TRAVAUX DIRIGES DE BIOCHIMIE

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UNIVERSITE JOSEPH FOURIER
GRENOBLE I
TRAVAUX DIRIGES DE BIOCHIMIE
MODULE BIO 241
Deuxième année de LICENCE
(L2, S4)
ANNEE 2012-2013
TD BIO 241 2012-2013
AVANT-PROPOS
AVANT-PROPOS
Ce fascicule est organisé de façon à illustrer les différents thèmes abordés en cours
magistral et en travaux pratiques. La préparation personnelle des exercices qui
nécessite une maîtrise préalable du cours est vivement recommandée afin de tirer le
meilleur profit des séances de travaux dirigés.
La plupart des thèmes sont précédés de quelques rappels théoriques des notions
abordées en cours et qui vous seront utiles pour résoudre les exercices. En aucun
cas, ces rappels théoriques très succincts ne remplacent le cours.
Les thèmes 1 et 2 sont des révisions des notions que vous devez avoir acquises en
Licence 1ère année dans le module BIO 121. Les thèmes suivants illustrent
directement le programme abordé en Licence 2ème année dans le cadre de ce
module BIO 241.
CONTROLE DES CONNAISSANCES
Dans le cadre du module BIO 241, deux notes de contrôle continu et une note
d’épreuve terminale nous permettront d’évaluer vos connaissances. La première note
de contrôle continu (CC1) sera une note de travaux pratiques. Le deuxième contrôle
continu (CC2) sera réalisé sous forme d’un examen écrit (1h), au cours du semestre,
et portera sur des notions abordées en cours magistral et travaux dirigés. Enfin, une
épreuve terminale écrite (2h) se déroulera à la fin du module et portera sur
l’ensemble des connaissances devant être acquises dans ce module.
La note finale de l’UE = CC1(25%) + CC2(25%) + ET (50%)
1
TD BIO 241 2012-2013
AVANT-PROPOS
EQUATIONS UTILES
Equation de Henderson-Hasselbalch
pH = pKa + log ([A-] / [AH])
Variation d’énergie libre dans les conditions non standard
[C] [D]
G’ = Go’ + RT ln (
)
[A] [B]
Variation d’énergie libre et potentiel redox
Go’ = - n F E0’
Potentiel redox dans une réaction d’oxydo-réduction
E0’ = E0’ (accepteur) – E0’ (donneur)
Equation de Michaelis-Menten
[S]
V0  Vmax
[S]  KM
QUELQUES UNITES
Masse molaire, poids moléculaire, dalton
-
Masse molaire : masse d’une mole de molécules de la substance, c’est-à-dire
la masse de 6,022.1023 molécules.
Elle s’exprime en g.mol-1.
-
Poids moléculaire : correspond au rapport entre la masse d’une molécule de
la substance et le douzième de la masse d’un atome de carbone 12.
C’est un nombre sans dimension.
-
Dalton : unité introduite pour définir la masse de certaines particules
biologiques pour lesquelles le terme de poids moléculaire est impropre.
Le dalton est le douzième de la masse d’un atome de carbone 12, soit
1/6,022.1023 grammes.
Les 3 modes d’expression font apparaître la même valeur numérique pour un
composé donné.
Exemple pour l’hémoglobine : on dira que cette protéine a un poids
moléculaire de 64 000, ou une masse molaire de 64 000 g.mol-1, ou encore
qu’une molécule de cette protéine possède une masse de 64 000 Da ou 64
kDa.
2
TD BIO 241 2012-2013
AVANT-PROPOS
TERME
ABBREVIATION UNITE
Variation d’énergie libre
Potentiel redox
Vitesse initiale d’une réaction
Activité enzymatique
Activité spécifique
Vitesse maximale d’une réaction
Constante de Michaelis
Constante catalytique
Efficacité catalytique

G
E0
Vo
AE
AS
Vmax
KM
kcat
kcat / KM
3
J.mol-1
Volts (V)
mol.L-1.s-1 (ou M.s-1)
nmol.s-1 (nanokatals, nkat)
nkat.mg-1
mol.L-1.s-1 (ou M.s-1)
mol.L-1 (ou M)
s-1
s-1.M-1
TD BIO 241 2012-2013
RAPPELS
THEME N°1 : RAPPELS
CONCENTRATIONS
SPECTROPHOTOMETRIE
CONCEPT ACIDES / BASES FAIBLES
4
TD BIO 241 2012-2013
RAPPELS
CONCENTRATIONS
Notions déjà acquises, à revoir :
-
Concentration massique.
Concentration molaire.
Concentration en % (p/v) ou en % (v/v).
Normalité.
Préparation d’une solution de concentration exacte à partir d’une
substance solide (soluté).
Produit anhydre, produit hydraté.
Pureté en %.
Dilutions en cascade.
Exercice n°1 :
Vous voulez réaliser un dosage des protéines suivant un protocole appelé méthode
de Lowry. Pour cela, vous devez préparer différentes solutions :
A- Solution de NaOH 0,1 M dans l’eau distillée.
B- Solution de CuSO4, 5H2O à 1% (p/v) dans l’eau distillée.
C- Solution de tartrate double de K et Na (C4H4KNaO6) à 2% (p/v) dans l’eau
distillée.
D- Solution de Na2CO3 à 2% (p/v) dans NaOH 0,1 M.
1- Calculer les quantités de produits à peser pour préparer 100 mL de chaque
solution, sachant que vous disposez des poudres suivantes :
- NaOH
M = 40 g.mol-1
Pureté = 97%.
-1
- CuSO4, 5H2O
M = 249,68 g.mol
Pureté = 98%.
- C4H4KNaO6, 4H2O
M = 282,22 g.mol-1
Pureté = 98%.
M = 286,14 g.mol-1
Pureté = 99%.
- Na2CO3, 10H2O
2- En pratique, comment procédez-vous ? Quel type de verrerie devez-vous
utiliser ?
3- A l’aide de ces différentes solutions, vous devez ensuite préparer le réactif
cuproalcalin selon le protocole suivant :
- 1 mL de solution de sulfate de cuivre (B)
- 1 mL de tartrate double de K et Na (C)
- Compléter à 100 mL avec la solution de carbonate de sodium à 2% (p/v)
dans la soude 0,1 M.
Calculer la concentration finale en sulfate de cuivre et en tartrate double de K et Na.
4- Comme vous n’avez aucune idée de l’ordre de grandeur de la concentration en
protéines de l’extrait biologique dont vous souhaitez doser les protéines, vous
devez au préalable effectuer une gamme de dilutions en cascades de cet extrait :
1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32. Comment réalisez-vous ces dilutions en cascades,
sachant que vous devez réaliser le dosage de chaque dilution en triplicata pour
tester la reproductibilité de votre manipulation ? (voir le protocole exact du dosage
ci-dessous).
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TD BIO 241 2012-2013
RAPPELS
Protocole du dosage des protéines par la méthode de Lowry :
- A 200 L d’échantillon protéique, ajouter 1 mL de réactif cuproalcalin et
agiter.
- Laisser reposer 15 min.
- Ajouter rapidement 100 L de réactif de Folin-Ciocalteu et homogénéiser.
- Laisser reposer 30 min. et lire l’absorbance à 750 nm contre un témoin
sans protéines.
Exercice n°2 :
A partir des données ci-dessous, calculer la molarité et la normalité des deux
solutions. Indiquer comment préparer 1 litre de solution 1 N.
1- Acide acétique (CH3CO2H) M = 60,05 g.mol-1 d = 1,05
Pureté = 99,7%.
-1
2- Acide sulfurique (H2SO4)
M = 98,08 g.mol
d = 1,83
Pureté = 95%.
SPECTROPHOTOMETRIE
Notions déjà acquises, à revoir :
-
Absorbance d’une substance colorée (spectre dans le visible) ou incolore
(spectre dans l’UV).
Loi de Beer-Lambert et ses limites.
Loi d’additivité.
Gamme étalon.
Exercice n°1 :
Le tryptophane présente une bande d’absorption avec un maximum à la longueur
d’onde de 280 nm. Dans une cuve de trajet optique 1 cm, une solution de
tryptophane à 200 M a une absorbance à 280 nm de 1,2.
1- Calculer le coefficient d’extinction molaire du tryptophane.
Une solution de la protéine X, à la concentration de 25 µM, présente une absorbance
à 280 nm de 0,6. La protéine X ne contient aucun résidu tyrosine et phénylalanine.
2- Déterminer le nombre de résidus tryptophane que contient cette protéine X.
Exercice n°2 :
L’uracile et l’adénine sont deux bases azotées qui présentent un maximum
d’absorption à 260 nm. Une solution d’uracile à 20 mol.L-1 présente une absorbance
à 260 nm égale à 0,24 dans une cuve de trajet optique 1 cm.
1- Calculer le coefficient d’extinction molaire de l’uracile.
6
TD BIO 241 2012-2013
RAPPELS
Une solution contenant un mélange d’uracile et d’adénine présente une absorbance
à 260 nm égale à 0,4 (cuve de 1 cm). Sachant que la concentration molaire en
uracile est le double de celle de l’adénine et que le coefficient d’extinction molaire de
l’adénine à 260 nm est de 16000 mol-1.L.cm-1 :
2- Calculer les concentrations molaires en adénine et en uracile dans le mélange.
CONCEPT ACIDES / BASES FAIBLES
Notions déjà acquises, à revoir :
-
Equation de Henderson-Hasselbalch.
Titration d'un acide faible par une base forte ; courbe de titration.
Solutions tampon.
Exercice n°1 :
Calculer le pH des solutions tampon suivantes :
1- Acide acétique (1 M) + acétate de sodium (0,5 M).
2- Acide phosphorique (0,3 M) + KH2PO4 (0,8 M).
Données : pKa de l’acide acétique = 4,76 ; pKa de l’acide phosphorique = 2,14.
Exercice n°2 :
L’acide phosphorique est un triacide. Il se trouve très souvent associé à diverses
molécules biologiques (protéines, lipides) sous forme de groupement phosphate.
Son état d’ionisation dépend du pH de la solution et des valeurs de ses pKa.
1- Quelles sont les formes présentes à pH physiologique (7,4) ?
2- Sous quelle forme va-t-on l’écrire préférentiellement ?
Données : pKa1 = 2,1 ; pKa2 = 7,2 ; pKa3 = 12,4.
7
TD BIO 241 2012-2013
RAPPELS SUR LES PROTEINES
THEME N°2 : RAPPELS SUR LES PROTEINES
PROPRIETES IONIQUES DES ACIDES AMINES ET PEPTIDES
STRUCTURE ET METHODES D’ETUDE
8
TD BIO 241 2012-2013
RAPPELS SUR LES PROTEINES
PROPRIETES DES ACIDES AMINES ET PEPTIDES
Notions déjà acquises, à revoir :
-
Molécules à caractère hydrophobe, polaire, apolaire.
Formule semi-développée des 20 acides aminés standard.
Attribuer à chaque fonction ionisable la valeur de pKa correspondant.
Ecrire les équilibres de dissociation des acides aminés et peptides.
Calcul du pHi d’un acide aminé et d’un peptide.
Courbe de titration des acides aminés et peptides.
Propriétés des 20 acides aminés rencontrés dans les protéines :
Nom
Abréviation
Alanine
Arginine
Asparagine
Aspartate
Cystéine
Glutamate
Glutamine
Glycine
Histidine
Isoleucine
Leucine
Lysine
Methionine
Phénylalanine
Proline
Sérine
Thréonine
Tryptophane
Tyrosine
Valine
Ala, A
Arg, R
Asn, N
Asp, D
Cys, C
Glu, E
Gln, Q
Gly, G
His, H
Ile, I
Leu, L
Lys, K
Met, M
Phe, F
Pro, P
Ser, S
Thr, T
Trp, W
Tyr, Y
Val, V
pKa
-COOH
2,3
2,2
2,0
2,1
1,7
2,2
2,2
2,4
1,8
2,4
2,4
2,2
2,3
1,8
2,0
2,2
2,6
2,4
2,2
2,4
pKa
-NH3+
9,7
9,0
8,8
9,8
10,8
9,7
9,1
9,6
9,2
9,7
9,6
9,0
9,2
9,1
10,6
9,2
10,4
9,4
9,1
9,6
pKa
Chaîne latérale
12,5
3,9
8,3
4,3
6,0
10,5
10,1
Masse molaire
(g.mol-1)
89
174
132
133
121
147
146
75
155
131
131
146
149
165
115
105
119
204
181
117
Les différentes classes d’acides aminés :
En biochimie, la classification généralement utilisée traduit la capacité de l’acide
aminé à interagir avec son environnement (ex : capacité à former des liaisons
électrostatiques, Hydrogène, ou de van der Waals).
1- Acides aminés relativement apolaires – hydrophobes - :
(Gly), Ala, Pro, (Met), Val, (Tyr), Leu, Ile, Trp, Phe.
2- Acides aminés relativement polaires non chargés – hydrophiles - :
Ser, Thr, Cys, Asn, Gln.
3- Acides aminés plus ou moins ionisés selon le pH – hydrophiles - :
Asp, Glu, Lys, His, Arg.
9
TD BIO 241 2012-2013
RAPPELS SUR LES PROTEINES
Structure des 20 acides aminés rencontrés dans les protéines (formes
prépondérantes à pH 1) :
Acides aminés aliphatiques
Acides aminés à chaîne latérale comportant des groupements
hydroxyle ou sulfhydryle
Acides aminés acides et les amides dérivées
Acides aminés aromatiques
Acides aminés basiques
10
Acide aminé cyclique
TD BIO 241 2012-2013
RAPPELS SUR LES PROTEINES
Exercice n°1 :
Classer les composés suivants par ordre d’hydrophobicité décroissante à pH =7 :
- 1,3-dihydroxypropane
- n-propanol
- sérine
- glycérol
- alanine
- propane
- sérine phosphoester
- alanylamide
Exercice n°2 :
Ecrire les équilibres de dissociation et calculer le pHi des acides aminés suivants :
Leucine, Cystéine, Histidine.
Exercice n°3 :
On étudie le peptide tyrosyl-alanyl-glutaminyl-aspartyl-lysine.
1- Ecrire la formule semi-développée du peptide à pH = 1. Indiquer les extrémités Nterminale et C-terminale. Indiquez les carbones .
2- Ce peptide comporte 5 fonctions ionisables dont les pKa sont respectivement :
2,2 ; 3,9 ; 9,1 ; 10,1 ; 10,5. Attribuer chaque valeur de pKa à chaque fonction
ionisable en justifiant votre réponse (d’après le tableau).
3- Ecrire les équilibres de dissociation et calculer le pHi du peptide.
4- Tracer la courbe de titration de 1 mole du peptide par la soude.
STRUCTURE ET METHODES D’ETUDE DES PROTEINES
Notions déjà acquises, à revoir :
-
Structure primaire, secondaire, tertiaire et quaternaire.
Interactions non covalentes (liaison hydrogène, liaison ionique, liaison de
van der Waals, interaction hydrophobe)
Rôle des agents dénaturants et des agents réducteurs sur la conformation
des protéines.
Précipitation des protéines par les sels ou les solvants organiques.
Méthodes chromatographiques.
Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions natives ou
dénaturantes.
11
TD BIO 241 2012-2013
RAPPELS SUR LES PROTEINES
Exercice n°1 :
Dans des conditions de pH proches des conditions physiologiques, la masse molaire
d’une protéine P a été déterminée par filtration sur gel. M = 140 000 g.mol-1.
1- Rappeler le principe de la chromatographie par filtration sur gel.
Lorsque cette même protéine est étudiée par électrophorèse sur gel de
polyacrylamide en présence de SDS avec ou sans 2-mercaptoéthanol, les profils
électrophorétiques obtenus sont représentés sur les pistes A et B de la figure
suivante. La piste C contient les marqueurs de masse moléculaire.
A
B
C
Dépôts
Albumine sérique : 67 000 Da
Ovalbumine : 43 000 Da
Anhydrase carbonique : 30 000 Da
Inhibiteur de
trypsine : 20 000 Da
A : en absence de 2-mercaptoéthanol ; B : en présence de 2-mercaptoéthanol ; C :
marqueur de masse moléculaire.
2345-
Qu’est-ce que le SDS et quel est son rôle dans cette électrophorèse ?
Quel est le rôle du 2-mercaptoéthanol ?
Sur quel (s) critère (s) sont séparées les protéines lors de cette électrophorèse ?
A partir de ces données, décrire la protéine P native en termes de masse molaire
des sous-unités présentes, de stœchiométrie entre les sous-unités et du type de
liaisons (covalentes ou non) existant entre les sous-unités.
Exercice n°2 :
Dans une protéine, identifier quels sont les groupes pouvant former des liaisons
hydrogène ou électrostatiques avec la chaîne latérale de l’arginine à pH 7.
12
TD BIO 241 2012-2013
ENZYMOLOGIE
THEME N°3 : ENZYMOLOGIE
ENERGIE D’ACTIVATION
CINETIQUE ENZYMATIQUE
INHIBITION
ACTIVITE ENZYMATIQUE
NOTION DE SITE ACTIF
13
TD BIO 2241 2012-2013
E
ENZYMOLOG
GIE
ENERG IE D’ACTIIVATION
Quelqu
ues rappels théoriques :
LES ENZYMES
E
SONT DE
ES CATAL
LYSEURS BIOLOGIQ
QUES.
Un cata
alyseur ag
git en abais
ssant l’éne
ergie d’ac
ctivation d’une
d
réacttion chimiq
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s
la vitesse
e de la
réaction. Les enzzymes augmentent do
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ques se
déroula
ant dans la
a cellule, ett se retrouvvent intactes à la fin de la réacttion.
La loi e
empirique
e d’Arrhen
nius perme
et de relierr l’énergie d’activatioon, la temp
pérature
et la co
onstante de
e vitesse de
d la réactio
on :
k = Ae - Ea / RT
a réaction.
Avec : - k = consttante de vitesse de la
- T = température ab
bsolue en kkelvins.
- R = constante des gaz
g parfaitts = 8,315 J. mol-1. °K
K-1.
-1
- Ea = éne
ergie d’activ
vation (J. m
mol ).
- A = consttante.
ce :
Exercic
La réacction de dé
écompositiion de l’ea
au oxygéné
ée (H2O2) se
s déroulee selon la réaction
r
suivantte :
2 H2O2
2 H2 O + O2
14
TD BIO 241 2012-2013
ENZYMOLOGIE
Cette réaction peut avoir lieu sans catalyseur, en présence d’un catalyseur chimique
(le platine colloïdal), ou en présence d’un catalyseur enzymatique (la catalase).
1- D’après les données du tableau suivant, déterminer le facteur par lequel la
vitesse de la réaction est augmentée en présence de chacun des catalyseurs.
2- Quel est le catalyseur le plus efficace ?
Conditions de réaction
Aucun catalyseur
En présence de platine colloïdal
En présence de catalase
Ea (kJ.mol-1) à 20°C
75
49
8
CINETIQUE ENZYMATIQUE
Quelques rappels théoriques :
1- Relation de Michaelis-Menten :
Le modèle de Michaelis-Menten permet de décrire le comportement d’un grand
nombre d’enzymes. Dans ce modèle, une enzyme (E) fixe un substrat (S) pour
former un complexe enzyme-substrat (ES) qui peut se dissocier en E et S ou
conduire à la formation du produit de réaction (P).
k1
E+S
k2
ES
E+P
k -1
La vitesse de la réaction enzymatique est définie par : V = 
d [S] d [P]
.

dt
dt
[P]
V0
V = cte = 0
V = cte = V0
Temps
V=
d [P]
est, pour chaque temps t, la pente de la tangente à la courbe [P] = f(t).
dt
Si l’on se place en condition de vitesse initiale (V0), c’est-à-dire dans des temps de
réaction très courts, nous pouvons supposer que le produit n’est pas converti de
nouveau en substrat par la réaction inverse.
Nous voulons établir une expression qui relie la vitesse de catalyse avec les
concentrations en substrat et enzyme. Notre point de départ est :
15
TD BIO 241 2012-2013
ENZYMOLOGIE
V0  k 2 [ES]
(1)
Nous avons maintenant besoin d’exprimer [ES] en termes de concentrations
connues. Les vitesses de formation et de disparition de ES sont données par :
Vitesse de formation de ES :
Vitesses de disparition de ES :
k1 [E] [S]
k-1 [ES] + k2 [ES]
Ou (k-1 + k2) [ES]
(2)
(3)
Pour simplifier, nous allons nous placer dans l’hypothèse de l’état stationnaire,
c’est-à-dire un état dans lequel la concentration en ES reste constante. Cet état
s’établit dans les tous premiers temps de la réaction. La vitesse de formation de ES
est donc égale à sa vitesse de disparition :
k1 [E] [S] = (k-1 + k2) [ES]
(4)
En réarrangeant l’équation (4), on obtient :
[E] [S] k 1  k 2

[ES]
k1
(5)
L’équation (5) se simplifie en définissant une nouvelle constante, KM, appelée la
constante de Michaelis :
KM 
k 1  k 2
k1
(6)
L’équation (5) devient alors :
[E] [S]
 KM
[ES]
ou
[ES] 
[E] [S]
KM
(7)
Il faut maintenant exprimer [E] en termes de concentrations connues.
Examinons alors la loi de conservation de l’enzyme :
Ou encore :
[E]T = [E] + [ES]
(8)
[E] = [E]T – [ES]
(9)
L’équation (7) devient alors :
[ES] 
D‘où l’on tire :
([E] T  [ES]) [S]
KM
[ES]  [E] T
[S]
[S]  K M
(10)
(11)
16
TD BIO 241 2012-2013
ENZYMOLOGIE
En revenant à l’équation (1) V0 = k2 [ES] et en substituant [ES] par son expression
dans l’équation (11), on obtient :
V0  k 2 [E] T
[S]
[S]  KM
(12)
La vitesse maximale étant atteinte lorsque toute l’enzyme est saturée en substrat et
donc quand [E]T = [ES], on obtient :
Vmax = k2 [E]T
(13)
L’équation (12) devient ainsi la relation de Michaelis-Menten:
V0  Vmax
[S]
[S]  KM
(14)
2- Représentations graphiques :
2.1- Représentation de Michaelis-Menten :
En fixant [E] et en faisant croître [S], on constate que la vitesse croît et tend vers une
limite Vmax quand toute l’enzyme est saturée de substrat, c’est-à-dire quand toute
l’enzyme est sous forme de complexe ES.
Ainsi, si [S] devient très grande, KM << [S] et V0 = Vmax.
V0
Vmax
Vmax
/2
[S]0
S = KM
2.2- Représentation de Lineweaver et Burk :
La représentation graphique de Michaelis-Menten n’étant pas suffisamment
pour déterminer KM et Vmax, c’est le plus souvent la représentation en double
1/V0 = f(1/[S]0) qui est utilisée.
La représentation graphique de Michaelis-Menten n’étant pas suffisamment
pour déterminer KM et Vmax, c’est le plus souvent la représentation en double
1/V0 = f(1/[S]0) qui est utilisée.
17
précise
inverse
précise
inverse
TD BIO 241 2012-2013
ENZYMOLOGIE
1 / V0
1 / Vmax
1 / [S]0
- 1 / KM
3- Signification de KM, kcat et kcat/KM :
-
La représentation de Michaelis-menten montre que KM est égal à la concentration
en substrat avec laquelle la réaction atteint la moitié de sa vitesse maximale.
La constante de Michaelis KM est souvent associée à l’affinité de l’enzyme pour
son substrat. Cependant, cette relation n’est valable que pour les réactions dans
lesquelles k2 est très petit devant k -1, ce qui conduit à :
KM =
k 1
= Ks = constante de dissociation du complexe ES
k1
-
La constante catalytique kcat est égale à k2. Elle représente le nombre de
molécules de substrat transformées par une molécule d’enzyme en une seconde.
L’unité de kcat est donc s-1. Elle traduit l’efficacité cinétique de l’enzyme.
-
C’est en fait le rapport de ces 2 valeurs (kcat / KM) qui traduit le mieux l’efficacité
catalytique d’une enzyme.
4- Les effecteurs de l’activité enzymatique :
Les effecteurs sont des substances chimiques qui modifient l'activité des enzymes.
On distingue :
- les activateurs qui augmentent l'activité catalytique. Ex : certains cations
augmentent l'activité des enzymes (Mg2+ pour les kinases, Zn2+ pour les
phosphatases alcalines).
- les inhibiteurs qui diminuent l'activité catalytique.
Nous ne détaillerons ici que les inhibiteurs.
Nous nous intéresserons à 2 types d’inhibitions réversibles, c’est-à-dire
caractérisées par une dissociation rapide du complexe enzyme-inhibiteur EI.
D’une façon générale, un inhibiteur est lié à l’enzyme mais n’est pas transformé par
elle.
18
TD BIO 241 2012-2013
ENZYMOLOGIE
4.1- Inhibition compétitive :
Lorsque l’inhibiteur possède une structure voisine de celle du substrat (on parle alors
d’analogue de substrat), il peut se fixer à l’enzyme sur le même site que le substrat.
Inhibiteur et substrat ne peuvent donc pas se trouver ensemble dans le site actif de
l’enzyme : il s’agit d’une inhibition compétitive.
Un inhibiteur diminue la vitesse de catalyse en réduisant la proportion de molécules
d’enzyme liées au substrat.
Une inhibition compétitive peut être levée par un excès de substrat.
E+S
+
I
ES
E+P
Ki
EI
x
La constante d’inhibition Ki est également la constante de dissociation du complexe
[E] [I]
EI : Ki =
[EI]
La représentation de Lineweaver et Burk suivante montre qu’un inhibiteur compétitif
n’induit pas de variation de la Vmax, mais augmente la valeur du KM. Le KM apparent
[I]
)
devient alors : KM app. = KM (1 +
Ki
1 / V0
+ Inhibiteur
- Inhibiteur
1 / Vmax
1 / [S]0
- 1 / KM
- 1 / KM app.
4.2- Inhibition non compétitive :
Dans une inhibition non compétitive, le substrat et l’inhibiteur peuvent se lier
simultanément à l’enzyme sur des sites distincts. Un inhibiteur non compétitif agit en
diminuant la constante catalytique plutôt que la proportion de molécules de substrat
liées à l’enzyme. Contrairement à l’inhibition compétitive, une inhibition non
compétitive ne peut pas être levée par un excès de substrat.
19
TD BIO 241 2012-2013
ENZYMOLOGIE
E+S
+
I
ES
+
I
E+P
Ki’
Ki
EI
EI + S
x
La représentation de Lineweaver et Burk suivante montre qu’un inhibiteur non
compétitif n’induit pas de variation du KM, mais diminue la valeur de Vmax. La Vmax
Vmax
(dans le cas simple ou Ki = Ki’)
apparente devient : Vmax app. =
1  ( [I] / K i )
1 / V0
+ Inhibiteur
- Inhibiteur
1 / Vmax app.
1 / Vmax
1 / [S]0
- 1 / KM
Exercice n°1 :
Les affirmations suivantes sont-elles vraies ?
1- V0 et Vmax sont des vitesses initiales.
2- On peut calculer Vmax et KM à partir des cinétiques d'apparition du produit en
fonction du temps obtenues à partir de plusieurs concentrations en substrat.
3- Si l'on exprime V0 en fonction de [S]0, on obtient une parabole.
4- Il est possible de déterminer Vmax et KM en représentant 1/V0 en fonction de 1/[S]0.
5- KM est la concentration en enzyme qui donne la moitié de Vmax.
6- Pour une enzyme et un substrat donnés, les valeurs de KM et Vmax sont
invariables.
7- La vitesse initiale d'une réaction enzymatique :
- Présente une relation linéaire en fonction de quantités croissantes d'enzyme.
- Présente une relation hyperbolique en fonction de quantités croissantes
d'enzyme.
- Peut être sensible aux variations de température.
- Est maximale à pH 7.
- Est sensible à la présence d'autres ligands que le substrat.
20
TD BIO 241 2012-2013
ENZYMOLOGIE
Exercice n°2 :
Les mesures des constantes de vitesse d’une réaction enzymatique simple, avec une
enzyme E obéissant à la cinétique de Michaelis-Menten, donnent les valeurs
suivantes :
k1
E+S
k2
ES
E+P
k -1
k1 = 2 x 108 M-1 sec-1
k-1= 1 x 103 sec-1
k2 = 5 x 103 sec-1
1234-
Calculer la constante de Michaelis KM de l’enzyme.
Quelle est la valeur de la constante catalytique (kcat) de l’enzyme ?
Déterminer l’efficacité catalytique de l’enzyme.
Indiquer si cette enzyme est proche de la perfection cinétique.
Exercice n°3 :
Les figures suivantes représentent :
courbe 1
[P] = f ( t )
courbe 2
Vo = f ( [ So ] )
1/Vo = f ( 1/[So] )
courbe 3
1
[P ]
tem p s
Vo
2
1/Vo
3
[So]
1 / [So]
1- Que peut-on déterminer à partir de chacune des courbes ci-dessus ? Compléter
les graphiques (flèches).
2- A partir de la courbe 2, donner l'expression de la vitesse de la réaction pour les
concentrations en substrat :
- Inférieures à KM / 10.
- Comprises entre KM / 10 et 10 KM.
- Supérieures à 10 KM.
3- A quelle partie de la courbe correspond :
- Une réaction d'ordre 1.
- Une réaction d'ordre 0.
- Une réaction d’ordre intermédiaire.
21
TD BIO 241 2012-2013
ENZYMOLOGIE
4- Une enzyme E qui obéit à une cinétique michaelienne a un KM = 1 M vis-à-vis de
son substrat S. Pour une concentration de [S] = 100 M, la vitesse initiale V0
mesurée est de 0,1 M.min-1. Quelle sera la valeur de V0 dans les conditions
suivantes :
a- [S] = 1 mM
b- [S] = 1 M
c- [S] = 2 M
1
1
5- Les figures 4 et 5 représentent :
f(
) en présence d'un inhibiteur
V0
[S]
compétitif (IC) et non compétitif (INC).
a- Indiquer sur les graphiques lequel représente l’inhibition compétitive et lequel
représente l’inhibition non compétitive. Justifier.
b- Compléter les graphiques en précisant ce que chaque flèche indique.
4
1/Vo
5
[I]
1/Vo
[I]=0
[I]
1/ [S]
[I]=0
1/ [S]
Exercice n°4 :
Les vitesses initiales d'une réaction enzymatique sont données pour cinq
concentrations en substrat (Tableau ci-dessous).
1- Déterminer KM graphiquement.
2- Calculer la concentration d'un inhibiteur compétitif, ayant une constante de
dissociation Ki = 2,4.10-4 M, qui aurait pour effet de doubler la valeur du KM.
[S] (mol.L-1)
V0 (mol.L-1 min-1)
1,0 x 10-4
1,5 x 10-4
2,0 x 10-4
5,0 x 10-4
7,5 x 10-4
28
35
42
63
75
22
TD BIO 241 2012-2013
ENZYMOLOGIE
Exercice n°5 :
Le tableau ci-dessous traduit la cinétique de la transformation d'un substrat S par
une décarboxylase en présence et en l'absence d'une substance F.
1- Sans construire la courbe, déterminer la vitesse maximale et la constante de
Michaelis en l'absence et en présence de F ; en déduire le rôle précis de F.
[S] (mM)
V0 (mM.min-1)
V0 en présence de F
(mM.min-1)
1
1,5
2
3
4
8
16
20
0,15
0,21
0,25
0,30
0,33
0,40
0,42
0,42
0,06
0,08
0,10
0,12
0,13
0,15
0,16
0,16
On mesure la vitesse de transformation du substrat S en présence de 3 substances
M, N et P. On obtient les courbes 1, 2 et 3 ci-après.
2- Déduire de ces courbes si M, N et P sont des activateurs ou des inhibiteurs.
Justifier.
3- Dans le cas d'un inhibiteur, préciser le type d'inhibition. Justifier les réponses.
1
[M ]= 2 mmol/ml
Vo
[M ]= 0 mmol/ml
0
2
1/Vo
[S]
3
[N]=0 mmol/ml
1/Vo
[P]= 2 mmol/ml
[P]=O mmol/ml
[N]= 2 mmol/ml
0
1/ [S]
0
23
1/ [S]
TD BIO 241 2012-2013
ENZYMOLOGIE
Exercice n°6 :
Pour caractériser une enzyme nouvellement purifiée, un biochimiste a mesuré les
vitesses de réaction en présence de concentrations croissantes de substrat et cela
dans trois conditions :
a) En présence de l'enzyme seule.
b) En présence de l'enzyme et d'un analogue non métabolisable du substrat
(composé A) à une concentration de 150 M.
c) En présence de l'enzyme et d'un composé qui inhibe l'enzyme en se liant hors du
site actif de l'enzyme (composé B), à une concentration de 60 M.
A partir des résultats expérimentaux, il a tracé les diagrammes de Lineweaver et
Burk représentés dans la figure ci-dessous.
1- Indiquer la correspondance entre les expériences a, b, c et les symboles
employés (losanges, cercles, triangles). Justifier la réponse.
2- Déterminer graphiquement KM, KM app., Vmax et Vmax app.
3- Calculer les constantes d'inhibition pour les composés A et B (c’est-à-dire les
constantes de dissociation des complexes EI).
1 / V0 (min.M-1)
2
1
-5,00E+03
1 / [S]0 (M-1)
0
0,00E+00
5,00E+03
1,00E+04
ACTIVITE ENZYMATIQUE
Quelques rappels théoriques :
1- L’activité enzymatique : elle s’exprime en nanokatals.
Un nanokatal mesure l’activité d’une solution enzymatique qui catalyse la
transformation d’une nanomole (10-9 mole) de substrat en une seconde dans les
conditions optimales de la réaction (pH, température, concentration saturante en
substrat) dans un volume réactionnel donné.
24
TD BIO 241 2012-2013
AE (nkat) =
ENZYMOLOGIE
nombre de nanomoles de substrat transformées
temps de réaction (s)
L’activité enzymatique se rapporte toujours à un volume de solution enzymatique
donnée. Par convention, on ramène souvent le résultat à 1 mL de solution
enzymatique non diluée.
2- L’activité spécifique :
Elle correspond à l’activité enzymatique ramenée à 1 mg de toutes les protéines
présentes dans l’échantillon (et non pas à l’enzyme seule).
activité enzymatique
AS (nkat.mg-1) =
masse de protéines (mg)
3- Evaluation d’une purification enzymatique :
Un extrait enzymatique brut est constitué de la protéine à laquelle on s’intéresse
mais aussi d’un grand nombre de protéines indésirables dites contaminantes.
Une purification réussie implique :
a- De récupérer le maximum d’activité enzymatique par rapport à ce que contenait
l’extrait brut initial ; ceci est traduit par la valeur du rendement de purification.
b- D’éliminer le maximum de protéines contaminantes présentes dans l’extrait brut
initial ; ceci est traduit par la valeur du facteur de purification.
Après chaque étape de purification, plusieurs paramètres doivent ainsi être
mesurés :
a- La masse totale de protéines (mg) : elle est obtenue en déterminant la
concentration (en mg.mL-1) d’une partie de l’échantillon et en multipliant par le
volume total de la fraction.
b- L’activité enzymatique totale (nkat) : elle est obtenue en mesurant l’activité
enzymatique (en nkat.mL-1 d’extrait enzymatique) d’un volume d’échantillon et en
multipliant par le volume total de l’échantillon.
c- L’activité spécifique (nkat.mg-1) : ce paramètre est obtenu en divisant l’activité
enzymatique totale par la masse totale de protéine. Elle est généralement
exprimée en nkatals.mg-1 de protéines.
Ces trois paramètres permettent ensuite de calculer :
AE totale de l' extrait purifié
a- Le rendement de la purification =
x 100 (%)
AE totale de l' extrait brut
AS de l' extrait purifié
b- Le facteur de purification =
AS de l' extrait brut initial
4- Notion de vitesse et d’activité – Unités :
- Une vitesse de réaction en phase liquide est conventionnellement exprimée en
variation de la concentration de produit (ou substrat) en fonction du temps car
ce sont les concentrations qui déterminent les équilibres réactionnels. La vitesse
caractérise donc l’aspect cinétique de la réaction enzymatique.
25
TD BIO 241 2012-2013
ENZYMOLOGIE
- L’activité enzymatique est exprimée en variation du nombre de moles de
produit (ou substrat) en fonction du temps. Le volume d’enzyme utilisé pour
réaliser le test enzymatique doit alors être obligatoirement précisé. L’activité
enzymatique caractérise ainsi le pouvoir catalytique de l’échantillon enzymatique.
Exercice n°1 :
La glucose-6-phosphate-déshydrogénase (G-6-P-D) catalyse la réaction :
D-glucose-6-phosphate + NADP+
6-phosphoglucono--lactone + NADPH + H+
Le coefficient d'extinction molaire du NADPH à 340 nm est 6220 M-1.cm-1. Les autres
composés n'absorbent pas à 340 nm.
On se propose de purifier la G-6 P-D de Bacillus subtilis. Pour tester le degré de
pureté de la préparation, après chaque étape de purification, on ajoute une partie de
la préparation enzymatique à une solution de D-glucose-6-P et de NADP+ qui restent
en excès pendant tout le temps de la mesure dans la cuve de spectrophotomètre. La
longueur du trajet optique est 1cm. Le volume total final est 1mL.
1- Après une étape de purification, on ajoute au mélange réactionnel une partie de
préparation enzymatique contenant 100 g de protéines (dosées par la méthode
de Lowry). Après 5 min., la variation d'absorbance à 340 nm est de 0,3.
Calculer l'activité spécifique (AS) de la préparation de G-6-P-D à ce stade de
purification.
2- Après de nouvelles opérations de purification, une partie de la préparation
enzymatique contenant 1 g de protéines entraîne après 1 min. un accroissement
de l'absorbance de 0,36.
2.1- Calculer l'AS de la préparation de G-6-P-D à ce stade de purification.
2.2- Par rapport au stade précédent, combien de fois l’enzyme a t’elle était
purifiée ?
3- Après de nouvelles étapes de purification, on ne parvient pas à obtenir une
activité spécifique plus élevée. Qu'en déduire ?
Exercice n°2 :
Plusieurs étapes de purification sont utilisées pour obtenir une enzyme :
- étape 1 : précipitation par le sulfate d'ammonium
- étape 2 : chromatographie par échange d'ions
- étape 3 : chromatographie par filtration sur gel
1- Rappeler le principe des différentes techniques utilisées pour purifier l’enzyme.
2- Les mesures effectuées au cours de cette purification sont données dans le
tableau suivant. Calculer pour chaque étape l'activité enzymatique totale (AT),
l'activité spécifique (AS), le rendement (Rdt) et le facteur de purification (Fp ).
26
TD BIO 241 2012-2013
ENZYMOLOGIE
Fraction
Volume de
solution (mL)
Masse de
protéines (mg)
Extrait cellulaire brut
étape 1
étape 2
étape 3
100
10
1
1
50000
500
50
5
Activité enzymatique
mesurée sur 0,1 mL de
solution protéique
(nmol.sec-1)
20
20
100
50
Exercice n°3 : Etude de transaminases sériques
Les 2 principales enzymes de transamination présentes dans le sérum sont :
- La glutamate oxaloacétate transaminase (GOT).
- La glutamate pyruvate transaminase (GPT).
1- Ecrire la réaction catalysée par ces 2 enzymes.
Données : l'-cétoglutarate est l'-cétoacide dicarboxylique dérivé de Glu et
l'acide oxaloacétique est l'-cétoacide dicarboxylique dérivé de Asp.
On dispose des réactifs suivants :
- réactif 1 : alanine à 0,08 M, lactate déshydrogénase à 10 mg.L-1 et NADH à
2.10-4 M dans le tampon phosphate 0,1 M pH 7,4.
- réactif 2 : solution à 0,1 M d'acide -cétoglutarique.
On met à incuber 2,2 mL de réactif (1) avec 0,5 mL de sérum pendant 5 min. à 25°C.
On ajoute alors 0,3 mL de réactif (2) et, très rapidement, le mélange est transvasé
dans la cuve d'un spectrophotomètre réglé à 340 nm. L'épaisseur de la cuve est de 1
cm. On relève l'absorbance toutes les minutes pendant 5 minutes, ce qui donne les
résultats suivants :
temps (min.)
A340
0
0,558
1
0,452
2
0,348
3
0,245
4
0,142
5
0,070
2- Quelle est la transaminase dosée ?
3- Calculer l'activité transaminasique en nkat par mL de sérum.
Donnée : NADH à 340 nm = 6220 M-1.cm-1.
4- Les valeurs physiologiques sont comprises entre 5 et 15 mU.mL-1 de sérum
(milliunités internationales). Commenter la valeur trouvée dans l'expérience
proposée.
Donnée : Une unité internationale est l'activité enzymatique qui transforme 1
mole de substrat par minute dans les conditions optimales de pH, de force
ionique et de concentration en substrat.
Exercice n°4 :
La glutamate déshydrogénase (GDH) catalyse la réaction suivante :
27
TD BIO 241 2012-2013
ENZYMOLOGIE
Cette enzyme permet la désamination de l'acide glutamique en présence de NAD+.
On mesure l'activité de la GDH dans le sens de formation de l'acide glutamique dans
les conditions suivantes :
- 0,2 mL de sulfate d'ammonium à 5 M
- 2,4 mL d'une solution tampon pH 8
- 0,1 mL d'une solution de NADH à 6,5 mg.mL-1 (M = 709 g.mol-1)
- 0,2 mL d'une solution à 1 M d'acide -cétoglutarique
- Pré-incubation 5 min. à 25°C
- Addition de 0,1 mL de solution de GDH contenant 1,6 mg.mL-1 de
protéines (dosées par la méthode de Lowry) pour démarrer la réaction.
On mesure l'absorbance du milieu réactionnel (maintenu à 25°C) à 340 nm en
fonction du temps dans une cuve de trajet optique de 1 cm. On obtient les résultats
suivants :
Temps (min.)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
A à 340 nm
1,760
1,718
1,675
1,635
1,595
1,550
1,510
1,476
1,450
1,430
1- Expliquer le rôle des différents constituants du milieu réactionnel.
2- Tracer la courbe A = f(t). Commenter l'allure de cette courbe, en expliquant
notamment l’apparition d’un début de plateau.
3- Donner la vitesse initiale V0 de la réaction en M.min-1.
4- Calculer l'activité enzymatique de 1mL de solution de GDH dans les conditions du
test.
5- Calculer l'activité spécifique de la solution de GDH.
Donnée : NADH à 340 nm = 6220 M-1.cm-1.
Exercice n°5 :
On souhaite étudier une nouvelle protéase P isolée du tube digestif d'un insecte
amazonien. Cette protéase existe sous deux formes Pi et Pa ayant des séquences en
28
TD BIO 241 2012-2013
ENZYMOLOGIE
acides aminés identiques. Seule la forme Pa possède une activité protéasique. Pour
élucider le mode d'activation de la protéine Pi (forme inactive) en protéine Pa (forme
active), une expérience à l'aide de DIFP a été réalisée.
La découverte de la neurotoxicité du DIPF (diisopropylphosphofluoridate) a conduit à
utiliser ce réactif comme agent inactivateur d'enzyme. Le DIPF réagit avec une
sérine du site actif de l’enzyme, selon la réaction suivante :
Enzyme
Enzyme
1. Les deux protéases Pa et Pi sont incubées séparément en présence de 32P-DIPF
pendant 30 minutes à 37°C, puis dialysées pour éliminer l'excès de réactif
radiomarqué. Les deux protéases sont alors analysées par électrophorèse sur gel de
polyacrylamide, en présence de SDS (sodium dodecyl sulfate) avec ou sans 2mercaptoéthanol.
Après coloration au bleu de Coomassie, la photographie du gel obtenu donne le
résultat suivant :
Piste 1
Piste 2
Piste 3
Piste 4
Piste 5
Les marqueurs de masse molaire déposés dans la piste 1, sont les suivants : βgalactosidase 120 000 g.mol-1 ; albumine du sérum de bœuf 70 000 g.mol-1 ;
ovalbumine 42 000 g.mol-1 ; trypsine 25 000 g.mol-1 ; myoglobine 16 000 g.mol-1 ;
29
TD BIO 241 2012-2013
ENZYMOLOGIE
peptone 9 000 g.mol-1. La protéine Pi est déposée sur les pistes 2 et 3,
respectivement en absence et en présence de 2-mercaptoéthanol. De même, la
protéine Pa est déposée sur les pistes 4 et 5, respectivement en absence et en
présence de 2-mercaptoéthanol.
1- Que pouvez-vous tirer de l'analyse de cette électrophorèse sur le mode
d'activation de la protéine P ?
Après autoradiographie du gel, les bandes radioactives sont révélées sur un film
photosensible par une coloration noire. Le résultat est le suivant :
Piste 1
Piste 2
Piste 3
Piste 4
Piste 5
2- Compléter votre analyse précédente (question 1) de l'électrophorèse, par l'étude
des résultats obtenus par autoradiographie pour affiner vos conclusions sur le
mode d'activation de la protéine P.
2. L'étude enzymatique de la protéine P s'effectue sur un substrat artificiel, le paranitrophénylacétate (pNPA) dont le produit d'hydrolyse absorbe à 410 nm avec un
coefficient d'extinction molaire à 410 nm de 4 000 M-1.cm-1.
1- Ecrire la réaction catalysée par la protéine P sur le substrat artificiel.
2- L’extrait enzymatique est trop concentré en activité pour être utilisé en l’état. Une
dilution au 1/300 est nécessaire. Quels sont les volumes respectifs en solution
tampon et en extrait enzymatique que vous devez prendre pour effectuer cette
dilution sachant qu'un volume minimum de 600 µL d'extrait dilué est nécessaire
pour la suite de vos manipulations ?
Le protocole expérimental pour mesurer l'activité enzymatique de l'enzyme P est le
suivant. Le spectrophotomètre est programmé pour faire une cinétique pendant 3
minutes à 410 nm. Le zéro d’absorbance est fait à 410 nm à l’aide d’1 mL de tampon
phosphate de sodium 0,1 M pH 7.
Dans une cuve de 1 mL, 450 µL de tampon phosphate 0,1 M, pH 7, et 500 µL de
pNPA à 1 mM sont mis en présence de 50 µL d’extrait enzymatique dilué et
homogénéisés rapidement avant de démarrer la cinétique.
30
TD BIO 241 2012-2013
ENZYMOLOGIE
3- Quelle critique apportez-vous au choix du contenu de la cuve utilisé pour faire le
zéro d'absorbance ?
Le résultat expérimental obtenu est le suivant :
4- Calculer l'activité enzymatique de 1mL de l'extrait enzymatique de départ dans les
conditions expérimentales proposées. Détailler vos calculs.
Le dosage selon la méthode de Bradford des protéines présentes dans l'extrait
enzymatique est effectué selon le protocole suivant :
A 100 µL d’échantillon protéique dilué, ajouter 1 mL de réactif de Bradford.
Laisser 20 min. à température ambiante.
Lire l’absorbance à 595 nm contre un témoin ne contenant pas de protéines.
5- Donner le contenu du tube témoin.
L'extrait enzymatique est préalablement dilué au 1/10ème.
Les résultats expérimentaux obtenus sont les suivants :
Tube
Tampon phosphate de sodium
0,1 M pH 7 (L)
Extrait enzymatique dilué (L)
Réactif de Bradford (mL)
A à 595 nm
1
50
2
50
3
50
4
0
5
0
6
0
50
50
50
100
100
100
1
1
1
1
1
1
0,102 0,098 0,101 0,199 0,200 0,200
6- Quel est l'intérêt de faire plusieurs mesures ?
31
TD BIO 241 2012-2013
ENZYMOLOGIE
7- Calculer la concentration en protéines de l'extrait enzymatique à l’aide de la
courbe d’étalonnage suivante, effectuée avec de la sérum albumine bovine.
Absorbance à 595 nm
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Masse de SAB (en g / tube)
8- Calculer l'activité spécifique de l'extrait enzymatique.
NOTION DE SITE ACTIF
Quelques rappels théoriques :
Le site actif est une zone de l'enzyme où se fixe le substrat et où intervient l'effet
catalytique. Les acides aminés présents dans cette zone, ainsi que les molécules
non protéiques (dites cofacteurs) qui y sont également localisées, participent
directement à l'action catalytique.
On distingue les acides aminés qui participent à la fixation du substrat par
l’intermédiaire de liaisons non covalentes (essentiellement ioniques, hydrophobes et
hydrogène) et les acides aminés catalytiques participant à la transformation du
substrat en produit.
NB : Les protéines sont des molécules déformables ; il en résulte que les ligands qui
se fixent en un autre point de l'enzyme que le site actif, et souvent fort loin, peuvent
modifier la conformation du site actif et ainsi changer les valeurs des constantes
cinétiques de l'enzyme.
Principe de l'étude expérimentale d'un site actif :
Toutes les méthodes physicochimiques d'étude des protéines sont utilisées pour
déterminer le mécanisme d'action d'une enzyme. Néanmoins, de nombreuses
méthodes sont basées sur le principe suivant : modification légère soit de la structure
d'un ligand soit de celle de l'enzyme et mesure des variations d'activité et d'affinité
correspondantes. Si les constantes caractéristiques KM ou kcat sont nettement
modifiées, on en déduit que la zone concernée du ligand ou de l'enzyme participe à
la fixation du substrat ou à sa transformation.
32
TD BIO 241 2012-2013
ENZYMOLOGIE
Exercice n°1 :
La carboxypeptidase est une métalloenzyme qui assure l'hydrolyse de la liaison
peptidique liant le dernier acide aminé du côté COOH terminal au reste des peptides
et des protéines substrats.
La fixation du peptide L-alanyl-L-tyrosine sur le site actif de cette enzyme, est donnée
dans le schéma ci-dessous :
OH
Poche apolaire
C H2
HC
C
H
O-
NH O
++
Zn
O
C
C
C
H
N
Arg 145
NH 2
H
H
N
+N
H
H
O
Tyr 248
H
Glu
COO-
NB : Cette représentation donne une image plane de la structure spatiale du site
actif : deux groupes positionnés au voisinage l'un de l'autre sur ce schéma, sont
supposés l'être dans la structure réelle, tridimensionnelle de l'enzyme. Les traits
hachurés représentent les liaisons enzyme-substrat.
1- Quels types d'interactions interviennent dans la fixation du substrat ?
2- Préciser à priori si le KM est modifié si on remplace le L-alanyl-L-tyrosine par les
substrats suivants :
L-alanyl-L-phénylalanine ; L-alanyl-L-aspartate ; L-aspartyl-L-tyrosine.
Exercice n°2 :
La
glycéraldehyde-3-phosphate-deshydrogénase
catalyse
glycéraldehyde-3-phosphate en 1,3-bisphosphoglycérate :
l'oxydation
du
Si on fait réagir de l'iodoacétate sur cette enzyme, on constate que le
glycéraldehyde-3-phosphate continue à se fixer sur l'enzyme modifiée mais ne
s'oxyde plus. Que peut-on conclure ?
33
TD BIO 241 2012-2013
ENZYMOLOGIE
Donnée : l'iodoacétate ICH2COO- est un agent alkylant qui réagit avec les thiols (SH) pour former de façon irréversible des groupements -S-CH2COO-.
Exercice n°3 :
Les paramètres Vmax et KM d'une réaction enzymatique sont étudiés en fonction du
pH et donnent les résultats suivants :
Vmax (unités arbitraires)
KM (mM)
20
80
10
40
KM = 1mM
0
0
4
6
8
10
pH
4
6
8
10
pH
1- Que représentent les paramètres Vmax et KM pour une enzyme michaelienne ?
Que permettent-ils d’étudier chez cette enzyme ?
2- Quel est le type d'acides aminés qui apparaît comme essentiel pour le
fonctionnement du site catalytique, et quel est l'état de protonation de ce (ou ces)
acide(s) aminé(s) dans l'enzyme active ?
3- Même question en ce qui concerne le site de fixation du substrat sur l'enzyme.
34
TD BIO 241 2012-2013
BIOENERGETIQUE
THEME N°4 : BIOENERGETIQUE
ENERGIE LIBRE – SENS DES REACTIONS – EQUILIBRE
POTENTIELS REDOX – FORMULE DE NERNST
35
TD BIO 241 2012-2013
BIOENERGETIQUE
ENERGIE LIBRE – SENS DES REACTIONS - EQUILIBRE
Quelques rappels théoriques : Variation d’énergie libre et constante d’équilibre
Considérons la réaction chimique suivante, se déroulant au sein d'un système à pH =
7 (à ce pH, les grandeurs thermodynamiques classiques sont affectées du signe
"prime").
A + B
C + D
Bien que la réaction puisse évoluer dans les 2 sens, nous avons écrit C et D à
droite ; nous les appellerons donc “ produits ”. A et B sont alors appelés “ substrats ”.
Nous voulons calculer la variation d’énergie libre lorsque  moles de A et  moles de
B sont converties en  moles de C et  moles de D, chacun à une concentration
donnée. Pour la réaction inverse, nous avons seulement besoin de changer le signe
de l’énergie libre que nous aurons calculée.
Dans une réaction chimique, la variation d’énergie libre (G’), exprimée en kJ.mol-1,
dépend de la variation d’énergie libre dans les conditions standard (Go’) et de la
concentration des substrats et produits.
[C] γ [D] δ
)
G’ = Go’ + RT ln (
(1)
[A] α [B] β
Avec :
- Conditions standard : Concentrations molaires des réactants autres
que H+, 298°K, pH = 7.
- R = constante des gaz parfaits = 8,315 J. mol-1. °K-1.
- T = température absolue en kelvins (°K).
- [A], [B], [C], [D] : concentrations dans les conditions initiales.
Signification de G’ :
-
Si G’ > 0 : la transformation n’est pas spontanée, et il faut lui fournir de
l’énergie pour qu’elle se fasse (c’est la réaction inverse qui est alors
spontanée) : elle est dite endergonique.
Si G’ < 0 : la transformation est spontanée et elle est susceptible de
fournir de l’énergie : elle est dite exergonique.
Si G’ = 0 : la transformation n’a tendance à se faire ni dans un sens ni
dans l’autre : elle est à l’équilibre.
Lorsque le système est à l’équilibre, les concentration dans le facteur entre
parenthèses de l’équation (1) ne sont plus les concentrations initiales mais les
concentrations à l’équilibre. De ce fait, ce facteur entre parenthèses est appelé la
constante d’équilibre K de la réaction :
[C]  [D] 
) eq
(2)
K= (
[A]  [B] 
36
TD BIO 241 2012-2013
BIOENERGETIQUE
o
L’équation (1) devient donc :
0 = G ’ + RT ln (
ou :
Go’ = - RT ln K
[C]  [D] 
[A]  [B] 
)
eq
(3)
(4)
Exercice n°1 :
La variation d'énergie libre standard de la réaction :
D-glucose-1-phosphate
D-glucose-6-phosphate
considérée de gauche à droite, est de : - 7270 J.mol-1 (à 25°C et pH = 7).
Dans quel sens la réaction tend-elle à se faire spontanément dans les 3 cas
suivants :
D-glucose-1-phosphate (mM)
D-glucose-6-phosphate (mM)
72
7,2
5,55
72
137
555
Exercice n°2 :
La variation d'énergie libre standard de la réaction :
oxaloacétate + L-alanine
pyruvate + aspartate
considérée de gauche à droite, est nulle à 25°C, pH = 7.
On incube du pyruvate, de l'aspartate et de la L-alanine dont les concentrations
initiales sont 1 x 10-3 M, l'oxaloacétate étant initialement absent.
Calculer la molarité des différents composés à l'équilibre.
Exercice n°3 :
Le tableau suivant donne les variations d’énergie libre standard d'hydrolyse de
quelques composés phosphorylés.
Go’ (kJ.mol-1)
- 61,7
- 51,4
-43,0
- 43,0
- 33,4
- 30,4
- 20,8
- 13,8
- 9,1
Composés
Phosphoénolpyruvate
Carbamyl-phosphate
Acétyl-phosphate
Créatine-phosphate
Pyrophosphate
ATP
Glucose-1-phosphate
Glucose-6-phosphate
Glycérol-3-phosphate
37
TD BIO 241 2012-2013
BIOENERGETIQUE
1- Qu’est-ce que le potentiel de transfert de groupement phosphate ?
2- Quel est le composé qui a le potentiel de transfert le plus élevé ?
3- Quel est le sens de chacune des réactions suivantes lorsque les réactifs sont
initialement présents en quantités équimolaires (1M) ?
ATP + créatine
créatine-phosphate + ADP
ATP + pyruvate
phosphoénolpyruvate + ADP
4- Quel est l’élément de couplage absolument indispensable ?
Exercice n°4 :
La réaction de biosynthèse de la L-glutamine chez l'homme est catalysée par la Lglutamine synthétase. On peut la résumer de la manière suivante :
ADP + phosphate + glutamine
ATP + glutamate + NH3
Go’ de cette réaction est de -16,3 kJ.mol-1 (de gauche à droite).
1- Préciser la signification de cette dernière donnée.
2- Cette réaction peut être considérée comme la somme de deux réactions
composantes, l'une exergonique, l'autre endergonique.
Ecrire ces deux réactions composantes et évaluer Go’ de la réaction
endergonique.
3- Plus généralement, quelles sont les conditions thermodynamiques nécessaires
pour qu'une réaction endergonique puisse se produire ?
Donnée : Go’ de l’hydrolyse de l’ATP = - 30,4 kJ.mol-1.
POTENTIELS REDOX – FORMULE DE NERNST
Quelques rappels théoriques :
Le transport des électrons dans les systèmes biologiques consiste en une série de
réactions d’oxydation et réduction couplées entre elles (encore appelées réactions
redox).
Une oxydation = perte d’électrons ; une réduction = gain d’électrons.
Un réducteur est un composé ayant tendance à fournir un (ou des) électron(s).
Un oxydant est un composé ayant tendance à capter un (ou des) électron(s).
Oxydant + n e-
Réducteur
Les formes réduite et oxydée d’un même composé constituent un couple redox.
Le pouvoir réducteur d’un couple redox est défini par le potenteil redox (E). Plus ce
potentiel redox est négatif, plus le couple a un pouvoir réducteur.
38
TD BIO 241 2012-2013
BIOENERGETIQUE
Il est possible de calculer les potentiels redox grâce à la relation de Nernst :
RT
[ox]
ln
n F [red]
Avec : - E’ = potentiel redox en volts à pH 7.
- E0’= potentiel standard redox à pH 7, 298°K, [ox] = [red] = 1 mol.L-1.
- R = constante des gaz parfaits = 8,315 J. mol-1. °K-1.
- T = température absolue en kelvins.
- n = nombre d’électrons impliqués.
- F = faraday = 96 500 J.V-1.mol-1 = 96 500 C. (Coulombs).
- [ox] et [red] = concentrations des formes oxydée et réduite.
E’ = E0’ +
Une réaction d’oxydo-réduction fait intervenir 2 couples redox : la forme réduite d’un
premier couple transfère ses électrons à la forme oxydée du second couple. On
obtient alors la forme oxydée du premier couple et la forme réduite du second
couple.
Red1
E0’ (1)
Ox1 + n eRed2
Ox2 + n e-
E0’ (2)
Si E0’ (2) < E0’ (1), le couple 2 est le plus réducteur.
Spontanément, les électrons sont transférés de la forme réduite du couple 2 à la
forme oxydée du couple 1 et donc le système 2 réduit le système 1 :
Red2 + Ox1
Ox2 + Red1
Il est possible de calculer la variation d’énergie libre des réactions redox dans les
conditions standard grâce à la relation suivante :
Go’ = - n F [ E0’ (1) – E0’ (2) ] = - n F E0’
Quelques potentiels redox standard E0’ utiles en biochimie :
½ O2 + 2 H + 2 e
H2O
E0’ (Volt)
+ 0,81
NO3- + 2 H+ + 2 e-
NO2- + H2O
+ 0,42
2 cyt c (ox) + 2 e-
2 cyt c (red)
+ 0,25
2 cyt b (ox) + 2 e-
2 cyt b (red)
+ 0,08
Pyruvate + 2 H+ + 2 e-
Lactate
- 0,19
NAD+ + 2 H+ + 2 e-
NADH + H+
-0,32
Acétoacétate + 2 H+ + 2 e-
-hydroxybutyrate
- 0,35
+
-
39
TD BIO 241 2012-2013
BIOENERGETIQUE
Exercice n°1 :
En vous aidant du tableau précédent, déterminer le sens de chacune des réactions
suivantes. Justifier les réponses (on suppose que les conditions sont les conditions
standard et que le milieu contient l'enzyme catalysant la réaction considérée).
Pyruvate + -hydroxybutyrate
Lactate + Acétoacétate
(1)
Acétoacétate + NADH + H+
-hydroxybutyrate + NAD+
(2)
2 cyt c (ox) + 2 cyt b (red)
2 cyt c (red) + 2 cyt b (ox)
(3)
Exercice n°2 :
Une bactérie dénitrifiante A est anaérobie stricte. Elle possède néanmoins une
chaîne transporteuse d'électrons lui permettant de “ respirer ”. L'accepteur final
d'électrons, au lieu d'être l'oxygène moléculaire comme dans l'aérobiose est le nitrate
(NO3-) réduit en nitrite (NO2-). Les électrons sont introduits dans la chaîne des
transporteurs d'électrons par le nicotinamide adénine dinucléotide réduit (NADH +
H+).
1- Ecrire le bilan global des réactions réalisées par cette bactérie.
2- Calculer la variation d'énergie libre standard correspondante.
3- La “ respiration nitrate ” est-elle théoriquement plus ou moins exergonique que la
respiration aérobie ? Justifier par le calcul.
40
TD BIO241 2012-2013
METABOLISME GENERAL
THEME N°5 : METABOLISME GENERAL
GLYCOLYSE
CYCLE DE KREBS
PHOSPHORYLATION OXYDATIVE
-OXYDATION DES ACIDES GRAS
41
TD BIO241 2012-2013
METABOLISME GENERAL
Exercice n°1 : Fermentation des bactéries lactiques.
La plupart des bactéries lactiques sont dépourvues de cytochromes. Elles peuvent
dégrader le glucose par 2 voies :
- La voie de la glycolyse
- La voie hétéro-fermentaire.
Le bilan de la voie de la glycolyse en conditions anaérobie peut s'écrire :
1 glucose
2 acides lactiques
1- On laisse se développer la souche bactérienne sur un milieu contenant du
2345-
glucose dont le C1 est radioactif (14C). Sur quel atome de carbone de quel produit
retrouvera-t-on la radioactivité au terme de la glycolyse ?
Quel est le gain net en moles d'ATP par mole de glucose consommé ?
On précisera quelles sont les étapes au cours desquelles il y a consommation ou
production d'ATP.
La transformation de glucose en acide lactique s'accompagne-t-elle globalement
d'une réduction de nicotinamide-adénine-dinucléotide ? Expliquer votre réponse.
Quel serait le bilan en ATP et en NADH de la dégradation d’une mole de
saccharose par la voie de la glycolyse ?
La voie de la glycolyse comprend plusieurs réactions couplées.
Décrire celles qui correspondent à des réactions de phosphorylation liée au
substrat.
La voie hétéro-fermentaire d'une bactérie lactique comporte la séquence de
réactions donnée dans la figure 1.
Le 3-phosphoglycéraldéhyde formé est transformé en lactate par une séquence de
réactions commune avec celle de la voie de la glycolyse.
6- Quel est le gain net en moles d'ATP par mole de glucose consommé par la voie
hétéro-fermentaire, lorsque cette voie donne les produits de fermentation figurant
dans le bilan suivant :
1 glucose
1 CO2 + 1 acide lactique + 1 éthanol
7- Etablir le bilan de NADH + H+ participant aux réactions de cette voie.
Une étude précise des produits formés donne les résultats regroupés dans le tableau
ci-dessous. Toutes les valeurs sont exprimées en mmol. de produits formés à partir
de 10 mmol. de glucose fermenté.
Acide lactique
Ethanol
Dioxyde de carbone
Acide acétique
10,2
9,7
9,5
0,0
8- Etablir la balance carbonée de cette fermentation (rapport exprimé en
pourcentage entre le nombre de moles d'atomes de carbone récupérées en
42
TD BIO2241 2012-20133
METAB
BOLISME GE
ENERAL
prod
duits et le nombre de moles d
d'atomes de carbone
e de glucosse consom
mmées).
Com
mmenter la
a valeur rettrouvée.
Figure 1 : Schém
ma de la voie hétéro
ofermenta
aire d'une bactérie laactique
Exercic
ce n°2 : Changemen
C
nt de sens d'une réac
ction biochimique
La pre
emière éta
ape de la dégradati on du D-g
glucose pa
ar la voiee de la glycolyse
possèd
de une variiation d’éne
ergie libre standard égale
é
à - 13,4 kJ.moll-1 à 25°C.
1- Ecrire cette ré
éaction. Nommer l'e
enzyme impliquée. Nommer
N
lee produit X formé.
Ecrire les forrmules du D-glucose
e et du produit
p
X selon la rreprésenta
ation de
Haw
worth.
2- On suppose que les conditionss initiales de la ré
éaction coorresponde
ent aux
conditions de concentrations suiva
antes :
[glucose] = 10
0-5 M
[A
ATP] = 10-3
M
[X
X] = 10-1 M
[ADP] = 10-4 M
Montre
er que danss ces cond
ditions, X se
e transform
me en gluc
cose.
43
TD BIO241 2012-2013
METABOLISME GENERAL
Exercice n°3 :
L’enzyme aldolase catalyse la réaction suivante dans la voie de la glycolyse :
Fructose-1,6-bisphospate
Dihydroxyacétone phosphate
+ Glycéraldéhyde-3-phosphate
Le Go' de la réaction est + 5,7 kcal.mol-1 (T = 25°C), alors que le G dans la cellule
est – 0,3 kcal.mol-1. Calculer le rapport entre produits et substrat à l’équilibre et dans
les conditions intracellulaires. A l’aide de vos résultats, expliquer comment la réaction
peut être endergonique dans les conditions standard et exergonique dans les
conditions intracellulaires.
Rappel : 1 cal = 4,18 J.
Exercice n°4 :
Un être humain consomme environ 2800 kcal par jours en s'alimentant. Si on
considère que les voies métaboliques qui conduisent à la production d'ATP opèrent
avec une efficacité thermodynamique de 50%. Calculer le poids d'ATP qui est produit
par le corps humain en une journée sachant que l'énergie libre produite par
l'hydrolyse d'une mole d'ATP = 50 kJ et masse molaire de l'ATP = 551 g/mol.
Exercice n°5 :
Quelle quantité d’ATP, exprimée en moles, une cellule musculaire peut-elle produire :
1.1-
1.2-
en condition aérobie à partir :
a- d’une mole de glucose
b- d’une mole d’acide gras palmitique (C16) (donner seulement l’ordre de
grandeur)
en condition anaérobie prolongée à partir :
a- d’une mole de glucose
b- d’une mole d’acide gras palmitique (C16)
Données : Utilisez pour le calcul les valeurs P/O suivantes : 2 moles ATP formées
par mole de FADH2 re-oxydé et 3 moles ATP formées par mole de NADH,H+ reoxydé (quelle que soit son origine cytosolique ou mitochondriale)
Exercice n°6 :
Un fragment de muscle squelettique humain dans lequel une électrode a été
implantée est plongé dans une solution physiologique contenant du glucose.
Lorsqu’il est stimulé par un courant électrique, le fragment de muscle consomme 76
µmoles d’ATP par minute. La concentration initiale en glucose de la solution
physiologique est de 3,6 g/L. Le volume total est de 10 ml. Dans ces conditions
expérimentales, tout l’ATP consommé par le fragment de muscle provient
44
TD BIO241 2012-2013
METABOLISME GENERAL
uniquement de l’oxydation du glucose présent dans la solution physiologique, en
condition aérobie. En vous aidant des résultats de la question précédente,
déterminer le temps nécessaire pour que la quantité de glucose présente dans la
solution initialement soit totalement épuisée. Détailler votre raisonnement et vos
calculs.
Donnée : la masse molaire du glucose est de 180 g/mol
45
TD BIO241 2012-2013
METABOLISME GENERAL
THEME N°6 : METABOLISME GENERAL
SPECIFICITES MICROBIENNES
46
TD BIO241 2012-2013
METABOLISME GENERAL
Remarque préliminaire :
Tous les exercices qui suivent impliquent le calcul de temps de génération (Tg) et de
taux de croissance (). Il s’agit de notions que vous avez abordées au cours de l’UE
BIO231, et il vous suffira donc de vous reporter au polycopié de TD de cette UE pour
vous remémorer leur mode de calcul.
1
=
( est exprimé en divisions.min-1 ou divisions.h-1, et Tg en min ou h)
Tg
log2
x t ) + log N0
avec N = population à un temps t
log N = (
Tg
N0 = population initiale
t = t – t0
Exercice n°1 :
Dans le cadre d'un travail sur le catabolisme des sucres chez Escherichia coli, vous
avez voulu étudier l'influence de la nature des sources de carbone sur la croissance.
Vous avez effectué trois cultures parallèles, inoculées avec la même pré-culture à une
DO600 initiale égale à 0,7, en variant la composition du milieu comme suit : A, milieu
minimum + glucose 0,25% + lactose 0,1% ; B, milieu minimum + glucose 0,15% +
lactose 0,2% ; C, milieu minimum + glucose 0,07% + lactose 0,28%. Les résultats sont
présentés dans la figure ci-dessous.
1- Décrivez l’allure générale de la courbe (A, B ou C).
2- Calculez (aussi précisément que possible) les différents temps de génération et taux
de croissance horaires.
3- Interprétez les différences observées entre les 3 courbes, en faisant référence à vos
connaissances théoriques sur le sujet.
4- Comment pourriez-vous faire pour tester votre interprétation du phénomène mis en
évidence ?
5- Si vous aviez remplacé le glucose par du maltose, qu'auriez-vous vu ?
DO600
A
B
C
0,1
0
1
2
3
4
5
0
1
2
3
4
5
0
1
2
3
4
5
t (h)
47
TD BIO241 2012-2013
METABOLISME GENERAL
Exercice n°2 :
Vous étudiez le catabolisme du glycérol chez une bactérie. Vous avez réalisé
différentes cultures en milieu minimum en variant uniquement la concentration en
glycérol, sachant qu’il s’agit là de la seule source de carbone disponible. A : [glycérol] =
400 mg.L-1, B : [glycérol] = 100 mg.L-1, C : [glycérol] = 40 mg.L-1, D : [glycérol] = 10
mg.L-1. Le milieu de culture ne contient que des nutriments, le glycérol rentre dans la
cellule par diffusion facilitée.
1- Calculez les temps de génération des différentes courbes.
2- Comment interprétez-vous le fait que les courbes de croissances A et B soient
identiques ? Quelle expérience complémentaire vous permettrait de tester votre
hypothèse quant à la culture A (proposez un protocole succinct, et analysez les
probables résultats expérimentaux) ?
3- Pourquoi la culture C entre-t-elle en phase stationnaire avant les cultures A et B, et à
une DO plus faible ? Quelle expérience complémentaire vous permettrait de tester
votre hypothèse (proposez un protocole succinct, et analysez les probables résultats
expérimentaux) ?
4- Comment expliquez-vous les différences entre les courbes C et D ?
DO600
A
B
x
C
D
0,1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
t (h)
Exercice n°3 :
On étudie la croissance d'une bactérie dans un milieu défini, contenant un tampon de
régulation du pH (Na2HPO4 : 3,8 g.L-1, KH2PO4 : 1,5 g.L-1), des sels minéraux (MgSO4 :
200 mg.L-1; CaCl2 : 20 mg.L-1). Le glucose (2 g.L-1) est la seule source de carbone et
d’énergie ; la source d’azote est soit du nitrate de potassium (KNO3) (culture A), soit du
chlorure d’ammonium (NH4Cl) (culture B). Après 3 h de culture, on fait buller de l’azote
(N2) dans le milieu de culture dans le seul but de chasser rapidement l’oxygène
dissous. Toutes les 30 minutes, une aliquote de la culture est prélevée, sur laquelle on
effectue une mesure de DO600 (le « 0 » est réglé avec le milieu de culture non inoculé).
48
TD BIO241 2012-2013
METABOLISME GENERAL
1- Calculez temps de génération et taux de croissance (expliquez brièvement vos
calculs).
2- Commentez l'aspect des deux courbes. A quel(s) phénomène(s) biologique(s) peuton imputer l’origine des différences observées : avant et après le bullage ; entre les
cultures A et B (justifiez vos réponses).
3- On s’intéresse à deux mutants (M1, M2) dérivés de la bactérie étudiée. D’après les
courbes de croissance obtenues, quelle(s) hypothèse(s) pourriez-vous émettre qui
puisse expliquer, pour chaque mutant, la différence de comportement : par rapport à
la souche sauvage ? entre les deux cultures A et B ?
4- Pour chacune des trois souches étudiées, que se passerait-il si, après avoir lancé
une culture dans le milieu A en absence d’oxygène, on injectait de l’oxygène dans la
culture à t = 3 h (esquissez la courbe de croissance) ?
DO600
A
B
bullage
d’azote
0,1
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
5,5
6
6,5
7
7,5
8
DO600
8,5
9
9,5
t (h)
M1-A
bullage
d’azote
M1-B
M2-A
M2-B
0,1
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
5,5
6
6,5
7
7,5
8
8,5
9
9,5
t (h)
49
TD BIO241 2012-2013
METABOLISME GENERAL
Exercice n°4 :
Des chercheurs s’intéressent au comportement de bactéries du genre Shewanella
quand on ajoute dans leur milieu de culture de l’ADN. Ils ont réalisé différentes cultures
dont les résultats sont présentés dans les deux figures ci-dessous.
Figure 1 : Cultures en aérobie des bactéries
Shewanella oneidensis MR-1 (A), Shewanella
putrefaciens CN32 (B) et Shewanella sp. souche
W3-18-1 (C) dans un milieu de culture
contenant : du PIPES (solution tampon) ; de l’acide
lactique ; NH4Cl, NaCl, MgCl2, KCl, CaCl2 et
Na2SeO4 ; des traces de vitamines et de minéraux ;
et NaH2PO4 (carrés noirs) ou ADN de sperme de
hareng (carrés blancs). Les données présentées
correspondent à la densité optique, c.a.d. la
biomasse totale.
Figure 2 : Cultures en anaérobie de Shewanella
oneidensis MR-1 dans un milieu contenant : du
PIPES (solution tampon) ; de l’acide lactique ;
NH4Cl, NaCl, MgCl2, KCl, CaCl2 et Na2SeO4 ;
Fe(III)-NTA (= Fe3+ complexé à de l’acide
nitriloacétique) ; des traces de vitamines et de
minéraux. Dans la figure 2A, les chercheurs ont
ajouté au milieu de culture du NaH2PO4 ; dans la
figure 2B, du NaH2PO4 et de l’ADN de sperme de
hareng. Les carrés noirs représentent la quantité de
cellules en suspension ; les ronds blancs
représentent la concentration en Fe2+.
1- Au vu des résultats présentés dans la Figure 1, que pouvez-vous dire du rôle joué
par l’ADN (justifiez votre réponse) ?
2- Quels autres rôles pourrait-il jouer (et quelles incidences pourrait-on en tirer quant
à la composition des milieux de culture) ?
50
TD BIO 241 2012-2013
METABOLISME GENERAL
3- Quel rôle le Fe(III)-NTA joue-t-il dans les cultures de la Figure 2, et quelles
conclusions pouvez-vous en tirer quant aux capacités métaboliques des bactéries
du genre Shewanella ?
4- Pouvez-vous expliquer l’absence de croissance bactérienne dans la Figure 2C ?
51
TD BIO 241 2012-2013
METABOLISME GENERAL
CORRIGES – valeurs numériques
Thème n°1 : Rappels
Concentrations
Ex 1
1: 0,41 g NaOH - 1,02 g CuSO4, 5H2O - 2,73 g tartrate de K et Na, 4H2O - 5,44 g Na2CO3, 10 H2O
3: Sulfate de cuivre :0,01 % - Tartrate de K et Na 0,02%
Ex 2
1: 17,4 M - 17,4 N - 57 mL acide acétique concentré + H2O qsp 1L
2: 17,7 M - 35,4 N - 28 mL acide concentré + H2O qsp 1L
Spectrophotométrie
Ex 1
1: εtrp = 6000 M-1.cm-1
2: 4 résidus Trp
Ex 2
1: εura = 12 000 M-1.cm-1
2: [Ade] = 10-5 M - [Ura] = 2 .10-5 M
Acides/Bases faibles
Ex 1
1: pH = 4,46 2: pH = 2,56
Thème n°2 : Rappels sur les protéines
Ex 2
Leu pHi = 6 - Cys pHi = 5 - His pHi = 7,6
Ex 3
pHi peptide = 6,5
Thème n°3 : Enzymologie
Energie d’activation
1 : Aucun catalyseur : k = 4,27.10-14
Platine colloïdal : k= 1,84.10-9
Catalase : k = 3,75.10-2
2 : Platine colloïdal : 4,3.104 - catalase env 1012
Cinétique enzymatique
Ex 2
1 : KM = 3.10-5 M
2 : kcat = 5.103 s-1
3 : kcat/KM = 1,67.108 s-1.M-1
Ex 3
4a : Vo = 0,1 µM.mn-1
4b : Vo = 0,05 µM.mn-1
4c : Vo = 0,066 µM.mn-1
Ex 4
1: KM = 2,86.10-4 M
52
TD BIO 241 2012-2013
METABOLISME GENERAL
2 : [I] = Ki
Ex 6
2 : composé A Ki = 150 µM - composé B Ki= 60 µM
Activité enzymatique
Ex 1
1 : AS1 = 1,6 nkat.mg-1 protéines
2 : AS2 = 965 nkat.mg-1 protéines - Fp ~ 600
Ex 3
3 : pour 1 mL de sérum, AE = 1,67 nkat.mL-1
Ex 4
3 : Vo = 6,7.10-6 M.mn-1
4 : 1 ml sol GDH, AE = 3,3 nkat.mL-1
5 : AS = 2,1 nkat.mg-1
Ex 5
4 : AE : 20000 nkat.mL-1
7 : conc. Protéines = 0,04 mg.mL-1
8 : AS = 5.104 nkat.mg-1
Thème n°4 : Bioénergétique
ENERGIE LIBRE – SENS DES REACTIONS - EQUILIBRE
Ex 2
[oxaloacétate] = 3,33.10-4 M.
[L-alanine] = 1,33.10-3 M.
[pyruvate] = [aspartate] = 6,67.10-4 M.
POTENTIELS REDOX – FORMULE DE NERNST
Ex 2
2 : respiration nitrate Go’ = -142,8 KJ.mol-1
3 : respiration aérobie Go’ = -218 KJ.mol-1
Thème n°5 : Métabolisme général
Ex 1
8 : Balance carbonée de la voie hétérofermentaire = 99,2%
Ex 3
A l’équilibre : [dihydroxyacétone-P] [glycéraldéhyde-3-P] = 6,7.10-5 [fructose-1,6-BP]
Conditions intra-cellulaires : [dihydroxyacétone-P] [glycéraldéhyde-3-P] = 4.10-5 [fructose-1,6-BP]
Ex 4
Le poids d’ATP produit est : = 64,5 kg
Ex 6
Temps d’épuisement du glucose : = 100 min soit 1h 40 min
Thème n°6 : Métabolisme - spécificités bactériennes
Ex 1
2:
1ère phase de croissance : Tg = 1h ; ν= 1 division.h-1
2ème phase de croissance : Tg = 2h30 ; ν = 0,4 division.h-1
Ex 2
53
TD BIO 241 2012-2013
1 : A - B - C : Tg = 2,5 h
METABOLISME GENERAL
- D : Tg = 4,5 h
Ex 3
1:
Avant bullage : Tg = 0,75 h (45 min) - ν = 1,32 divisions.h-1
Après bullage - A : Tg = 1,25 h (75 min) - ν = 0,8 divisions.h-1
Après bullage - B : Tg = 3,4 h (205 min) -
ν = 0,3 divisions.h-1
54
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