modele animal de sarcoïdose pulmonaire chez le rat par l`adjuvant

SOPHIE BOIVIN
MODELE ANIMAL DE SARCOÏDOSE PULMONAIRE
CHEZ LE RAT PAR L'ADJUVANT DE FREUND
COMPLET :ANALYSES DE PARAMÈTRES DE
L'INFLAMMATION ET DE L'EFFICACITÉ D'UN
AGONISTE NICOTINIQUE COMME THÉRAPEUTIQUE
Mémoire présenté
à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval, Québec
dans le cadre du programme de maîtrise en médecine expérimentale
pour l'obtention du grade de maître es sciences (M.Sc.)
FACULTE DE MEDECINE
UNIVERSITÉ LAVAL
QUÉBEC
2007
© Sophie Boivin, 2007
II
Résumé
La sarcoïdose est une maladie inflammatoire multisystémique s'attaquant aux poumons
dont l'étiologie demeure inconnue. Elle est caractérisée par l'accumulation de granulomes noncaséeux dans les organes touchés. L'appareil pulmonaire est fréquemment atteint par la
sarcoïdose et d'importants changements de population cellulaire sont observés dans le fluide
récolté lors de lavages bronchoalvéolaires (LBA).
Une étude précédente a démontré la
possibilité d'utiliser un modèle animal de rat pour l'étude de cette maladie. Cette étude a
démontré que l'adjuvant complet de Freund (CFA) administré par voie intraveineuse (IV) à deux
reprises induit l'apparition de granulomes qui furent, par la suite, analysés par tomographie
axiale. Le projet de recherche décrit dans ce mémoire a visé à développer, à partir du modèle
déjà connu, un modèle mieux toléré par les animaux et à analyser les caractéristiques cellulaires,
histologiques et immunologiques de celui-ci.
De plus, certains agonistes des récepteurs
nicotiniques, molécules ayant des propriétés anti-inflammatoires, seront testés sur le modèle
comme traitement potentiel. Il fut démontré lors de cette étude qu'une seule injection de CFA
cause l'apparition de granulomes dans les poumons des animaux et que cette injection est bien
tolérée par les animaux. Les analyses cellulaires des LBA des animaux malades ont permis de
noter une forte similarité avec la sarcoïdose pulmonaire humaine.
De plus, le profil
immunologique des animaux était très près de la pathologie humaine. Finalement, l'utilisation
des agonistes nicotiniques n'a pas permis d'atténuer l'inflammation reliée à cette pathologie
granulomateuse.
m
Avant-propos
Ce mémoire de maîtrise résume le travail de recherche et de laboratoire accompli durant l'année et demie
que dura ma maîtrise. Il est divisé en cinq chapitres permettant de comprendre la pathologie à laquelle je m'attarde,
de mesurer la nécessité d'un modèle animal, d'une thérapie efficace et finalement de démontrer les progrès effectués
dans ces différentes voies. Un article scientifique portant sur ces recherches sera rédigé sous peu et présenté pour
publication.
Je suis très heureuse d'avoir pris la décision de faire une maîtrise en médecine expérimentale. Ce fut une expérience
extrêmement enrichissante qui m'a permis de mesurer mes capacités et mes limites. Mais surtout cette maîtrise m'a
dirigé vers la carrière future auquel je me dédie. Grâce au Dr. Cormier qui m'a rapidement poussé à présenter mes
résultats lors de différents congrès, j'ai pu constater que la communication était mon avenir. Merci au Dr. Cormier
qui m'a fait confiance dès le début et qui m'a permis de mesurer à quel point j'aime transmettre des connaissances
scientifiques. Je le remercie aussi pour son écoute lorsque j'avais des questionnements et pour ses nombreux
conseils prodigués avec beaucoup de compréhension. Une mention spéciale pour les cours de jardinage.
Je ne pourrais passer sous silence l'aide indéfectible d'Evelyne Israël-Assayag qui était toujours présente pour me
conseiller et me diriger dans mes travaux. J'ai apprécié particulièrement ta porte qui m'étais toujours ouverte et
l'attention que tu porte à tes étudiants. Je voudrais aussi dire un gros merci à Marie-Josée Beaulieu pour ses mimes
qui m'ont immédiatement mise en confiance, mais surtout pour son aide lorsque mes journées me semblaient
irréalisables! Une mention spéciale à Mélissa Girard qui a été pour moi une figure très importante lors de ma
maîtrise. Tu as toujours répondu à mes mille et une questions, tu m'as soutenue, appuyée, bref tu as toujours été
présente pour moi. Mille merci! Un gros remerciement à tout le reste de l'équipe Cormier passée et présente; MarieRenée, Geneviève, Arnold, Yakob, Annick et Magalie. Et comment passer sous silence l'aide que m'ont apporté
Justin, Guy et Sébastien les techniciens en santé animale du Centre de recherche. Merci au Centre de Recherche de
l'Hôpital Laval pour le soutien financier qu'il m'a accordé.
Finalement, un gros gros remerciement à mes parents Marie et Gaétan qui m'ont appuyée dans mes démarches et à
ma sœur Catherine qui était toujours présente pour moi.
Merci à tous ceux qui ont contribué à mon succès!
IV
Table des matières
Pages
Résumé
Avant-propos
Table des matières
Liste des tableaux
Liste des
Liste des abréviations
figures
II
III
IV
VI
VII
VIII
Chapitre 1 ; Introduction
1.1 Pathologie; la sarcoïdose
2
1.2 La prévalence
3
UÉtiologie
3
1.3.1
Facteurs génétiques
3
1.3.2
Agents infectieux
4
1.3.3
Agents organiques et inorganiques
5
1.4 Symptômes
5
1.5 Diagnostique
6
1.6 Traitements
7
1.7 Granulome, contenu et formation
9
1.8 Caractéristiques cellulaires
10
1.8.1 Le lymphocyte T
11
1.8.2 Le macrophage alvéolaire
12
1.8.3 Le neutrophile
12
1.9 Les cytokines et chimiokines
13
1.9.1 L'interleukine-1
13
1.9.2 L'interleukine-2
13
1:9.3 L'interleukine-4
14
1.9.4 L'interleukine-6
14
1.9.5 L'interleukine-10
14
1.9.6 L'interleukine-12
15
V
1.9.7 L'interleukine-13
15
1.9.8 L'interleukine-15
16
1.9.9 L'interleukine-18
16
1.9.10 L'interféron-gamma
16
1.9.11 TNF
17
1.10 Distinction entre sarcoïdose, alvéolite allergique et tuberculose
17
1.10.1 Alvéolite allergique
17
1.10.2 Tuberculose
18
1.11 Modèles animaux de granulomes pulmonaires
18
1.11.1 Le béryllium
19
1.11.2 L'adjuvant complet de Freund
19
1.12 Nicotine
20
1.12.1 Récepteurs nicotiniques
20
1.12.2 Agonistes des récepteurs nicotiniques
21
Chapitre 2; Objectif général et objectifs spécifiques
23
Chapitre 3; Méthodologie
25
Chapitre 4; Résultats
.30
Chapitre 5; Discussion et conclusion
42
Bibliographie
48
VI
Liste des tableaux
Pages
Tableau 1.1
Pourcentage des organes touchés chez les patients
Tableau 1.2
Symptômes associés à la sarcoïdose
Tableau 1.3 Résultats des tomographies axiales effectuées au jour 0 et 33 sur les
5
31
rats du groupe contrôle
Tableau 1.4 Résultats des tomographies axiales effectuées au jour 0 et 33 sur les
rats des groupes CFA et DMPP
32
VII
liste des figures
Figure 1.1
Schéma d'un granulome non-caséeux
Pages
9
Figure 1.2
Récepteur nicotinique
21
Figure 1.3
Tomographie axiale d'un rat des groupes contrôle et CFA
30
Figure 1.4
Résultats obtenus en tomographie axiale
32
Figure 1.5
Coupes histologiques de poumons de rats des groupes contrôle et CFA
33
Figure 1.6
Résultats obtenus en histologie
33
Figure 1.7
Comptes cellulaires totaux et différentiels
34
Figure 1.8
Pourcentages des cellules en présence dans le LBA
35
Figure 1.9 : Marquage CD4 sur les cellules des LBA
36
Figure 1.10 : Ratio CD4/CD8
36
Figure 1.11: Résultats d'histologie après 45 jours
37
Figure 1.12 : Score histologique
37
Figure 1.13 : comptes cellulaires totaux et différentiels
38
Figure 1.14 : Pourcentages des cellules en présence dans le LBA
39
Figure 1.15: Marquage des cellules CD4+ et CD8+
40
Figure 1.16: Analyses immunologiques
40
VIII
Liste des abréviations
TNF
tumor necrosis factor
IL
interleukine
ACE
angiotensin converting enzyme
TAP
transporter-associated with antigen processing
NRAMP
natural resistance-associated macrophage protein
LBA
lavage bronchoalvéolaire
CD
cluster of différenciation
PMN
cellule polymorphonucléaire
NK
natural killer
1FN
interferon
CFA
adjuvant complet de Freund
IV
intraveineuse
ADN
acide désoxyribonucléique
AcH
acétyleholine
Ca
calcium
DMPP
diméthylphénylpiperazinium
se
sous-cutanée
IP
intrapéritonéale
Chapitre 1
Introduction
1. INTRODUCTION
1.1 Pathologie; la sarcoïdose
La sarcoïdose est une maladie granulomateuse multisystémique décrite depuis
125 ans et dont on ignore encore à ce jour la cause exacte [5]. Cette pathologie est
caractérisée par une réponse exagérée du système inflammatoire dirigée contre un
antigène non-identifié. La maladie peut toucher de nombreux organes tels que le
cœur, la peau, les yeux, le foie et les poumons [6]. Dans la majorité des cas de
sarcoïdose, il y a présence d'une atteinte pulmonaire et d'une atteinte des ganglions
médiastinaux.
En
effet,
l'appareil
respiratoire
est
l'organe
touché
dans
approximativement 90% des cas de sarcoïdose; on parle alors de sarcoïdose
pulmonaire [2-3].
Tableau 1.1 : Pourcentage des organes touchés chez les patients
Organes
% des patients
Ganglion lymphatique médiastinal
Poumon
Foie
Rein
Yeux
Ganglion lymphatique périphérique
Peau
Système nerveux
Coeur
95-98
>90
50-80
40-80
20-50
30
25
10
5
Adapté de la référence [1]
La sarcoïdose peut évoluer de différentes façons selon, entre autre, la gravité de
l'atteinte, la durée de la maladie et le patient lui-même. Il existe un processus de
résorption spontanée de la maladie qui ne nécessite aucun traitement et ne laisse
aucune séquelle aux personnes atteintes. Par contre, un pourcentage des malades va
développer une forme plus grave de la maladie nécessitant un traitement et pouvant
évoluer vers une forme chronique et potentiellement mortelle [1-2-6]. La sarcoïdose
peut donc être fatale, son taux de mortalité variant de 1 à 5% [1-2].
1.2 Prévalence
La sarcoïdose est une maladie observée partout à travers la planète avec une
prédominance sur le continent africain et asiatique. Elle frappe légèrement plus
souvent les femmes, peut survenir à tout âge, mais semble plus fréquente entre la
vingtaine et la quarantaine. De plus, il semble y avoir une prédominance chez les
non-fumeurs [1-2-6]. La prévalence moyenne de la maladie varie de 1 à 40 cas pour
100 000 personnes, mais peut atteindre 50 cas et plus dans les
pays à forte
prédominance [1-2-6]. Par contre, la prévalence de la maladie est fort probablement
sous-estimée. En effet, les symptômes étant non spécifiques, variables et la rémission
souvent spontanée, la sarcoïdose est parfois non diagnostiquée et même condondue
avec d'autres pathologies. Finalement, des agrégations spatiales et familiales sont
parfois observées.
Il est donc probable que certains facteurs environnementaux
(exposition à des agents) ou des prédispositions génétiques puissent influencer à la
hausse la prévalence de la sarcoïdose [1-2-4].
1.3 Etiologie
L'étiologie de la sarcoïdose demeure l'un des aspects les moins bien connus
de la maladie.
De nombreuses recherches sont présentement en cours afin
d'identifier un agent causal [1-2-3-4]. Étant donné la variabilité des symptômes
cliniques, une possible susceptibilité génétique et la similarité de la maladie à
d'autres maladies granulomateuses, il est très difficile d'arriver à une conclusion
valable [1-2]. Ainsi, diverses hypothèses sont avancées pour expliquer l'apparition
de la maladie.
1.3.1 Facteurs génétiques
II est de plus en plus accepté que divers facteurs génétiques soient impliqués dans le
développement de la sarcoïdose.
Des prédispositions génétiques pourraient être
responsables, entre autres, des divers tableaux cliniques présentés par la maladie. De
plus, cela expliquerait les prévalences variables entre les différents groupes ethniques
ainsi que la présence d'agrégations familiales dans des populations à prévalence
normale[l-2]. Ces prédispositions semblent reliées à la régulation de la réponse
immunologique à un antigène ou à la fonction des lymphocytes T [2]. Des études sur
plusieurs gènes (sujets atteints ou sains) furent effectuées et quelques uns ont plus
particulièrement attiré l'attention.
Des polymorphismes de gène codant pour des
cytokines proinflammatoires et autres molécules semblent fréquemment associés à la
pathologie.
Ces polymorphismes furent retrouvés, par exemple, dans les gènes
codant pour : le tumor necrosis factor-oc (TNF-a), l'interleukine-1
(IL-1),
l'angiotensin converting enzyme (ACE), le récepteur de la vitamine D, le transporter
associated with antigen processing (TAP) et le natural résistance associated
macrophage protein (NRAMP) [1-2-4]. Ce type de mutation peut mener à une
susceptibilité à la sarcoïdose et non à la maladie elle-même. Grâce à ces découvertes,
il fut suggéré que les différentes formes prises par la maladie pourraient être
directement reliées aux différents haplotypes . En dernier lieu, il a été démontré chez
certains patients atteints la présence de microsatellite d' acide désoxyribonucléique
(ADN) instable ou une perte d'hétérozygosité [2].
1.3.2 Agents infectieux
Certaines observations suggèrent qu'une exposition à un agent spécifique présent
dans l'environnement pourrait conduire au développement de la sarcoïdose [4]. La
prévalence de la sarcoïdose semble variable selon la saison, le lieu géographique et
même l'occupation du patient. Cela laisse supposer la présence d'un agent dans
l'environnement pouvant contribuer à déclencher le processus associé à la maladie
[2]. Dans le cas d'une sarcoïdose pulmonaire, l'inhalation de particules présente dans
l'air ouvre directement une porte d'entrée à l'agent étiologique. Plusieurs agents
infectieux peuvent être impliqués dans la maladie comme : les virus (herpès,
rétrovirus,
Epstein-Barr),
les
bactéries
(Propionibacterium acnés, Borrelia
burgdorferi, Mycoplasma, Chlamedia, Nocardia) et les mycobactéries (Mycobacteria
tuberculosis, Mycobacteriaparatuberculosis) [1-2-5].
Les anticorps contre ces agents ont tous été détectés dans les sérums de patients
atteints de sarcoïdose. Par contre, il est possible que cela soit dû à une infection
accessoire (autre) et non à une réponse spécifique à l'agent causal [1].
1.3.3 Agents organiques et inorganiques
Une dernière hypothèse explorée est l'inhalation d'un agent inorganique (béryllium,
zirconium et aluminium) ou organique qui une fois internalisé par les macrophages
agissent comme des antigènes [2-7]. Ces agents sont difficilement dégradable et
demeurent donc intacts dans les macrophages. En définitive, il n'existe toujours
aucune preuve irréfutable identifiant l'agent ou les agents mis en cause dans cette
pathologie [4].
1.4 Symptômes
Les symptômes associés à la sarcoïdose pulmonaire sont très nombreux et
variables. Principalement, cette variabilité dépend de l'origine ethnique, de la durée
de la maladie, du ou des organes touchés et de la gravité de l'atteinte granulomateuse
[1-2-6]. De plus, il existe trois manifestations de la sarcoïdose dont les tableaux
cliniques sont différents [1-2].
Tableau 1.2 : Symptômes associés à la sarcoïdose
Manifestations cliniques
Symptômes respiratoires
Toux sèche
Dyspnée
Douleur thoracique
Uveitis aiguë
Lymphadénopathie périphérique
Lésion de la peau
Érythème
Fatigue
Perte de poids
Fièvre
Adapté de la référence [2]
Fréquence (%)
30
30
28
15
7-25
15-37
4-12
4-33
27
28
10-17
La première forme de la maladie, la sarcoïdose asymptomatique est la plus répandue.
La majorité des patients atteints de sarcoïdose (30-50%) ne présentent aucun
symptôme physique incommodant et la maladie est souvent diagnostiquée par hasard
[1-2-6]. La seconde forme est la sarcoïdose avec symptômes non spécifiques. Les
manifestations physiques de cette atteinte sont d'ordre général et ceux-ci incluent la
fièvre, une perte de poids et d'appétit, une grande fatigue accompagnée de faiblesse et
de la sudation nocturne[ 1-2-6]. La dernière forme de sarcoïdose est celle présentant
des symptômes spécifiques à l'organe atteint. Pour ce qui est de la sarcoïdose
pulmonaire, les malades présentent, en plus des symptômes spécifiques, diverses
difficultés respiratoires. Les patients rapportent avoir le souffle court (dyspnée), un
sifflement respiratoire persistant, une toux sèche ainsi qu'une douleur thoracique [12-3-6]. Finalement, il est bon de noter que la sarcoïdose peut évoluer vers une forme
dite chronique lorsqu'il y a fibrose au niveau pulmonaire [1].
1.5 Diagnostic
Le diagnostique de la sarcoïdose n'est pas aisé à confirmer dû à l'absence de
tests spécifiques et à la grande diversité de tableaux cliniques [2]. Trois critères
furent proposés afin d'arriver à établir hors de tout doute raisonnable le diagnostique
de sarcoïdose. Il est essentiel que le tableau clinique et radiologique soit compatible
à celui de l'atteinte, qu'il y ait des évidences histologiques de la présence de
granulomes non-caséeux et finalement que les autres maladies pouvant présenter des
similitudes avec la sarcoïdose soient écartées [1-2].
Plusieurs tests ou procédures peuvent être utiles afin d'apporter des appuis au
diagnostique. L'histoire clinique et l'examen physique du patient est le premier test
pouvant permettre de suspecter une sarcoïdose. En effet, la présence des symptômes
d'ordre généraux ou spécifiques (partie 1.4) peuvent orienter le spécialiste sur la
bonne voie [6]. Lorsqu'une sarcoïdose pulmonaire est soupçonnée, l'obtention de
biopsies souvent associée à un LBA est l'un des meilleurs outils de diagnostique [12-3-6].
Grâce à la bronchoscopie,
des biopsies transbronchiques
bronchoalvéolaire sont effectués pour analyse.
et
un lavage
La biopsie transbronchique sera
analysée afin de vérifier l'état des poumons et déterminer s'il y a présence de
granulomes non-caséeux caractéristiques de la sarcoïdose [6]. Le liquide récolté lors
du LBA sera lui aussi afin de démontrer l'augmentation des lymphocytes et de
caractériser leur sous-population. Une des caractéristiques d'un LBA d'un patient
atteint de sarcoïdose est un changement dans le ratio des cellules CD4 et CD8 [2].
Ceci sera discuté dans les sections à venir.
Il est aussi possible d'utiliser des techniques moins invasives comme la tomographie
axiale [1-2-6] , car un fort pourcentage (environ 90%) des patients démontrent des
anormalités pulmonaires caractéristiques lors des radiographies [6]. Il peut aussi être
utile d'effectuer des tests de fonctions pulmonaires telle la spirométrie, mais ceux-ci
ne sont pas toujours corrélés avec les résultats obtenus en tomographie. Dans la
majorité des cas, les tests de fonctions pulmonaires sont normaux. Des analyses
sanguines (compte de globules blancs et rouges, calcium...) sont nécessaires afin
d'exclure l'hypercalcémie [1-6]. Finalement, il appert important de s'assurer qu'on
est bien en présence d'une sarcoïdose et non d'une tuberculose. Pour ce faire, le test
cutané à la tuberculine confirme ni infirme la présence d'une tuberculose mais ne fait
que démontrer si le sujet a été en contact avec le bacille tuberculeux[l].
1.6 Traitements
Une forte proportion des patients atteints de sarcoïdose (+ de 60%) ne reçoit
aucun traitement et la maladie s'estompe d'elle-même. Pour les patients ayant une
forme plus sévère, chronique ou dont les organes touchés sont d'une importance
vitale, un traitement peut s'avérer nécessaire [2-6]. Il n'y a pas de traitement bien
défini pour cette maladie. Les traitements proposés ne visent qu'à contrôler les
symptômes et à prévenir la perte irréversible de fonction des organes touchés [6]. De
plus, il n'existe aucune thérapie visant à traiter la « cause » de la sarcoïdose vu son
étiologie inconnue [1].
Le traitement de première ligne pour la majorité des cas de sarcoïdose (surtout
pulmonaire) est l'utilisation systémique de corticostéroïdes [1-2-3-6]. Cet agent est
celui qui agit le plus rapidement, qui est le plus fiable et celui dont les chances de
succès sont les plus élevées. La prednisone est le corticostéroïde le plus utilisé [1-6].
Les corticostéroïdes sont des anti-inflammatoires efficaces mais présentant de
nombreux effets secondaires.
La prise de poids, le diabète, l'hypertension,
l'ostéoporose, l'insomnie, l'acné, le glaucome et l'apparition de cataracte ne sont que
quelques-uns des effets secondaires rencontrés lors de la prise de cet agent. Ces effets
secondaires contribuent à rendre l'usage des corticostéroïdes controversé[2-3-6].
Il existe d'autres thérapies possibles selon l'organe touché ou lorsque le patient
démontre une résistance au traitement précédent. L'hydroxychloroquine est efficace
chez un tiers des patients et surtout chez ceux souffrants d'atteinte cutanée.
L'hydroxychloroquine fut longtemps utilisée pour le traitement de la malaria et
inhibe la présentation de l'antigène [1-2-6]. Le méthotrexate est efficace chez 60 à
80% des patients, mais doit être pris sur une longue période. Cet agent inhibe la
production de TNF-a par les macrophages et est le traitement de prédilection lors
d'une sarcoïdose cortico-résistante [1-3-6]. L'azathioprine est un inhibiteur de la
prolifération lymphocytaire efficace chez la moitié des malades [2-6].
Le
cyclophosphamide agit de la même façon que l'azithioprine mais présente des effets
secondaires plus marqués et n'est donc utilisé que lors de sarcoïdose très sévère [2-36]. De plus, il existe de nombreux autres agents utilisés seul ou en combinaison et
dont nous ne discuterons pas dans ce mémoire. Finalement, de nombreuses
recherches portant sur des traitements nouveaux et innovateurs sont en cours et
demeurent d'une grande importance pour les patients touchés.
1.7 Granulomes; contenu et formation
L'un des aspects importants de la sarcoïdose est le développement de
granulomes présents surtout dans l'appareil pulmonaire. Le granulome est composé
de plusieurs types de cellules arrangées de façon très compacte.
Le centre du
granulome contient des monocytes/macrophages ainsi que des cellules épithéloïdes.
Il contient aussi des cellules particulières appelées cellules géantes multinucléées
provenant de l'agrégation de plusieurs macrophages [4-8]. Ce centre est entouré par
des cellules T majoritairement de type CD4+, de cellules plasmatiques et quelques
rares cellules T CD8+. Telle une barrière, une enveloppe composée de collagène, de
fibronectine, de fibrine et de protéoglycane entoure l'agrégat cellulaire [4-8-9].
Macrophage
Cellule géante
multinucléée
Fibronectine
Collagène
Fibrine
protéoglycane
Cellule T
Figure 1.1 : Schéma d'un granulome non-caséeux. Le granulome est composé, en son centre, de
macrophages et de cellules géantes multinucléées (en jaune). Ces cellules sont entourées de cellules T
majoritairement CD4+ (en bleu) qui sont elle même entourée d'une enveloppe composée de
fibronectine, collagène, fibrine et protéoglycane (en noir).
Adaptée de la référence [8]
La formation de granulomes est en premier lieu un processus visant à protéger
l'organisme. En effet, la fonction du granulome lors d'une infection est de contenir le
pathogène (inconnu pour la sarcoïdose) afin de prévenir sa dissémination et de
restreindre la réponse inflammatoire [9]. Par contre, une infection granulomateuse
chronique peut causer des dommages et de la fibrose aux tissus environnants. La
formation « normale » d'un granulome est divisée en quatre phases distinctes;
l'initiation, l'accumulation, la régression et la résolution [4-9]. L'initiation est
caractérisée par l'arrivée de macrophages attirés par des stimulus inflammatoires et
qui vont commencer à créer le noyau du granulome. Lors de la phase suivante, des
cellules T CD4+ vont s'accumuler autour du noyau et recruter d'autres cellules
effectrices (ex : cellule T) et plus de macrophages. Cette phase est la plus importante
lors de la formation du granulome car sans l'apport en cellules T CD4+, le granulome
ne pourrait pas devenir mature. C'est durant la phase de régression qu'il y aura
diminution de la quantité de pathogènes. Finalement, lors de la phase de résolution, la
population de cellules infiltrées va graduellement diminuer et le processus de
cicatrisation va s'enclencher [9].
1.8 Caractéristiques cellulaires
Un processus immunitaire important à lieu dans l'appareil respiratoire juste avant
la formation de granulomes et se poursuit durant la maturation de ceux-ci. Deux
phénomènes dominent cette réponse immunitaire; l'activation des macrophages et
monocytes et l'activation des lymphocytes T [11-12]. Le contenu cellulaire des LBA
de patients atteints de la maladie est déjà bien caractérisé. Le liquide récolté lors du
LBA démontre une forte augmentation du nombre de cellules totales accompagnée
d'un pourcentage élevé en lymphocyte T de type CD4+ [4-11-12].
10
1.8.1 Le lymphocyte T
Dans un poumon normal, la quantité de lymphocytes retrouvés dépasse
rarement 10% de la quantité totale de cellules.
En terme de quantité totale de
lymphocytes, il est peu fréquent de retrouver plus de 1 X 106 lymphocytes dans un
LBA d'un individu normal [4]. De plus, on retrouve deux fois plus de lymphocytes T
CD4+ que de lymphocytes T CD8+ dans un poumon normal (ratio normal de 2) [410-11]. Lors d'une sarcoïdose pulmonaire, le nombre de lymphocyte T augmente
drastiquement. La quantité de lymphocytes T dénombrée peut être jusqu'à vingt-cinq
fois supérieure à celle
normalement retrouvée [4].
Ainsi, le pourcentage de
lymphocytes est fortement augmenté causant par le fait même une diminution de
celui des macrophages.
Une des caractéristiques importantes de cette maladie permettant de consolider un
diagnostique de sarcoïdose est le ratio de cellules CD4+/CD8+. Le déséquilibre
macrophage/lymphocyte
retrouvé lors de cette atteinte est attribuable aux
lymphocytes T CD4+.
Lors de la progression de la maladie, il y aura une
augmentation des deux types de lymphocytes T soient les CD4+ et les CD8+. Par
contre, il y aura une augmentation beaucoup plus marquée des lymphocytes T CD4+
causant un débalancement du ratio habituel (ratio CD4/CD8 anormal variant entre 5
et 15) [4-11]. L'augmentation du nombre de lymphocytes dans les poumons peut être
dû à deux mécanismes différents : le recrutement des lymphocytes T de la circulation
sanguine périphérique et la prolifération de ces même cellules dans le tissu
lymphoïde.
Il a été suggéré que des cytokines chimioattractives coopèrent à
l'expansion du bassin de lymphocytes dans les granulomes. De plus, des cytokines
produites par les macrophages alvéolaires peuvent servir de facteur de croissance
pour les lymphocytes infiltrant le tissu inflammé [11].
Il
1.8.2 Le macrophage alvéolaire
Chez une personne en santé, la contribution de la circulation sanguine au
bassin de macrophage est relativement basse (environ 1,25%). Par contre, chez les
malades, il y a production de facteurs chimiotactiques pour les leucocytes qui
permettent de recruter des monocytes du sang et ainsi favoriser le développement de
granulomes. Ainsi, il y aura une augmentation
importante
du « trafic »
macrophagique dans les poumons de patients ayant la sarcoïdose [11]. De plus, 90%
des cellules retrouvées dans les LBA normaux sont des macrophages soit 9 X 106
cellules.
Lorsqu'un individu est atteint de sarcoïdose, la quantité de macrophages
alvéolaires augmente [4-11]. Par contre, dû à la très forte augmentation de la quantité
de lymphocytes, le pourcentage de macrophages par rapport aux cellules totales
présentes dans le LBA diminue. Les macrophages jouent un rôle important dans la
présentation de l'antigène, le recrutement et l'activation des cellules T et finalement
dans le relâchement de cytokines.
Chez un patient atteint de sarcoïdose, les
macrophages alvéolaires ont une capacité de présentation de l'antigène supérieur aux
macrophages alvéolaires normaux. Les macrophages s'agrègent au site de formation
du granulome.
Ces macrophages présentent un phénotype similaire à celui des
monocytes et sont fréquemment appelés les monocytes/macrophages [11].
1.8.3 Le neutrophile
Une personne non-fumeuse et en santé présente très peu de cellules
polymorphonucléaires (PMN) dans le LBA (moins de 5%). Par contre, ce type
cellulaire est retrouvé en plus grande quantité dans le LBA de patients atteints de
sarcoïdose pulmonaire et présentant des signes radiologiques de fîbrose pulmonaire.
De plus, une augmentation de la concentration de granules libérés par le neutrophile
est décelée chez ce même type de patient [4]. La migration du PMN vers le site de la
fîbrose est médiée par les macrophages alvéolaires qui en relâchant des
chimioattractants vont attirer ces cellules. Les neutrophiles semblent jouer un rôle
dans la destruction des cellules pulmonaires et de la matrice extracellulaire [4].
12
1.9. Les cytokines et chimiokines
Les cytokines et chimiokines influencent
de nombreuses
propriétés
physiologiques des cellules. Par exemple, elles peuvent agir sur la prolifération, la
différenciation, l'activation et la chimiotaxie. Ce sont des médiateurs très importants
qui affectent les fonctions cellulaires et la communication entre cellules.
De
nombreuses données expérimentales ont contribué à associer le relâchement de
cytokines au développement de la fibrose pulmonaire [13]. La sarcoïdose étant une
maladie pulmonaire CD4 helper de type I (TH1) pouvant mener à la fibrose, il fut
proposé que des variations dans la quantité de cytokines relâchées par les cellules
pulmonaires pourraient jouer un rôle prépondérant [4-12-13]. Ainsi, plus de 20
cytokines furent reliées à la pathologie lors d'études réalisées en 1999 [4]. Les
paragraphes suivants traiteront de certaines de ces molécules.
1.9.1 Interleukine-1 (IL-1)
L'IL-1 est une cytokine pro-inflammatoire produite majoritairement par les
macrophages alvéolaires [4-13-14]. Dans les poumons, cette cytokine a une activité
de facteur de croissance accessoire pour les cellules T. De plus, cette molécule
stimule le développement
des granulomes et de la fibrose en induisant la
prolifération des fibroblastes et en augmentant la production de collagène [4-13].
1.9.2 Interleukine-2 (IL-2)
L'IL-2 est une cytokine produite par les cellules Thl [14]. Cette molécule contribue
à l'expansion de la population des cellules T activées en se liant à des récepteurs à
triple chaîne.
Elle est aussi impliquée dans la régulation de la production
d'immunoglobines et augmente la cytotoxicité des lymphocytes T cytotoxiques.
Finalement, il est bon de préciser que cette cytokine semble aussi impliquée dans
l'activations de certaines fonctions des macrophages alvéolaires [4-13].
13
1.9.3 Interleukine-4 (IL-4)
L'IL-4 est une cytokine produite par les cellules Th2 [14]. Elle sert de cofacteur pour
la prolifération de plusieurs lignées cellulaires comme les fîbroblastes [4]. Elle agit en
synergie avec l'IL-2 afin de stimuler la croissance des cellules T[13]. Comme la
sarcoïdose est une maladie de type Thl, cette cytokine est retrouvée en faible quantité
lors de la phase aiguë de la maladie. La production de celle-ci est majoritairement liée
à la phase de fibrose pulmonaire (chronicité) lors de laquelle le profil Thl laisse plus
de place au profil Th2 [4-13].
1.9.4 Interleukine-6 (IL-6)
L'IL-6 est une cytokine produite par les cellules T, les macrophages alvéolaires, les
cellules endothéliales et les fîbroblastes [4]. Cette molécule stimule les cellules B et
la prolifération des cellules T. De plus, elle peut provoquer de la fièvre et activer la
synthèse des protéines de la phase aiguë [13].
1.9.5Interleukine-10(IL-10)
L'IL-10 est une cytokine anti-inflammatoire relâchée par les cellules Th2 et les
macrophages alvéolaires [4-15]. Elle est retrouvée en concentration importante dans
les LBA de patients atteints de sarcoïdose [15]. Elle inhibe la sécrétion de diverses
cytokines pro-inflammatoires comme l'interferon (IFN) et l'IL-2. L'IL-10 stimule la
croissance des mastocytes et contribue à réguler les fonctions des cellules
présentatrices d'antigènes [4-13]. Cette cytokine joue donc un rôle important dans le
contrôle de la réponse inflammatoire et est impliquée dans le processus de résolution
spontané de la sarcoïdose pulmonaire.
14
1.9.6 Interleukine-12 (IL-12)
L'IL-12
est une cytokine de type Thl
sécrétée majoritairement
par les
monocytes/macrophages [16]. Il existe trois formes de cette cytokine; le monomère
p40, l'homodimère p40 et l'hétérodimère p70 [17]. L'IL-12 induit la différentiation
des précurseurs de cellules T (ThO) en cellules de type Thl et stimule l'activité
lytique des cellules T pulmonaires activées [4]. De plus cette molécule stimule, en
synergie avec Pinterleukine-18 (IL-18), la production d'IFN-gamma [18].
De
nombreuses études ont démontré une augmentation de la quantité d'IL-12 dans les
LBA de patients atteints de sarcoïdose pulmonaire.
1.9.7 Interleukine-13 (IL-13)
L'IL-13 est une cytokine anti-inflammatoire qui partage certaines des propriétés de
l'IL-4. Elle est produite par les cellules T de type CD4 et est déjà impliquée dans
certaines pathologies comme l'asthme.
Cette molécule inhibe la sécrétion de
plusieurs cytokines comme le TNF chez des sujets sains. Elle pourrait aussi avoir un
effet anti-inflammatoire ou influencer la réponse Thl chez des sujets atteints de
sarcoïdose [19]. De plus, l'IL-13 est un chimioattractant qui pourrait avoir une
importance particulière dans le recrutement de monocytes dans les poumons de
patients atteints de sarcoïdose [4-13].
Une étude récente a démontré une
augmentation de l'expression de l'IL-13 dans les LBA et les cellules mononucléaires
sanguines chez les malades.
Comme il est fréquent de retrouver des patients
présentant des symptômes atténués, il est possible q'un mécanisme impliquant des
cytokines anti-inflammatoires contibue à améliorer l'état des patients. Il fut proposé
que cette cytokine puisse constituer un de traitement pour cette maladie [19].
1.9.8Interleukine-15(IL-15)
15
L'IL-15 est une cytokine partageant plusieurs activités biologiques et le récepteur de
l'IL-2.
Cette molécule est sécrétée en grande quantité par les macrophages
alvéolaires lors d'une sarcoïdose pulmonaire [4-13]. L'IL-15 stimule la prolifération
et la chimiotaxie des cellules T en plus d'induire l'activation des cellules natural
killer (NK) [13]. Ces caractéristiques contribuent à favoriser le développement de
granulomes pulmonaires.
1.9.9 Interleukine-18 (IL-18)
L'IL-18 est une cytokine produite par les monocytes/macrophages. Cette molécule
agit en synergie avec l'IL-12 afin d'induire la production d'IFN-gamma par les
cellules de type Thl [16]. Ainsi, ces deux cytokines coopèrent au développement
d'une réponse inflammatoire de type Thl. De plus, l'IL-18 inhibe la production de
l'IL-10, une cytokine anti-inflammatoire [13]. Il est déjà connu que l'IL-18 est
exprimée au site inflammatoire de certaines pathologies de type Thl comme la
maladie de Crohn [18].
Plusieurs études ont démontré une augmentation de
l'expression de 1*11-18 dans les LBA de patients souffrants de sarcoïdose pulmonaires
comparativement à ceux des sujets normaux [16-18].
1.9.10 Interferon-gamma (IFN-gamma)
L'IFN-gamma est une cytokine produite par les lymphocytes de type Thl et par les
macrophages [14]. Elle est sécrétée principalement en réponse à la stimulation
synergique exercée par l'IL-12 et l'IL-18 [18].
Cette molécule augmente les
fonctions accessoires des cellules présentatrices d'antigènes, augmente les fonctions
cytotoxiques des macrophages et lymphocytes et régule la sécrétion de certaines
cytokines durant la sarcoïdose pulmonaire [4-13]. La production d'IFN-gamma est
fortement augmentée dans les LBA de patients atteints de sarcoïdose pulmonaire
[18].
16
1.9.11 Tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha)
Le TNF-a est une chimiokine sécrétée, dans les poumons, surtout par les
macrophages alvéolaires [14-20]. Elle est sécrétée en quantité très importante chez les
patients atteints de sarcoïdose pulmonaire.
Cette molécule est particulièrement
importante dans la phase initiale de la sarcoïdose. Il fut démontré qu'un relâchement
important de TNF-a par des cellules isolées de LBA était relié à la présence
d'agrégats de macrophages alvéolaires [20]. Ces agrégats de macrophages sont les
prédécesseurs de granulomes proprement dit. Ainsi, le TNF-a joue un rôle primordial
dans le recrutement et maintenance des granulomes pulmonaires. Le TNF-a est aussi
un stimulateur et un régulateur de la sécrétion de certaines cytokines (ex; IL-1 et IL6) [4].
1.10 Distinction entre sarcoïdose, alvéolite allergique et tuberculose
1.10.1 L'alvéolite allergique
L'alvéolite allergique est une maladie pulmonaire qui est causée par une réponse
immunologique à divers agents inhalés. Ces agents peuvent être des bactéries, des
moisissures et des protéines animales.
Les symptômes physiques de l'alvéolite
allergique ressemblent beaucoup à ceux présents lors de sarcoïdose. De plus, lors de
cette affection, des granulomes sont retrouvés dans le parenchyme pulmonaire [27].
Tout comme la sarcoïdose, l'alvéolite allergique est caractérisée par une forte
accumulation de cellules inflammatoires dans les poumons des patients. Elle présente
une augmentation du nombre de lymphocytes dans le liquide du LBA plus élevée
que lors d'une sarcoïdose. Contrairement à la sarcoïdose, cette maladie est marquée
par une prédominance des lymphocytes de type CD8+. En effet, on remarque une
diminution du ratio CD4/CD8 lors de l'alvéolite allergique tandis qu'on dénote une
augmentation de celui-ci lors d'une sarcoïdose [27].
17
1.10.2 La tuberculose
La tuberculose est une maladie provoquée par une mycobactérie appelée
Mycobacterium tuberculosis. Cette mycobactérie est contractée par aspiration dans
l'appareil pulmonaire. Lorsque le pathogène est inhalé, celui-ci est phagocyté par les
cellules dentritiques et les macrophages alvéolaires [28]. Suite à cela, il y aura
formation
de
granulomes
pulmonaires.
Comparativement
aux
granulomes
sarcoïdiens, la formation de granulomes lors de la tuberculose est un processus
considéré comme bénéfique pour le patient. En effet, le granulome à pour but de
circonscrire l'inflammation et d'empêcher la dissémination de la mycobactérie. La
principale différence entre la tuberculose et la sarcoïdose est le type de granulome en
présence.
En effet, les granulomes présents lors de la tuberculose sont des
granulomes caséeux tandis qu'ils sont non-caséeux dans l'autre pathologie [8]. Le
terme caséeux signifie que le centre du granulome est nécrosé.
Sur le plan cellulaire, la tuberculose est elle aussi une pathologie de type Thl
présentant une augmentation de lymphocyte majoritairement de type CD4+. Cette
augmentation demeure légèrement inférieure à celle rencontrée lors d'une sarcoïdose
pulmonaire. Bien que l'augmentation du ratio CD4/CD8 est légèrement moins
prononcée lors de la tuberculose, cet indice ne permet pas de distinguer à coup sûr ces
deux pathologies [29].
1.11 Modèles animaux de granulomes pulmonaires
II existe dans la littérature scientifique un certain nombre de publications
décrivant divers modèles animaux de maladies pulmonaires granulomateuses.
Chacun des modèles présente des caractéristiques particulières pouvant le relier à une
ou plusieurs pathologies. Cette section vise à expliquer deux des principaux modèles
et à en faire ressortir les caractéristiques distinctes.
IX
1.11.1 Le béryllium
Tel que mentionné à la section 1.3.3 le béryllium est un composé qui pourrait être
impliqué dans la sarcoïdose pulmonaire. Le béryllium peut induire une affection
aiguë pouvant s'attaquer à la peau, les muqueuses et l'appareil respiratoire. Il peut
aussi induire une pathologie chronique granulomateuse systémique ressemblant à
beaucoup à la sarcoïdose pulmonaire [21-22]. La berylliose et la sarcoïdose sont
deux pathologies qui furent, durant un temps, considérées comme identiques. Elles
impliquent toute deux la formation de granulomes non-caséeux dans les poumons,
une lymphocytose à prédominance CD4+ et une augmentation de l'activation des
macrophages [21]. Durant les années 1990, les modèles animaux (souris, rat, chien,
cochon d'inde...) de berylliose étaient considérés comme les meilleurs modèles de
sarcoïdose. Il est maintenant connu que la berylliose est une maladie à part entière
qui s'apparente à la sarcoïdose.
Ces modèles demeurent donc des modèles de
berylliose et non de sarcoïdose pulmonaire, bien que les caractéristiques soient
pratiquement les mêmes. En effet, comme l'agent étiologique de la berylliose est le
béryllium, l'injection, l'instillation ou l'inhalation de cette substance à tout type
d'animaux provoque une berylliose.
1.11.2 L'adjuvant complet de Freund (CFA)
Le CFA est une émulsion d'eau dans l'huile contenant des mycobactéries tuées. Le
CFA est un produit qui est normalement utilisé pour provoquer une augmentation de
la production d'anticorps. Cet effet est accompagné d'une réponse inflammatoire
sévère [24]. Le CFA provoque aussi des lésions de type granulomateuses au site
d'injection.
L'inflammation est provoquée par la présence de mycobactéries dans
l'émulsion. Il fut démontré lors de quelques études que les injections intraveineuse
(IV) de CFA à des rats provoquaient, dans les poumons, la formation de granulomes
non-caséeux contenant des cellules épithéloides et des cellules géantes entourées de
lymphocytes [25-26]. Ces manifestations sont très semblables à celles retrouvées
chez les patients souffrants de sarcoïdose pulmonaire.
La réaction granulomateuse étant variable d'un animal à l'autre, une équipe de
chercheurs français a développé une technique d'analyse de la progression de la
maladie par tomographie axiale [26]. Ce modèle fut évalué en histopathologie par
cette même équipe, mais aucune analyse cellulaire ou immunologique ne fut réalisée.
Ce modèle est celui qui se rapproche le plus de la sarcoïdose pulmonaire tant par la
présence de granulomes que par la composition de ceux-ci. De plus, il existe un
certain nombre de pistes impliquant les mycobactéries dans l'apparition de la maladie
[1-2-5]. Comme le CFA contient des mycobactéries, il utilise un facteur étiologique
possible de la sarcoïdose pulmonaire. C'est donc sur ce modèle que se basera ce
projet de recherche.
1.12 Nicotine
1.12.1 Récepteurs nicotiniques
Les récepteurs nicotiniques sont des protéines transmembranaires (ligand-gated ion
channel) présents sur les cellules excitables et non-excitables de l'organisme [30-31].
Le ligand naturel de ces récepteurs est l'acétylcholine (ACh) qui une fois liée à son
récepteur, va permette l'ouverture de canaux à ions. Ces canaux à ions peuvent être
par exemple des canaux permettant l'échange d'ions calcium (Ca2+). L'ouverture de
ces canaux permet de modifier le potentiel de membrane et la dépolarisation des
cellules [30-32-33].
20
Exetiteuf
intérieur
Figure 1.2; Récepteur nicotinique.
Adapté du site internet http://www.usc.edu/hsc/pharmacy/ced/autonomic/nl-nicotinic.html
1.12.2 Les agonistes de récepteurs nicotiniques
Les agonistes des récepteurs nicotiniques sont des molécules qui peuvent se lier aux
récepteurs nicotiniques. Ces agonistes peuvent entrer en compétition avec le ligand
naturel des récepteurs nicotiniques (ACh) et ont un effet inhibiteur sur le
développement de l'inflammation [32]. Il existe de nombreux agonistes de ces
récepteurs qui sont soit d'origine naturelle ou synthétique. La nicotine est un des
agonistes pouvant se lier aux récepteurs et ayant des effets anti-inflammatoires
lorsque liée. La nicotine est une molécule qui traverse aisément la barrière hématoencéphalique et crée donc une dépendance [34].
Par contre, il existe certains
agonistes qui n'ont pas la faculté de traverser cette barrière et qui ne créeent donc pas
de dépendance. Le diméthylphenylpiperazinium (DMPP) est un exemple d'agoniste
des récepteurs nicotiniques de nature synthétique qui ne cause pas de dépendance
[34-35]. Le DMPP possède, tout comme la nicotine, des effets anti-inflammatoires
[35]. Le DMPP permet de diminuer le relâchement cytokines pro-inflammatoires
telles que l'IL-1 et du TNF-a des cellules splénique et de l'IL-6 et du TNF-a des
macrophages [36].
21
Chapitre 2
Objectif général et objectifs spécifiques
22
2. OBJECTIFS GENERAUX ET SPECIFIQUES
2.1 Objectif général
Vous avez pu constater lors de la lecture du chapitre précédent que la
sarcoïdose pulmonaire est une maladie qui demeure méconnue sous plusieurs aspects.
Il semble désormais évident que seules des recherches poussées nous permettront
d'approfondir nos connaissances sur cette pathologie. De plus, la recherche d'une
thérapie efficace pour traiter la maladie est l'un des principaux points d'intérêt, vu
l'absence de traitement adapté. Pour mener à terme ces recherches, il est nécessaire
d'avoir un modèle animal sur lequel tester et valider nos hypothèses.
L'objectif
général de ce projet de recherche est donc de mettre au point un modèle animal de
sarcoïdose pulmonaire s'approchant le plus de la réalité clinique.
2.2 Objectifs spécifiques
Pour arriver à un modèle de sarcoïdose pulmonaire efficace et réalisable, ce
projet à pris ses bases sur un ébauche de modèle réalisée par une équipe française
[24]. Les objectifs spécifiques sont donc les suivants :
Tester le modèle préexistant et apporter les modifications nécessaires afin de
rendre le modèle fidèle à la pathologie et éthiquement acceptable;
-
Dresser un profil complet des caractéristiques (cellulaires, radiologiques,
histopathologiques et immunologiques) de ce nouveau modèle afin de préciser
sa similitude avec la sarcoïdose pulmonaire;
-
Tester une thérapie potentielle basée sur l'utilisation des agonistes des
récepteurs nicotiniques.
Chapitre 3
Méthodologie
24
3. Méthodologie
3.1 Projet #1 Efficacité d'un agoniste nicotinique (DMPP) sur un modèle de base
de sarcoïdose pulmonaire (réalisée une fois)
3.1.1 Induction du modèle et radiologie
Trente rats Wistar (250-300g) ayant nourriture et eau ad libium furent utilisés
dans cette étude. Les animaux furent séparés en trois groupes de 10 animaux; le
groupe contrôle recevant de la saline (gr contrôle), le groupe recevant du CFA
uniquement et le groupe recevant du CFA et du DMPP. Au jour 0, tous les animaux
furent examinés par tomographie axiale. Au jour 1 et 2, une IV de CFA (0.6 ml/kg)
fut effectuée dans la veine de la queue sur les animaux du groupe CFA et DMPP
endormis à l'isofurane. Les animaux du groupe contrôle furent endormis selon le
même processus et reçurent des injections de saline. Les rats des groupes CFA et
DMPP reçurent des injections sous-cutanées (se) de vancomycine durant les 3 jours
suivant les deux injections (jour 3 à 5) afin d'éviter les infections au niveau du site
d'injection. Les animaux du groupe DMPP furent traités avec du DMPP (2mg/kg)
par voie intrapéritonéale (IP) une fois par jour à partir du jour 3 et ce durant 30 jours.
Au jour 33, tous les animaux subirent une seconde tomographie axiale qui sera
comparée à celle du jour zéro afin d'évaluer l'atteinte.
L'échelle de gravité de
l'atteinte varie de normale à très sévère. Le radiologue agissait à l'aveugle pour
l'analyse. Trente-cinq jours après la première injection de CFA, les animaux furent
endormis à la kétamine/xylazine et sacrifés par ponction cardiaque.
3.1.2 Lavages broncho-alvéolaires
Immédiatement après les sacrifices, des LBA furent effectués sur tous les animaux.
Les poumons furent lavés avec 50 ml de saline stérile (5 X 10 ml). La saline fut
injectée dans la trachée et récupérée par aspiration après chaque aliquote.
3.1.3 Histopathologie
Après les lavages, des morceaux d'un poumon de chaque rat furent collectés, fixés
dans la paraformaldéhyde, inclus dans la paraffine, coupés puis colorés à
l'hématoxyline-éosine. Les lames furent analysées à l'aveugle par un pathologiste et
un score situé entre 0 et 25 fut attribué pour chaque échantillon.
3.1.4 Analyses cellulaires
Les fluides récoltés lors des LBA furent centrifugés (7min/ 1500 rmp). Un « pool »
des cellules récoltées après centrifugation (5 tubes) fut effectué pour chaque animal et
re-suspendues dans 3 ml de saline.
Des comptes totaux et différentiels furent
effectués pour chaque rat. Pour les comptes différentiels, la technique du cytospin
(75 000 cellules/lame) en duplicata fut utilisé avant la coloration et le décompte.
Le cytométrie de flux a été utilisée afin d'identifier les lymphocytes CD4+ et CD8+.
Les anticorps employés sont les suivants; Pe-cy5-mouse anti-rat CD4 (mouse
IgG2ak, 0.2 mg/ml), Pe-Cy5-mouse (mouse IgG2ak, 0.5 mg/ml), Fitc-mouse anti-rat
CD8 (mouse IgGlk, 0.5 mg/ml) and Fitc-mouse (IgGlk, 0.5 mg/ml). Le Pe-cy5mouse anti-rat CD4 et le Fitc-mouse anti-rat CD8 furent utilisés à lp.g par million de
cellules. Le Pe-Cy5-mouse a été utilisé à 20 jxg par million de cellules alors que le
Fitc-mouse fut utilisé à 0,5 |ig par million de cellules.
3.1.5 analyses statistiques
Les résultats furent analysés par test T non apparié en utilisant le logiciel Stat View.
Une valeur de p<0,05 fut considéré comme statistiquement significatif.
26
3.2 Projet #2 Modification du modèle existant et analyses supplémentaires
3.2.1 Induction du modèle
Trente rats Wistar (250-300g) ayant nourriture et eau ad libium furent utilisés
dans cette étude. Les animaux furent divisés en deux groupes; le groupe contrôle
(n=10) recevant de la saline et le groupe CFA (n=20). Au jour 1, une seule injection
IV de CFA (0.6 ml/kg) fut effectuée dans la veine de la queue sur les animaux du
groupe CFA endormis à l'isofurane. Les animaux du groupe contrôle furent endormis
selon le même processus et reçurent une injection de saline. Les rats furent pesés à
toutes les semaines afin de vérifier l'état des animaux des deux groupes. Quarantecinq jours après l'injection de CFA, tous les rats furent endormis par injection à la
kétamine/xylazine et sacrifiés par ponction cardiaque. Le sang fut conservé dans des
tubes individuels.
3.2.2 Lavages broncho-alvéolaires
Immédiatement après les sacrifices, des LBA furent effectués sur tous les animaux.
Les poumons furent lavés avec 50 ml de saline stérile (5 X 10 ml). La saline fut
injectée dans la trachée et récupérée par aspiration après chaque aliquote. Le premier
aliquote de chaque animal fut récolté séparément pour des analyses de cytokines.
3.2.3 Histopathologie
Après les lavages, des morceaux de poumon et d'un ganglion thoracique de chaque
rat furent collectés, fixés dans la paraformaldéhyde, inclus dans la paraffine, coupés
puis colorés à Phématoxyline-éosine. Les lames furent analysées à l'aveugle par un
pathologiste et un score situé entre 0 et 25 fut attribué pour chaque échantillon.
27
3.2.4 Analyses cellulaires
Les fluides récoltés lors des LBA furent centrifugés (7min/ 1500 rmp). Un « pool »
des cellules récoltées après centrifugation (5 tubes) fut effectué pour chaque animal et
re-suspendu dans 3 ml de saline. Des comptes totaux et différentiels furent effectués
pour chaque rat. Pour les comptes différentiels, la technique du cytospin (75 000
cellules/lame) en duplicata fut utilisé avant la coloration et le décompte.
La cytométrie de flux a été utilisée afin d'identifier les lymphocytes CD4+ et CD8+.
Les anticorps utilisés sont les suivants; Pe-cy5-mouse anti-rat CD4 (mouse IgG2ak,
0.2 mg/ml), Pe-Cy5-mouse (mouse IgG2ak, 0.5 mg/ml), Fitc-mouse anti-rat CD8
(mouse IgGlk, 0.5 mg/ml) and Fitc-mouse (IgGlk, 0.5 mg/ml). Le Pe-cy5-mouse
anti-rat CD4 et le Fitc-mouse anti-rat CD8 furent utilisés à lfig par million de
cellules. Le Pe-Cy5-mous a été utilisé à 20 jig par million de cellules alors que le
Fitc-mouse fut utilisé à 0,5 jig par million de cellules.
3.2.5 Analyses de cytokines
Quatre ml du surnageant de LBA de chaque animal furent concentrés (6 à 11 fois) par
centrifugation sur filtre (Amicon ultra 15 ml). Quatre cytokines Thl (IFN-y, TNF-oc,
IL-12p40+70, IL-18) et deux cytokines Th2 (IL-13, IL-4) ont été dosées dans les
concentrés de surnageants en utilisant les ensembles de measures par ELISA (IFN-y;
Biosource International, sensitivity <13 pg/ml TNF-oc; Biosource International,
sensitivity <4pg/ml IL-12 p40+70; Biosource International, sensitivity <3pg/ml IL18; Biosource International, sensitivity <4pg/ml, IL-13; Biosource International,
sensitivity 1.5pg/ml, IL-4 : Biosource International, <2pg/ml).
3.2.6 Analyses statistiques
Les résultats furent analysé par test de T non apparié en utilisant le logiciel Stat
View . Une valeur de p<0,05 fut considéré comme statistiquement significatif.
28
Chapitre 4
Résultats
4. RESULTATS
4.1 Projet #1 Efficacité des agonistes nicotiniques sur le modèle de base de
sarcoïdose pulmonaire
4.1.1 Induction du modèle
À la suite des injections du jour 2, un certain nombre de décès furent constatés dans
les cohortes de rats du groupe CFA et DMPP. Ces décès sont survenus entre la
première et la douzième heure suivant la seconde injection de CFA. Le taux de décès
pour ces deux groupes réunis était de 15%, ce qui correspond à 3 décès sur les 20
animaux. Une autre réaction indésirable fut observée au cours de cette expérience : la
nécrose. En effet, trois cas de nécrose au niveau du site d'injection (queue) furent
dénombrés dans le groupe DMPP.
Cette nécrose devenait visible en milieu de
protocole, c'est-à-dire autour du jour 22, mais demeurait sous contrôle jusqu'au
sacrifice des animaux. Finalement, il y eut une période fébrile variant de 2 à 4 jours
chez tous les animaux ayant reçu du CFA.
4.1.2 Tomographie axiale
II fut démontré grâce à la tomographie de départ (jour 0) que tous les animaux utilisés
lors de ce protocole étaient en parfaite santé (figure 1.3).
Figure 1.3 : Tomographie axiale d'un rat du groupe contrôle (gauche) et CFA (droite).
30
Il n'y avait ni nodules, ni inflammation ou maladie pulmonaire quelconque ayant pu
fausser nos résultats (tableau 1.3 et 1.4).
Les animaux du groupe contrôle
présentaient des résultats identiques lors de la tomographie axiale finale réalisée au
jour 33 (tableau 1.3).
Tableau 1.3 : Résultats des tomographies axiales effectuées aux jours 0 et 33 sur les
rats du groupe contrôle
# du rat
lAà5A
!Bà5B
Résultat
Tomographie
jour 0
Normale [0]
Résultat
Tomographie
jour 33
Normale [0]
Pour le groupe 2 (CFA seul), les tomographies axiales finales démontrent une grande
variabilité de résultats. L'atteinte pulmonaire était visible en tomographie axiale et
quantifiable (figure 1.4). Tous les animaux sauf un seul démontrent une atteinte
pulmonaire dont la sévérité varie. La gravité de l'atteinte oscille entre normale et très
sévère (tableau 1.4). Pour ce qui est du groupe DMPP, le degré de sévérité varie
autant que pour le groupe CFA. Les animaux ont une atteinte variant de normale à
très sévère (tableau 1.4). Afin de pouvoir compiler ces résultats, un score variant de 0
(normal) à 5 (très sévère) fut attribué pour chaque animal et des moyennes furent
calculées pour chaque groupe. Les résultats, une fois convertis, font état d'une
atteinte pour le groupe contrôle de zéro (normal), pour le groupe CFA de 3,2
(modérée) et pour le groupe DMPP de 2,3 (légère) (figure 1.4).
31
Tableau 1.4 : Résultats des tomographies axiales effectuées aux jours 0 et 33 sur les rats des groupes
CFA et DMPP
# du rat
groupe
CFA
6A
8A
9A
10A
6B
7B
8B
9B
Résultat
Tomographie
jour 0
normal
normal
normal
normal
normal
normal
normal
normal
# du rat
groupe
DMPP
Résultat
Tomographie
Jour 33
normal
léger
très léger
très sévère
très sévère
modéré
modéré
sévère
6
5
4
3
2
1
0
Contr™le
11A
12A
13A
10B
11B
1214
13B
14B
15B
I
CFA
Résultat
Tomographie
jour 0
normal
normal
normal
normal
normal
normal
normal
normal
normal
Résultat
Tomographie
Jour 33
modéré
modéré
très sévère
léger
léger
modéré
modéré
normal
normal
DMPP
Groupes
Figure 1.4; Résultats obtenus en tomographie axiale. Le p-value entre les groupes CFA/contrôle et
DMPP/contrôle est de 0,0001. Non significatif entre les groupes CFA et DMPP.
4.1.3 Analyses histopathologiques
Les résultats en histopathologie ont démontré la présence d'inflammation et de
granulomes chez tous les animaux ayant reçu les injections de CFA y compris ceux
obtenant un score normal en tomographie (figure 1.5).
32
Les coupes pulmonaires des animaux du groupe contrôle ne présentant aucune
anomalie ont servi de comparatif pour l'attribution d'un score aux coupes des rats
atteints (figure 1.5).
groupe CFA
groupe contrôle
Figure 1.5 : Coupes histologiques de poumons de rats des groupes contrôle et CFA
Les animaux du groupe contrôle ont donc obtenu un score moyen de 0 (poumon
normal). Les groupes CFA et DMPP ont obtenu un score très similaire de 19 et 18 ce
qui défini leur atteinte comme modérée (figure 1.6).
25 -i
20 15
10
5H
0
contrôle
DMPP
Figure 1.6 : Résultats obtenus en histologie. P-value entre les groupes contrôle/CFA et
contrôle/DMPP < 0,0001.
33
4.1.4 Comptes cellulaires totaux et différentiels
Lors des comptes cellulaires totaux (nombre de cellules X 105 /ml) effectués sur les
LBA, une augmentation du nombre de cellules totales d'un facteur de 5 fut notée
entre le groupe contrôle (0,53 X 105 /ml) et les deux autres groupes (2,86 X 105 /ml
et 2,62 X105 /ml) (figure 1.7). Par contre, il n'y a aucune différence notable ou
statistiquement valable entre les groupes CFA et DMPP. Les comptes différentiels
réalisés sur les mêmes échantillons démontrent une augmentation de 5,5 fois la
quantité de macrophages pour les deux groupes ayant reçu le CFA comparativement
au groupe contrôle (figure 1.7). Aucune différence significative n'est notée entre le
groupe CFA et DMPP.
Finalement, une augmentation de 7 fois la quantité de
lymphocytes est présente entre le groupe contrôle et les deux autres groupes (figure
1.7). Aucune différence significative n'est notée entre le groupe CFA et DMPP.
5
4,5
4
lymphocytes
I macrophages
I cellules totales
3,S
3
I
0,'»
I)
groupe
Figure 1.7 : Comptes cellulaires totaux et différentiels pour les trois groupes.
En plus de l'augmentation de la quantité de tous les types cellulaires analysés, les
résultats démontrent un changement des proportions de cellules en présence. Un
LBA normal contient approximativement 90% de macrophages et 10% de
lymphocytes. Les comptes différentiels réalisés font état d'une diminution (90% ->
73-79%) du pourcentage de macrophages et une augmentation (9% -> 25-19%) de
celui des lymphocytes entre le groupe contrôle et les groupes CFA et DMPP (figure
1.8).
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
I macrophages
I lymphocytes
contr™le
CFA
DMPP
groupes
Figure 1.8 : Pourcentages des cellules en présence dans le LBA
4.1.5 Analyse du ratio CD4/CD8
Lors de l'analyse par cytométrie de flux, seule la moitié des échantillons furent
analysés dû à une erreur de manipulation. Il fut constaté que tous les animaux ayant
reçu le CFA démontraient une nette augmentation de la quantité de lymphocytes
CD4+ comparativement au groupe contrôle (figure 1.9). En effet, nous avons obtenu
une augmentation de deux fois le ratio CD4/CD8 entre le groupe contrôle et les deux
autres groupes (figure 1.10). Aucun changement significatif de ratio ne fut observé
entre le groupe CFA et le groupe DMPP.
B2 vs B1 iso
i:
B 7 vs B6 iso
"marqué CD4
i:
isotypique
b)
B 1 2 vs B1 0 iso
C)
Figure 1.9 : Marquage CD4 sur les cellules des LBA.
5
a) rat contrôle b) rat CFA
c) rat DMPP
-
4
3
2
1
0
Freund + DMPP
contrôle
Figure 1.10 : Ratio CD4/CD8
4.2 Projet #2 Modification du modèle existant et analyses supplémentaires
4.2.1 Induction du modèle
L'injection d'une seule dose de CFA a permis d'enrayer la mortalité post-injection,
problème majeur causé par la double injection. Ce changement au modèle de base a
aussi permis d'éliminer les cas de nécrose au site d'injection. Les animaux, comme
pour le modèle de base, ont démontré une période fébrile d'un ou deux jours suivant
l'injection de CFA. Cet épisode était confirmé par une prise de poids moins élevée
chez le groupe CFA que chez le groupe contrôle lors de la première semaine
seulement.
36
4.2.2 Analyses histologiques
Dans cette étude, 18 rats sur les 20 injectés au CFA démontrent la présence de lésions
dans les échantillons analysés (figure 1.11 a). Il n'y avait pas d'évidence de
granulomes ou d'inflammation chez tous les animaux du groupe contrôle et chez
deux rats du groupe CFA (figure 1.11 b). Le score moyen obtenu pour le groupe
contrôle était de 0, donc les poumons peuvent être considérés comme normaux. Pour
le groupe CFA, le score moyen était de 11 (p=0,0005) et les poumons furent
considérés comme moyennement atteints (figure 1.12).
a)
b)
Figure 1.1 T : Résultats d'histologie après 45 jours. Coloration à l'hématoxyline-éosine.
a) coupe pulmonaire d'un rat du groupe contrôle b) coupe pulmonaire d'un rat du groupe CFA
20
18
ooooo
12
£8°
8
4
0
contrôle
Groupe
s
Figure 1.12 : Score histologique
37
CFA
L'analyse histologique des ganglions a pu démontrer que chez les animaux du groupe
CFA, les ganglions étaient aussi atteints (résultats non présentés).
ganglions analysés démontraient la présence d'inflammation
En effet, les
et de pseudo-
granulomes.
4.2.3 Comptes cellulaire totaux et différentiels
Les résultats des comptes cellulaires totaux démontrent une nette augmentation du
nombre de cellules totales entre les deux groupes. Chez les animaux du groupe
contrôle, on retrouve 0,63 X 105 cellules/ml comparativement à 2,51 X 105 pour le
groupe CFA (p=0,003), ce qui correspond à une augmentation de quatre fois le
nombre de cellules (figure 1.13). On dénote aussi une augmentation très forte de la
quantité de lymphocytes, les niveaux augmentant de 25 fois entre les deux groupes
(p=0,0098).
• cellules totales
• macrophage
lymphocytes
T
contrôle
CFA
groupe
Figure 1.13 : Comptes cellulaires totaux et différentiels
38
Pour ce qui est des comptes cellulaires différentiels, on dénote, comme pour le
modèle de base, un débalancement dans le pourcentage des cellules retrouvées. Ce
changement cellulaire est plus prononcé pour ce modèle que pour le précédent.
Une très forte augmentation du pourcentage de lymphocytes est notée pour le groupe
CFA (figure 1.14). En effet, le pourcentage moyen de lymphocytes retrouvés dans
les LBA des rats contrôle est de 5% tandis qu'il est de 37% pour les rats CFA ce qui
correspond à une augmentation de 7 fois (p=0,0002). Le pourcentage moyen de
macrophages démontre des résultats inverses, il passe de 95% à 60% pour le groupe
CFA, une diminution de 1,5 fois par rapport au groupe contrôle (p=0,0003) (figure
1.14).
I macrophages
I lymphocytes
100
90
80
70
60
50
40
30
70
10
0
contrôle
CFA
groupes
Figure 1.14 : Pourcentages des cellules en présence dans le LBA
4.2.4 Analyse du ratio CD4/CD8
L'analyse par cytométrie de flux à permis de démontrer qu'une forte population de
cellules marquées CD4 était retrouvée chez tous les animaux du groupe CFA (figure
1.15). La présence de cette population particulière fait apparaître un ratio CD4/CD8
deux fois supérieur pour le groupe CFA (p=0,0003) (figure 1.16).
39
Contrôle
Figure 1.15 : Marquage des cellules CD4+ et CD8+. Les cellules CD4+ sont entourées en rouge.
4.2.5 Analyses immunologiques
L'analyse des eytokines de type Thl a démontré qu'il y a augmentation pour le
groupe CFA de trois des quatre eytokines testées. L'IFN-y augmente de deux log
(p=0,045), le TNF-a de deux log et demi (p=0,0003) et l'IL-12 de deux log
(p=0,0024) entre le groupe contrôle et le groupe CFA (figure 1.16). Il n'y a aucune
augmentation notable de l'IL-18 et des deux eytokines Th2, l'IL-4 et l'IL-13 (non
présenté).
6 -]
• IFN
IL-18
5-
• TNF
BIL-12
contrôle
CFA
groupe
Figure 1.16 : Analyses immunologiques
40
41
Chapitre 5
Discussion et Conclusions
42
5.DISCUSSION ET CONCLUSIONS
La sarcoïdose pulmonaire est une maladie encore mal comprise et qui
provoque de nombreux questionnements dans le domaine médical et scientifique.
L'ignorance de l'agent causal, des traitements non adaptés, un tableau clinique
variable et l'absence de modèle permettant d'effectuer des recherches comptent parmi
les difficultés rencontrées par les médecins et chercheurs. La découverte d'un effet
secondaire provoqué par le CFA qui, jusque-là, était utilisé en immunologie fit
germer l'idée d'une nouvelle utilisation de celui-ci. L'adjuvant complet de Freund
injecté par voie IV à des rats provoquait la formation de granulomes dans les
poumons, qui lorsque analysés en tomographie axiale et en histologie, démontraient
un profil ressemblant à celui de la sarcoïdose [26]. C'est sur ces bases que s'est
orienté ce projet de recherche.
5.1 Induction des modèles (comparaison)
Lors de ce projet, deux techniques d'induction différentes furent tentées. La
première technique consistait en deux injections IV de CFA à une journée
d'intervalle.
Ce modèle, bien que donnant un très bon profil inflammatoire,
comportait beaucoup trop d'effets indésirables. En effet, le taux de mortalité (15%)
associé à cette méthode demeure un obstacle majeur à son utilisation.
Ces décès
peuvent être dus à diverses causes. L'injection de CFA peut causer, dans certains
cas, une réaction appelée hypersensibilité sévère fatale. Cette réaction qui est une
forme de réaction allergique très sévère est suivie d'un œdème pulmonaire massif
[37]. Il est aussi possible que ces décès soient provoqués par une embolie pulmonaire
massive [37] ou par l'injection accidentelle d'une bulle d'air dans la veine. En plus
du taux de mortalité élevé, la nécrose était l'autre obstacle majeur.
Les lésions
nécrosées au niveau de la queue (site d'injection) sont causées par la composante non
organique du CFA; l'huile [37-38]. Lors de l'injection, une petite quantité de CFA se
retrouvant dans l'espace péri-veineux cause probablement la nécrose.
Le second modèle ne comportant qu'une seule injection de CFA apporte les correctifs
nécessaires à rendre le traitement moins toxique et mieux toléré par les animaux. En
effet, ce deuxième modèle semble être plus doux en ce sens qu'aucun décès ne fut
constaté et qu'aucune nécrose apparente ne fut décelée. L'injection unique de CFA a
permis d'éliminer les décès apparaissant toujours après la seconde injection. De plus,
réduire de moitié le nombre d'injection permet de réduire d'autant la probabilité
d'une injection péri-veineuse causant accidentellement la nécrose.
La formation de granulomes dans les poumons des animaux semblent avoir été
provoquée par la présence des mycobactéries dans le CFA.
Les mycobactéries
demeurent, encore à ce jour, un agent dont ont suspecte l'implication dans les cas de
sarcoïdose pulmonaire.
Bien que de nombreuses études ne supportent pas cette
hypothèse, il semble de plus en plus acquis qu'un certain pourcentage des cas de
sarcoïdose serait provoqué par cet agent [39]. Ainsi, les mycobactéries en émulsion
dans le CFA semblent créer un modèle représentant une forme possible de sarcoïdose
pulmonaire.
5.2 Analyses par tomographie axiale
La tomographie axiale ne fut utilisée que pour le premier modèle à double
injection. En effet, les résultats obtenus ne furent pas à la hauteur de nos attentes. Le
modèle de granulomes pulmonaires chez le rat semble bien fonctionner et cela est
prouvé par l'aggravation évidente de l'état de l'appareil pulmonaire. Par contre, les
résultats obtenus en comparant les groupes s'avéraient non significatifs. Cette
méthode présente des limitations importantes comme une qualité visuelle très
moyenne comparativement à celle obtenue par l'équipe ayant mise au point le
protocole tomographique [27]. De plus, la gravité de l'atteinte était très variable et ce
à l'intérieur du même groupe. Les résultats obtenus demeurent donc qualitatifs et non
quantitatifs. À la lumière de ces résultats, la tomographie axiale fut abandonnée pour
le modèle à injection unique. Il est bon de préciser que le traitement expérimental au
44
DMPP n'a pas donné les résultats escomptés.
Il n'y eut aucune différence
significative prouvant que l'utilisation de cet agoniste puisse avoir contribué à
améliorer l'état des animaux.
5.3 Analyses histopathologiques
L'histopathologie a permis d'obtenir des résultats beaucoup plus précis que
ceux obtenus en radiologie. Les données du premier modèle (2 injections) montrent
des granulomes non-caséeux bien formés, la présence de cellules géantes
multinucléées, de cellules épithéloides et d'inflammation [4-8]. Ces caractéristiques
sont représentatives des granulomes rencontrés lors de biopsies de patients atteints de
sarcoïdose pulmonaires. De plus, ces analyses ont démontré que les poumons des rats
des groupes CFA ou DMPP semblant normaux en tomographie (3 animaux)
s'avéraient présenter des atteintes lorsque observés en histopathologie. Par contre, il
n'y eut aucune différence entre l'état des animaux traités au DMPP et celui des
animaux du groupe CFA. Pour ce qui est du second modèle (1 injection), les résultats
histopathologiques tendent à montrer des poumons présentant des pseudo-granulomes
ou granulomes en formation. Il y a aussi chez ce modèle présence d'inflammation
qui démontre une réaction de l'animal au CFA injecté. Ainsi, il fut démontré que
l'injection IV de CFA avait pour effet d'induire des granulomes en tout point
ressemblant à ceux présents lors de la sarcoïdose pulmonaire. Ces résultats permettent
d'écarter la thèse selon laquelle nous serions en présence d'un modèle s'apparentant
d'avantage à la tuberculose. En effet, les granulomes retrouvés chez les patients
atteints de tuberculose sont de type caséeux comparativement à ceux-ci [8]. Par
contre, ces données entrent en contradiction avec les résultats obtenus par une autre
équipe en 1989 [40]. Ceux-ci, après caractérisation des granulomes, avaient défini
ceux-ci comme caséeux ce que nous tentons de réfuter par cette étude.
45
5.4 Analyses cellulaires
II fut démontré dans le chapitre 1 que certaines caractéristiques cellulaires
étaient typiques de la sarcoïdose pulmonaire. En effet, l'augmentation de la quantité
de cellules totales ainsi qu'une lymphocytose prononcée sont deux de ces
caractéristiques [4]. Nous avons noté lors de ces deux études que l'injection de CFA
causait une forte augmentation de la quantité de cellules totales. Ces deux modèles
ont permis de tirer une conclusion importante; une seule injection de CFA est
suffisante pour causer une augmentation cellulaire qui est significativement valable.
En effet, nous pouvons constater qu'une injection unique de CFA cause une hausse
de 4 fois la quantité de cellules totales ce qui démontre clairement un profil
inflammatoire.
De plus, nous sommes en présence de deux modèles provoquant une lymphocytose
caractéristique de la sarcoïdose pulmonaire humaine. Contrairement à nos attentes, le
modèle à injection unique démontre une augmentation de la quantité et du
pourcentage de lymphocytes plus élevée que le modèle à double injection. Ce
phénomène peut être dû à la durée plus longue du second protocole qui pourrait avoir
contribué à cette lymphocytose élevée. Finalement, il n'y eut aucune différence entre
le groupe DMPP et le groupe CFA que ce soit au niveau du nombre de cellules totales
ou de la quantité de lymphocytes. Ainsi, le traitement n'apporta pas d'amélioration
de l'inflammation pulmonaire chez les animaux.
5.5 Analyse du ratio CD4/CD8
Le ratio CD4/CD8 est l'un des indices les plus révélateur d'une sarcoïdose
pulmonaire. De nombreuses études ont révélé qu'un ratio CD4/CD8 élevé était signe
d'une sarcoïdose [4-11]. Lors de ces études, nous avons constaté que le ratio retrouvé
était doublé entre les groupes contrôle et les groupes recevant du CFA.
Cet indice permet de réfuter la thèse selon laquelle nous serions en présence d'un
modèle d'alvéolite allergique. En effet, le ratio CD4/CD8 diminue lors d'une
alvéolite allergique et ce phénomène est causé par l'augmentation du nombre de
lymphocytes de type CD8 [27].
5.6 Analyses immunologiques
II est déjà reconnu que la sarcoïdose pulmonaire est une maladie
inflammatoire à profil Thl.
Ainsi, lors du processus inflammatoire, il y a
relâchement par les divers types cellulaires de cytokines principalement de type Thl.
Les données obtenues par ELISA ont permis de confirmer une sécrétion accrue de 3
cytokines Thl, l'IL-12, le TNF et l'IFN. Ces trois cytokines sont retrouvées en
grande quantité dans les poumons de patients souffrant de sarcoïdose [14-18-20]. De
plus, nous dénotons une absence de sécrétion ou une sécrétion minime des deux
cytokines de type Th2 testées ce qui confirmer le profil recherché pour ce modèle. Par
contre, l'absence d'augmentation de la production d'IL-18, une autre cytokine Thl,
semble contradictoire avec les résultats attendus.
5.7 Traitement expérimental au DMPP
II est déjà connu que le DMPP possède des effets anti-inflammatoires sur un
modèle murin d'asthme [35]. Pour ce qui est de ce présent modèle de sarcoïdose
pulmonaire, nous avons supposé que comme cette maladie présente une forte
inflammation, il serait possible de la diminuer grâce à cet agoniste. L'utilisation du
DMPP n'a causé aucune amélioration significative que ce soit au niveau cellulaire
qu'au niveau physiologique. Il est possible que la durée du traitement n'aie pas été
appropriée et qu'ainsi, les effets n'aie pas eu le temps d'apparaître. La quantité de
DMPP injectée aux animaux était fonction du poids des animaux au départ (300g), et
les rats au terme du protocole pesaient en moyenne 450g.
47
Ainsi, la quantité d'agoniste injectée aurait pu être révisée au cours du protocole en
fonction du poids de l'animal.
De plus, l'injection IP n'était peut-être pas la
meilleure voie à utiliser pour administrer le traitement. Il est possible qu'une
administration par voie intra-nasale aurait pu être plus appropriée pour traiter cette
pathologie. En conclusion, le traitement que nous avons tenté sur le premier modèle
s'est avéré inefficace et ce malgré le fait que le DMPP a déjà fait ses preuves dans
d'autres modèles tel l'asthme et l'alvéolite allergique intrinsèque.
Tous ces résultats mis en perspective démontrent bien que ce modèle expérimental de
sarcoïdose pulmonaire pourrait être fort utile lors de recherches subséquentes. Il reste
beaucoup à faire pour réellement comprendre cette pathologie et la maîtriser. Ce
modèle se veut un outil de compréhension mais surtout un instrument utile pour la
découverte de traitements pouvant mener à une amélioration ou une guérison pour les
patients.
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