif et positifs) utilisés dans la PCR en temps réel 110 Résultats : souche de reference muté en position G (resistance à la clarithromycine) souche HP1 sauvage (WT) souche HP2 sauvage (WT) souche HP3 sauvage (WT) Fig. 44 : Cas positif de la PCR à partir des culture de H. pylori testés et la souche de référence 111 Résultats Quant aux échantillons des biopsies gastriques (cinq choisis), ayant montré une absence de H. pylori par la culture, la PCR en temps réel a également révélé l’absence de H. pylori dans les trois biopsies gastriques (fig. 45), conformémant au résultats de la culture (négatif). Tandis que cette technique moléculaire a detecté la presence des souches de H. pylori dite sauvage (ADN positif sauvage) dans les deux autres biopsies gastriques testées ayant montré une negativité de H. pylori par la culture (fig. 46). On peut donc constater que la culture peut parfois donner des resultats faussenent négatif en raison de sa extreme sensibilité et que la PCR reste la technique la plus fiable pour la mise en evidence de H. pylori à partir des biopsies gastriques. 112 Résultats Fig. 45: Cas négatif de la PCR des 3 biopsies gastriques 113 Résultats biopsie 4 (HP sauvage WT) biopsie 5 (HP sauvage WT) Fig. 46 : Cas positif de la PCR à partir de deux biopsies gastriques 114 Résultats II Isolement et identification des lactobacilles L’isolement des lactobacilles à partir du lait cru de chèvre nous a permis d’isoler 42 souches de lactobacilles. Ces isolats ont été identifiés au stade du genre et espèce voire sous espèce dans certains cas en se basant sur leur morphologie cellulaire, et leur caractères biochimiques et physiologiques (tableau12). En effet, nous avons procédé en premier lieu à une pré-identification des colonies apparues sur le milieu MRS sur la base de leur caractère macrospique, microscopique, ainsi que le test de la catalase. Tous les isolats Gram positif, de forme bacillaire, ne possédant pas de catalase sont retenues et présumées de lactobacilles. II.1 Examen morphologique L’étude macroscopique des cultures permet de décrire l'aspect des colonies obtenues sur milieu MRS (forme, taille, couleur) et de retrouver les critères relatifs aux colonies de lactobacilles. Ces dernières sont de petite taille d'environ 1mm de diamètre, de couleur blanchâtre à crémeuse, de forme circulaire et régulière avec une surface lisse (Fig. 47). L’observation microscopique après la coloration de Gram révèle la présence de bactéries Gram positive, de forme bacillaire, plus ou moins longue, isolées, en paires, ou en chaînettes typiques des lactobacilles (Fig. 48). II.2 Caractères physiologiques et biochimiques Les résultats des tests physiologiques et biochimiques permettent de classer les isolats dans le genre de lactobacille. 115 Résultats Tableau 12: Code des espèces de lactobacilles isolées à partir du lait de chèvre Code des Nom des espèces espèces LBDB Lactobacillus delbrueckii sp. bulgaricus LBDL Lactobacillus delbrueckii sp. lactis LBH Lactobacillus helveticus LBS Lactobacillus salivarius LBP Lactobacillus plantarum LBR Lactobacillus rhamnosus LBCC Lactobacillus casei sp. casei LBCR Lactobacillus casei sp. rhamnosus LBPP Lactobacillus paracasei sp. paracasei LBPS Lactobacillus pentosus LBB Lactobacillus brevis LBF Lactobacillus fermentum 116 Résultats Fig. 47: Aspect macroscopique des colonies de lactobacilles sur milieu MRS Fig. 48 : Aspects microscopiques des lactobacilles après coloration de Gram (x 1000) 117 Résultats Le premier test biochimique effectué chez les lactobacilles permettant son appartenance au groupe de bactéries lactiques est celui de la catalase. Tous les isolats de lactobacilles sont dépourvus de catalase, caractère connu chez les bactéries lactiques mais ils peuvent produire une pseudocatalase quand le milieu contient une concentration élevée de glucose (Carr et al., 2002). Le test du type fermentaire nous a également permis de différencier les souches homofermentaires des souches hétérofermentaires. Or, nous avons pu isoler 06 lactobacilles hétérofermentaires et 36 lactobacilles homofermentaires. La présence de gaz dans la cloche de Durham indique un métabolisme hétérofermentaire, alors que le test de croissance à différentes températures a classé les souches de lactobacilles isolées en bactéries thermophiles pouvant croître à 45°C et non pas à 15°C, et des bactéries mésophiles ne pouvant pas pousser à 45°C mais croitre à 15°C. De plus, l’hydrolyse de l’arginine est un caractère connu chez les lactobacilles. Certaines espèces de Lactobacillus sp. possèdent l’enzyme arginine dihydrolase (ADH) qui en dégradant l’arginine produisent l’ammoniac (Hugenholtz et al., 1993, Mannu et al., 2000). D’autre part, l’hydrolyse de l’esculine par les lactobacilles se traduit par le noircissement du milieu gélosé à l’esculine, indiquant la libération de l’esculétine. Le métabolisme du citrate, sucre fermentescible par les lactobacilles est en relation étroite avec l’activité aromatique. La détection de cette propriété sur milieu KMK (Kemper et Mckay., 1980) a montré la capacité de certaines souches de Lactobacillus sp. à utiliser le citrate (fig. 49). La figure 50 rassemble certains tests biochimiques préliminaires pour l’identification des lactobacilles. 118 Résultats 1 Citrate - 4 2 Citrate + 3 1 : Lb. helveticus; 2 : Lb. brevis; 3 : Lb. plantarum; 4: Lb. rhamnosus Fig. 49: Utilisation du citrate sur milieu Kempler et Mc Kay (KMK) 1 2 1 2 1 2 2 1 : témoin 2 : test A 1 2 1 2 1 2 1 : témoin 2 : test B Fig. 50: tests biochimiques préliminaires des lactobacilles (type fermentaire, test ADH, test esculine) 119 A : lactobacilles hétérofermentaire (Lb. brevis) B : lactobacilles homofermentaire (Lb. plantarum) Résultats Sur la base de différentes températures de croissance, de l’hydrolyse de l’arginine et du type fermentaire, les lactobacilles isolés sont classés selon Carr et al. (2002) en trois groupes (I, II et III) qui représentent respectivement les bactéries homofermentaires thermophiles, homofermentaires mésophiles et hétérofermentaires mésophiles. Ces dernières font partie du groupe Betabacterium, les homofermentaires thermophiles celui de Thermobacterium alors que le groupe Streptobacterium renferme les homofermentaires mésophiles (Tableau. 13). Or, nous avons révélé la prédominance des lactobacilles du groupe II (19 souches) ayant un taux de 45.23% parmi les lactobacilles isolées suivi par les lactobacilles du groupe I (17 souches) avec un taux de 40.47 %, et enfin les lactobacilles du groupe III (6 souches) avec un taux de 14.28 % (fig. 51). L’emploi des tests cités ci-dessus nous a permis de faire une préidentification des lactobacilles, qui sont ensuite identifiés au stade de l’espèce par l’étude de leur profil fermentaire en utilisant 14 sucres (tableau 14). Cette identification est faite en confrontant les profils obtenus des isolats avec ceux des souches de référence trouvés dans la clé d'identification de Bergey (Lopez et Mayo, 1994; Mathara et al., 2004; Lee et al., 2006). La détermination des propriétés fermentaires a été confirmée par l’emploi de la galerie API 50 CHL notamment chez les souches de lactobacilles (tableau 15) (fig. 52) sélectionnés pour leur activité antimicrobienne vis-à-vis de H. pylori comme on le verra ultérieurement. 120 Résultats Tableau 13 : Caractéristiques des lactobacilles isolées Souches Co2 du glucose LBDB1 LBDB2 LBDB3 LBDB4 LBDB5 LBDB6 + + + + + + LBDB7 LBDL1 LBDL2 LBDL3 LBDL4 LBH1 LBH2 LBH3 LBH4 LBS1 LBS2 LBP1 LBP2 LBP3 LBP4 LBP5 LBR1 LBR2 LBR3 LBCC1 LBCC2 LBCC3 LBCC4 LBCR1 LBCR2 LBCR3 LBPP1 LBPP2 LBPS1 LBPS2 LBB1 LBB2 LBB3 LBB4 LBF1 LBF2 15°C 45 °C Hydrolyse Arginine + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Hydrolyse esculine Hydrolyse citrate Pré-identification + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + + + - Lactobacillus (groupe I) 121 THERMOBACTERIUM Lactobacillus (groupe II) STREPTOBACTERIUM Lactobacillus (groupe III) BETABACTERIUM Résultats 122 Résultats Tableau 14: Profils fermentaires des lactobacilles isolés sucre soucheLBF1 LBF2 LBDB1 LBDB2 LBDB3 LBDB4 LBDB5 LBDB6 LBDB7 LBDL1 LBDL2 LBDL3 LBDL4 LBH1 LBH2 LBH3 LBH4 LBS1 LBS2 LBP1 LBP2 LBP3 LBP4 LBP5 LBR1 LBR2 LBR3 LBCC1 LBCC2 LBCC3 LBCC4 LBCR1 LBCR2 LBCR3 LBPP1 LBPP2 LBPS1 LBPS2 LBB1 LBB2 LBB3 LBB4 1-- 2-- 3+ + - 4+ + + 5-- 6-- 7+ +- 8+ +- + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 123 9-- 10 + 11 + 12 + 13 + --+ +- + - + - + - + - + - + + + + + + + + + + - + + + + + + + + - + + + + - + + + + - + + + + - + + + + - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - 14 -- Résultats Tableau 15: Profils fermentaires des lactobacilles par6:galerie API 50 1: Arabinose, 2: Cellobiose, 3: Gluconate; 4: Lactose, 5: isolés Mannitol, Mélezitose, 7: CHL Mélibiose, 8: Raffinose, 9 : Rhamnose, 10: Ribose, 11: Sucrose, 12 : Tréhalose, , 13: Sorbitol, 14: Xylose. ; +: réaction positive, -: réaction négative, sucre 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 souche LBDB LBH LBS LBP LBR LBCC LBCR LBB + + + + + + v - + + + v + + + + + + v + + + + + v + - + + + + + + + + + + + + + + + + V + + + + + - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + + + - v - 124 Résultats 37 38 39 40 41 - - - + + - + + - + - + - + - 42 43 44 45 46 47 48 49 - - - + - + - + + - + + - + - Sucres: 0: CONTROL; 1: GLYcerol; 2: ERYthritol; 3: D ARAbinose; 4: L ARAbinose; 5: RIBose; 6: D XYLose; 7 L XYLose; 8 ADOnitol; 9 Methyl-D-Xyloside; 10 GALactose; 11 GLUcose; 12 FRUctose ; 13 MaNnosE ; 14 SorBosE; 15 RHAmnose; 16 DULcitol; 17 INOsitol; 18 MANnitol; 19 SORbitol; 20 -Methyl-D-Mannoside; 21 -Methyl-D-Glucoside; 22 N-Acetyl-Glucosamine; 23 AMYgdalin; 24 ARButin; 25 ESCulin; 26 SALicin; 27 CELlobiose; 28 MALtose; 29 LACtose; 30 MELibiose; 31 Sucrose; 32 TREhalose; 33 INUlin; 34 MeLeZitose; 35 RAFfinose; 36 Starch; 37 GLYcoGen; 38 XyLiTol; 39 GENtiobiose; 40: D TURanose; 41: D LYXose ; 42: D TAGatose ; 43 D FUCose ; 44 L FUCose; 45 D ARabitoL; 46: L ARabitoL; 47: GlucoNaTe ; 48: 2-Keto-Gluconate; 49: 5-Keto-Gluconate. Souches: LBDB : Lb. delbrueckii sp. bulgaricus ; LBH: Lb. helveticus ; LBS : Lb. salivarius ; LBP: Lb. plantarum ; LBR : Lb. rhamnosus ; LBCC : Lb. casei sp. casei ; LBCR : Lb. casei sp. rhamnosus ; LBB: Lb. brevis. 125 Résultats A B Fig. 52 : Profil fermentaire par le système API 50 CHL chez Lb. rhamnosus (A), Lb. plantarum (B) II-3 Répartition des espèces de lactobacille 126 Résultats Les résultats obtenus lors de la fermentation des carbohydrates des lactobacilles permettent de les répartir en 10 espèces (fig. ). Le groupe 1 (groupe des lactobacilles thermophiles homofermentaires) est constitué de 11 isolats de Lactobacillus delbrueckii dont 07 isolats de Lactobacillus delbrueckii sp. bulgaricus, espèce prédominante dans ce groupe avec un taux de 17%, et 04 isolats de Lactobacillus delbrueckii sp. lactis (9.5%), suivie par Lactobacillus helveticus représentés par 04 isolats (9.5%) et Lactobacillus salivarius avec deux isolats (5%). Ces espèces sont caractérisées par la transformation des hexoses exclusivement par voie homofermentaire en produisant du lactate, ils ne fermentent ni les pentose ni les gluconate. Ce sont des thermophiles, qui se développent à 45° C mais pas à 15°C. Leur température de croissance optimale est de 42°C. Les lactobacilles du groupe II (groupe des lactobacilles mésophiles hétérofermentaires facultatifs) sont représentés en majorité par Lactobacillus plantarum (05 souches) (12%), puis Lactobacillus casei dont 04 isolats de Lactobacillus casei sp. casei (9.5%) et 03 isolats de Lactobacillus casei sp. rahmnosus (7%), suivi par Lactobacillus rhamnosus (03 souches) (7%). Ces bactéries métabolisent le rhamnose. Les Lactobacillus paracasei subsp. paracasei (02 isolats) et Lb. pentosus (02 isolats) sont également rattachés dans ce groupe avec un taux de 5% respectivement. Ces espèces fermentent les hexoses en produisant du lactate par voie homofermentaire et les pentoses par voie hétérofermentaire. Ce sont des mésophiles, qui se développent à 15 °C. Leur température optimale de croissance se situe entre 30°C et 37°C. Quant aux Lactobacillus brevis (04 isolats) (9.5 %) et Lactobacillus fermentum, (2 isolats) (5%), ils font partie du groupe III (groupe des lactobacilles hétérofermentaires stricts). Les bactéries appartenant à ce groupe fermentent les pentoses et les hexoses par voie hétérofermentaire en lactate, en acétate et/ou en éthanol et CO2. Leur température de croissance diffère selon les espèces, elle varie de 30 à 45°C. 127 Résultats Fig. 53 : Répartition des espèces de lactobacilles isolées du lait de chèvre 128 Résultats III Production des substances antimicrobiennes L'interaction entre les Lactobacilles sp. et H. pylori constitue un critère important de sélection des souches lactiques, utilisées comme probiotique pour le traitement de l’infection de H. pylori. Cette partie concerne les méthodes permettant de mettre en évidence l’antagonisme sur milieu solide et liquide qui pourrait exister entre les souches de Lactobacillus sp. isolées du lait cru de chèvre et les souches pathogènes de H. pylori isolées des biopsies gastriques. La détermination de la nature de l’agent inhibiteur a également été recherchée. III-1 Mise en évidence des inhibitions entre les Lactobacillus sp. et H. pylori L’étude de l’activité antimicrobienne des Lactobacillus sp. sur la croissance de H. pylori a été effectuée par la méthode directe de diffusion sur milieu solide (Geis et al., 1983). Les souches de lactobacilles ont été testées vis-à-vis de H. pylori où une souche est considérée comme inhibitrice (lactobacille) et l’autre indicatrice (H. pylori). L’inhibition se traduit par la formation d’une zone autour de la souche ensemencée en touche (lactobacille), témoignant ainsi la présence d’une activité antagoniste vis-à-vis de H. pylori. La lecture des résultats consiste à mesurer le diamètre de cette zone d’inhibition apparue autour de la colonie de lactobacille. Les 42 souches de lactobacilles isolées ainsi que la souche de référence Lb. delbrueckii sp. bulgaricus CNRZ 449 (LBDB CNRZ) ont été testées pour leur activité antimicrobienne vis à vis de H. pylori isolés (HP1, HP2, HP3) et les souches de références H. pylori J99 (HP4) et H. pylori 26695 (HP5). Les lactobacilles isolés testés sont représentés par les espèces suivantes: Lb. plantarum; Lb. rhamnosus; Lb. casei; Lb. paracasei; Lb. pentosus; Lb. salivarius; Lb. delbrueckii; Lb. helveticus; Lb brevis et Lb. fermentum. 129 Résultats L’ensemble des inhibitions est illustré dans les tableaux (16, 17) et dans les figures 54, 55, 56 montrant des spectres d’activité variable des lactobacilles. En effet, d’après les résultats obtenus, il en ressort que la plupart des souches de lactobacilles prouvent une activité antimicrobienne contre H. pylori testés, démontrée par l'apparition de zone d’inhibition avec des diamètres variés. Or, nous avons constaté que les espèces Lb. delbrueckii sp. bulgaricus, Lb. plantarum, Lb.rhamnosus, Lb brevis, Lb. helveticus, Lb salivarius, Lb casei (Lb. casei sp. casei et Lb casei sp. rhamnosus) ont montré un effet inhibiteur élevé avec une zone d’inhibition importante dont le diamètre varie d’une souche à l’autre. C’est le cas par exemple de l’espèce Lb. delbrucekii sp. bulgaricus ou les souches (LBDB1, LBDB3, LBDB5) ont révélé une activité antagoniste remarquable vis-à-vis de la souche H. pylori2 (HP2) dont le diamètre d’inhibition dépasse 14 mm (fig. 54) et des diamètres de 10 mm et 12 mm pour les souches LBDB3, et LBDB5 vis-à-vis de H. pylori1 (HP1). En revanche, les souches de Lb. plantarum (LBP1, LBP3) présentent une activité inhibitrice contre la souche H. pylori2 (HP2) avec un diamètre d’inhibition de 12mm et 9mm respectivement (fig. 54) et un diamètre de 8 mm et 10 mm pour la souche LBP3 et LBP4 vis-à-vis de HP1. De même, les souches de Lb. rhamnosus (LBR1, LBR2) ont prouvé une inhibition importante contre H. pylori2 avec des diamètres de 19,83 et 10 mm respectivement (fig. 54). De plus, les souches de Lb. salivarius (LBS1, LBS2) (fig. 55) et les souches de Lb. helveticus (LBH1, LBH2) (fig. 55) ainsi que Lb. brevis (fig. 55) ont également révélé une activité antagoniste contre HP2 ou les diamètres des zones d’inhibition oscillent entre 7 et 11 mm. 130 Résultats 1: LBDB1 1 2: LBDB3 4 5 3: LBDB5 2 3 4: LBDB6 5: LBDB7 1 : LBP1 1 2 : LBP3 2 3 : LBP4 4 4 : LBP5 3 3 1 : LBR1 1 4 2 : LBR2 2 3 : LBR3 4 : LBP2 3 Fig. 54: Mise en évidence de l’effet inhibiteur de Lactobacillus sp. sur la croissance de H. pylori (HP2) ensemencé dans la masse 131 Résultats 1 1 : LBPP1 4 2 2 : LBPP2 3 : LBS1 3 4 : LBS2 1 : LBH1 2 2 : LBH2 1 3 3 : LBH3 4 : LBH4 4 1 : LBB1 1 2 2 : LBB2 3 : LBB3 4 3 4 : LBB4 Fig. 55 : Mise en évidence de l’effet inhibiteur de Lactobacillus sp. sur H. pylori (suite) 132 Résultats De plus, l’espèce Lb. delbruekii sp. lactis (LBDL) montre certaine inhibition mais qui varie d’une souche à l’autre (fig. 56). Cependant, certaines souches n’ont présenté qu’un faible pouvoir inhibiteur, voire nul vis-à-vis des souches de H. pylori. En effet, nous avons enregistré des zones d’inhibition avec des diamètres ne dépassant pas 3 mm, parfois nul expliquant ainsi une absence totale de cette inhibition. C’est le cas Lb. pentosus (LBPS) et Lb. fermentum (LBF) (fig. 56). Le tableau 7 rassemble les résultats de l’activité antimicrobienne des souches de lactobacilles vis-à-vis de H. pylori. D’après les résultats obtenus, nous avons remarqué que la souche Lb. rhamnosus (LBR1) a prouvé un pouvoir inhibiteur le plus élevé, et représente l’espèce la plus inhibitrice pour la majorité des souches de H. pylori testés. Quant aux souches de H. pylori testées, nous avons constaté que la souche H. pylori 2 (HP2) est la souche la plus inhibée et la plus sensible au pouvoir inhibiteur des lactobacilles testés. Les résultats obtenus ont parfois montré des différences de comportement des souches lactiques d’une même espèce vis-à-vis des souches pathogènes de H. pylori comme par exemple le cas de la souche LBP4 qui présente un pouvoir inhibiteur contre la souche HP1, alors que la souche LBP5 ne montre aucune inhibition vis-à-vis de HP1 ou le diamètre d’inhibition est nul. Le tableau 16 et 17 récapitulent les résultats de l’activité antimicrobienne des lactobacilles sur H. pylori. 133 Résultats 1 1 : LBDL1 2 : LBDL2 2 4 3 : LBDL3 4 : LBDL4 3 1 1 : LBPS1 2 2 : LBPS2 3 : LBF1 3 4 : LBF2 4 1 1: LBDB CNRZ 2: LBCC2 2 4 3: LBCC3 4: LBCC4 3 Fig. 56 : Mise en évidence de l’effet inhibiteur de Lactobacillus sp. sur H. pylori 134 Résultats Tableau 16: Activité antimicrobienne des Lactobacillus sp. sur H. pylori Souches Lb. delbrueckii sp. bulgaricus Lb. delbrukuii code pH HP1 HP2 HP3 HP4 HP5 LBDB1 4.04 5 14.5 7 10 6 LBDB2 4.75 2.1 2.5 3 1.5 2 LBDB3 4.95 10 15.9 2.5 1.9 6 LBDB4 5.20 0 5 4.1 5 4.5 LBDB5 5.45 12 12 3.4 7 4 LBDB6 4.57 4 10 0 5 0 LBDB7 4.18 4.2 10 5 3.5 5.5 LBDL1 4.27 3 3 0 4.5 2.1 LBDL2 3.97 0 0 0 5 3.1 LBDL3 5.36 0 0 2.4 0 0 LBDL4 4.94 2.5 3 1.5 3 2.8 LBH1 4.24 5 7.1 6 2.3 0 LBH2 4.03 3.2 8 7 3 4 LBH3 4.9 3 2.9 2.5 0 3 LBH4 4.5 0 0 3 0 0 LBS1 5.21 4.1 11 4.2 4.5 3.2 LBS2 4.83 5,8 10.3 3.1 4.4 4.1 LBP1 4.99 4.5 12 5 6 5.1 LBP2 5.98 3 2.8 6.4 3 2.5 LBP3 4.69 8.1 9 1.5 5 4.3 LBP4 4.50 1.2 3 0 3.5 0 LBP5 5.90 0 4 2.4 0 0 sp. lactis Lb. helveticus Lb. salivarius Lb. plantarum 135 Résultats LBR1 4.95 12 19.2 5 10 9.1 LBR2 5.90 2.1 10 2.8 3 4.1 LBR3 4.50 1.9 2.8 2.5 0 3 LBCC1 4.76 2.1 8 3.5 5 4.2 Lb. casei sp. LBCC2 casei LBCC3 5.88 0 4 7.5 2 5 6.62 3.5 0 2.4 2 1.9 LBCC4 6.13 0 3 2.6 0 0 LBCR1 3.73 5.5 10 3 6 4.5 Lb. casei sp. LBCR2 rhamnosus 4.27 2.9 9 2.4 2 3 LBCR3 4.50 0 3 6.5 0 2.4 LBB1 4.99 3 5.2 2.9 3 3 LBB2 5.98 6 4 0 2 4.5 LBB3 4.91 3 2.5 0 0 0 LBB4 5.88 0 3 3.8 3.5 0 LBF1 6.53 0 0 0 0 0 LBF2 4.12 1.5 0 0 0 0 LBPS1 6.23 0 0 0 1.5 2 LBPS2 6.53 0 0 0 0 0 LBPP1 Lb. paracasei sp. paracasei 3.86 2 3 2.4 2.5 0 4.1 1.2 2 0 0 0 4.04 4.5 6.2 2.5 6 4.1 Lb. rhamnosus Lb. brevis Lb. fermentum Lb. pentosus LBPP2 LBDB Lb. delbruekii sp. 449 bulgaricus CNRZ 449 136 Résultats Tableau 17: Inhibition de H. pylori par les souches de lactobacilles H. pylori HP1 HP2 HP3 HP4 HP5 LBDB1 ++ ++ ++ ++ ++ LBDB2 ++ ++ ++ + + Lactobacilles LBDB3 ++ ++ ++ + ++ LBDB4 - ++ ++ ++ ++ LBDB5 ++ ++ ++ ++ ++ LBDB6 ++ ++ - ++ - LBDB7 ++ ++ ++ ++ ++ LBDL1 ++ ++ - ++ ++ LBDL2 - - - ++ ++ LBDL3 - - ++ - - LBDL4 ++ ++ + ++ ++ LBH1 ++ ++ ++ ++ - LBH2 ++ ++ ++ ++ ++ LBH3 ++ ++ ++ - ++ LBH4 - ++ ++ ++ - LBP1 ++ ++ ++ ++ ++ LBP2 ++ ++ ++ ++ ++ LBP3 ++ ++ + ++ ++ LBP4 + ++ - ++ - LBP5 - ++ ++ - - LBR1 ++ ++ ++ ++ ++ LBR2 ++ ++ ++ ++ ++ LBR3 + ++ ++ - ++ LBCC1 ++ ++ ++ ++ ++ LBCC2 - ++ ++ + ++ LBCC3 ++ - ++ + + LBCC4 - ++ ++ ++ - LBCR1 ++ ++ ++ ++ ++ LBCR2 + ++ ++ ++ ++ LBCR3 - ++ ++ - ++ LBB1 ++ ++ ++ ++ ++ LBB2 ++ ++ - + ++ LBB3 ++ ++ - - - LBB4 - ++ ++ ++ - LBF1 - - - - - LBF2 + - - - - LBS1 ++ ++ ++ ++ ++ LBS2 ++ ++ ++ ++ ++ LBPS1 - - - + + LBPS2 - - - - - LBDB CNRZ ++ ++ ++ ++ ++ + : Halo inférieur 2mm; ++: Halo supérieur 2mm; -: pas d’inhibition 137 Résultats Ce pouvoir inhibiteur, exercés par les lactobacilles, qui diffère d’une souche à l’autre reflète la capacité de ses souches lactiques de produire des substances antimicrobiennes inhibant la croissance de la souche pathogène H. pylori. En effet, L’effet inhibiteur des lactobacilles peut avoir plusieurs origines parmi lesquelles, nous pouvons mentionner la production d’acides organiques, de peroxyde d’hydrogène, de bactériocines et les phages (Moreno et al., 1999; Navarro et al., 2000; Rodriguez et al., 2002; Maldonado et al., 2003; Todorov et Dicks, 2005). Afin de déterminer la nature de l'agent inhibiteur, nous avons sélectionné les souches lactiques fortement inhibitrices (ayant une zone d’inhibition élevée) parmi les 43 souches de lactobacilles étudiées, et testées leur pouvoir acidifiant. Le choix et la sélection de 14 souches de lactobacilles a donc été réparti comme suit : Lb. delbrueckii sp. bulgaricus (LBDB1, LBDB3, LBDB5), Lb. plantarum (LBP1, LBP3), Lb.rhamnosus (LBR1, LBR2), Lb brevis (LBB1), Lb. helveticus (LBH1, LBH2), Lb salivarius (LBS1, LBS2), Lb casei sp. casei (LBCC1), Lb casei sp. rhamnosus (LBCR1). Ce choix est basé sur les travaux de Hosono et al., (1977) qui établit que le tri doit se faire à partir des souches qui présentent le plus grand effet inhibiteur. 138 Résultats III-2 Pouvoir acidifiant L’évaluation du pouvoir acidifiant des lactobacilles a été réalisée par la mesure du degré Dornic, qui correspond à la quantité d’acide lactique produite. Les résultats obtenus ont révélé que la majorité des 14 souches de lactobacilles étudiées ont un pouvoir acidifiant important, qui diffère selon l’espèce et même au sein de la même espèce. Effectivement, La souche Lb. rhamnosus (LBR1) a montré une activité acidifiante plus élevée, qui atteint 69°D en 24h, suivi par les souches Lb. delbrueckii sp. bulgaricus (LBDB1, LBDB3) et Lb. plantarum (LBP1) dont le taux d’acidité est de 65°D. De même, les souches LBR2, LBP3, LBS1, LBS2, LBDB5 ont présenté un pouvoir acidifiant important, qui varie entre 60 et 64°D après 24 d’incubation. Quant aux souches de Lb. helveticus (LBH1, LBH2), Lb. brevis (LBB1), ainsi que l’espèce Lb. casei (LBCR1, LBCC1) ont montré des taux d’acidification moyen qui varient entre 52 et 59 °D en 24 h. Les résultats de l’acidité sont illustrés dans les figures 57, 58, 59. En parallèle, le suivit de la variation du pH montre que La souche Lb. rhamnosus 1 (LBR1) a baissé le pH jusqu'à 4.2 en 24h, suivi par la souche Lb. delbruecki subsp. bulgaricus (LBDB1, LBDB3) ainsi que Lb. plantarum (LBP1) dont le pH a atteint 4.4. Quant aux souches LBR2, LBP3, LBDB5, LBS1, LBS2, les valeurs du pH varient de 4,5 à 4,8 alors que les valeurs du pH obtenues par les souches LBH1, LBH2, LBB1, LBCR1, LBCC1 sont plus élevées par rapport à celles des autres souches, compris entre 5.4 et 5.8 après 24 h d’incubation (fig. 57,58,59). Par conséquent, nous avons remarqué que la baisse du pH dans le milieu est en relation étroite avec le pouvoir acidifiant exercé par les souches de lactobacilles. D’après les résultats obtenus, nous avons constaté que les souches de lactobacilles retenues pour leur pouvoir inhibiteur face au H. pylori, possèdent dans l’ensemble un pouvoir acidifiant important. De plus, la souche Lb. rhamnosus (LBR1) s’est avérée la plus performante non seulement pour son pouvoir antibactérien, mais également pour son pouvoir acidifiant. 139 Résultats Fig. 57 : Evolution de l’acidité et du pH en fonction du temps chez LBCR1, LBCC1, LBH1, LBH2, LBB1. 140 Résultats 82 Résultats Fig. 58: Evolution de l’acidité et du pH en fonction du temps chez LBP1, LBP3, LBS1, LBS2. 141 Résultats Fig. 59 : Evolution de l’acidité et du pH en fonction du temps chez LBR1, LBR2, LBDB1, LBDB3, LBDB5. 142 Résultats III-3 Détermination de l’agent inhibiteur : L’effet inhibiteur des lactobacilles sur la croissance de H. pylori pourrait être principalement dû à deux facteurs. Le premier est la production des acides organiques essentiellement l’acide lactique, un des caractéristiques connu chez les lactobacilles, alors que le deuxième facteur est la production de substance protéique inhibitrice appelée bactériocine (Larsen et al., 1993; Anderssen et al., 1998; Oyetayo et al., 2003; Avila et al., 2005). De plus, d’autres facteurs tels que la production de peroxyde d’hydrogène et les phages pourraient également être responsables de cette inhibition. Pour cela, certains tests s’avèrent nécessaires, permettant de déterminer le ou les facteurs impliqués dans cet antagonisme. Pour la recherche de la nature de l’agent inhibiteur sur milieu solide, nous avons testé les 14 souches de lactobacilles sélectionné pour leur pouvoir inhibiteur élevé précedemment mentionnés (Lb. delbrueckii sp. bulgaricus (LBDB 1, LBD3, LBD5), Lb. plantarum (LBP1, LBP3), Lb. rhamnosus (LBR1, LBR2), Lb brevis (LBB1), Lb. helveticus (LBH1, LBH2), Lb. salivarius (LBS1, LBS2), Lb casei sp. casei (LBCC1), Lb casei sp. rhamnosus (LBCR1). Quant aux H. pylori testés, la souche H. pylori 2 (HP2) s’avère la souche la plus sensible au pouvoir inhibiteur des lactobacilles, raison pour laquelle HP2 est choisie comme souche indicatrice. Dans ce contexte, nous avons procédé à la méthode indirecte dite méthode des puits (Wendakoon et al., 1998), qui consiste à mettre au contact la souche pathogène de H. pylori (HP 2) ensemencé en masse avec les surnageants obtenus des lactobacilles testés et par la suite visualiser l’apparition des zones d’inhibition autour des puits. 143 Résultats III-3-1 Effet de la production d’acide lactique : L’acide lactique est, depuis longtemps, reconnu comme un agent majeur de l'activité antimicrobienne des bactéries lactiques en particulier celle des lactobacilles. Pour détecter l’effet de l’acide sur H. pylori, nous avons neutralisé le surnageant des souches de lactobacilles test avec le tampon phosphate à pH 7 afin de minimiser sa production. L’évaluation des résultats obtenus avec un surnageant non traité (témoin) nous permettra de déterminer si la production d’acides est un facteur actif des inhibitions observées. Or, nous avons remarqué que l’inhibition est levée chez 13 souches parmi les 14 souches choisies. C’est le cas de Lb. delbrucekii sp. bulgaricus (LBDB 1, LBD3, LBD5), Lb. rhamnosus (LBR1, LBR2), Lb. helveticus (LBH1, LBH2), Lb. salivarius (LBS1, LBS2), Lb. plantarum (LBP1, LBP3), Lb. Casei sp. rhamnosus (LBCR1), Lb. casei sp. casei (LBCC1) (tableau 18). Ces souches lactiques testées sont capable d’inhibé H. pylori à leur pH natif, mais cette effet disparait une fois le surnagent est ajusté à la neutralité, indiquant ainsi l’effet des acides organiques produits. Ceci est expliqué par l’absence totale des zones d’inhibition autour des puits contenu le surnageant traité comparativement avec le témoin non traité. Par contre, l’intensité de l’inhibition pour la souche restante Lb. brevis (LBB1), est diminuée comparativement au témoin. Ce résultat montre qu’en plus de l’acidité, un autre facteur est impliqué dans cette inhibition. Le milieu MRS utilisé comme contrôle négatif n’a pas été inhibé par les lactobacilles. Par contre, une zone d’inhibition a été observée autour de l’amoxicilline, comme étant un contrôle positif avec un diamètre de 9 mm. Ce test réalisé nous a permis de montrer que les inhibitions sont en majorité dues à l’acidité puisqu’elles ont été soit partiellement soit totalement levées. Nous pouvons également dire que les souches lactiques inhibent les souches cibles qu’elle rencontre de façon différentes. Pour le cas où l’inhibition a été partiellement levée, nous pouvons donc dire que l’acidité n’est pas la cause majeure de l’inhibition chez Lb. brevis testé. 144 Résultats Tableau 18: Effet de la production d’acides et du peroxyde d’hydrogène sur H. pylori Souches code pH SR SR N SRC Lb. delbrueckii LBDB1 4.04 11 0 11 sp. bulgaricus LBDB3 3.95 14 0 14 LBDB5 4.75 10 0 10 LBR1 3.76 15 0 15 LBR2 3.73 8 0 8 LBH1 4.24 5 0 5 LBH2 4.03 6 0 6 LBS1 3.71 7 0 7 LBS2 3.50 8 0 8 LBP1 3.27 10 0 10 LBP3 3.69 7 0 7 LBCC1 4.02 5 0 5 LBCR1 4.5 7 0 7 LBB1 4.9 5 3 5 Lb. rhamnosus Lb. helveticus Lb. salivarius Lb. plantarum Lb. casei Lb. brevis SR : surnageant à pH natif ; SRN: surnageant neutralisé à pH 7; SRC: surnageant traité à la catalase; zone d’inhibition exprimée en mm. 145 Résultats III-3-2 Effet du peroxyde d’hydrogène Le peroxyde d'hydrogène produit par les lactobacilles est parmi les facteurs majeurs dans l’inhibition des espèces bactériennes. Les bactéries lactiques sont généralement dépourvues de catalase mais certaines souches peuvent accumuler le peroxyde d'hydrogène lorsqu’elles sont cultivées en aérobiose. Pour cette raison, nous avons testé un autre facteur antimicrobien qui est le peroxyde d’hydrogène, impliqué probablement dans cette inhibition. Pour ce faire, Le surnageant des lactobacilles est traité par la catalase pour éliminer l’effet éventuel du peroxyde d’hydrogène. Cependant, l’inhibition n’a pas été levée chez toutes les souches lactiques testées, au contraire elle persiste avec l’apparition d’un halo d’inhibition dont le diamètre est similaire à celui du témoin (tableau 18), Ce qui exclut donc l’effet inhibiteur du peroxyde d’hydrogène sur la croissance de H. pylori. III-3-3 productions de phage lysogène Une des caractéristiques de l'effet antibactérien des phages virulents est que chaque cellule bactérienne infectée et lysée donne naissance à des dizaines ou des centaines de nouveaux phages qui sont libérés dans le milieu et pourront déclencher de nouveaux cycles lytiques. Par conséquent, l'effet antibactérien se propage d'une bactérie à l'autre en s'amplifiant. Afin d'éliminer la possibilité de la présence de phages, nous avons utilisé la méthode de Hardy ou le résultat s’est révélé négatif pour l’ensemble des souches lactiques testées, aucune plage de lyse n’est apparue après incubation. L’obtention d’un tapis bactérien signifie que l'effet inhibiteur ne peut pas se propager d'une bactérie à l'autre et donc qu'il n'est pas dû à la présence de bactériophages. 146 Résultats III-3-4 Effet de la bactériocine Puisque les bactériocines sont par définition des substances protéiniques, elles doivent être sensibles au moins à une protéase. La sensibilité aux enzymes protéolytiques est un critère principal dans leur caractérisation En effet, les réponses obtenues après l’action des enzymes protéolytiques (pepsine, trypsine et α-chymotrypsine) nous permettra d’identifier les substances antibactériennes comme étant des bactériocines. Si l’halo d’inhibition disparait en présence de l’action d’une enzyme protéolytique, l’agent inhibiteur est de nature protéique mais, s’il persiste après l’action des trois enzymes utilisées, il y a une forte probabilité pour que l’agent ne soit pas de nature protéique c'est-àdire qu’il ne s’agit pas d’une bactériocine (Callewaert et de Vuyst, 2000; Aslim et al., 2005). Or, nous avons remarqué qu’après le traitement des surnageant des lactobacilles par les trois enzymes protéolytiques, aucune inactivation n’est constaté chez les 13 souches testées (LBDB 1, LBD3, LBD5, LBR1, LBR2, LBH1, LBH2, LBS1, LBS2, LBP1, LBP3, LBCR1, LBCC1) (tableau 19). Ceci se traduit par la persistance de la zone d’inhibition autour des puits, indiquant ainsi que la substance antimicrobienne n’est pas de nature protéique et confirmant l’effet inhibiteur de l’acide lactique. Cependant, chez la souche Lb. brevis (LBB1), l’inhibition est partiellement levée comparativement au témoin avec une diminution de l’halo d’inhibition après le traitement de surnageant bactérien par la pepsine. Alors, aucune inactivation n’est constatée chez la souche LBB1en présence de trypsine et alpha-chymotrypsine (tableau 19). Des zones d’inhibitions sont détectées après mise en présence de ces enzymes dont le diamètre est identique à celui du témoin (surnageant non traité). Puisque les bactériocines sont sensible à au moins à une protéase, critère principal dans leur caractérisation, il y a une probabilité pour que l’agent inhibiteur soit de nature protéique. 147 Résultats Tableau 19: Effet de la production de la bactériocine Souches code SR SRAC SRT SRP Lb. delbrueckii LBDB1 11 + + + sp. bulgaricus LBDB3 14 + + + LBDB5 10 + + + LBR1 15 + + + LBR2 8 + + + LBH1 5 + + + LBH2 6 + + + LBS1 7 + + + LBS2 8 + + + LBP1 10 + + + LBP3 7 + + + LBCC1 5 + + + LBCR1 7 + + + LBB1 5.5 + + - Lb. rhamnosus Lb. helveticus Lb. salivarius Lb. plantarum Lb. casei Lb. brevis SR : surnageant non traité ; SRAC : surnageant traité par alpha chymotrypsine; SRT: surnageant traité par la trypsine ; SRP : surnageant traité par la pepsine ; + : présence de la zone d’inhibition ; - : diminution de la zone d’inhibition 148 Résultats La substance antibactérienne contenu dans le surnageant de la souche LBB1 est sensible à la pepsine mais l’inactivation n’est pas totale et résistante complètement aux deux autres enzymes protéolytiques testées. Sa structure chimique pourrait donc être probablement complexe, contenant en plus du groupement protéique ou peptidique des entités de nature lipidique ou polysaccharidique, ou autre structure. D’autre part, le traitement thermique de surnageant de la souche LBB1 a révélé la sensibilité de surnageant de la souche LBB1 à la chaleur (filtrat chauffé à 100°C et 120°C). L’activité anti-H. pylori n’est donc pas retenue après un traitement thermique. Ceci est expliqué par l’absence de zone d’inhibition autour des puits, montrant ainsi que la substance contenu dans le surnageant n’est pas thermostable. Sachant que les bactériocines éventuellement produites par Lb. brevis sont généralement connu par leur sensibilité aux enzymes protéolytiques et par leur résistance au traitement thermique. La figure 60 montre l’effet des surnageants traités de Lb.brevis et Lb. rhamnosus sur la croissance de H. pylori. A B 2 2 3 1 1 3 4 4 1 : filtrat+trypsine 2 : filtrat+pepsine 3 : filtrat+chymotrypsine 4 : MRS (témoin négatif) 1 : filtrat non traité 2 : filtrat + catalase 3 : filtrat tamponné 4 : MRS (témoin négatif) Fig. 60: l’effet de surnageant de Lb. brevis (A) traité par les enzymes, et le surnageant tamponné de Lb. rhamnosus (B) sur la croissance de H. pylori ensemencé en mase 149 Résultats III-4 Effet de surnageant de lactobacille sur H. pylori en milieu liquide La recherche des inhibitions a également été entamée en milieu liquide. Le but de cette expérience est de voir d’une part si la souche de lactobacille a également un pouvoir inhibiteur en milieu liquide, comme celui démontré en milieu solide, et d’autre part, de montrer si la substance antimicrobienne éventuellement produite a un effet bactéricide ou bactériostatique sur la croissance de H. pylori testé. Pour ce faire, il suffit de suivre l’évolution de la concentration en bactérie indicatrice viable de H. pylori dans le milieu de culture. La viabilité de la souche H. pylori incubée à 37°C en présence de surnageant de lactobacille à son pH natif et de l’acide lactique est mesurée en fonction du temps. Une stabilité de la concentration en bactérie viable est indicatrice d’un effet bactériostatique alors qu’une baisse de cette concentration indique un effet bactéricide. Dans cette expérience, la souche Lb. rhamnosus (LBR1) est choisie comme souche inhibitrice pour son pouvoir inhibiteur élevé vis-à-vis de H. pylori Quant aux souches indicatrices, H. pylori1 (HP1) et H. pylori2 (HP2) ont été retenus pour leur grande sensibilité à l’effet inhibiteur de Lb. rhamnosus. En effet, dans le cas ou les souches de H. pylori (HP1, HP2) sont inoculées à une concentration initiale de 105 CFU/ml dans le surnageant de Lb. rhamnosus , la population bactérienne de H. pylori dans les deux cultures restent stables durant les 12 h d’incubation comparativement au témoin (culture de H. pylori). Cependant, après cette période, une diminution progressive en concentration des cellules viables de H. pylori est observée après 24 d’incubation qui atteint à la moyenne de 103 CFU/ml. Cette baisse de la population bactérienne se poursuit jusqu' une absence totale en cellules viables à 72h chez H. pylori1 (HP1), et à 60h chez H. pylori2 (HP2) (fig. 61). De même, l’inoculation des souches de H. pylori (HP1, HP2) dans l’acide lactique entraine une baisse rapide en cellule de H. pylori dans les deux cultures 150 Résultats Fig. 61 : Viabilité de H. pylori (HP1, HP2) en présence de surnageant de Lb. rhamnosus (LBR1) et de l’acide lactique 151 Résultats dans les 12 d’incubation ou le taux de H. pylori a diminué de 105 à 103 CFU/ml, ensuite un déclin dramatique est observé dans le nombre cellulaire de H. pylori à 24h notamment chez la souche H. pylori2 , suivi par une absence de croissance à 48 h chez H. pylori1 et à 36 h d’incubation chez H. pylori2 (fig. 61). Les résultats obtenus montrent d’une part que l’inhibition provoquée par Lb. rhamnosus est maintenue en milieu liquide additionnée de surnageant et d’autre part, que le surnageant de Lb. rhamnosus1 contient une substance antibactérienne ayant une action bactéricide active vis-à-vis de H. pylori qui est bien l’acide lactique, confirmant ainsi le pouvoir inhibiteur que peut exercer Lb. rhamnosus contre les souches pathogènes de H. pylori. De plus, nous avons remarqué que La souche (HP2) montre une sensibilité élevée par rapport à la souche H. pylori (HP 1) vis-à-vis du surnageant de Lb. rhamnosus1 (LBR1) et de l’acide lactique. III-5 Inhibitions des bactéries pathogènes par les Lactobacillus sp. Les souches lactiques sont testées pour leur pouvoir inhibiteur à l’égard de différentes bactéries pathogènes, permettant ainsi de déterminer leur spectre d’activité en utilisant la méthode directe expliquée précédemment (Geis et al., 1983). En effet, nous avons testé l’effet inhibiteur des Lactobacilus sp. sélectionnés vis-à-vis des espèces bactériennes Gram positive (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis), et Gram négative (E. coli, Klebsiella pneumoninae, Salmonella enteritidis, Pseudomonas aeruginosa). Sur la base des résultats obtenus, il en ressort que les souches de lactobacilles testées exercent également une activité antagoniste contre les bactéries pathogènes et présentent un spectre d’activité large renfermant les bactéries Gram positive et les bactéries Gram négative. Cet effet antagoniste est variable, dépend d’une part de la souche indicatrice cible et d’autre part de la souche lactique inhibitrice. 152 Résultats En effet, toutes les souches lactiques montrent une activité importante vis à vis de E. coli et de St. aureus (fig. 62) dont les diamètres des zones d’inhibition varient entre 9 et 30 mm. De même, les lactobacilles présentent une activité inhibitrice remarquable sur la souche B. subtilis avec une zone d’inhibition allant de 8 et 24 mm (tableau 20). De plus, On a remarqué que les espèces de Ps. aeruginosa et S. enteritidis, Kl. pneumoninae ont également été inhibées par la majorité des souches de lactobacilles testées. De plus, nous avons constaté que les bactéries pathogènes n’ont pas le même comportement face aux lactobacilles. Ceci renseigne sur les capacités de résistance de ces bactéries aux agents produits par les souches lactiques. D’autre part, certaines souches lactiques montrent une différence dans leur comportement face aux bactéries pathogènes, au niveau d’une même espèce. C’est l’exemple de la souche LBH1 et LBH2 vis-à-vis de Ps. aeruginosa (tableau 20). Alors que les souches de Lb. rhamnosus (LBR1, LBR2) inhibent toutes les souches pathogènes testées, qu’elles soient Gram positive ou Gram négative. Ces bactéries lactiques ont donc une forte potentialité d’inhibition visà-vis des bactéries pathogènes y compris l’Helicobacter pylori. En revanche, nous avons également constaté que l’inhibition des bactéries pathogènes Gram positive par les lactobacilles est plus importante à celle des bactéries Gram négative dont la zone d’inhibition est plus grande. L’inhibition des bactéries pathogènes s’explique par la capacité des lactobacilles de produire de substances antibactériennes, responsable de cet effet antagoniste tel que l’acide lactique, le peroxyde d’hydrogène et les bactériocines. Les bactériocines sont surtout active sur les pathogènes gram+. Le tableau 20 récapitule les résultats des inhibitions des bactéries pathogènes par les lactobacilles. 153 Résultats A B 1 2 4 1 3 2 4 3 1 : LBS1; 2 : LBS2; 3 : LBDB1; 4 : LBDB3 Fig. 62: Effet antimicrobien des lactobacilles sur les bactéries pathogènes (A : E. coli ; B : St. aureus) 154 Résultats Tableau 20 : Activité antimicrobienne des Lactobacillus sp. vis-à-vis des bactéries pathogènes. Souches cibles E. coli Kl. pneumoniae St. aureus S. enteritidis Ps. aeruginosa B. subtilis LBDB1 17 9.5 14 14 15 22 LBDB3 15 10 8 12 12 14.5 LBDB5 15 0 12 9.5 8.4 10 LBR1 29 20 25 12 10.5 24 LBR2 18 17 19 20.3 8.3 15 LBH1 10 0 23.5 15.6 15 17.5 LBH2 8 0 15.5 0 0 10 LBS1 9.5 19 9 0 22.5 21 LBS2 10 0 10 10 19 14 LBP1 19.4 20 19 13 15 20 LBP3 10 0 20 14.5 2 8.5 LBCR1 11 14 26 11 0 23 LBCC1 9 0 21 0 14 20 LBB1 16 14 10 6 0 8.2 Souches test ST: souches ensemencées en touches; SC: souches ensemencées en masse; Zone d’inhibition exprimée en mm 155 Discussion Discussion Récemment, l’attention est portée sur l’interaction entre H. pylori et les bactéries lactiques essentiellement les lactobacilles (Sgouras et al., 2004). H. pylori, bactérie pathogène chez l’homme est impliqué dans les affections gastroduodénales (Megraud, 2007). Cette infection est répandue dans le monde entier et affecte plus de 50% de la population (Dunn et al., 1997; Perez-Perez et al., 2004). La trithérapie est le traitement actuel le plus recommandé et le plus efficace (Malfertheiner et al., 2002). Cependant, l’échec de l’éradication de H. pylori constitue un problème majeur dans la santé (Borody et al., 1996 ; Megraud, 2007 ;). Par conséquent, la recherche des méthodes alternatives serait indispensable (Rokka et al., 2006 ; Pinchuk et al., 2001;). Les lactobacilles, hôte naturel des intestins de l’homme ont des propriétés nutritionnelles et thérapeutiques aujourd’hui reconnu (Tannok, 1999). Ils sont considérés comme des probiotiques en raison de leur innocuité chez l’homme et leur propriétés antagonistes contre les bactéries pathogènes y compris H. pylori (Sgouras et al., 2004). Dans ce présent travail, nous avons procédé, en premier temps, à mettre en évidence H. pylori chez des patients atteints de maladies gastro-duodénales par des méthodes invasives nécessitant la réalisation des biopsies gastriques lors de la fibroscopie. Ces méthodes incluent le test rapide à l’uréase, l’examen cytologique, l’examen histologique, la culture et l’amplification génique (PCR). La mise en évidence de l’uréase dans les biopsies gastriques par les tests rapides à l'urée (C.L.O test ou Urée-indole), constitue un point important indiquant la présence de la bactérie (Dorval, 1992). Cette enzyme, caractéristique essentielle de H. pylori hydrolyse l'urée normalement présente dans l'estomac en ammoniac et gaz carbonique. L'ammoniac Libéré neutralise le micro-environnement de la bactérie en la protégeant de l'acidité gastrique (Leclerc et Vincent, 1991 ; Lamouliatte et al., 1992; Bretagne, 1996 ). 156 Discussion Selon plusieurs auteurs, la rapidité et l’intensité de la réaction sont en fonction du temps du virement et de la densité bactérienne (Sobhani et al, 1991; Souquet, 1995; Megraud, 1996a). D’après nos résultats, le temps de virement obtenu varie selon les cas de 20 mn, 30 mn voire 1h. Delchier (1996b) observe un virage sur des biopsies infectées dans la première demi-heure sur environ 80% des cas étudiés. De même, (Lamouliatte et al., 1992; Megraud, 1992; Fennerty, 1994) ont obtenus des réactions positives en 20 minutes chez des patients souffrants d’une affection gastroduodénale et d’après ces chercheurs, la rapidité de la réaction rend ce test d’une spécificité excellente. Tout résultat positif est donc présumé en rapport avec l’infection à H. pylori en raison de la forte activité uréasique de cette bactérie mais à condition de proscrire la lecture tardive du test à 24h, à ce moment il ne s’agit plus d’un diagnostic rapide car certaines bactéries uréasiques contaminantes provenant notamment de la bouche comme Staphylococcus, Streptococcus, voire Klebsiella, Proteus peuvent être à l'origine des faux positifs (Sobhani et al., 1991; Lamouliatte et al., 1992; Lozniewski, 1996; Megraud, 1996a ; de Korwin, 2003). De plus, la positivité du test dépend aussi du nombre des bactéries présent dans la biopsie qui est de l'ordre de 105 bactéries (Lamouliatte et al., 1992; Megraud, 1992; Missonier et Dorval, 1994 ; de Korwin, 2003 ). Ceci explique les faux négatifs de ce test, qui pourraient être du à un inoculum de départ trop faible, ou à la répartition hétérogène de H. pylori à la surface de la muqueuse gastrique (Riachi et Colin, 1995; Lozniewski, 1996 ). Il parait donc préférable de placer 2 biopsies dans le milieu pour augmenter la densité microbienne (de Korwin, 2003). D’après des données littéraires, l'uréase chez H. pylori est un facteur d’adaptation partiel lui permettant la colonisation et la survie dans un environnement acide particulièrement hostile aux autres bactéries (Lamouliatte et al., 1992 ; Vincent et Leclerc, 1991). Ce rôle a été démontré par Eaton et 157 Discussion al., (1991) en utilisant des mutants uréase négatif de H. pylori qui ne peuvent coloniser l'estomac du porcelet, meilleur modèle d’infection à H. pylori. D’autre part, Marshall et al. (1988) rapporte que H. pylori est également sensible à l'acidité gastrique que Campylobacter jejuni , mais en présence de l'urée, H. pylori reste viable à un pH < 3,5. Cependant, nous ne pouvons pas nous contenter du test à l'uréase pour établir formellement la recherche de l'infection à H. pylori. Cette recherche doit être donc complétée par d’autres tests (Delchier, 1994). L'examen cytologique d’un frottis biopsique, nous a permis de repérer les Helicobacter par leur morphologie caractéristique (Fauchére et Rosenau, 1991). Il s’agit de bacilles gram négatif incurvés ou légèrement spiralés. La présence de ces formes dans les empreintes biopsiques a déjà été signalée par (Cassel-Béraud et al., 1996; Megraud, 1992; Lamouliatte et al, 1992; Megraud, 1996a). Ces auteurs confirment l'intérêt de ce test puis qu’il informe sur la présence ou l'absence de la bactérie dans l’échantillon. Par ailleurs, l'examen histologique effectué par l'anatomopathologiste a révélé dans la plupart des cas la présence des formes incurvées ou spiralées de H. pylori dans les cryptes et l’épithélium de surface. Cet examen détecte la présence de H. pylori selon sa morphologie caractéristique et sa localisation particulière (Megraud, 1994a; De Mascarel et Merlio, 1989). L’intérêt de cette technique a été confirmé par (de Korwin, 2003; Megraud, 1994a; De Mascarel et Merlio, 1989). De plus, La présence de H. pylori au niveau de l’épithélium gastrique met en évidence les rapports de contact entre cette bactérie et les cellules épithéliales gastriques, site préférentiel de H. pylori et confirme son appartenance aux bactéries du mucus digestif (Fauchére, 1994a; Lamouliatte et al., 1992; Missonier et Dorval, 1991). Toutefois, cette méthode est parfois prise en défaut notamment du fait de la distribution irrégulière de la bactérie dans l'antre (Bruley Des Varannes, 1996; Souquet, 1995). Pour cela, la réalisation de biopsies multiples (au moins deux) 158 Discussion diminue le risque de résultats faussement négatifs sur les biopsies (de Korwin, 2003). Les méthode morphologiques laissent parfois un doute contrairement à la culture qui seule permet une identification certaine de la bactérie (Lamouliatte et al., 1992; Souquet, 1995; Bruley Des Vanannes, 1996). La culture est donc une méthode diagnostic la plus spécifique et constitue le test de référence le plus fiable pour affirmer la présence de H. pylori et tester la sensibilité aux antibiotiques, mais elle nécessite une attention particulière (de Korwin, 2003). Dans ce contexte, nous avons procédé à l’isolement de H. pylori. Cependant, H. pylori est une bactérie fragile, difficile à cultiver. Elle est microaérophile, sensible à la dessiccation et exigeante sur le plan métabolique (Lamouliatte et al., 1992; Megraud, 1992; Lozniewski, 1996). Son isolement exige une atmosphére microaerobie (système de Campy-pack) et un milieu de culture enrichi par le sang, le sérum ou l'amidon (Sobhani et al., 1991 ; Fennerty, 1994 ; Sobhani et al., 1995). La croissance de H. pylori est favorisée en particulier par l'apport du sang dans le milieu. Ceci a été démontré par l'équipe de Graham en utilisant un milieu gélosé, enrichi avec 7% de sang de cheval pour traiter les biopsies gastriques (Hachem et al., 1994). Pour cela, nous avons utilisé des milieux d’isolement additionnés de sang comme celui de la gélose au chocolat. De plus, l'utilisation d’un milieu sélectif (milieu pylori) nous a également permis un isolement sélectif de la bactérie (Megraud, 1989, 1994a). Une fois la bactérie isolée, nous avons procédé à l’'identification des souches, qui est fondée sur des caractères morphologiques (macroscopique, microscopique) et biochimiques (Lamouliatte et al., 1992; Megraud, 1992 ; 1994a, 1996a). L’aspect particulier de H. pylori facilite son identification (Megraud, 1992) et ces caractères spécifient l’espèce de H. pylori (Megraud, 1989, 1994a, 1996a, 1996b). Effectivement, les souches de H. pylori isolées forment de petites colonies grisâtres ou transparentes, luisantes et bombées rondes et régulières. 159 Discussion Ces caractères macroscopiques spécifie l’espèce de H. pylori (Medouakh et Bensoltane, 2010; Medouakh et al., 2010 ; 2006, 2008 ; Megraud, 1989, 1994a, 1996a). De plus, les souches de H. pylori ont montré une mobilité par l’examen direct à l’état frais. Il s’agit donc de bactéries mobiles et d’après certains auteurs (Lamouliatte et al., 1992; Monteiro, 1995) cette mobilité est due d’une part à sa forme spiralée, d’autre part à la présence des flagelles polaires. Cette propriété permet à H .pylori de se mouvoir dans le mucus gastrique (Lamouliatte et al., 1992; Fauchére et Roseneau, 1991; Fauchére, 1994a). D’autre part, le caractère Gram négatif des souches obtenues permet de les classer parmi les bactéries Gram négative (Megraud, 1994a). De plus, les souches isolées possèdent des formes cellulaires variables (incurvés, en virgules, en forme de C, de V ou de S), morphologie particulière de H. pylori (Fauchére, 1994a; Megraud, 1994b). Quant à l'identification biochimique, les souches de H. pylori isolées possèdent une oxydase, une catalase et une uréase extrêmement intense. La positivité de ces trois caractères biochimiques confirment qu’il s’agit bien de H. pylori (Fauchére, 1994a; Medouakh et Bensoltane, 2010; Medouakh et al, 2010, 2006, 2008; Megraud, 1989; Megraud, 1994a; Sobhani et al., 1991; Yousfi et al., 1997). D’après les tests effectués et les résultats obtenus, nous avons pu isoler trois souches de H. pylori (HP1, HP2, HP3) alors qu’il y’ a des cas où de nombreuses bactéries sont vues sur frottis coloré au Gram ou sur coupes histologiques, mais qu’aucune colonie ne pousse sur la gélose. C’est le cas d’une étude qui a été réalisée à Madagascar où Quinze souches (10,7 %) seulement de H. pylori ont pu être isolées parmi 140 biopsies malgré la positivité des autres tests de diagnostic (l’examen cytologique, l’examen cytologique, test à l’uréase) (Cassel-Béraud, 1996). L'échec de la culture dans ces conditions peut être traduit selon (Lozniewski, 1996 ; Megraud, 1996a; Yousfi et al., 1997) par la sensibilité de la technique 160 Discussion extrêmement dépendante des conditions de transport, de stockage et de culture fournies au laboratoire (mode de culture des prélèvement, milieux spéciaux, atmosphére microaérobie). En effet, la croissance de H. pylori semble limiter par la température, le contact avec l'oxygène, la dessiccation, le milieu de transport et le laps de temps avant de traiter les biopsies (Megraud, 1994g, 1996a; Yousfi et al., 1997). De plus, la distribution irrégulière de la bactérie dans la muqueuse gastrique peut influencer l'apparition des colonies dans les milieux de culture et peut donc contribuer à des résultats faussement négatifs (Yousfi et al., 1997). Pour cela, certains auteurs ont recommandés la réalisation de plusieurs biopsies à des sites différents de la muqueuse gastrique, améliorant ainsi le rendement de la culture (Megraud, 1994a; Yousfi et al., 1997). En outre, la culture permet de tester la sensibilité de H. pylori aux antibiotiques (de korwin, 2003 ; Megraud, 2007). Effetivement, les résultats obtenus de l’antibiogramme des souches de H. pylori isolées vis-à-vis des antibiotiques habituellement utilisé en thérapie ont révélé la sensibilité de la majorité des souches aux antibiotiques notamment l’amoxicilline, la tétracycline, la clarithromycine et la résistance au métronidazole a été observée chez la plupart des souches étudiées. La sensibilité et la résistance de H. pylori à ces antibiotiques ont été signalées par plusieurs auteurs (Adeyemi et al., 1999; Cayla, 1996 ; Fellous, 2009 ; Megraud, 1994c ; 2007; Raymond et al., 2010). L’étude réalisée en Tunisie chez des enfants infectés par H. pylori a montré une absence de résistance de H. pylori à l’amoxicilline, un taux de résistance moyen à la clarithromycine et un taux de résistance élevé au métronidazole (Mazigh et al., 2005). En Algérie, la résistance de H. pylori à la clarithromycine et au métronidazole a été évaluée de 12% et 37% respectivement (Burucoa, 2009). De même, l’étude de la sensibilité de 530 souches de H. pylori collectées à Paris et à Poitiers a révélé une absence totale de résistance à l’amoxicilline et à la tétracycline, 26% (138 cas) de résistance à la clarithromycine et 61% (324 cas), de résistance au métronidazole (Raymond et al., 2010). 161 Discussion Le chercheur Mégraud a également présenté des résultats similaires au cours d’une étude européenne sur la résistance de H. pylori aux antibiotiques (Burucoa, 2009). La résistance au métronidazole et parfois à la clarithromycine pose de nombreux problèmes à l’inverse de l’amoxicilline et de la tétracycline, ces antibiotiques ne donnant qu’exceptionnellement des résistances (de Korwin, 2003). Cette résistance aux antibiotiques généralement recommandés en thérapie constitue le principal facteur d’échec des traitement d’éradication, elle doit donc inciter les gastrologues à ne traiter les malades infectés par H. pylori qu’en fonction des résultats de test de sensibilité classique (antibiogramme) ou moléculaire (PCR) et ceci pour un traitement d’éradication efficace de l’Helicobacter pylori (Burucoa, 2009 ; Fellous, 2009 ; Raymon et al., 2010). C’est dans le même contexte que s’est développé la recherche de H. pylori par la PCR en temps réel. Cette technique moléculaire est une innovation dans le diagnostic de H. pylori car elle permet non seulement une détection rapide et précise de H. pylori mais également la détection d’éventuelles mutations de résistance à la clarithromycine (Megraud, 2007). Effectivement, l’application de cette technique nous a permis d’une part de confirmer l’identité des souches de H. pylori isolées par la culture et montrer d’autre part son appartenance à des souches sauvages (Hp sauvage) sans aucune mutation de résistance à la clarithromycine conformément au résultat de l’antibiogramme qui ont montré la sensibilité des souches isolée à la clarithromycine. Par ailleurs, cette technique a détecté la présence de H. pylori à partir de biopsies gastriques ayant montré une absence de H. pylori par la culture. Cette discordance entre les résultats a également été signalée par Tankovic et al. (2007) entre les deux Techiques utilisés l’histologie et la PCR en temps réel. Ces auteurs ont mis en lumière l’intérêt d’utiliser en routine la PCR en temps réel qui permet de tester facilement la sensibilité à la clarithromycine ou 162 Discussion ils ont trouvé une prévalence très élevé à la résistance à la clarithromycine (30%). De même, l’application de la technique PCR en temps réel par une équipe espagnole sur 63 biopsies d’enfants, a permis une meilleure détection de la présence de H. pylori et des mutations qui lui confère la résistance à la clarithromycine (Burucoa, 2009). Le test moléculaire PCR en temps réel rend désormais accessible une détermination rapide et facile de la sensibilité à H. pylori aux antibiotiques. Il représente une alternative fiable de l’antibiogramme (Buruora, 2009). Toutefois, l’amplification génique en temps réel n'est pas utilisée en pratique courante pour l'instant en raison de son coût et de sa complexité, mais elle sera sans aucun doute la méthode diagnostic du futur (Megraud, 2007 ; Buruora, 2009). Les discordances constatées, au cours de notre étude entre les résultats des méthodes de recherches utilisées ont également été observées par Lage et al. (1995); Cassel-Béraud (1996) ; Cellini et al. (1996); Tonkovic et al. (2007). Ceci peut être expliqué par l'existence des faux négatifs (absence de visualisation du germe alors que l'infection est présente), car les méthodes applicables sur des prélèvements biopsiques sont toutes soumises à l'erreur de l'échantillonnage du fait de la répartition inégale de H.pylori dans la muqueuse gastrique (Megraud, 1996c; Altman et al., 1995; Yousfi et al., 1997). Pour cette raison, il est recommandé de faire plusieurs biopsies à des sites différents de la muqueuse gastrique (Megraud, 1996c; Yousfi et al., 1997). Certains auteurs ont proposé de faire un brossage plutôt qu’une biopsie afin d’étudier une plus grande surface gastrique (Megraud, 1994a). La sensibilité de la technique utilisée comme celle de la culture peut également fausser les résultats (exliqué précédemment). De plus, il peut exister des faux positifs (la positivité du test alors que l'infection est absente) due probablement à une contamination extérieure. 163 Discussion La deuxième partie de ce présent travail concerne l’isolement et la caractérisation des lactobacilles à partir du lait cru de chèvre collecté. Le lait cru constitue une source intéressante des souches de bactéries lactiques, dotées de potentialités fermentaire intéressant les industries alimentaires et pharmaceutiques. Les lactobacilles représentent une part importante dans ce groupe lactique (Poisson, 2000; Saidi, 2002). L’isolement de bactéries lactiques essentiellement les lactobacilles du lait cru de vache, de chèvre et de brebis collectés dans la région de l’Ouest algérien a fait l’objet de plusieurs travaux de recherche (Cheriguene, 2008; Cheriguene et al., 2006; 2007 ; Chograni, 2008 ; Kacem et al., 2002, Saidi, 2002, 2007). A travers cette étude, nous nous sommes intéressés à isoler des lactobacilles du lait de chèvre. Il est donc important de développer des conditions adéquates qui permettront d’isoler les lactobacilles. Il s’agit de bactéries exigeantes sur le plan nutritionnelle et métabolique, leur isolement nécessite des milieux de culture spécifiques et une atmosphère anaérobie (Deguchi et al., 1992). En pratique, les techniques d’identification des lactobacilles basées sur les caractères phénotypiques restent d’une grande utilité (Badis et al., 2005 ; Khedid et al., 2006). Les résultats obtenus de l’identification des souches de lactobacilles, basé sur les analyses morphologiques, biochimiques et physiologiques nous ont permis de caractériser 42 souches de lactobacilles isolées du lait de chèvre. Ces isolats ont été identifiés au stade du genre et espèces conformément aux méthodes décrites par (Kandler et Weiss, 1986; Sharpe, 1979). En outre, cette identification a révélé la présence d’une diversité en espèces dans le genre de lactobacilles répartie essentiellement entre Lactobacillus delbrueckii (sp. bulgaricus et sp. lactis ); Lactobacillus helveticus; Lactobacillus salivarius ; Lactobacillus plantarum ; Lactobacillus casei (sp. casei et sp. rahmnosus) ; Lactobacillus rhamnosus ; Lactobacillus paracasei ; Lb. pentosus ; Lactobacillus brevis et Lactobacillus fermentum. 164 Discussion Ces espèces sont fréquemment isolées des animaux tels que les bovins, les ovins et les caprins. L’environnement et le climat où vivent ces animaux peuvent jouer un très grand rôle dans cette diversité (Badis et al., 2005 ; Cheriguene, 2008 ; Cheriguene et al., 2007; Picque et al., 1992). Plusieurs auteurs décrivent l’isolement et la caractérisation des lactobacilles à partir du lait cru et des produits laitiers. En effet, Cheriguene et al. (2007) ont révélé la présence de lactobacilles (29,40%) parmi 153 souches de bactéries lactiques isolées du lait de chèvre algérien, renfermant des espèces variés telles que Lb. delbrueckii sp. bulgaricus, Lb helveticus, Lb. salivarius, Lb. rhamnosus, Lb paracasei, Lb plantarum, Lb pentosus, Lb. fermentum et Lb brevis, espèces rencontrées également dans notre présente étude. Les mêmes chercheurs (2006) ont pu caractériser 28 souches de lactobacilles parmi 120 bactéries lactiques isolées du lait cru de chèvre collecté dans l’ouest algérien, et montrer également une diversité en espèces des lactobacilles. En outre, Badis et al., (2005) ont montré une variétés d’espèces appartenant au genre Lactobacillus , isolées du lait cru de chèvre de deux population caprines algériennes . Ces résultats sont en accord avec ceux obtenus dans notre recherche. D’autre part, des études menées ont montré que les espèces que nous avons identifiées sont fréquemment isolées du lait cru de vache (Bekhouche et Boulahraf, 2005), du lait cru de brebis (Chograni, 2008) et du lait cru de chamelle (Khedid et al., 2006). Ces espèces sont adapté à croitre dans le lait et les produits laitiers et elles sont généralement importantes dans la production du lait fermenté et du fromage (Khedid et al., 2006; Kandler and Weiss, 1986). D’autre part, nous avons noté une présence majoritaire des lactobacilles mésophiles homofermentaires avec un taux de 45,23% dans les échantillons du lait traité, Cette constatation a également été faite par Cheriguen et al. (2007) dans le lait de chèvre étudié. Ceci pourrait être expliqué par le faite que les animaux à partir desquelles ces bactéries ont été isolées sont plus adaptées au 165 Discussion condition climatique de ces régions (Khedid et al., 2006 ; Cheriguen et al., 2007 ; Cheriguene, 2008). Toutefois, la présence de lactobacilles hétérofermentaire obligatoire représenté par Lb. brevis et Lb. fermentum dans le lait de chèvre est faible avec un taux de 14,28%. Tornadijo et al., (1995) ont reporté des résultats similaires dans le lait de chèvre. De même, cette faible présence de ces lactobacilles a été constaté par Khedid et al., (2006) dans le lait de chamelle collecté au Maroc. En résumé, Les résultats obtenus lors de cette étude montrent que la majorité des espèces des lactobacilles isolées sont présentes dans le lait cru de chèvre bien qu’il pourrait exister des différences au niveau quantitatif et qualitatif, très probablement en relation avec la différence de la composition physicochimiques du lait traité (Jenness, 1982 ; Remeuf et al., 1991 ; Badis et al., 2005). Les bactéries lactiques essentiellement les lactobacilles sont connues pour leur rôles bénéfiques pour la santé humaine en raison de leur propriétés antagonistes contre les bactéries pathogènes y compris l’Helicobacter pylori. L’effet antagoniste constitue une des propriétés majeures des microorganismes probiotiques (Bouzaine, 2004). Les lactobacilles sont donc capables de produire lors de leur croissance des substances antimicrobiennes, pouvant ainsi inhiber le développement des bactéries nuisibles (Piard et Desmazeaud, 1992 ; Daeschel, 1993). La production d’acide lactique est le caractère le plus exploité dans ce domaine, mais d’autres produits de métabolisme tels que le peroxyde d’hydrogène sont également des agents antimicrobiens. Certaines bactéries lactiques sont par ailleurs susceptibles de synthétiser des substances de natures protéiques appelées bactériocine (Tagg et al., 1976 ; Dortu et Thonart, 2009 Castro et al., 2010). Récemment, il est rapporté que les lactobacilles peuvent inhiber la croissance de H. pylori in vitro et in vivo. Dans cette optique, Nous avons testé in vitro le pouvoir antimicrobien des souches de lactobacilles isolées du lait de chèvre 166 Discussion vis-à-vis des souches pathogènes de H. pylori isolées des biopsies gastriques en utilisant la méthode de la diffusion sur gélose. En effet, sur la base des résultats obtenus, nous avons remarqué que la majorité des 42 isolats de lactobacilles ainsi que la souche de référence présentent une activité antagoniste vis-à-vis des souches pathogènes cliniques de H. pylori, (H. pylori 1, H. pylori 2, H. pylori 3) et des souches de références HP4 et HP5. Ceci est expliqué par l’apparition de zones d’inhibition plus ou moins importante sur le milieu MRS solide. Cependant, le comportement des lactobacilles testés vis-à-vis de H. pylori varie en fonction des souches. Des résultats similaires obtenus par Allem et al. (2007) au cours d’une étude portant sur l’effet antibactérien des souches lactiques sur H. pylori in vitro, ont montré qu’il existe parfois des différences dans l’activité inhibitrice des souches lactiques de la même espèce vis-à-vis de H. pylori, ceci peut être du à une faible homologie de leur acide nucléique. De même, Ryan et al. (2008) ont montré que parmi 28 souches de Lb. salivarius testés vis-à-vis de H. pylori, 9 souches seulement ont exprimé leur pouvoir inhibiteur. D’autre part, les mêmes auteurs ont testé l’activité antibactérienne de la souche probiotique Lb. salivarius UCC119 contre 6 souches cliniques de H. pylori et montré que UCC119 capable d’inhiber la croissance toutes les souches de H. pylori testées (6/6 H. pylori), mais le degré de cette inhibition varie d’une souche à l’autre. Bhatia et al. (1989) ont été les premiers à observer l’effet antagoniste des souches de Lactobacillus contre H. pylori. Depuis, plusieurs études ont été menées sur le pouvoir inhibiteur des souches de Lactobacillus face aux H. pylori c’est le cas de Lb. acidophilus (Lorca et al, 2001.), Lb. salivarius (Ryan et al., 2008); Lb. plantarum (Rokka et al., 2006), Lb. casei (Sgouras et al., 2004.); Lb. rhamnosus GG (Goldin et al., 1992) et Lb. gasseri (Armuzzi et al., 2001). Les lactobacilles sont largement utilisés dans la fabrication des produits fermentés et sont présents en grande quantité dans la flore normale 167 Discussion gastro-intestinale humaine et animale (Tsai et al., 2004). Ils sont connus, depuis longtemps pour leurs rôles probiotiques sur la santé humaine et animale parmi lesquels l’interaction avec le microbiote (flore intestinale) et notamment l’inhibition de nombreux pathogènes Gram positif et Gram négatif. H. pylori fait parti de ce groupe de bactéries (Fuller, 1991 ; Sgouras, 2004). Sgouras et al. (2004) ont montré, in vitro l’effet inhibiteur de la souche probiotique Lb. casei Shirota, isolée du lait fermenté Yakult (Japan) sur la souche H. pylori SS1 (Sydney Strain1) et neuf autres souches cliniques de H. pylori où les diamétres d’inhibition varient de 12,7 à 15,7 mm . De même, Midolo et al. (1995) ont trouvé 6 souches de Lb. acidophilus ayant une activité inhibitrice vis-à-vis de H. pylori. Plusieurs études ont montré l’effet inhibiteur de certaines souches lactiques sur H. pylori. En effet, des inhibitions ont été constatées par la méthode de diffusion sur gélose avec les souches de Streptococcus thermophilus, Lb. bulgaricus et Lb. acidophilus et Bifidobacterium longum ou les diamètres de zone d’inhibition varie entre 5 mm et 14 mm (Allem et al., 2007). En outre, l’étude de l’activité antibactérienne de 17 souches de Lactobacillus appartenant aux différentes espèces contre 10 souches de H. pylori a montré la capacité de toutes les souches lactiques à inhiber la croissance de H. pylori in vitro. Rokka et al. (2006) ont également montré in vitro le pouvoir anti-Helicobacter des souches de Lb. plantarum testées. Le pouvoir inhibiteur, exercés par les lactobacilles reflète la capacité de ses souches lactiques de produire des substances antimicrobiennes inhibant la croissance du pathogène H. pylori. L’effet inhibiteur des lactobacilles pourrait être principalement dû à deux facteurs. Le premier est la production des acides organiques essentiellement l’acide lactique, qui est le caractère le plus exploité dans ce domaine, alors que le deuxième facteur est la production de substance protéique inhibitrice appelée bactériocine (Larsen et al. 1993; Anderssen et al., 1998; Avila et al., 2005). De plus, d’autres facteurs tels que la production 168 Discussion de peroxyde d’hydrogène et les phages pourraient également être responsables de cette inhibition. Afin de déterminer la nature de l'agent inhibiteur, nous avons sélectionné les souches fortement inhibitrices (ayant une zone d’inhibition élevée) parmi les 43 lactobacilles étudiés, et testé leur pouvoir acidifiant. Ce n’est qu’à partir des résultats obtenus de la mise en évidence des inhibitions, que nous avons pu sélectionner les souches inhibitrices. Le choix et la sélection de 14 souches de lactobacilles a donc été répartit comme suit : Lb. delbrueckii sp. bulgaricus (LBDB1, LBDB3, LBDB5), Lb. plantarum (LBP1, LBP3), Lb.rhamnosus (LBR1, LBR2), Lb brevis (LBB1), Lb. helveticus (LBH1, LBH2), Lb salivarius (LBS1, LBS2), Lb casei sp. casei (LBCC1), Lb casei sp. rhamnosus (LBCR1). Ce choix est basé sur les travaux de Hosono et al. (1977) qui établit que le tri doit se faire à partir des souches qui présentent le plus grand effet inhibiteur. D’autre part, la souche de H. pylori2 (HP2) s’est révélé la souche la plus sensible au pouvoir inhibiteur des lactobacilles, raison pour laquelle HP2 est choisie comme souche indicatrice. Le pouvoir acidifiant des souches sélectionnées de lactobacilles est évalué par la mesure du degré Dornic, qui correspond à la quantité d’acide lactique produite. En effet, Les résultats obtenus ont révélé que la majorité des 14 souches de lactobacilles ont un pouvoir acidifiant important, mais qui varie selon les espèces et parfois au sein de la même espèce. Le taux d’acidité est légèrement variable d’une souche à l’autre appartenant à la même espèce. Nos résultats concordent avec ceux obtenus par Accolas et al. (1980), Cheriguene (2008) et (Chograni, 2008). Durlu-Ozkaya et al. (2001) ont également montré que les souches de Lactobacillus diffèrent dans leur capacité à réduire le pH initial du lait. Il existe une relation étroite entre le pH et le degré Dornic, le pH diminue 169 Discussion au fur et à mesure que la quantité d’acide lactique augmente, ce qui a été constaté dans nos résultats. En revanche, la souche Lb. rhamnosus1 (LBR1) a montré une activité acidifiante plus élevée, par rapport aux autres espèces de Lactobacillus testées. Cette constatation a également été signalée par Cheriguene (2008) montrant ainsi que la souche Lactobacillus rhamnosus 9S3, est parmi les lactobacilles isolée du lait de chèvre ayant un taux d’acidité le plus élevé. En outre, les résultats obtenus par Bouzaine (2004) ont montré que les souches appartenant à l’espèce Lb. rhamnosus, isolées de la microflore intestinale de poulet représentent les souches les plus acidifiantes produisant une quantité d’acide lactique qui atteint 19g/100 ml. Ceci nous a mené à penser que le pouvoir acidifiant important exprimé par Lb. rhamnosus1 (LBR1) pourrait être corrélé à son pouvoir inhibiteur élevé vis-à-vis de H. pylori. Les lactobacilles ont généralement un pouvoir d’acidification important comparativement aux autres genres lactiques tels que les lactocoques (Ayad et al., 2004; Cogan et al., 1997; Cheriguene, 2008). Cette activité constitue d’une part un critère technologique essentiel pour la coagulation du lait et donc la fabrication des produits laitier et d’autre part provoque l’inhibition de la croissance des germes indésirables. Dans ce contexte, nous avons déterminé la nature de l’effet inhibiteur des souches de lactobacilles sélectionné vis-à-vis du pathogène H. pylori. Or, nous avons remarqué que l’effet antagonique est du dans la majorité des cas à l’acide lactique produit, facteur responsable de l’inhibition de H. pylori. En effet, le pouvoir inhibiteur de la plupart des souches de Lactobacillus. sp testés contre la souche H. pylori a disparu après la neutralisation des surnageants obtenus des cultures des lactobacilles, ceci a été démontré par la levée totale des zones d’inhibition, indiquant ainsi l’effet de l’acide produit par cette bactérie. Cependant, la souche Lb. brevis (LBB1) a montré une diminution de la zone d’inhibition comparativement au surnageant non traité (témoin). Ceci indique 170 Discussion qu’un autre facteur autre que l’acide lactique pourrait être impliqué dans cette inhibition. Les bactéries lactiques ont un métabolisme fermentaire, principale caractéristique commune qui sont capables, en métabolisant le lactose de produire des quantités importantes d’acide lactique, abaissant ainsi le pH et créant un environnement défavorable au développement des bactéries pathogènes. La capacité de produire de l’acide lactique par les bactéries lactiques qui agirait comme inhibiteur et empêcherait la croissance d’autres bactéries indésirables a été mis en évidence par plusieurs auteurs (Budde et al., 2003; Cabo et al., 2002). De même plusieurs travaux ont lié cet effet inhibiteur des bactéries lactiques vis-à-vis de H. pylori à la production d'acide lactique (Allem et al, 2001, Lorca et al., 2001; Kabir et al., 1997., Tabak et al., 2007). Ces résultats sont en accord avec ceux obtenus dans notre étude. Par ailleurs, d’autres mécanismes d’antagonisme, telles que la production de bactériocines et le peroxyde d’hydrogène pourrait être impliqué dans l’inhibition de H. pylori (Vandenbergh, 1993; Coconnier et al., 1998; Hamilton-Miller, 2003). En effet, l’addition de la catalase au surnageant bactérien n’élimine pas l’inhibition exercée par les lactobacilles. Le peroxyde d’hydrogène n’est donc pas responsable de l’antagonisme. D’après des auteurs, le peroxyde d’hydrogène est partiellement responsable de l’antagonisme (Saidi, 2002). En plus, il est probable que la possession de la catalase chez H. pylori, élimine l’effet de peroxyde d’hydrogène produit (Allem et al., 2007). D’autre part, l’effet inhibiteur des lactobacilles n’est pas du à la présence de bactériophages. Par ailleurs, certains lactobacilles produisent une substance antimicrobienne de nature protéique appelée bactériocine. il est donc probable que l’activité antimicrobienne soit une conséquence de la production de bactériocines (Jack et al., 1995; Piard et Desmazeaud, 1992). La sensibilité aux 171 Discussion enzymes protéolytiques est un critère principal dans leur caractérisation (Barefoot et Klaenhammer, 1983; Mehta et al., 1984; Klaenhammer, 1988). Dans notre cas, l’action des enzymes protéolytique sur les surnageants bactériens de 13 lactobacilles testés (LBDB1, LBDB3, LBDB5, LBR1, LBR2, LBH1, LBH2, LBS1, LBS2, LBP1, LBP3, LBCR1, LBCC1) ne lève pas l’inhibition mais au contraire elle persiste. Ce résultat montre d’une part que la substance antimicrobienne n’est pas de nature protéique, donc il ne s’agit pas de bactériocine, d’autre part il confirme que l’acide lactique est le seul facteur responsable de l’inhibition de H. pylori. Cependant, chez la souche Lb. brevis (LBB1), l’inhibition est partiellement levée après le traitement de surnageant bactérien par la pepsine, alors qu’elle persiste en présence de trypsine et alpha-chymotrypsine. Puisque les bactériocines sont sensible à au moins à une protéase, il y a une probabilité pour que l’agent inhibiteur soit de nature protéique, c'est-à-dire une bactériocine. La substance antibactérienne contenu dans le surnageant de la souche LBB1 est sensible à la pepsine mais l’inactivation n’est pas totale et résistante aux deux autres enzymes protéolytiques testées (trypsine et chymotrypsine). En outre, le deuxième critère qui caractérise généralement les bactériocines est la thermorésistante. Cependant, le traitement thermique de surnageant de la souche LBB a révélé la sensibilité de la substance contenu dans le surnageant entrainant ainsi la perte de l’activité antimicrobienne. Les bactériocines produites par l’espèce Lb. brevis sont généralement connu pour leur sensibilité à la majorité des enzymes protéolytiques et leur résistance au traitement thermique et présente un spectre d’activité centré sur les espèces phylogénetiquement proche du microorganisme producteur. C’est le cas par exemple de la brévicine 9296, qui est inactivée par toutes les enzymes protéolytiques, elle est thermostable et son spectre d’activité est limité sur les bactéries Gram positive y compris Listeria monocytogenes, par contre les germes Gram négatif ne sont pas affecté par cette substance inhibitrice. 172 Discussion Les caractéristiques de la bactériocine produite par Lb. brevis ne correspondent pas à celles de la substance produite par la souche LBB1. Ceci nous permettra de conclure qu’il ne s’agit pas de bactériocine. Il est donc possible que la structure chimique de cette substance pourrait être probablement complexe, contenant en plus du groupement protéique des entités de nature polysaccharidique ou lipidique ou, ou autre structure. Cette substance est produite au cours de la fermentation par Lb. brevis, bactérie hetérofermentaire. D’après Tagg et al., (1976), le spectre d'activité des bactériocines des bactéries à Gram+, bien qu'il puisse être variable suivant les souches, ne touche pas les bactéries à Gram-. La résistance des bactéries Gram- est attribuée à la barrière que représenterait leur membrane externe (Kalchayanand et al., 1992; Dortu et Thonart, 2009). Dans le cas où la membrane externe est rendue perméable, soit par un traitement physique (Kalchayanand et al., 1992), soit par un traitement chimique (Stevens et al., 1992), les bactéries Gram négatives deviennent sensibles aux bactériocines. Cette incapacité des bactériocines d'inhiber les bactéries à Gram négatives a déjà été rapportée (Broadbent et al., 1989; Chung et al., 1989). D’après Castro et al., (2010), Coventry et al., (1997) et Noonpakdee et al., (2003), les bactériocines sont surtout active sur les pathogènes Gram positif alors qu’ils ne sont pas efficaces contre les bactéries Gram négatives. H. pylori fait partie des bactéries à Gram négatif raison pour laquelle il n’est pas affecté par les bactériocines. Ceci a été démontré par plusieurs études montrant que les bactériocines produites par Lb. plantarum sont active contre plusieurs bactéries qui lui sont rapproché comme Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, et certains pathogènes tels que Bacillus, Stapphylocoque, Enterococcus et Listeria, mais elles ne sont actives contre les bactéries Gram négative comme exemple E. coli et Salmonella. De même, Roka et al., (2006) ont montré que l’activité anti-Helicobacter de la souche de Lb. plantarum (MLBPL1) n’est pas due à une bactériocine, mais à une substance active dont 173 Discussion le poids moléculaire varie entre 3 et 10 KDa. Michetti et al. (1999) qui ont étudié Lb. acidophilus La1 ont remarqué qu'une autre substance sécrétée non déterminée, en plus de l'acide lactique a contribué à l'effet inhibiteur observé chez H. pylori. D’autre part, une étude réalisé sur l’effet de Lb. salivarius sur H. pylori a révélé que H. pylori n’est pas sensible aux bactériocine ou bactériocine-like peptides produites par Lb. salivarius mais à d’autre composé sécrété en petites quantité (Ryan et al., 2008). Ces résultats rejoignent ceux obtenus dans notre présent. Sur la base des résultats obtenus, il en ressort que l’inhibition de H. pylori par les souches de lactobacilles testées sur milieu solide est majoritairement due à la production de l’acide lactique. Cet effet inhibiteur a également été testé en milieu liquide sur la souche Lb. rhamnosus1(LBR1), choisie pour son pouvoir inhibiteur élevé. Effectivement, le surnageant de la souche LBR1 s’est avéré actif sur H. pylori, ceci s’explique par l’action de la substance inhibitrice produite par LBR1, contenu dans le surnageant, qui est à l’origine de la diminution de la viabilité cellulaire de H. pylori. Pour s’assurer que l’agent inhibiteur soit l’acide lactique, comme il a été démontré en milieu solide, l’addition de L- acide lactique dans la culture bactérienne de H. pylori a eu conséquence d’une diminution rapide de la viabilité de H. pylori jusqu'à l’absence totale de cellules viables. Ceci confirme l’effet inhibiteur de l’acide lactique, principal composé de surnageant de Lb. rhamnosus. Cette espèce possède une activité antibactérienne contre des germes pathogènes et non pathogènes et elle est parmi les souches acidifiantes, produisant une quantité d’acide lactique de type L (+), qui atteint 19/100ml (Bouzaine, 2004; Narayanan et al., 20004). Ceci peut expliquer l’effet inhibiteur de Lb. rhamonosus sur les bactéries pathogènes. Le pouvoir acidifiant important de Lb. rhamnosus démontré dans notre présente étude pourrait ainsi être lié à l’effet inhibiteur remarquable de cette souche vis-à-vis de H. pylori. 174 Discussion Plusieurs études ont attribuées l’activité anti-Helicobacter des lactobacilles à la production de l’acide lactique (Aiba et al., 1998; Alakomi et al., 2000; Kabir et al., 1997). En effet, Sgouras et al. (2004) ont montré que le surnageant de la souche Lb. casei Shirota est capable d’inhiber la viabilité de H. pylori et que l’acide lactique contenu dans le surnageant est un composé majeur déterminé par HPLC, et est la cause de cette inhibition. En outre, les mêmes auteurs ont démontré que l’acide lactique contenu dans le surnageant est capable d’inhiber l’activité uréasique de H. pylori mais le mécanisme d’inhibition n’est pas encore clair. Bhatia et al. (1989) ont proposé que l'acide lactique produit sécrété extracellulairement par Lb. acidophilus soit responsable de l'inhibition de H. pylori. Des résultats similaires ont rapporté l’inhibition de H. pylori par 17 souches de lactobacilles et montré également que cette inhibition est liée à la production de l’acide lactique et que 60 mM est suffisante pour inhiber la croissance de H. pylori (Lorca et al., 2001), ces résultats sont comparables avec ceux obtenus dans notre présente étude. De même, Michetti et al. (1999) ont trouvé qu’un surnageant de culture de Lb. acidophilus est aussi actif que les lactobacilles vivants, un des composé importants de surnageant est l’acide lactique qui inhibe fortement la croissance de H. pylori. Midolo et al. (1995) ont également rapporté l’inhibition de la croissance de H. pylori par des acides organiques et inorganiques (Acide lactique, acétique et hydrochlorique) et que l'acide lactique a prouvé la plus grande inhibition. Cette inhibition est due au pH et la concentration qui sont importants dans l’inhibition de H. pylori par l’acide lactique in vitro. En générale, Le degré d’inhibition de H. pylori par le surnageant des lactobacilles est généralement corrélé à la concentration de L-acide lactique. Cette concentration de L-acide lactique produit par 12 probiotiques testés compris les lactobacilles varie de 50 à 156 mmol l-1. (Midolo et al., 1995). 175 Discussion L'acide lactique est produit en grande quantité au cours du métabolisme des glucides des lactobacilles inhibe le métabolisme oxydatif et entraine la diminution du pH intracellulaire, lié aux ions H + important dans l'inhibition de H. pylori in vitro (Piard et Desmazeaud, 1991). Par ailleurs, Midolo et al. (1995) ont suggérer qu’il peut exister d’autres composés extracellulaires produits par ces microorganismes ayant un pouvoir inhibiteur contre H. pylori. Coconnier et al. (1998) ont montré qu’une substance thermostable sécrétée par Lb. acidophilus est active contre H. pylori. Cependant, l’effet de l’acide lactique ou autre agent inhibiteur produit par les probiotiques dans la muqueuse gastrique reste à élucider. De plus, il a été démontré que d’autre bactéries probiotiques telles que Enterococcus faecium (Tsai et al., 2004), Cl. butyricum (Takahashi et al., 2000) et Bacillus subtilis (Pinchuk, 2001) ont également un pouvoir inhibiteur vis-àvis de H. pylori in vitro et in vivo. Les souches de lactobacilles testées exercent également une activité antagoniste contre les bactéries pathogènes et présentent un spectre d’activité large renfermant les bactéries Gram positive telles que St. aureus et B. subtilis et les bactéries Gram négative comme E. coli, Klebsiella pneumoninae, Salmonella enteritidis, Pseudomonas aeruginosa. Ce phénomène a déjà été démontré par de nombreuses études signalant que les bactéries lactiques en générale, et les lactobacilles en particulier présentent une activité antagoniste intéressante (Bouzaine, 2004; Dalache, 2006; Bey, 2009 ; Allouche et al., 2010; Anes et al., 2010; Hwanhlem et al., 2011; Belarbi, 2011). L’inhibition des bactéries pathogènes s’explique par la capacité des lactobacilles de produire de substances antibactériennes, responsable de cet effet antagoniste tel que les acides organiques, le peroxyde d’hydrogène et les bactériocines (Bareffot et Klahenmmer, 1983; Vandenbergh, 1993; Dambélé et al., 1998). Les bactéries pathogènes présentent une grande sensibilité pour l’acide lactique et le peroxyde d’hydrogène. En effet, L’effet antagoniste des lactobacilles contre 176 Discussion les bactéries pathogènes est attribué d’après plusieurs auteurs à la production de H2O2 et les acides organiques (Eschenbach et al., 1989; Brashears et al., 1998 ; Ouwehand, 1998 ; Brashears et Durre, 1999; Malakar et al., 1999). D’autre part, cette inhibition est due à la forte acidité produite par les lactobacilles comme observé par Adams et Nicolaides (1997) ; Byaruhanga et al. (1999) et Hwanhlem et al. (2011), alors que l’effet inhibiteur par les bactériocines s’exerce surtout sur les bactéries Gram positive (Castro et al., 2010; Coventry et al., 1997; Piard et Desmazeaud, 1999; Noonpakdee et al., 2003). Le pouvoir inhibiteur des lactobacilles vis-à-vis des bactéries pathogènes constitue une des propriétés importantes des probiotiques. Les lactobacilles sont connus pour leur grande résistance aux pH acides (jusqu’a un pH voisin de 3.5). Contrairement aux autres genres bactériens qui sont plus sensibles (Adams et Hall, 1988; Wong et Chen, 1988). Ils peuvent résister à des concentrations élevées de l’acide et sont parmi certaines bactéries qui peuvent adhérer et survivre dans l’estomac humain (Goldin et al., 1992). Les lactobacilles sont alors considérer comme des probiotiques, non seulement parce qu’ils ont un effet antagoniste vis-à-vis des bactéries pathogènes, une des propriétés majeures des microorganismes probiotiques, mais également parce qu’ils sont résistants au stress causé par les sucs gastrique et biliaire lors de leur passage dans le tractus gastrointestinal. En outre, les lactobacilles présentent certaine propriété d’adhésion, qui en rentrant en compétition avec les pathogènes in vivo par la production des composés inhibiteurs, colonisent la surface de la muqueuse épithéliale, raison pour laquelle leur application fréquente dans la prévention et le traitement des infections bactériennes (Tannock, 1999 ; Armuzzi et al., 2001; Lorca et al., 2001 ; Bouzaine, 2004; Tsai, 2004). Plusieurs études ont montré que l’administration d’un lait fermenté contenant de lactobacilles (Lb. acidophilus) entraine une diminution du taux de H. pylori et exerce à long terme un effet partiel sur l’éradication de l’infection à H. pylori (MRDA et al., 1998 ; Michetti et al., 1999; Sgouras et al., 2004). 177 Discussion L’activité anti-Helicobacter des souches de lactobacille, utilisées dans les produits laitiers a été rapporté dans plusieurs études in vitro et les résultats cliniques sont encourageants in vivo (Hamilton-Miller, 2003). Par conséquent, les lactobacilles pourraient être exploités et utilisés comme un potentiel agent adjuvant thérapeutique pour l’éradication de l'infection à H. pylori après l’échec du traitement par les antibiotiques. La consommation des probiotiques pourrait donc être une alternative thérapeutique au traitement de l’infection à H. pylori dans le futur proche. 178 Conclusion Conclusion Récemment, l’attention est portée sur l’interaction entre H. pylori et les bactéries lactiques, particulièrement les lactobacilles, qui sont reconnus pour leur rôle probiotique en raison de leur innocuité chez l’homme et leur propriété antagoniste contre les bactéries pathogènes y compris l’Helicobacter pylori. Le but de ce présent travail est de tester in vitro le pouvoir inhibiteur des lactobacilles isolés de lait cru de chèvre vis-à-vis de H. pylori isolés des biopsies gastriques. La mise en évidence de H. pylori a été effectuée par des méthodes invasives nécessitant la réalisation des biopsies gastriques humaines, parmi lesquelles, nous citons le test rapide à l’uréase, l’examen cytologique, l’examen histologique, la culture et l’amplification génique PCR en temps réel. Quoique, nous avons parfois remarqué une discordance entre les résultats. Ceci est éventuellement du à l’erreur de l’échantillonnage ou à la sensibilité de la technique utilisée. La culture reste la méthode diagnostic de référence car elle permet d’une part un isolement de H. pylori et une identification précise et certaine de la bactérie, et d’autre part l’étude de la sensibilité aux antibiotiques pour un traitement efficace permettant l’éradication de H. pylori. Cependant, la sensibilité de cette technique est extrêmement dépendante des conditions de transport des biopsies et de culture fournis au laboratoire. La PCR en temps réel est une innovation dans le diagnostic de H. pylori parce qu'elle permet non seulement une détection rapide et précise de H. pylori mais également la détection des mutations qui sont associées à la résistance aux antibiotiques sans demander des conditions strictes de transport. Elle représente une alternative fiable de l’antibiogramme et reste une méthode d’avenir. En revanche, l’identification des lactobacilles isolés du lait de chèvre a été faite sur la base de leurs caractères morphologiques, biochimiques, et physiologiques. 179 Conclusion Les critères phénotypiques restent encore importants aujourd’hui pour la classification des lactobacilles. Les lactobacilles sont connus depuis des décennies pour leur capacité à protéger l’homme contre les bactéries pathogènes. Ce pouvoir antimicrobien exercé par les lactobacilles est généralement due à la production des substances antimicrobiennes telles que les 'acides organiques, le peroxyde d'hydrogène, et les bactériocines. Il a été démontré in vitro, que la majorité des Lactobacilles testés ont un pouvoir antimicrobien vis à vis de la bactérie pathogène H. pylori et que l’agent impliqué dans cette inhibition est majoritairement du l’acide lactique. En effet, les lactobacilles peuvent résister à des concentrations élevées de l’acide et sont parmi peu de bactéries qui peuvent adhérer et survivre dans l’estomac humain, site généralement hostile aux bactéries et préférentiel aux Helicobacter, et exercer ainsi leur pouvoir inhibiteur sur H. pylori, raison pour laquelle leur utilisation comme probiotique est recommandée dans la prévention de l’infection à H. pylori. Les lactobacilles pourraient donc être exploité et utilisé comme un agent adjuvant thérapeutique pour éradiquer l'infection à H. pylori après l’échec du traitement par les antibiotiques. 180 Perspectives Perspectives Les résultats de notre recherche permettent d’ouvrir de nouvelles perspectives notamment : -Développement des moyens diagnostiques non invasifs comme le test respiratoire pour le dépistage de l’infection à H. pylori et le contrôle de l’éradication de H. pylori après la thérapie. -Développement de la biologie moléculaire (PCR) qui représente un examen d’appoint important en infectiologie moderne sans recours à la fibroscopie et qui permettrait la détection des souches résistantes de H. pylori. -Identification moléculaire des souches de lactobacilles isolées. -Mise en évidence de l’acide lactique par chromatographie HPLC. -Etude du potentiel probiotique des souches de lactobacilles isolées, particulièrement la souche Lb. rhamnosus. -Application des essais cliniques par l’administration des lactobacilles à des sujets infectés par H. pylori. 181 Références bibligraphiques Références Bibliographiques ACCOLAS J.M., HEMME D., DESMAZEAUD M. J., VASSAL L., BOUILLANE C. & VEAUX M., 1980. Les levains lactiques thermophiles : propriétés et comportement en technologie laitière. Le Lait. 60: 487-524. ADAMS M.R., & HALL C.J., 1988. Growth inhibition of food borne pathogens by lactic and acetic acids and their mixtures. Int. J. Food Sci. Technol. 23: 287-292. ADAMS M.R. & NICOLAIDES L., 1997. Review of the sensitivity of different Foodborne pathogens to fermentation. Food. Control. 8. 227-239. ADEYMI E.O., DANIAL M .F., HELAL T., BENEDICTE S., & ABDULLE A.M., 1999. The outcome of a 2 weeks treatment of Helicobacter pylori–positive duodenal ulcer with omeprazole-based antibiotics regimen in a region with high metronidozole resistante rate. Eur. J. Gastroentero. Hepatol. 11: 1259-1263. AIBA Y., SUZUKI N., KABIR A.M.A., TAKAGI A. & KODA Y., 1998. Lactic acid-mediated suppression of Helicobacter pylori by the oral administration of Lactobacillus salivarius as a probiotic in a gnotobiotic murin model. Am. J. Gastroenterol., 93: 2097–2101. ALAKOMI H. L., SKYTTA E., SAARELA M., MATTILA-SANDHOLM T., LATVAKALA K. & HELANDER I. M., 2000. Lactic acid permeabilizes gram-negative bacteria by disrupting the outer membrane. Appl. Envir. Microbiol. 66, 2001-2005. ALLEM R., ELKEBIR F.Z. & GUETARNI H., 2007. Effet des bactéries lactiques sur Helicobacter pylori. Méd. Nut., 43 (3) : 1-7. AL-MUSHRIF S. & JONES B. M., 1998. A study of the prevalence of hydrogen peroxide generating Lactobacilli in bacterial vaginosis: the determination of H2O2 concentrations generated, in vitro , by isolated strains and the levels found in vaginal secretions of women with and without infection. J. Obstet ; Gynecol. 18 : 63-67. ALLOUCHE F. N., HELLAL A. & LARABA A., 2010. Etude de l’activité antimicrobienne des souches de lactobacilles. thermophiles utilisées dans l’industrie laitière. Nature et Technologie. 3 : 13- 20. ALTMAN C., LORDOUCH A., BRIANTAIS M.J., MARTIN E., JAQUES L. & BUFFET C., 1995. Gastrite antrale au cours de l’alcoolisme chronique: rôle de la cirrhose et d’Helicobacter pylori. Pres. Med. 24: 708-710. AMMOR S., TAUVERON G., DUFOUR E. & CHEVALLIER I., 2005. Antibacterial activity of lactic acid bacteria against spoilage and pathogenic bacteria isolated from the same small scale facility-screening and characterization of the antibacterial compounds. Food. Control. Eds Elsevier. pp : 1-6. 182 Références bibligraphiques ANAS M., HAMEDI A- R, 1HENNI J. et al., 2010. Activité Anti-Bactérienne de Lactobacillus plantarum isolée du lait cru de chèvre d’Algérie vis à vis de Staphylococcus aureus. Les technologies de laboratoire. 5 (21) : 26-33. ANDERSSON E.L., DIEP B.D., NES I.F, EIJSINK V.G.H & NISSEN-MEYER J., 1998. Antagonistic activity of antibacterial activity and practical applications. Adv. Microbiol. Phys. 32: 87-108. ARMUZZI A., CREMONINI F., BARTOLOZZI F., CANDELLI M., OJETTI V., CAMMAROTA G., ANTI M. , DE LORENZO A., POLA P., GASBARRINI G. & GASBARRINI A., 2001. The effect of oral administration of Lactobacillus GG on antibioticassociated gastrointestinal side effects during Helicobacter pylori eradication therapy. Alim. Pharm. Therp. 15: 163– 169. AVILA M., GARDE S., MEDINA M. & NUNEZ M., 2005. Effects of milk inoculation with bacteriocin producing lactic acid bacteria on a Lactobacillus helveticus adjunct cheese culture. J. Food. Prot. 68: 1026-1030. AVRIL J.L., 1988. Dictionnaire pratique de bactériologie clinique. Edition Marceting. Paris. pp: 31-32. AXELSSON L.T., 2004. Lactic Acid Bacteria: Classification and Physiology. In Lactic Acid Bacteria -Microbiology and functional aspects. Edited by S. Salminen, A.v. Wright et A. Ouwehand. Marcel Dekker, Inc. pp: 1-66. AXELSSON L.T., CHUNG T.C., DOBROGOSZ W.J. & LINDGREN, S.E., 1989. Production of a broad spectrum antimicrobial substance by Lactobacillus reuteri. Microbiol. Ecol. Health. Dis. 2: 131-136. AYAD E.H.E., NASHAT S., EL-SADEK N., METWALY H. & EL-SODA M., 2004. Selection of wild lactic acid bacteria isolated from traditional Egyptian dairy products according to production and technological criteria. Food Microbiol. 21(6): 715-725. BADIS A., GUETARNI D., MOUSSA-BOUDJEMA B., HENNI D.E., TORNADIJO M.E. & KIHAL M., 2004. Identification of cultivable of lactic acid bacteria isolated from algerian raw goat’s milk and evaluation of their technological properties. Food. Microbiol. 3: 72-78. BAIRD-PARKER A.C., 1980. Organic acids. In J. H. Silliker (Ed.), Microbial ecology of foods. New York: Academic press. pp. 126–135. BAREFOOT S.F. & KLAENHAMMER T.R., 1983. Detection and activity of lactacin B, a bacteriocins produced by Lactobacillus acidophilus. Appl. Environ. Microbiol. 45: 18081815. BEIL W. 1995. Interaction of Helicobacter pylori an dits fatty acids with parietal cells and gastric. Gut. 35: 54-87. 183 Références bibligraphiques BEKHOUCHE F. & BOULAHROUF A., 2005. Etudes quantitative et qualitative des bacteries lactiques de lait cru produits par des vaches locales appartenant a six stations d’elevage de constantine. Sci. Technol. 23 : 38-45. BELARBI F., 2011. Isolement et sélection des souches de bactéries lactiques productrices de métabolites antimicrobiens. Memoire de Magister. Université d’ORAN. BELBLIDIA N., BENREMOUGA M.C. & MEDJAHED F., 1995. Place de l’Helicobacter pylori dans la pothologie gastrique à l’hopital central de l’armée (janvier à septembre. Rev. Alg. Sant. Milit. 5: 3-36. BENALLAL K., 2009. Infection à Helicobacter pylori chez l’enfant dans l’Ouest algérien. Etude épidémiologique, clinique et thérapeutique. Doctorat en Sciences Médicales. Université Djillali Liabes. Sidi Bel-Abbes. BENTHIN S., & VILLADSEN, J., 1995. Different inhibition of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus by D- and L-lactic acid: effects on lag phase, growth rate and cell yield. J. Appl. Bacteriol. 78: 647-654. BERNET M.F., BRASSART D., MEESER J.R & SERVIN A.L., 1994. Lactobacillus acidophilus LA1 binds to cultured human intestinal cell lines and inhibits cell-attachment and cell-invasion by enterovirulent bacteria. Gut., 35:483–489 BERSTAD K., 1993. Helicobacter pylori infection in peptic ulcer disease. Scan. J. Gastroenterol. 28: 561-567. BEY F. 2009. Etude de l’intéraction antagoniste entre Lactobacillus sp. et quelques souches d’entérobactéries. Mémoire de Magister. Université d’ORAN. BHATIA S.J., KOCHAR N., ABRAHAM P., NAIR P.G. & MEHTA A.P., 1989. Lactobacillus acidophilus inhibits growth of Campylobacter pylori in-vitro. J. Clin. Microbiol. 27: 2328-233O. BIBEL D. J., 1988. Elie Metchnikoff's bacillus of long life. A.S. M. News 54: 661-665. BIBEK R. & DEASCHEL M. 1992. Food biopreservatives of Microbial origin. Eds CRC. Press. BIGARD M.A., 1991. Ulcére gastrique. Collection médicale pratique. N° 3. BIGRET M., 1989. Probiotics from Empirism to Science. Biofutur. pp: 62-64. BISSONNETTE F., LABRIE S., DEVEAU H., LAMOUREUX M. & MOINEAU S., 2000. Characterization of mesophilic mixed starter cultures used for the manufacture of aged Cheddar cheese. J. Dairy. Sci. 83: 620-627. BJORKSTEN B., 2004. Effects of intestinal microflora and the environment on the development of asthma and allergy. Springer Seminras in Immunopathol : 25 : 257-270. 184 Références bibligraphiques BOMMELAER G., 1996. Maladie ulcéreuse gastro-duodénale et gastrites : épidémiologie générale, historie naturelle et filiation. Gastroenterol. Clin. Biol. 20: 5 –8. BORODY T.J., SHORTIS N.P., REYES E. & O’SHEA J.E, 1996. Eradication Failure (EF) after H pylori treatment- further therapies. Gastroenterol., 110: A67. BORRIELLO S. P., HAMMES W. P, HOLZAPFEL W., MARTEAU P., SCHREZENMEIR J., VAARA M., & VALTONEN V., 2003. Safety of probiotics that contain Lactobacilli or Bifidobacteria. Clin. Infect. Dis. 36 :775-780. BOURGEOIS C.M. & LARPENT J.P., 1996. Microbiologie alimentaire. Aliments fermenté et fermentations alimentaires. Ed, Tec. et Doc., Paris. pp. 523 BOUZAINE M. 2004. Selection de bactéries lactiques probiotiques d’origine animale. Microbiol. Hyg. Alim. 16 (46): 24-29. BRASHEARS M. M. & DURRE W. A., 1999. Antagonistic action of Lactobacillus lactis toward Salmonella spp.and Escherichia coli O157 : H7 during growth and refrigerated storage. J. Food. Prot. 62: 1336–1340. BRASHEARS M. M., REILLY S. S. & GILLILAND S. E., 1998. Antagonistic action of cells of Lactobacillus lactis toward Escherichia coli O157 : H7 on refrigerated chicken meat. J. Food. Prot. 61 : 166–170. BRETAGNE J.F., 1996. Helicobacter pylori. De la bactérie à la pathologie gastroduodénale. Quot. Med. pp: 9 – 13. BROADBENT J. R., CHOU Y. C., GILLIES K., & KONDO J.K., 1989. Nisin inhibits several gram-positive, mastitis-causing pathogens. J. Dairy. Sci. 72: 3342-3345. BRULEY DES VARANNES S., diagnostiques .Quot. Med. 321: 14-48. 1996. Helicobacter.pylori. Les méthodes BRULEY DES VARANNES S. & SCARPIGNATO C., 1996. Infection à Heliobacter pylori: relation entre gastrite et symptomatologie clinique. Gastroenterol. Clin. Biol. 20: 84-94. BUCKLEY M. & O’ MORAIN C., 1996. Quand faut-il éradiquer Heliobacter pylori ? Gastroenterol. Clin. Biol. 20: 95-102. BUDDE B.B., HORNBAEK T., JACOBSEN T., BARKHOLT V. & KOCH, A.G., 2003. Leuconostoc carnosum 4010 has the potential for use as a protective culture for vacuumpacked meats: culture isolation, bacteriocin identification, and meat application experiments. Int. J. Food Microbiol. 83: 171-184. BURUCOA C., 2009. Résistance aux antibiotiques. XXIInd International Workshop on Helicobacter and related bacteria in chronic digestive inflammation. 185 Références bibligraphiques BYCZKOWSKI J. & GESSNER, T., 1988. Biological role of superoxide ion radical. Int. J. Biochem. 20: 569-580. CABO M.L., BRABER A.F. & KOENRAAD P., 2002. Apparent antifungal activity of several lactic acid bacteria against Penicillium discolor is due to acetic acid in the medium. J. Food. Prot. 65: 1309- 1316. CANNON J. P., LEE T. A., BOLANOS J. T. & DANZIGER L. H., 2005. Pathogenic relevance of Lactobacillus: a retrospective review of over 200 cases. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 24: 31-40. CARR F.J., CHILL D., & MAIDA N., 2002. The Lactic Acid Bacteria: A Literature Survey. Critical Rev.Microbiol., 28: 281-370. CASLA D., REQUENA T. & GOMEZ R ., 1996. Antimicrobiol activity of lactic bacteria isolated from goat’s milk and artisanal cheeses : characteristics of a bacteriocin produced by Lactobacillus curvatus IFPL. J. Appl. Bacteriol. 81: 35–41. CASSEL-BERAUD A.M. PEGHINI M., MOUDEN J.C. & RAJAONARISON P. 1996. Prévalence de l’infection à Helicobacter pylori à Tananarive, Madagascar. Bactériologie. CASTRO, M.P., PALAVECINO N.Z., HERMAN C.,. GARRO O.A. & CAMPOS C. A.. 2010. Lactic acid bacteria isolated from artisanal dry sausages: Characterization of antibacterial compounds and study of the factors affecting bacteriocin production. Elsevier. Xxx–xxx (article in press) CATALANO F., BRANCIFORTE G., CATANZARO R., BENTIVEGNA C., CIPOLLA R., NACIFORO G. & BROGNA A., 1999. Comparative treatment of Helicobacter pylori-positive duodenal ulcer using pantoprazole at low an high doses versus omeprazole in triple therapy. Helicobacter. 4: 178-184. CAYLA R., 1995. Eradication d’Helicobacter pylori. Hepato. Gastro. 2: 53-61. CAYLA R., 1996. Comment éradiquer Helicobacter pylori ? Gastroenterol. Clin. Biol. 20: 119-130. CELLINI L., ALLOCATI N., ANGE LUCCI D., LEZZI T., CAMPLI E. D., MARZIOL., & DAINELLI B., 1994. Coccoid Helicobacter pylori not culturable in vitro Reverts in Mice. Microbiol. Immun. 38: 843-850. CELLINI L., ALLOCATI N., & DAINELLI B., 1995a. Failure to detect Helicobacter pylori nasaf mucus in H.pylori positive dyspeptic patients. J. Clin. Pathol. 48: 1072-1073. 186 Références bibligraphiques CELLINI L., ALLOCATI N., PIATTELI A., PETRELLI I., FANCI P., & DIANELLI B., 1995b. Microbiological evidence of Helicobacter pylori from dental plaque in dyspeptic patients. Microbiol. 18: 187-192 CELLINI L., ALLOCATI N., DI CAMPLI E., MASULLI M., DI BORTOLONEO S., & DAINELLI B., 1996. Helicobacter pylori isolated from stomach corpus and antrum : comparison of DNA patterns. J. Infec. 32: 1-3. CENATIEMPO Y., BERJEAUD J.M., BIET F., FREMAUX C., HECHARD Y. & ROBICHON D., 1996. Bactériocines de bactéries lactiques: données récentes sur leur structure, leur mode d'action et leurs déterminants génétiques. Lait, 76: 169-177. CHAMOUARD P., 1996. Place de l’infection à l’Heliobacter pylori dans les causes et les mecanismes de l’ulcère gastroduodenal et des gastrites chroniques. Gastroenterol. Clin. Biol. 20: 103-110. CHERIGUENE A., 2008. Caractérisation et étude du potentiel technologique des bactéries lactiques isolées à partir du lait de chèvre de l’ouest algérien. Thèse de doctorat. Université d’ORAN. CHERIGUENE A., CHOUGRANI F., & BENSOLTANE A., 2006. Identification and characterization of lactic acid bacteria isolated from Algerian goat’s milk. Pak. J. Biol. Sci. 9 (7): 1242-1249. CHERIGUENE A., CHOUGRANI F., BEKADA A., EL SODA M. A, M. & BENSOLTANE A., 2007. Enumeration and identification of lactic microflora in Algerian goats’ milk. Afr. J. Biotechnol., 6 (15): 1854-1861. CHIBA N., THOMSON A.B., & SINCLAIR P., 2000. From bench to bedside to bug : an update of chimically revant advances in the care of persons with Helicobacter pyloriassociated diseases. Can. J. Gastroenterol. 14: 188 – 198. CHOUGRANI F., 2008. Utilisation de souches lactiques isolées à partir du lait de brebis algérien dans la fabrication d’un yaourt nature. Thèse de Doctorat. Université d’ORAN. CHOW T.K.F., LAMBERT J.R., WAHLQUIST M.L., & HSU-HAGE B.H.H., 1995. Helicobacter pylori in Mellourne chinese immigrants : Evidence for oral-oral transmission via chopsticks. J. Gastroenterol. Hepatol. 10 : 562-569. CHUNG K-T., DICKSON J.S. & CROUSE J.D., 1989. Effects of nisin on growth of bacteria attached to meat. Appl. Environ. Microbiol. 55: 1329-1333. CINTAS L.M., HERRANZ C., HERNÁNDEZ P.E., CASAUS M.P, NES I.F., & HERNÁNDEZ P.E., 2001. Bacteriocins of Lactic Acid Bacteria. Food. Sci. Technol. Int. 7: 281-305. 187 Références bibligraphiques CLYNE M. & DRUMM B., 1994. Helicobacter pylori requires an acidic environment to survive in the presence of urea. Am. Gastroenterol. Asso. Dig. Dis. Week. New Orleans (USA). Abstract Nb. 2400. pp: 15-20. COCONNIER M.H., LIEVIN V., HEMERY E. & SERVIN A.L., 1998. Antagonistic activity against Helicobacter infection in vitro and in vivo by the human Lactobacillus acidophilus strain LB. Appl. Environ. Microbiol., 64: 4573–4545 COGAN T.M., 1986. The leuconostocs: Milk products. In: Gilliland, S.E. (Ed.), Bacterial Starter Cultures for Foods. COGAN T.M., & HILL C., 1993. Cheese starter cultures. In: Fox, P.F. (Ed.), Cheese: Chemistry, Physics and Microbiology. Vol. 1, Second Edition, Chapman and Hall, London, pp. 193-255. COGAN M.T., DOWD O. & MELLERICK D., 1981. Effects of pH and sugar on acetoin production from citrate by Leuconostoc lactis. Appl. Environ. Microbiol. 41: 1-8. COGAN T.M., BARBOSA M., BEUVIER E., BIANCHI-SALVADORI B., COCCONCELLI P., GOMEZ R., KALANTZOPOULOS G., LEDDA, A. & RODRIGUEZ E., 1997. Characterization of lactic acid bacteria in artisanal dair products. J. Dairy. Res. 64: 409-421. COLIN R., 1995. Helicobacter pylori. Traitements d’éradication. Impact. Med. Dossier. Prat. 303: 1 –22. COLIN R., 1996. Helicobacter pylori en route vers l’an 2000. Quels sont les résultats de la conférence de consensus et pourquoi ? Actual. Innovat. Med. 2: 1-5. COLIN R.R., ARNAL J.-C., BERGMAN J.-F., BRU J.-B., CLOAREC D., DIEBOLD M.-D., DUPAS J.-L., FAGNIEZ P.-L., HOUCKE P., LAFON J., LAFONT J.-P., MARIE A., MONNET E., ET WEBER M., 1995. Helicobacter pylori. Conférence de consensus. Impact. Med. Doss. Prat. 303: 1-12. CONCLUSION ET RECOMMANDATIONS DU JURY., 1996. Maladie ulcéreuse et gastrites à l’heure d’heliobacter pylori. Gastroenterol. Clin. Biol. 20: 155-165. CONDON S., 1987. Responses of lactic acid bacteria to oxygen. F.E.M.S. Microbiology reviews. 46. 269-280. CONFÉRENCE DE CONSENSUS., 1995. Maladie ulcéreuse et gastrite à l’heure d’Helicobacter pylori. Impact. Med. Hebdo. 303: 2-15. CORR S.C., LI Y., RIEDEL CU et al.., 2007. Bacteriocin production as a mechanism for the antiinfective activity of Lactobacillus salivarius UCC118. Proc. Natl. Acad. Sci. 104: 7617–7621. 188 Références bibligraphiques CORREA P., 1988. A human model of gastric carcinogenesis. Cancer. Res. 48 : 1359 – 1360. CORREA P., 1991. Is gastric carcinoma an infectious disease ? N. Engl. J. Med. 325: 1170-1172 CORTHESY-THEULAZ I. & MICHETTI P., 2000. Vaccination contre Helicobacter pylori : acquis et perspectives. Gastroenterol. Clin. Biol. 24 (12): 1186-1190. COVENTRY M., GORDON J.B., ALEXANDER M., HICKEY M.W. & WAN J., 1996. A foodgrade process for isolation and partial purification of bacteriocins of lactic acid bacteria that uses diatomite calcium silicate. Appl. Environ. Microbiol. 62:1764-9. CUMMINGS J. H., GIBSON G. R., & MACFARLANE G. T., 1989. Quantitative estimates of fermentation in the hind gut of man. Acta. Veterinaria. Scandinavica., 86: 76-82. CUREL S., BESISK F., DEMIR K., MUNGAN Z., KAYMAKOGLU S., BOZTAS G., CAKALOGLU Y., YEGINSU O., OKTEN A., 1999. After the eradication of Helicobacter infection, relapse is a serious problem in Turkey. J. Clin. Gastroenterol. 28 : 241-244. CZYBA J.C. & GIROD C., 1967. Cours d’histologie et embryologie. De première année de médecine. SIMEP Edition .Lyon. pp : 1-211. DAESCHEL M.A., 1993. Applications and interactions of bacteriocins from lactic acid bacteria in foods and beverages, p. 63–91. In D. G. Hoover and L. R. Steenson (ed.), Bacteriocins of lactic acid bacteria. Academic Press, Inc., New York, N.Y. DAL BELLO F., WALTER J., HAMMES W.P. AND HERTEL C. , 2003. Increased complexity of the species composition of lactic acid bacteria in human feces revealed by alternative incubation condition. Microbiol. Ecol. 45, 455–463. DALIE D. K. D., 2010. Biocontrôle des moisissures du genre Fusarium productrices de fumonisines par sélection de bactéries lactiques autochtones de maïs. Thèse de Doctorat. ECOLE DOCTORALE SCIENCE DE LA VIE ET DE LA SANTE. UNIVERSITE BORDEAUX I. DALLACHE F., 2006. Effets inhibiteurs des bactéries lactiques.. Bactériocines de Lactococcus et d’Enterococcus : Mise en évidence d’un support plasmidique. Thèse de doctorat. Université d’ORAN. DARRA A., 1994. L’Helicobacter au pinacle. Abstract. Hopital. 36: 15-17. DAVIDSON P.M., POST L.S., BRANER A.L., & MC CURDY A.R., 1983. Naturally occuring and miscellaneous food antimicrobials. In: Antimicrobials in Foods. eds. Davidson, P.M. and Branen, A.L. pp. 385-392. Marcel Dekker Inc., New York. 189 Références bibligraphiques DEGUCHI Y. & MORISHITA T. 1992. Nutritional requitement in miltiple auxotrophic lactic acid bacteria: genetic lesion affecting amino acid biosynthetic pathways in Lactococcus lactis, Enterococcus faecium and Pediococcus acidilactic", Biosci. Biotechnol. Biochem., 56: 913-918. DE KORWIN J.-D., 1993. Helicobacter pylori et muqueuses gastriques et duodénales. Lettre. Infect. 8 : 164-171. DE KORWIN J.-D., 1994a. Réponse immunitaire locale, cytokines et Helicobacter pylori. Lettre. Infect. 4 : 14 – 20. DE KORWIN J.-D., 1994b. Helicobacter pylori. Pathologie. Comment expliquer que Helicobacter pylori présent essentiellement dans l’estomac peut être à l’origine d’une maladie duodénale ? Gastrographie. 19: 21 –33. DE KORWIN J.-D., 2003. Avantages et inconvenients des différentes méthodes de diagnostic de l’infection à H. pylori. Gastroenterol. Clin. Biol. 27 : 380-390. DELCHIER J.C., 1994. Helicobacter pylori. Diagnostic. Que penser de l’uréase test (CLO-test) ? Gastrographie. 19: 35 – 41. DELCHIER J.C., 1995. Influence d’Helicobacter pylori sur la physiologie gastrique. Hepato. Gastro. 2: 29-33. DELCHIER J.C., 1996a. Quand rechercher Helicobacter pylori ?. Gastroenterol. Clin. Biol. 20 : 34-37. DELCHIER J.C., 1996b. Méthodes de diagnostic de l’infection à Helicobacter pylori ? Le point de vue du clinicien. Let DELTENRE M., JONAS C., BUSET M., DENIS P., & DE KOSTER E., 1995. Gastric carcinoma : the Helicobacter pylori et lymphome gastrique. Hepato. Gastro 3: 91-95. DEMBELE T., OBDRZALEK V. & VOTAVA M., 1998. Inhibition of bacterial pathogens by Lactobacilli. Zentralbl. Bakteriol. 288: 395-401. DE MAN J.C., ROGOSA M. & SHARPE M.E., 1960. Amedium for the cultivation of lactobacilli. J. Appl. Bacteriol. 23: 130-135. DE MASCRAREL A . & MERLIO J.P., 1989. Mises en évidence histologiques de Campylobacter pylori. Gastroenterol. Clin. Biol. 23: 26-30. DE ROISSART H. & LUQUET F. M., 1994. Bactéries Lactiques, Aspects fondamentaux et technologiques.Uriage: Lorica. 190 Références bibligraphiques DOBRILLA G., BENVENUTI S., AMPLATZ S., & ZANCANELLA L., 1994. Chronic gastritis, intestinal metaplasia, dysplasia and Helicobacter pylori in gastric cancer: putting the pieces to gether. Ital. J. Gastroenterol. 26: 449-458. DOLEYRES Y., 2003. Production en continu de ferments lactiques probiotiques par la technique des cellules immobilisées. Faculté des études supérieures de l’université Laval Quebec. pp : 5-8. DORTU C. & THONART P. , 2009. Les bactériocines des bactéries lactiques : caractéristiques et intérêt pour la bioconservation des produits alimentaires. Biotechnologie, Agronomie. Societ. Envir. 13 : 143-154. DORVAL E.D., 1992. Gastrite chronique et ulcère duodénal: des maladies infectieuses ? Rev. Prat. Med. Gén. 162 : 82-83. DORVAL E.D., 1995. Heliobacter pylori et pathogénie de l’ulcère duodénal. Hépato. Gastro. 2 : 39-42. DRASAR B.S., 1989. The bacterial flora of the stomach and small intestine. Gastroenterol. Clin. Biol. 13: 18-2. DUBOIS A., 1996. Infections naturelles par les Helicobacters gastriques chez l’animal. Lettr. Infect. 5: 23-29. DUNN B.E., COHEN H. & BLASER M.J., 1997. Helicobacter pylori. Clin. Microbiol. Rev., 10: 720-741. DUNNE C., O'MAHONY L., MURPHY L., THORNTON G., MORRISSEY D., O'HALLORAN S., FEENEY M., FLYNN S., FITZGERALD G., DALY C., KIELY B., O 'SULLIVAN G. C., SHANAHAN F. & COLLINS J. K., 2001. In vitro selection criteria for probiotic bacteria of human origin: correlation with in vivo findings. Americ. J. Clin. Nutr. 73: 386-392. DURLU-OZKAYA F., XANTHOPOULOS V., TUNAIL N. & LITOPOULOU TZANETAKI E., 2001. Technologically important properties of lactic acid bacteria isolates from Beyaz cheese made from raw ewes’ milk. J. Appl .Microbiol. 91 (5): 861 870. EARNSHA W R.G., 1992. The antimicrobial action of lactic acid bacteria: natural food preservation systems. In: The Lactic Acid Bacteria in Health and Disease. ed. Wood, B.J.B. pp. 211-232. Elsevier Applied Science, London and New York. EATON K.A., BROOKS C.L., PORGAN D.R., & KRAKOWKA S., 1991. Essentiel role of urease in pathogenisis of gastritis induced by Helicabacter pylori in gnotobiotic piglets. Infet . Immun. 59 :2470-2475. 191 Références bibligraphiques EKLUND T., 1984. The effect of carbon dioxide on bacterial growth and on uptake processes in the bacterial membrane vesicles. Intern. J. Food Microbiol. 1: 179-185. EKLUND T., 1989. Organic acids and esters. In: Gould, G.W. (Ed.), Mechanisms of Action of Food Preservation Procedures, Elsevier Applied Science, London, pp. 161-200. EL SHAFEI H.A., ABDEL-SABOUR H., IBRAHIM N. & MOSTEFA Y.A., 2000. Isolation, screening and characterisation of the bacteriocin-producing Lactic and bacteria isolated from traditional fermented. Food. Microbiol. Res. 154: 4, 321-331. ESCHENBACH D. A., DAVICK P. R., WILLIAMS B. L., KLEBANOFF S. J., YOUNG-SMITH K., CRITCHLOW C. M. & HOLMES K. K., 1989. Prevalence of hydrogen peroxide-producing Lactobacillus species in normal women and women with bacterial vaginosis. J. Clin Microbiol. 27: 251–256. EVANS D.G., EVANS D. J. & MOOLD J.J. 1999. N-acetyl neuraminyl lactose binding Helicobacter pylori a putative colonization factor antigen. Infect. Immun. 56: 2896-2906. FAGNIEZ P.L., 1995. Helicobacter bactérie de la décennie. Rev. Prat. Med. 313: 1014. FALSEN E., PASCUAL C. & SJODEN B., 1999. Phenotypic and phylogenic characterization of a novel Lactobacillus species from human source: description of lactobacillus in. sp.nov. Int. J. Syst. Bacteriol., 49: 217-221. FARBER J.M., 1991. Microbiological aspects of modified-atmosphere packaging technology: a review. J. Food. Prot. 54: 58-70. FAUCHER J.-L., & ROSENAU A., 1991. Campylobacter et Heliobacter en pathologie digestive humaine. Med . Sci. 7: 138-152. FAUCHERE J.-L., 1994a. Infections gastriques à Helicobacter pylori. Gastroenterol. Clin. Biol. 18 : 212-216. FAUCHERE J.-L., 1994b. Helicobacter pylori. Bactériologie /Pathogénie. Quels sont les facteurs de colonisation de Helicobacter pylori? Gastrographie. 19: 5 – FAUCHERE J.-L., 1994c. Helicobacter pylori. Bactériologie/Pathogénie. Par quels mécanismes Helicobacter pylori est il pathogène ? Gastrographie. 19 : 5 – 11. FAYOL-MESSAOUDI D., BERGER C. N., COCONNIER-POLTER M. H., LIEVINLE MOAL V. & SERVIN A. L., 2005. pH-, Lactic acid-, and non-lactic acid-dependent activities of probiotic Lactobacilli against Salmonella enterica Serovar Typhimurium. Appl. Environ. Microbiol. 71 : 6008-6013. 192 Références bibligraphiques FEDERATION INTERNATIONALE DU LAIT (F.I.L). Lait et produit laitiers. Préparation des échantillons et des dilutions en vue de l'examen microbiologique. Document 122C. FELLOUS M. 2009. Résistance aux antibiotiques aux H. pylori. Thèse de Doctorat. Faculté de Medecine Paris FENNERTY M.B., 1994. Helicobacter pylori. JAMA. 19: 27-35 FLEJOU J.-F., 1989. Apport de l’anatomie pathologique à l’étude de la pathogénicité de Campylobacter pylori. Gastroenterol. Clin. Biol. 13 : 53-58. FLÉJOU J.-F., 1994. Helicobacter pylori. Pathologie. Par quels mécanisme une infection à Helicobacter pylori peut-elle favoriser le développment d’un cancer gastrique ? Gastrographie. 19 : 21 –33. FLEJOU J.-F., 1995. Lymphome gastrique et infection à Helicobacter pylori. Lett. Infect. 4 : 164 – 167. FLEJOU J.-F., 1996. Gastrite chronique et ulcères gastro-duodénaux : aspects anatomo-pathologiques, filiation et évolution. Gastroenterol. Clin. Biol. 20 : 9-13. FLEJOU J.-F., 2001. Gastrite chronique et ulcère gastro duodénale: aspects anatomopathologiques, filiation et évolution. Gastroentérolo. Clin. Biol. 26 : 9-13. FOLIGUET B., VICARI F., GUEDENET J.C., DE KORWIN J.D., & MARCHAL L., 1989. Etude en microscopie électronique à l’analyse de Campylobacter pylori et des lésions gastroduodénales associées. Gastroenterol. Clin. Biol. 13: 65-70. FOURMESTRAUX R., 1996. Helicobacter pylori et lymphome gastrique. Hepato. Gastro. 3 : 91-95 FRANÇOIS E., 1995. Helicobacter pylori et lymphomes MALT. Ann. Gastroenterol. Hépatol. 2 : 124 – 126. FREXINOS J., 1983. Hépato-gastroentérologie. 2éme édition. Edition SIMEP. FREXINOS J., ES COURROU J., LAZORTHES F., PASCAL J.P., FOURTANIER G., SUDUCA P., LEMOZY J., DUFFANT M., VINEL J.P., BALAS D., BOMMELAER G., & VOIGT J.J., 1989. Hépato gastro-enterologie. Ed.SIMEP. France FUCCIO L., ZAGARI R.M., MINARDI M.E. & BAZOLI F., 2007. Systematic review: Helicobacter pylori eradication for the prevention of gastric cancer. Aliment. Pharmacol. Ther. 25 (2): 133-41. FULLER R., 1991. Probiotics in human medicine. Gut. 32: 439– 442. 193 Références bibligraphiques FUTAMI H., TAKASHIMA M., FURUTA T., HANAI H., & KANEKO E., 1999. Relationship between Helicobacter pylori-infection and gastric metaplasia in the duodenal bulb in the pathogenesis of duodenal ulcer. J. Gastroenterol. Hepatol. 14: 14119 GARRITY G., BRENNER D., KRIEG N. & STALEY J., 2008. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology , Volume3 : The Firmicutes, Originally published by Williams and Wilkins, 1984, 2nd ed, Hardcover. pp: 1450 GRANGETTE C., NUTTEN S., PALUMBO E. et al., 2005. Enhanced antiinflammatory capacity of a Lactobacillus plantarum mutant synthesizing modified teichoic acids. Proc. Natl. Acad. Sci. 102: 10321-10326. GEIS A., 1989. Antagonist compounds produced by lactic acid bacteria. Kieler Milchwirtschaaftliche Forschungsbenchle. 41: 97-104. GEIS A., SINGH J. & TEUBER M., 1983. Potential of lactic streptococci to producebacteriocin. Appl. Environ. Microbiol., 45: 205-211. GIBSON G. R. & ROBERFROID M. B., 1995. Dietary modulation of the human colonic microbiota: introducing the concept of prebiotics. J. Nutr. 125: 1401-1412. GIUSEPPE D.G., ANTONELLO C.I., JOHN L.T., CESARE M., RINO R., 2001. The design of vaccines against Helicobacter pylori and their development. Annu. Rev.Immunol. 19: 523-63. GOLDIN B.R., SHERWOOD L.. SAXELIN M BARAKAT S.GUALTERI L. & SALMINEN S., 1992. Survival of Lactobacillus species (Strain GG) in human gastrointestinal tract. Dig. Dis. Sci., 37: 121-128. GOODWIN C.S., ARMSTRONG J.A., CHILVERS T., PETERS M., COLLINS M.D., SLY L., MCCONNEL W. & HARPER W.E.S. 1989. Transfer of Campylobacter pylori and Campylobacter mustelae to Helicobacter gen. nov. as Helicobacter pylori comb. Nov. and Helicobacter mustelae comb. nov., respectively. Int. J. Sys. Bacteriol. 39: 397 – 405. GOTTELAND M, BRUNSER O. & CRUCHET S. 2006. Systematic review: are probiotics useful in controlling gastric colonization by Helicobacter pylori? Aliment. Pharmacol. Ther. 23: 1077–1086. GÖTZ J.M., VEENENDAAL R.A., BIEMOND I., MULLER E.S.M., VESELIC M. & LAMERS C.B.H.W., 1994. Local mucosal somatostatin concentrations of gastric antrum and body, and serum gastrin levels in relation to the extent of Helicobacter pylori-associated gastric mucosal inflammation the body link. Gastroenterol. 106: 83. 194 Références bibligraphiques GOURNIER-CHATEAU N., LARPENT J. P., CASTILLANOS M. I. & LARPENT J. L., 1994. Les probiotiques en alimentation animale et humaine. Édition Technologie et documentation. Lavoisier. Paris. France. pp. 1-192 GOUYON B., CHEMTOB A., & RUSZNIEWSKI P., 1996. Ulcère gastro-duodénal de l’adulte. Rev.Prat. Doss. Méd. Géneral. 328: 21-40. GRAHAM D.Y. & KLEIN P.D. 2000. Accurate diagnosis of Helicobacter pylori: 13Curea breath test. Gastroenterol. Clin. N. Am.; 29:885-94. GRATIA A., 1925. Sur un remarquable exemple d'antagonisme entre deux souches de colibacille. C. R. S. Soc. Biol. Fil. 93: 2791-2792. GUARNER F. MALAGELADA J. R., 2003. Gut flora in health and disease. Lancet 361, 512-519. GUERRE J., 1996. pathologie gastroduodénale et Helicobacter pylori. 9e Congrès International du Groupe Européen d’Etudes sur Helicobacter pylori. Compte rendu de congrés. 39: 1026-1028 GUIRAUD J., 1998. Microbiologie alimentaire. Ed Dunod. pp : 285-294. HACHEM C.Y., CLARRIDGE J.E., EVANS D.G. & GRAHAM D.Y., 1994. Which is the best medium for isolution of Heliobacter pylori from gastric musocal biopsies ? Am . J. Gastroenterol . 89 : 9. HAMILTON-MILLER J.M.T., 2003 The role of probiotics in the treatment and prevention of Helicobacter pylori infection. Int. J. Antimicrob. Agric., 22: 360–366. Hammes W. P. & Hertel C. 1998. New developments in meat starter cultures. Meat Science 49, S125-S138. Hammes W.P., & Hertel C., 2003. The Genera Lactobacillus and Carnobacterium. In The Prokaryotes: An Evolving Electronic Resource for the Microbiological Community. Edited by M. Dworkin. NewYork HANDT L.K., FOX J.G., DEWHIRST F.E., FRASER G.J., PASTER B.J., YAN L.L., ROZMIAREK H., RUFO R., & STALIS I.H., 1994. Helicobacter pylori isolated from the domestic cat: public health implications. Infect. Immun. 62: 23672374. HARRIGAN W.F. ET MC CANCE M.E., 1976. Laboratory Methods in Food and Dairy Microbiology, Academic Press, Orlando. HAZELL S.L., LEE A., BRADY L., & HENNESSY W., 1986. Campylobacter pyloridis and gastritis. Association with intercellular spaces and adaptation to an 195 Références bibligraphiques environment of mucus as important factors in colonization of the gastric epithelium. J. Infect. Dis. 153: 658-663. HAZELL S.L., EICHBERG J.W., LEE D.R., ALPERT L., EVANS D.J.J.R., & GRAHAM D.Y., 1992. Selection of the chimpanzee over the baboon as a model for Helicobacter pylori infection . Gastroenterol. 103: 848-854. HELANDER I.M., VON WRIGHT A. & MATTILASANDHOLM T.M. 1997. Potential of lactic acid bacteria and Novel antimicrobials against Gram-negative bacteria. Trends. Food. Sc. Technol. 8: 146-150. HICKSON M., D'SOUZA A.L., MUTHU N., ROGERS T.R., WANT S., RAJKUMAR C., & BULPITT C.J., 2007. Use of probiotic Lactobacillus preparation to prevent diarrhoea associated with antibiotics: randomised double blind placebo controlled trial. BMJ. 335, 80-83. HO G.Y., WINDSOR H.M. 2000. Accurate diagnosis of Helicobacter pylori: Polymerase chain reaction tests. Gastroenterol. Clin. N. Am. 29: 903-916. HOLZAPFEL W.H., HABERER P., GEISEN R., BJÖRKROTH J. & SCHILLINGER U. 2001. Taxonomy and important features of probiotic microorganisms in food and nutrition. Am. J. Clin. Nutr. 73: 365S-73S. HOOPER L. V., & GORDON J. I., 2001. Commensal host-bacterial relationships in the gut. Sci. 292: 1115-1118. HOSONO A., YASTUKI K. & TOKITA F., 1977. Isolation and characterization of an inhibitory substance against E. coli produced by Lactobacillus acidophilus. Milchwissenschaft. 32: 727-730. HOTCHKISS J.H., CHEN J.H., & LAWLESS H.T., 1999. Combined effects of carbon dioxide addition and barrier films on microbial and sensory changes in pasteurized milk. J. Dairy Sci. 82: 690-695. HOUDART P ., 1995. Du nouveau pour guérir l’ulcère de l’estomac . TOP Santé. 62: 18- 21 . HUANG L., FORSBERG C.W. & GIBBINS L.N., 1986. Influence of external pH and fermentation products on Clostridium acetobutylicum intracellular pH and cellular distribution of fermented products. Appl. Environ. Microbiol. 51: 1230-1234. HUNT RH., 2006. WGO-OMGE practice guideline highlights: Helicobacter pylori in developing countries. World. Gastroenterol. News. 11: 22–9. HUSSELL T., TSAACSON P.G., GRAGTREE J.E. & SPENCER J., 1993. The response of cells from low-grade B-cell gastric lymphomas of mucosa-associated lymphoid tissue et Helicobacter pylori. Lancet.. 342: 571-574. 196 Références bibligraphiques HWANHLEM N., BURADALENG S., WATTANACHANT S et al., 2011. Isolation and screening of lactic acid bacteria from Thai traditional fermented fish (Plasom) and production of Plasom from selected strains. Elsevier. Food. Control. 22: 401-407. ILLOUL G., BIAD A ., GUECHI Z ., MOULOUDJI D., SI AHMED AREZKI F., AZZAL S., FERRAH Z., KHAROUBI S., HASSANI M., & LAGGOUNE D., 1995. Infection à Helicobacter pylori et pathologie digestive. J. Alg. Med. 5: 256 –303. ISOLAURI E., SALMINEN S., & OUWEHAND A. C., 2004. Probiotics. Best Practice & Resch.. Clin. Gastroenterol. 18: 299-313. JACK R. W., TAGG T. R. ET RAY B. 1995. Bacteriocins of Gram positive bacteria. Microbiol. Rev. 59: 171-200. JAMES R., LAZDUNSKI C. PATTUS F., 1991. Bacteriocins, Microcins and Lantibiotics, vol. H 65, Springer, New York, pp. 519. JAY M.J., 1982. Antimicrobial properties of diacetyl. Appl. Environ. Microbiol. 44: 525–532. JENNESS R., Composition and characteristics of goat milk. 1982. J. Dairy Sci., 63: 605. JUILLARD V., SPINNLER M., DESMAZEAUD M.J., ET BOUQUIEN C.Y., 1987. Phénomène de coopération et d’inhibition entre les bacteries lactiques utilisées en industrie laitière. Lait. 67: 149-172. KABIR A.M.A., AIBA Y. TAKAGI A., KAMIYA S., MIWA T. & KOGA Y., 1997. Prevention of Helicobacter pylori infection by lactobacilli in a gnotobiotic murine model.; But. 41: 49–50. KACEM M., ZADI-KAREM H. & KAREM N-E. 2002. Bactéries lactiques isolées de lait de vaches, de brebis et de chèvres de l’Ouest Algerien. Renc. Rech. Ruminants. 9: 375. KAILASAPATHY K., & CHIN J., 2000. Survival and therapeutic potential of probiotic organisms with reference to Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium spp. Immunol. Cell. Biol. 78: 80-88. KALCHAYANAND N., HANILIN M.B. & RAY B., 1992. Sublethal injury makes Gramnegative and resistant Gram-positive bacteria sensitive to the bacteriocins pediocin AcH and nisin. Lett. Appl. Microbiol. 15: 239-243. KANDLER O. & WEISS N., 1986. Regular non-sporning Gram-positive rods. Genus Lactobacillus (Beijerink 1901.22). In Bergey’s Manual ofSystematic Bacteriology Vol 2, ed. Sneath. PHA, Mair NS, Sharpe ME and Holt JG, pp. 1208-1234. 197 Références bibligraphiques KANDLER O., 1983. Carbohydrate metabolism in lactic acid bacteria. Antonie van Leeuwenhoek . 49: 209-224. KASHKET E.R., 1987. Bioenergetics of lactic acid bacteria: cytoplasmic pH and osmotolerance. FEMS Microbiol. Rev. 46: 233-244. KELLY S.M., CUMMINGS J.H., MACFARLANE G.T., GRIMES V., MACFARLANE S. & BIBSON G.R., 1993. Occurence of Helicobacter pylori in fecal specimens from patients with dyspepsia in the UK. Gastroenterol. 104: A 116. KEMPLER G.M., & MC KAY L.L., 1980. Improved medium for the detection of citratefermenting Streptococcus lactis ssp. diacetylactis. Appl. Environ. Microbiol. 39: 926-927. KHEDID K., FAID M., MOKHTARI A., SOULAYMANI A. & ZINEDINE A. , 2006. Characterization of lactic acid bacteria isolated from the one humped camel milk produced in Morocco. Microbiol. Resch. 1-11 . KHURANA R., FISCHBACH L., CHIBA N., VAN ZANTEN S.V., SHERMAN P.M., GEORGE B.A., GOODMAN K.J., GOLD B.D., 2007. Meta-analysis: Helicobacter pylori Eradication Treatment Efficacy in Children. Aliment Pharmacol Ther. 25 (5): 523-535. KLAENHAMMER T.R., 1988. Bacteriocins of lactic acid bacteria. Biochimie.70: 337-349. KLEIN G., 2001. International Committee of Systemat ic Bacteriology. Subcommittee on the Taxonomy of Bifidobacterium, Lactobacillus and Related Organisms. Minutes of the Meeting. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51, 259-261. KLEIN, G., PACK A. & BONAPARTE C., 1998. Taxonomy and physiology of probiotic lactic acid bacteria. Int. J. Food Microbiol. 41: 103-125. KONG S. & DAVISON A.J., 1980. The role of interactions between O2, H2, OH- and O2 in free radical damage to biological systems. Arch. Biochem. Biophys. 204: 13-29. KOSUNEN T.U., SEPPÄLÄ K., SARNA S. & SIPPONEN P. 1992. Diagnostic value of decreasing IgG, IgA and IgM antibody titres after eradication of Helicobacter pylori. Lancet. 11 : :893-895. KUIPERS E.J., 1995. Helicobacter pylori et atrophie gastrique. Lett. Infect. 4 : 159 – 163. KULSHRESTHA D.C. & MARTH E.H., 1974. Inhibition of bacteria by some volatile and non-volatile compounds associated with milk. I. Escherichia coli. J. Milk Food. Technol. 37: 510-516. LABAYE D., 1990. Hepato-gastro entérologie. 2éme éditions. Editions Lamarre .Paris. 198 Références bibligraphiques LABIGNE A., 1994. Existe t-il des souches ulcérogénes de Helicobacter pylori ? Lettre. Infect. 4 : 21 –27. LACHANCE M., 2000. Purification et caractérisation d’une bactériocine produite par Lactococcus lactis ssp lactis MJC 15. Université Laval. 10-25. LAGE A. P., GODFROID E., FAUCONNIER A., BURETTE A., BUTZLER J-P., BOLLEN A. & GLUPCZYNSKI Y. 1995. Diagnosis of Helicobacter pylori Infection by PCR: Comparison with Other Invasive Techniques and Detection of cagA Gene in Gastric Biopsy Specimens. J. Clin. Microbiol. 33 (10): 2752–2756. LAMARQUE D., 1998. Helicobacter pylori. Gastrographies. pp: 3 – 6. LAMBO J-F., INGRAM C-G. , JONSTHON I-A. & PITMAN R-M., 1990 : Digestion et nutrition Manuel de physiologie .Ed .MASSON , Paris .pp :147-186. LAMOULIATTE H., 1989. Traitement des gastrites chroniques associées à Campylobacter pylori. Gastroenterol. Clin. Biol. 13: 101 – 106. LAMOULIATTE H., 1994a. Traitement de l’infection à Helicobacter pylori et conséquences économiques. Lettre. Infect. 4: 38-42. LAMOULIATTE H., 1994b. Comment éradiquer Helicobacter pylori ? . Gastroenterol. Clin. Biol. 18 : 223 – 228. LAMOULIATTE H., 1994c. Helicobacter pylori. Thérapeutique. A-t’il un traitement optimal pour éradiquer Helicobacter pylori ? Gastrographie. 9: 43 – 51 LAMOULIATTE H., MEGRAND F., & CAYLA R., 1992. Helicobacter pylori et pathologie gastroduodénale. Encyclopédie Médico-chirurgicale. Editions techniques. EMC. LARSEN A.G., VOGENSEN F.K. & JOSEPHSEN J., 1993. Antimicrobial activity of lactic acid bacteria isolated from sour doughs; purification and characterization of bavaricin A, a bacteriocin produced by Lactobacillus bavaricus MI401. J. Appl. Bacteriol. 75: 113-122. LAW J. & HAANDRIKMAN A., 1997. Proteolytic enzymes of lactic acid bacteria. Int. Dairy. J. 7: 1-11. LECLERC H., BEJI A. & VINCENT P., 1989. Marqueurs moléculaires et identification des souches de Campylobacter pylori. Gastroenterol. Clin. Biol. 13 : 44 – 48. LECLERC H., & VINCENT P., 1991. Marqueurs moléculaires et identification des souches de Campylobacter pylori. Gastroenterol. Clin. Biol. 13 : 44 – 48. LEE A., 1992. Infectious causes of gastroduodenal inflammation in humans. Europ. J. Gastroenterol.. Hepatol. 4 : 1-7. 199 Références bibligraphiques LEE A., 1996: The nature of helicobacter pylori. Scend J. Gastroenterol. 5: 1-8. Lee Y.K. & Salminen S. 2009. Handbook of probiotics and prebiotics. 2nd Ed. A John Wiley and Sons, Inc, Publication. LEHTO E. M. & SALMINEN S. J., 1997. Inhibition of Salmonella typhimurium adhesion to Caco-2 cell cultures by Lactobacillus strain GG spent culture supernate: only a pH effect? FEMS . Immunol Med. Microbiol. 18 : 125-132. LE MINOR L., & VERON M., 1990. Bactériologie médicale. 2 ème édition. Ed. Flammarion : 711-721. LEODOLTER A., VAIRA D., BAZZOLI F., SCHUTZE K., HIRSCHL A., MEGRAUD F. & MALFERTHEINER P., 2003. European multicentre validation trial of two new non invasive tests for the detection of Helicobacter pylori antibodies: urine-based ELISA and rapid urine test. Aliment. Pharmacol Ther. 18 (9): 927-37. LEWIS C.B., KAISER A., & MONTVILLE T.J., 1991. Inhibition of food-borne bacterial pathogens by bacteriocins from lactic acid bacteria isolated from meat. Appl. Environ. Microbiol. 57: 1683-1688. LIN H. C., SU B. H., CHEN A. C., LIN T. W., TSAI C. H., YEH T. F., & OH W., 2005. Oral probiotics reduce the incidence and severity of necrotizing enterocolitis in very low birth weight infants. Pediatrics. 115: 1-4. LINDGREN S.E. & DOBROGOSZ W.J., 1990. Antagonistic activities of lactic acid bacteria in food and feed fermentations. FEMS Microbiol. Rev. 87: 149-164. LOGAN R.P., 1998. Urea breath tests in the management of Helicobacter pylori infection. Gut . 43: S47-S50. LORCA G.L., WADSTROM T., DE VALDEZ G.F. & JUNGH L. A., 2001. Lactobacillus acidophilus autolysins inhibit Helicobacter pylori in vitro. Current. Microbiol. 42 : 39-44. LOZNIEWSKI A., 1996. Méthodes diagnostiques de l’infection de Helicobacter pylori. Gastroenterol. Clin. Biol. 20 : 111-118. LYNCH N.A., 1997. Helicobacter pylori and ulcers: a paradigm revised. Biosci. 11: 109-115. MALAKAR P. K., MARTENS D. E., ZWIETERING, M. H., BÉAL, C. & VAN'T RIET, K. 1999. Modelling the interactions between Lactobacillus curvatus and Enterobacter cloacae.II. Mixed cultures and shelf life predictions. Int. J. Food. Microbiol. 51, 67–79 200 Références bibligraphiques MALFERTHEINER P., MEGRAUD F., O’MORAIN C., HUNGIN A.P., JONES R., AXON A., GRAHAM D.Y. & TYTGAT G., 2002. Current concepts in the management of Helicobacter pylori infection – The Maastricht 2-2000 Consensus Report. Aliment. Pharmacol. Ther., 16: 167–180. MARCHAL N., BOURDON J.L., & RICHARD C., 1991. Les milieux de culture : pour l’isolement et l’identification biochimiques des bactéries. Nouvelle édition . Doin éditeurs. Paris. pp:3-511. MARELLI G., PAPALEO E., & FERRARI A., 2004. Lactobacilli for prevention of urogenital infections: a review. E. R. Med. Pharmacol. Sci. 8: 87-95. MARSHAL B.J., & WARREN J.R., 1984. Unidentified curved bacilli in the stomach of patients with gastritis and peptic ulceration. Lancet. 1: 1311-1315 MARSHAL B.J., & GOODWIN C.S., 1987. Campylobacter pyloridis. Int. J. Syst. Bacteriol. 37: 68. Revised nomenclature of MARSHALL, B.J., 1989. Experimental models in vivo for Campylobacter pylori. Gastroenterol. Clin. Biol. 13: 50-52. MARSHALL B.J., BARRET L.J., PRAKESH C., MC CALLUM R.W., & GUEVANT R.L., 1988. Protection of Campylobacter pyloridis but not Campylobacter jejuni (CJ) against acid susceptibility by urea. 402-403. In : KAUSER B., ET FALSEN E. Campylobacter IV. University of Göteboig (Sweden). Göteborg. MARTIN M., 2007. LA PCR en temps réel. Choix d’amorces et analyses des résultats. INRA Toulouse. MATHARA, J.M., SCHILLINGER, U., KUTIMA, P.M., MBUGUA, S.K. ET HOLZAPFEL, W.H., 2004. Isolation, identification and characterisation of the dominant microorganisms of kule naoto: the Maasai traditional fermented milk in Kenya. Int. J. Food Microbiol. 94: 3, 269-278. MAZIGH MRDA S., BOUKHTIR S. et al., 2005. L'infection à Helicobacter pylori chez l'enfant. Tunusie Medicale. 83 (10): 599-602. MEDOUAKH L. & BENSOLTANE A., 2010. Acquisition of iron and production of siderophores in Helicobacter pylori. Sci. Technol. 31: 46-51. MEDOUAKH L., AIT-ABDESLAM A. & BENSOLTANE A. 2010. Antagonistic activity of Lactobacillus sp. against Helicobacter pylori. Intl. J. Microbiol. Res.1 (3): 80-86. 201 Références bibligraphiques MEDOUAKH L., TABAK S., BEKKADA A., MAHI M., ROUISSAT L., YAGOUBI A. & BENSOLTANE A., 2006. Isolation and characterization of Helicobacter pylori from patients suffering from gastroduodenal ulcer disease. Egypt. J. Appl. Sci. 21(3): 406-417. MEDOUAKH L., AIT ABDESLAM A., KRANTAR K. & BENSOLTANE A., 2008. Detection of siderophores in Helicobacter pylori. Egypt. J. Appl. Sci. 23 (4A): 91102. MEGRAUD F., 1989. Méthodes bactériologiques pour le diagnostic de Campylobacter pylori. Gastroenterol. Clin. Biol. 13: 31-36. MEGRAUD F., 1992. Méthodes diagnostiques pour Helicobacter pylori. GEFH. pp: 15-19. MEGRAUD F., 1994a. Méthodes diagnostiques directes et indirectes de Helicobacter pylori. Gastroenterol. Clin. Biol. 18 : 217-222. MEGRAUD F., 1994b. Mise en évidence de Helicobacter pylori au niveau de biopsies gastriques par les méthodes bactériologiques. Revue française des laboratoires. MEGRAUD F., 1994c. Difficultés pratiques de l’éradication d’Helicobacter pylori dans la maladie ulcéreuse duodénale. Med. Hyg. 52: 1813-1816. MEGRAUD F., 1994d. Helicobacter pylori. Bactériologie/Pathogénie. Quelles sont les particularités de Helicobacter pylori. Gastrographie. 19 : 5 – 11. MEGRAUD F., 1994e. Helicobacter pylori. Bactériologie/Pathogénie. Pourquoi a –t-il fallu attendre 1982 pour cultiver Helicobacter pylori pour la première fois. Gastrographie. 19 : 5 – 11. MEGRAUD F., 1994f. Helicobacter pylori. Epidémiologie. Comment expliquer la courbe de prévalence de l’infection à Helicobacter pylori observée actuellement dans les pays développés ? Gastrographie. 19 : 13 – 19. MEGRAUD F., 1994g. Helicobacter pylori. Diagnostic. Comment transporter les biopsies pour un examen bactériologique ? Gastrographie. 19 : 35 – 41. MEGRAUD F., 1996a. Comment rechercher Helicobacter pylori. Gastroenterol. Clin. Biol. 20: 38-43. MEGRAUD F., 1996 b. Helicobacter pylori. Historique et épidémiologie. Quot. Med : 4 –83. 202 Références bibligraphiques MEGRAUD F., 1996 c. Méthodes de diagnostic de l’infection à Helicobacter pylori. Le point de vue du biologiste. Lettre. Infec. 5 : 17-22. MEGRAUD F., 2007. Détection de H. pylori et de sa sensibilité aux antibiotiques. Gastroenterol. Clin. Biol. 31: 791. MEGRAUD F. & Lamouliatte H., 1992. Helicobacter pylori and duodenal ulcer. Evidence suggesting causation. Dig. Dis. Sci. 37:769–772. MEGRAUD F., & LABIGNE A., 1998. Helibacter pylori. Traité de microbiologie chimique. Institut Pasteur. MEHTA, A.M., PATEL, K.A., ET DAVE, P.J., 1984. Purification and some properties of an inhibitory protein isolated from Lactobacillus acidophilus AR1. Milchwissenschaft 39: 8689. MERCENIER A., PAVAN S., & POT B., 2002. Probiotics as biotherapeutic agents: Present knowledge and future prospects. Current Pharmaceutical Design. 8: 99-110. METCHNIKOFF E., 1907. The prolongation of life. In Optimistic Studies (Heinemann W., Ed.), G. P. Putnam and Sons, London, UK. pp. 1-100. . MICHETTI P., DORTA G., BRASSART D., VOUILLAMOZ D., SCHWITZER W., FELLEY C., BLUM A.L., PORTA N., ROUVET M. & CORTHESYTHEULAZ I., 1995. Lactobacillus acidophilus supernatant as a adjuvant in the therapy of H. pylori in humans. Gastroenterol., 108:A166. MICHETTI P., DORTA G., WIESEL P.H., BRASSART D., VERDU E., HERRANZ M., FELLEY C., PORTA ROUVET N., BLUMAL M.& CORTHESY-THEULAZ I. ,1999. Effect of whey-based culture supernatant of Lactobacillus acidophilus (johnsonii) La1 on Helicobacter pylori infection in humans. Dig. 60: 203–209. MIDOLO P.D., LAMBERT J.R., HULL R., LUO F., GRAYSON M.L., 1995. In vitro inhibition of Helicobacter pylori NCTC 11637 by organic acids and lactic acid bacteria. J. App. Bacteriol. 79: 475–479. MIGNON M., 2001. Les traitements d’éradication de H. pylori. Dossier du CNHIM. XXII (5). MIKELSAAR M., TÜRI M., LENCNER H., KOLTS K., KIRCH R., AND LENCNER A. 1987. Interrelations between mucosal and luminal microflora of gastrointestine. Nahrung. 31, 449-56, 637-8. MILLIERE J.B., MATHOT A.-G., SCHMITT P. & DIVIES, C., 1989. Phenotypic characterization of Leuconostoc species. J. Appl. Bacteriol. 67: 529-542. 203 Références bibligraphiques MINNIS J.A., TAYLOR T.E., KNESEK J.E., PETERSON W.L., & MCINTIRE S.A., 1995. characterization of a 3,5-kbp plasmid from Helicobacter pylori. Plasmid. 34: 22-36. MISSONNIER F. & DORVAL E.D., 1994. Helicobacter pylori. Conc. Méd. 116: 2590-2592. MOELLER V., 1955. Simplified tests for amino acid decarboxylases and for the arginine dihydrolase system. Acta. Pathol. Microbiol. Scand. 43: 158-172. MONTEIRO L., 1995. Helicobacter pylori: facteurs pathogens bactériens. Hepat. Gastro. 2: 23-27. MOORE W. E. C., & HOLDEMAN L. V., 1974. Human faecal flora: the normal flora of 20 Japanese-Hawaiians. Applied Microbiology, 27, 961-979. Morishita T., Deguchi Y., Yajima M., Sakurai T., and Yura T. 1981.Multiple Nutritional Requirements of Lactobacilli: Genetic Lesions Affecting Amino Acid Biosynthetic Pathways. J. Bacteriol. 148: 64-71. MORRIS J.G., 1976. Oxygen and the obligate anaerobe. J. Appl. Bacteriol. 40: 229244. MORRIS A., & NICHOLSON G., 1987. Ingestion of Campylobacter pyloridis causes gastritis and raised fasting gastric pH. Am. J. Gastroenterol. 82: 192-199. MRDA Z. et al., 1998. Therapy of Helicobacter pylori infection using Lactobacillus acidophilus. Med. Pregl. 51: 343-345. MUNOZ N., & PISANI P., 1994. Helicobacter pylori and gastric cancer. Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 6: 1097 – 1103. NARAYANAN N., ROYCHOUDHURY P. K. & SRIVASTAVA. A., 2004. Isolation of adh mutant of Lactobacillus rhamnosus for production of L(+) Lactic acid. Electr. J. Biotech.7 (1): 72-84. NOMURA A., STEMMERMANN G.N., CHYOU P.H., KATOL I., PEREZ – PEREZ G.I. & BLASER M.J., 1991. Helicobacter pylori infection and gastric carcinoma among japanese americans in Hawaü. N. Engl. J. Med. 325 : 1132 – 1136. NOONPAKDEE, W., SANTIVARANGKNA, C., JUMRIANGRIT, P., SONOMOTO, K. & PANYIM, S. 2003. Isolation of nisin-producing Lactococcus lactis WNC20 strain from nham, a traditional Thai fermented sausage. Int. J. Food. Microbiol. 81: 137-145. NOONPAKDEE W. JUMRIANGRIT P., WITTAYAKOM K., ZENDO J., NAKAYAMA J., SONOMOTO K. & PANYIM S., 2009. Two-peptide bacteriocin from 204 Références bibligraphiques Lactobacillus plantarum PMU 33 strainisolated from som-fak, a Thai low salt fermented fish product. Asia. Pacific. J. Mol. Biol. Biotechnol.17 (1) : 19-25. NOVEL G., 1993. Les bactéries lactiques. In: Microbiologie Industrielle, les microorganismes d’interet industriel, Eds. J.Y. Leveau et M. Bouix; Technique et documentation Lavoisier, Paris. 170-374. NOWOTTNY U. & HEILMAN K.L., 1989. Distribution of Campylobacter pylori associated gastritis in a urban and rural population. Klin. Wochenshr. 64 : 49. OGAWA M., SHIMIZU K., NOMOTO K., TANAKA R., HAMABATA T., YAMASAKI S., TAKEDA T. & TAKEDA, Y., 2001. Inhibition of in vitro growth of Shiga toxin-producing Escherichia coli O157:H7 by probiotic Lactobacillus strains due to production of lactic acid. Int. J. Food. Microbiol. 68 : 135-140. O’MORAIN C., BUCKLEY M., & COCHE J.C., 1994. Le cancer gastrique : une conséquence à long terme de l’infection de Helicobacter pylori ?. Gastroenterol. Clin. Biol. 18 : 187-189. ORLA-JENSEN, S., 1919. The lactic acid bacteria. Copenhagen, I Komision Ho Ejnarù Munsgaard. OUWEHAND A.C., 1998. Antimicrobial components from lactic acid bacteria. In: Salminen, S. and Von Wright A. (Ed.), lactic acid bacteria: Microbiology and functional aspects, 2nd edition . Marcel Dekker Inc, New York. pp. 139-159. OUWEHAND A. C., KIRJAVAINEN P. V., GRONLUND M. M., ISOLAURI S. J., & SALMINEN S., 1999. Adhesion of probiotic microorganisms to intestinal mucus. Int. Dairy. J. 9: 623-630. PARKER R. B., 1974. Probiotics, the other half of the antibiotic story. Animal Nutrition and Health. 29: 4-8. PARSONNET J., VANDERSTEEN D., GOATES J., SIBLEY R.K., PRITIKIN J.& CHANG Y., 1991. Helicobacter pylori infection in intestinal- and diffuse-type gastric adenocarcinomas. J. N. Cancer. Inst., 83: 640–643. PASTEUR L. (1857). Mémoire sur la fermentation appelée lactique. CR Séances Académiques de Sciences. 45 : 913-916. PENAUD S. 2006. Analyse de la séquence génomique et étude de l’adaptation à l’acidité de L. delbrueckii ssp. bulgaricus ATCC11842. Thèse de doctorat.. Paris-Grignon. PENFOLD S.S., LASTOVICA A.J., & ELISHA B.G., 1988. Demonstration of plasmids in Campylobacter pylori. J. Infect. Dis. 157: 850-851. 205 Références bibligraphiques PEREZ-PEREZ G.I., ROTHENBACHER D. & BRENNER H., 2004. Epidemiology of Helicobacter pylori Infection. Helicobacter, 9 (s1): 1–6. Piard J. C. et Desmazeaud M. 1991. Oxygen metabolites and catabolisme end products. Lait. 71. 525-541. PICQUE D., PERRET B., LATRILLE E ET CORRIEU G., 1992. Caractérisation et classification des bactéries lactiques à partir de la mesure de leur cinétique d’acidification. Lebensm. Wiss. U.Technol. 25: 181-186. PINCHUK I. V., P. BRESSOLLIER., B. VERNEUIL et al., 2001. In vitro antiHelicobacter pylori activity of the prbiotic strain Bacillus subtilis 3 is due to secretion of antibiotics. Antimicrob. Agents. Chemother., 45 (11): 3156-3161. Podolak P.K., Zayas J.F., Kastner C.L. & Fung D.Y.C., 1996. Inhibition of Listeria monocytogenes and Escherichia coli O157:H7 on beef by application of organic acids. J. Food Prot. 59: 370-373. POILLEUX M., 1943. Anatomie du tube digestif. Estomac-intestin. E.M.C. Editions techniques. Paris. pp : 1-4. POISSON D., 2000. “Les pieds dans le plateau”. Comité de defense du fromage fermier au lait cru. pp : 1-6 PRESSER K. A., RATKOWSKY D. A. & ROSS T. 1997. Modelling the growth rate of Escherichia coli as a function of pH and lactic acid concentration. Applied and Environmental Microbiology 63, 2355-2360. PULSANI S.R., RAO D.R., SUNKI G.R., 1997. Antimicrobial Activity of lactic cultures: partial purification and characterization of antimicrobial compounds produced by Streptococcus thermophilus. J. Food. Sci. 44 : 575-578. RAY B. & DAESCHEL M.A., 1994. Bacteriocins of starter culture bacteria, p. 133–165. In V. M. Dillon and R. G. Board (ed.), Natural antimicrobial systems and food preservation. CAB International, Wallingford, Oxford shire, United Kingdom. RAYMOND J., D. LAMARQUE S. CHAUSSADE , C. BURUCOA,. 2010. La résistance aux antibiotiques. 18e réunion annuelle du GEFH. Paris. REID G. & BURTON J. , 2002. Use of Lactobacillus to prevent infection by pathogenic bacteria. Microb. Infec. 4: 319-324. REMEUF F., COSSIN V., DERVIN C., LENOIR J. & TOMASSONE R., 1991. Relations entre les caractéristiques physico-chimiques des laits et leur aptitude fromagère. Lait.71 : 397-421. 206 Références bibligraphiques RIACHI G., & COLIN R., 1995. Helicobacter pylori. Méthodes de recherche. Impact. Med. Les dossiers du praticien. 303: 1-22. RIACHI G., SAVOYE G., & COLIN R., 1995. Helicobacter pylori. Helicobacter pylori et pathologie digestive. Impact. Med. Les dossiers du praticien . 303 : 1-22. RODRIGUEZ J.M., MARTINEZ M.I., KOK J., 2002. Pediocin PA-1, a wide-spectrum bacteriocin from lactic acid bacteria. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 42: 91-121. ROKKA S., PIHLANTO A., KORHONEN H. & JOUTSJOKI V., 2006. In vitro growth inhibition of Helicobacter pylori by Lactobacilli belonging to the Lactobacillus plantarum group. Letters. Appl. Microbiol., 43: 508-513. ROMANIUK P.J., ZOLTOWS B., TRUST T.J., LANE D.J., OLSEN G.J., PACE N.R., & STAHL D.A., 1987. Campylobacter pylori, the spiral bacterium associated with human gastritis, is not a true Campylobacter sp. J. Bacteriol. 169: 2137-2141. ROSENFELDT V., MICHAELSEN K. F., JAKOBSEN M., LARSEN C.N., MOLLER P. L., PEDERSEN P., TVEDE M., WEYREHTER H., VALERIUS N. H. & PAERREGAARD A., 2002. Effect of probiotic Lactobacillus strains in young children hospitalized with acute diarrhea. Pediat. Infect. Dis. J. 21: 411-416. ROSENFELDT V., BENFELDT E., VALERIUS N. H., PAERREGAARD A., & MICHAELSEN K. F., 2004. Effect of probiotics on gastrointestinal symptoms and small intestinal permeability in children with atopic dermatitis. Journal of Pediatry, 145, 612-616. ROSS, R. P., MORGAN, S. & HILL, C. (2002). Preservation and fermentation: past, present and future. Int. J. Food. Microbiol. 79 : 3-16. RUSZNIEWSKI P., 1994. Helicobacter pylori. Pathologie. Quelles sont les conséquences de l’infection à Helicobacter pylori sur la sécrétion gastrique acide ? Gastrographie. 19 : 21 –33. RYAN K.A., DALY P., LI Y., HOOTON C. & O’TOOLE P.W., 2008. Strainspecific inhibition of Helicobacter pylori by Lactobacillus salivarius and other lactobacilli. J. Antimicrob. Chemotherapy. 61 : 831–834. SAAD N. 2010. Caractérisation d’entités moléculaires de surface impliquées dans la relation de la bactérie probiotique Lactobacillus plantarum 299v avec l’hôte : approche in vitro. Thèse de Doctorat. Université de LIMOGES SAIDI N., 2007. La microflore lactique du lait cru de chèvre local: étude microbiologique, biochimique et génétique des bactéries lactiques d’intérêt biopréservateur. Thèse de Doctorat. Université d’ORAN . 207 Références bibligraphiques SAIDI N., GUESSAS B., BENSALAH F., BADIS A., HADADJI M., HENNI D. E., PREVOST H ET KIHAL M., 2002. "Caractérisation des bactéries lactiques isolées du lait cru de chèvre des régions arides d'Algérie", J. Algér. Rég. Arides. 1 : 1-10. SAITO T., 2004. Selection of useful probiotic lactic acid bacteria from the Lactobacillus acidophilus group and their applications to functional foods. Anim. Sci. J. 75: 1- 13. SALMINEN S. & ARVILOMMI H. , 2002. Safety of Lactobacillus strains used as probiotic agents. [Reply]. Clin. Infect. Dis. 34: 1284-1285. SALMINEN S., ISOLAURI E., & SALMINEN, E., 1996. Clinical uses of probiotics for stablising gut mucosal barrier: successful strains and future challenges. Antonie Van Leeuwenhoek. 70 : 347-358. SALMIMEN S., VON WRIGHT A., MORELLI L., MARTEAU P., BRASSARD D., DE VOS W. M., FONDEN R., SAXELIN M., COLLINS K., MOGENSEN G., BIRKELAND S. E., & MATTILA SANDHOLM T., 1998. Demonstration of safety of probiotics- a review. Int. J. Food. Microbiol. 44: 93- 106. SAMELIS J., MAUROGENAKIS F. & METAXOPOULOS J., 1994. Characterization of lactic acid bacteria isolated from naturally fermented Greek dry Salami. Int. J. Food. Microbiol. 23: 179-196. SANDINE W.E., RADICH P.C.& ELLIKER P.R., 1972. Ecology of lactic streptococci: A review. J. Milk. Technol. 35: 176-184. SAVAGE D.C., 1977. Microbiol ecology of the gastrointestinal tract. Ann. Rev. Microbiol. 31: 107-133. SCHIFFRIN E. J. & BLUM S., 2002. Interactions between the microbiota and the intestinal mucosa. E. J. Clin. Nutr.56: 60-64. SCHILLINGER, U. & LÜCKE, F.K., 1987. Identification of Lactobacilli from meat and meat products. J. Food. Microbiol. 4: 199-208. SCHLEIFER K.H. & LUDWIG W., 1995. Phylogenetic relationships of lactic acid bacteria. In The genera of lactic acid bacteria, pp. 7-18. Edited by B. J. B. Wood & W. H. Holzapfel. London: Blackie Academic&Professional. SCHNÜRER J., & MAGNUSSON J., 2005. Antifungal lactic acid bacteria as biopreservatives. Food. Sc. Technol. 16: 70-78. SCHUTZE K., HENTSCHEL E., DRA GOSICS B. & HIRSCHL A.M., 1995. Helicobacter pylori reinfection with identical organisms: transmission by the patients’ spouses. Gut. 36: 831-833. 208 Références bibligraphiques SERVIN A. L., 2004. Antagonistic activities of lactobacilli and bifidobacteria against microbial pathogens. FEMS. Microbiol. Rev. 28: 405-440. SGOURAS D., MARAGKOUDAKIS P., PETRAKI K., MARTINEZ-GONZALEZ B., ERIOTOU E., MICHOPOULOS S., KALANTZOPOULOS G., TSAKALIDOU E. & MENTIS A., 2004. In Vitro and In Vivo Inhibition of Helicobacter pylori by Lactobacillus casei Strain Shirota. Appl. Environ. Microbiol., 70 (1): 518-526. SHARPE M.E., 1979. Identification of Lactic Acid Bacteria, In: Skinner, F.A. and D.W. Lovelock (Eds.). Identification Methods for Microbiologists. London. Academic Press, pp: 233-259; SHIHATA A. & SHAH N.P., 2000. Proteolytic profiles of yogurt and probiotic bacteria. I. Dairy. J. 10: 401-408. SILVA M., JACOUBS N. V., DENEKE C. & GORBACH S. L., 1987. Antimicrobial substance from a human Lactobacillus strain. Antimicrob. Agent. Chemother. 31:1231– 1233. SIMSEK I. S., MENEVSE S., & SABIN F. I., 2000. PCR and RFLP analysis for identification and typing of Helicobacter pylori strains isolated from gastric biopsy specimens. J. Exp. Med. 190: 213 – 222. SIMOVA E. D. , BESHKOVA D. M. , ANGELOV M. P., DIMITROV ZH. P., 2008. Bacteriocin production by strain Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus BB18 during continuous prefermentation of yogurt starter culture and subsequent batch coagulation of milk. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 35: 559–567. SOBHANI I., 1994. Helicobacter pylori, lymphome et adénocarcinone gastriques. Gastroenterol. Clin. Biol. 18 : 232 – 235. SOBHANI I., FLOURIE B., LAVERGNE A., COLIMON R., MIGNON M., MODIGLIANI R., & RAMBAUD J.-C., 1991. Helicobacter pylori et pathologie gastroduodénale. Gastroenterol. Clin. Biol. 15: 405-420. SOBHANI I., BADO A. & MIGNON M., 1994. Interaction Helicobacter pylori, gastrine et sécrétion gastrique acide. Lettre. Infect. 4 : 28 –32. SOBHANI I., VALLOT T. & MIGNON M., 1995. Helicobacter pylori, une bactérie redécouverte. Son implication dans les maladies gastroduodénales. Press. Med. 24: 6779. SOUQUET J.C., 1995. Diagnostic de l’infection de Helicobacter pylori. Hepato. Gastro. 2 :17-22. 209 Références bibligraphiques SNEATH P.H.A. & HOLT J.G., 2001. Bergey’s Manual of Systematic Bbacteriology, 2nd edition. VOl 1, p. 64. A Waverly Company, Williams & Wilkins, Springer-Verlag, NY, USA. SUBRAMANIAN C. S. & OLSON N. E. 1968. Effect of hydrogen peroxide on activity of lactic starter cultures in milk. J. Dairy. Sci.. 51. 517-519. STAMER J.R., 1976. Lactic Acid Bacteria, Defigueiredo, M.P. and Spllittstoesser, D.F., Eds., Food Microbiology; Public Health and Spoilage Aspects, AVI Publishing Co. Inc., Westport, Connecticut. 404-426. STANGHELLINI V., BARBARA G., et al. 2001. “Review article: Helicobacter pylori, mucosalinflammation and symptom perception--new insights into an old hypothesis.” Aliment. Pharmacol. Ther. 1: 28-32. STANTON C., GARDINER G., MEEHAN H., COLLINS K., FITZGERALD G., LYNCH P. B., & ROSS R . P., 2001. Market potential for probiotics. Americ. J. Clin. Nutr, 73: 476- 483. STEVENS K.A., SHELDON B.W., KLAPES N.A. & KLAENHAMMER T.R., 1992. Effect of treatment conditions on nisin inactivation of gram-negative bacteria. J. Food . Protec. 55: 763-766. STILES M. E., 1996.Biopreservation by lactic acid bacteria. Antonie Van Leeuwenhoek. 70: 331-345. STILES M.E., & HOLZAPFEL W.H., 1997. Review article Lactic acid bacteria of foods and their current taxonomy. IntJ. Food. Microbiol. 36: 1-29. TABAK S., MEDOUAKH L., ADDA M., CHEKROUN A., KRANTAR K. & BENSOLTANE A., 2007. Interaction between Helicobacter pylori responsible for disease gastro-duodenales and Bifidobacteria. Egypt. J. Appl. Sci., 22(12A): 72-83. TAGG J.R., DAJANI A.S., & WANNAMAKER L.W., 1976. Bacteriocins of Grampositive bacteria, Bacteriol. Rev. 40: 722-756. TAKAHASHI M., TAGUCHI H., YAMAGUCHI H. et al., 2000. Studies of the effect of Clostridium butyricum on Helicobacter pylori in several test models including gnotobiotic mice, J. Med. Microbiol. 49: 638-642. TALARICO T.L. & DOBROGOSZ W.J, 1989. Chemical characterization of an antimicrobial substance produced by Lactobacillus reuteri. Antimicrob. Agents Chemother. 33: 674-679. TALARICO T.L., CASAS I.A., CHUNG T.C. & DOBROGOSZ W.J., 1988. Production and isolation of reuterin, a growth inhibitor produced by Lactobacillus reuteri. Antimicrob. Agents Chemother. 32: 1854-1858. 210 Références bibligraphiques TANKOVIC J., LAMARQUE D., LASCOLS C., SOUSSY C. & DELCHIER J.C., 2001. Impact of Helicobacter pylori resistance to clarithromycin on the efficacy of the omeprazole amoxicillin clarithromycin therapy. Aliment. Pharmacol. Ther. 15: 707-713. TANKOVIC J., CHAUMETTE-PLANCKAERT M-T., DEFORGES L. et al., 2007. Routine use of real-time PCR for detection of Helicobacter pylori and of clarithromycin resistance mutations. Utilisation en routine de la PCR en temps réel pour la détection de Helicobacter pylori et des mutations de résistance à la clarithromycine. Gastroenterol. Clin. Biol. 31 (10): 792-795. TANNOCK G. W., 1997. Probiotic properties of lactic-acid bacteria: plenty of scope for fundamental R & D. Trends in Biotechnology, 15, 270-274. TANNOCK, G. W., 1999. A fresh look at the intestinal microflora, p. 5-14. In G. W. Tannock (ed.), Probiotics. A critical review. Horizon Scientific Press, Norfolk, United Kingdom. TANNOCK G.W., 2005. Probiotics and Prebiotics: Scientific Aspects. Caister Academic Press, Wymondham. TEN BRINK B., MINEKUS M., VANDER VOSSEN J.M. B.M., LEER R.J. & HUIS IN’T VELD J.H.J., 1994. Antimicrobial activity of Lactobacilli: preliminary characterisation and optimisation of production of acidocin B, a novel bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus M46. J. Appl. Bacteriol. 77: 140–148. TIJIA T.A., HARPER W.E.S., GOODWIN C.S., & GRUBB W.B., 1987. Plasmids in Campylobacter pyloridis. Microbiol. Lett. 36: 7-11. TURCHET P., LAURENZANO M., AUBOIRON S., & ANTOINE J. M., 2003. Effect of fermented milk containing the probiotic Lactobacillus casei DN-114001 on winter infections in free-living elderly subjects: a randomised, controlled pilot study. Journal of Nutrition and Health. Aging. 7: 75-77. TSAI C-C., HUANG L-F., LIN C-C. & TSEN H-Y. , 2004. Antagonistic activity against Helicobacter pylori infection in vitro by a strain of Enterococcus faecium TM39. Int. J. Food. Microbiol., 96: 1–12 UEMURA N., OKAMOTO S., YAMAMOTO S. et al., 2001. Helicobacter pylori infection and the development of gastric cancer. N. Engl. J. Med., 345: 784–789. VAIRA D., HOLTON J., et al. 2000. “Review article: invasive and non-invasive tests for Helicobacter pylori infection.” Aliment Pharmacol Ther. 3: 13-22. VALLOT T., 1994. Helicobacter pylori et pathologie gastroduodénale. Rev. Prat. 7: 894-899. 211 Références bibligraphiques VALLOT T. & MERROUCHE M., 1992. Helicobacter pylori et maladie ulcéreuse duodénale. Rev. Prat. 42 : 11-15. VAN BELKUM M.J., HAYEMA B.J., JEENINGA R.E., KOK J. & VENEMA G., 1991. Organization and nucleotide sequences of two lactococcal bacteriocin operons. Appl. Environ. Microbiol. 57: 492-498. VAN BELKUM M.J., KOK J. & VENEMA G., 1992. Cloning, sequencing, and expression in Escherichia coli of lcnB, a third bacteriocin determinant from the lactococcal bacteriocin plasmid p9B4-6. Appl. Environ. Microbiol. 58: 572-577. VAN DE GUCHTE M., EHRLICH S. ET MAGUIN E., 2001. Production of growth inhibiting factors by Lactobacillus delbrueckii. Appl. Microbiol. 91: 147-149. VANDENBERGH P.A., 1993. Lactic acid bacteria, their metabolic products and interference with microbial growth. FEMS. Micorbiol. Rev. 12: 221–238. VAN DER HULST R.W.M., KELLER J. J., RAWS E.A.J., & TYTGAT G.N.J., 1997. Traitement de l’infection à Helicobacter pylori : revue de la littérature mondiale. Helicobacter. 1: 3 –16. VELDHUYZEN VAN ZANTEN S.J.O., TIMOTHY POLLAK P., BEST L.M., BEZANSON G.S., & MARRIE T., 1994. Increasing prevalence of Helicobacter pylori infection with age: continuous risk of infection in adults rather than cohortt effect. J. Infect. Dis. 169: 434-437. VERON M., 1989. Les Campylobactéries : Gastroenterol. Clin. Biol. 13: 21 – 25. une naissance mouvementée. VERON M. & FAUCHERE J.L., 1989. Campylobacter. In : LE MINOR L., & VERON M., eds. Bactériologie médicale (2 éd) Paris. Flammarion. pp: 694-722. VINCENT P. & LECLERC H., 1991. Tube digestif et pancréas. Helicobacter, etiologie et épidémiologie. Gastroenterol. Clin. Biol. 15: 121-123. VINCENT P., 1994a. Helicobacter pylori. Epidémiologie. Quel est le réservoir de Helicobacter pylori ? Gastrographie. 19 : 13-19. VINCENT P., 1994b. Helicobacter pylori. Epidémiologie. Quels sont les modes de contamination possibles de l’infection à Helicobacter pylori ? Gastrographie 19 : 13– 19. VINCENT P., 1995. L’habitat d’Heliobacter pylori et sa dissemination dans la population données récentes. Hépato. Gastro. 2: 7-16. 212 Références bibligraphiques VINCENT P., GOTTRAND F. & LECLERC H., 1996. Epidémiologie d’Helicobacter pylori: disparités dans la distribution de l’infection. Gastroenterol. Clin. Biol. 20 : 27-33. VINCENT P., MICHAUD L., MARTIN DE LASALLE E., BENON B., TURCK D. & GOTTRAND F., 1999. 13C-urea breath test and gastric mucosal colonization by Helicobacter pylori in children: quantitative relation and usefulness for diagnosis of infection. Helicobacter. 4: 233- 237. WADSTRÖM T., 1995. An update on Heliobacter pylori. Current. Opinion. Gastroenterol. 11: 69-75. WANG P. H., HSU C. I., TANG S. C., HUANG Y. L., LIN J. Y. & KO J. L., 2004. Fungal immunomodulatory protein from Flammulina velutipes induces interferon-gamma production through p38 mitogen-activated protein kinase signaling pathway. J. Agricult. Food. Chemist. 52: 2721-2725. WEEB P.M., KNIGHT T., ELDER J.B., NEWEL D.G., & FORMAN D., 1997. Helicobacter pylori est-il transmit du chat à l’homme . Helicobacter. 1 : 22-24. WENDAKOON C.N., FEDIO W., MACLEOD A. & OZIMEK L., 1998. In vitro inhibition of Helicobacter pylori by dairy starter cultures. Milchwissenschaft. 53: 499– 502. WITTWER C.T., RIRIE K.M., ANDREW R.V., DAVID D.A., GUNDRY R.A. & BALIS U.J., 1997. The Light Cycler: a microvolume multisample fluorimeter with rapid temperature control. BioTechniques. 22: 176–181. WHO H., 1974. Toxicological evaluation of some food additives including anticaking agents, antimicrobials, antioxidants, emulsifiers and thickening agents. WHO Food Additives 5: 461465. WONG B. C., XIAO S. D., HU F. L., QIAN S. C., HUANG N.X., LI Y.Y., HU P.J., DALDIYONO A., MANAN C., LESMANA L., CARPIO R.E., PEREZ J.Y., FOCK F.M., KACHINTORN U., PHORNPHUTKUL K., KULLAVANYAYA P., HO J., & LAM S.K., 2000. Comparison of lansopnazole – based triple and dual therapy for treatment of Helicobacter pylori-related duodenal ulcer : an Asian multicenter double-blind randomized placebo coàntrolled study. Aliment. Pharmacol. Ther. 14: 217–224. WONG H.-C. & CHEN Y.-L., 1988. Effects of lactic acid bacteria and organic acids on growth and germination of Bacillus cereus. Appl. Environ. Microbiol. 54: 2179-2184. WOOLFORD M. K., 1975. Microbiological screening of food preservatives, cold sterilants and specific antimicrobial agents as potential silage additives. J. Sci. Food Agric. 26: 229237. 213 Références bibligraphiques YOUSFI M.M., REDDY R., OSATO M.S. & GRAHAM D., 1997. Antre ou corps gastrique : quel est le meilleur site biopsique pour mettre en culture Helicobacter pylori. Helicobacter. 1: 25-26. ZAMFIR M., CALLEWAERT R., CORNEA P.C. & DE VUYST L., 2000. Production kinetics of acidophilin 801, a bacteriocin produced by Lactobacilus acidophilus IBB 801. FEMS. Microbiol. Lett. 190: 305-308. 214 Annexe Annexe Milieu MRS (MAN, ROGOSA et SHARPE, 1962) Peptone 10 g Extrait de viande 10 g Extrait de levure 5g Acétate de sodium 5g K2HPO4 2g Citrate d’ammonium 2 g 0,2 g MgSO4 7H2O MnSO4, 4H2O 0,05 g Glucose 20 g Tween 80 1 ml Eau distillée 1000 ml (+15g agar si le milieu gélosé). pH = 6,2 Solution de Ringer (g/l) NaCl 2.25 g CaCl2 0.12 g KCl 0.105 g 0.5 g NaCO3 pH= 7 Lait écrémé (Milieu de conservation) Lait en poudre 12.5 g Eau distillée 100 ml Glycérol 15 ml Répartir dans des tubes a raison de à.10 ml et autoclaver à 121°C pendant 10 min. Eau physiologique Chlorure de sodium 9g Eau distillée 1000 ml Autoclavage à 120°C pendant 20 mn. Milieu de Kempler et Mc.Kay (1980) Extrait de levure 3g Peptone 10 g Glucose 5 g Agar 15 g Eau distillée 1000 ml pH = 6,6 215 Annexe Le milieu est repartit à raison de 100 ml par flacon, puis autoclavé 20 mn à 120° C, au moment de l’emploi en ajoute : 1 ml d’une solution aqueuse de ferrocyanure de potassium à 10%. 1 ml d’une solution aqueuse à 2,5 % de citrate ferrique et citrate de sodium. Ces deux solutions stérilisées par filtration sont conservées à l’obscurité à 4° C. Gélose à l’esculine (g/l) (Guiraud, 1998) Peptone trypsique de caséine 10 Extrait de levure 5 Acétate de sodium 5 Tween 80 1 Sulfate de manganèse 0.05 Sulfate de magnésium 0.2 Esculine 5g Citrate de fer ammoniacal 0.5g Agar 15g Eau pH 6.5 Moeller (décarboxylases-bouillon) (Guiraud, 1998) Peptone 5g Extrait de viande de bœuf 5g Pourpre de bromocrésol 0.1g Rouge de crésol 5mg Pyridoxal 5mg Glucose 0.5 pH 6.0 Mettre en suspension 10.5 g de poudre dans 1L d’eau distillée. Ajouter 1 ml à 1% de L-arginine. Si nécessaire, réajuster le ph après l’addition des acides aminés. Préparer des tubes sans aminoacide qui serviront de contrôle. 1- Milieu Urée-indole : milieu commercialisé, prêt à l’emploi (Marchal et al., 1991). L-tryptophane 3g Phosphate monopotassique 1g Phosphate bipotassique 1g NaCl 5 Urée 20g Rouge de phénol à 1% 0.025g Alcool à 95% 10ml Eau distillée 1000ml pH 6,7 Campylobacter microaerophilic system : DIFCO (Marchal et al., 1991). Ce système est utilisé pour la génération de H2 et CO2 dans une jarre d’anaérobiose standard Chaque enveloppe de Campy pack contient des comprimés de borohydride de sodium, acide 216 Annexe tartarique et bicarbonate de sodium, produisant une atmosphère contenant approximativement 5% d’oxygène et 10% de CO2. Couper l’angle du sachet générateur d’H2 et CO2. Le placer en position verticale à l’intérieur de la jarre. Introduire 10 ml d’eau dans l’enveloppe. Mettre le couvercle en place et placer la jarre à l’étuve. Milieu gélose au sang (gélose chocolat) (Marchal et al., 1991) Le milieu Columbia de base pour gélose au sang est commercialisé déshydraté ou prêt à l’emploi (bioMerieux). Il convient à la culture des germes exigeants. Sa formule est la suivante : Infusion de cœur et de muscle Bio-Thione Chlorure de sodium Grélose Eau distillée pH 7.3 375g 10g 5g 15g 1000ml Mettre le milieu de base à fondre au bain-marie bouillant jusqu’à la liquéfaction complète du milieu. Refroidir le milieu à 45-50°C. Additionner 10% de sang de cheval ou de mouton défribriné stérile à la gélose fondue. Après homogénéisation par rotation, les flacons sont portés à 10min au bain-marie à 75-80°C, tout en agitant, jusqu’à l’obtention d’une teinte chocolat. Couler en boite de Pétri. Milieu sélectif à base de Wilkins Chalgren (Marchal et al., 1991). La gélose de Wilkins Chalgren, commercialisée sous forme déshydratée (Oxoid), permet la croissance de bactéries exigeantes. Sa formule (en g/l) est la suivante : Tryptone Peptone de gélatine Extrait de levure Glucose Chlorure de sodium L-arginine Pyruvate de sodium Ménadione Hémine Gélose pH 7.1 10 10 5 1 5 1 1 0.0005 0.0005 10 Mettre en suspension 43g de poudre dans un litre d’eau distillée. Porter à ébullition jusqu’à dissolution complète puis autoclaver 15min à 120°C, puis additionner les antibiotiques (10mg/l de Vancomycine, 5mg/l de cefsulodine, 100mg/l de cycloheximide ) et 10% de sang de cheval ou de mouton stérile ou. Le milieu est homogénéisé avant d’être coulé dans les boites de Pétri stériles. 217 Annexe Bouillon cœur-cervelle (BHIB) (Marchal et al., 1991) Ce milieu est particulièrement adapté à la croissance des germes exigeants. Sa composition (en g/l) est la suivante : Infusion de cervelle de veau 12.5 Infusion de cœur de bœuf 5 Peptone trypsique 10 Chlorure de sodium 5 Phosphate disodique 2.5 Glucose 2.0 pH 7.4 cœur-cervelle gélosé (BHI-agar) Il s’agit du milieu précédent (BHIB) contenant 15 g/l d’agar. Bouillon Brucella Tryptone Peptone pepsique de viande Extrait de viande Glucose Chlorure de sodium Bisulfite de sodium pH 7 10 10 2 1 5 0.1 Mueller-Hinton (pour l’antibiogramme) (Marchal et al., 1991). Extrait de viande 2 Hydrolysat acide de caséine 17,5 Amidon 1.5 Gélose 10 PH 7.4 Bouillon glycérol peptone (conservation de H. pylori) Glycérol 50 ml Peptone 2g NaCl 1g Eau distillée 150 ml pH 7.2 218 Annexe Détection AND 23S Helicobacter pylori par PCR en temps réel Mélange réactionnel Eau MgCl2 HpyA (20µM HpyS (20 µM) HpyRED (20µM) Anchor FL (20µM) Enzyme 5.28 0.64 0.16 0.16 0.08 0.08 0.80 Volume final 7.2 µl ADN 0.8 µl HpyA et HpyS: Amorces 23S HpyRED et Anchor FL : Sondes fluorescentes Enzyme : Taq polymérase ADN : échantillon de l’ADN de H. pylori (test) ou échantillon de l’ADN témoin (positif ou négatif) 2 témoins positifs : séquence ADN sauvage et séquence d’ADN muté (résistant à la clarithromycine) Témoin négatif : absence d’ADN 219